Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

प्रकाश संचालित एंजाइमी decarboxylation

Published: May 22, 2016 doi: 10.3791/53439
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Faculty of Biology and Biotechnology, Ruhr Universität Bochum, 2Biology and Biotechnology, Delft University of Technology

Summary

ऑक्सीडेटिव परिवर्तनों के लिए एक सहायक कारक - हम हाइड्रोजन पेरोक्साइड के प्रकाश उत्प्रेरित पीढ़ी के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन।

Abstract

Oxidoreductases सबसे लागू औद्योगिक एंजाइमों के हैं। फिर भी, वे बाहरी इलेक्ट्रॉनों जिनकी आपूर्ति अक्सर महंगा और चुनौतीपूर्ण है की जरूरत है। इलेक्ट्रॉन दाताओं NADH या NADPH के पुनर्चक्रण अतिरिक्त एंजाइम और बलि substrates के उपयोग की आवश्यकता है। दिलचस्प है, कई oxidoreductases इलेक्ट्रॉन दाता के रूप में हाइड्रोजन पेरोक्साइड स्वीकार करते हैं। जबकि सस्ती जा रहा है, इस अभिकर्मक अक्सर एंजाइमों की स्थिरता को कम कर देता है। इस समस्या का समाधान cofactor में सीटू पीढ़ी है। कम एकाग्रता में सहायक कारक की सतत आपूर्ति एंजाइम स्थिरता आई बिना प्रतिक्रिया ड्राइव। इस अखबार के लिए एक विधि दर्शाता प्रकाश उत्प्रेरित हीम निर्भर फैटी एसिड decarboxylase OleT जेई के उदाहरण के साथ हाइड्रोजन पेरोक्साइड के सीटू पीढ़ी में। फैटी एसिड decarboxylase OleT जेई अपनी अनूठी फैटी एसिड होता है, एक अब तक अज्ञात एंजाइमी से लंबी श्रृंखला 1-alkenes उत्पादन करने की क्षमता के कारण की खोज की थीप्रतिक्रिया। 1-alkenes व्यापक रूप से plasticizers और स्नेहक के लिए additives इस्तेमाल कर रहे हैं। OleT जेई ऑक्सीडेटिव डिकार्बोजाइलेशन के लिए हाइड्रोजन पेरोक्साइड से इलेक्ट्रॉनों को स्वीकार करने के लिए दिखाया गया है। हाइड्रोजन पेरोक्साइड हर्जाना एंजाइम और कम पैदावार में परिणाम, सहायक कारक के सीटू पीढ़ी में के अलावा इस समस्या में गतिरोध उत्पन्न है। photobiocatalytic प्रणाली, एंजाइम गतिविधि और उपज के बारे में फैटी एसिड decarboxylation के लिए एक सरल और कुशल प्रणाली है, जिसके परिणामस्वरूप स्पष्ट लाभ से पता चलता है।

Introduction

जलवायु परिवर्तन और अक्षय संसाधनों के निकट कमी हमारे समाज के लिए एक गंभीर खतरा बन गया है। इस संदर्भ में, एंजाइम कटैलिसीस टिकाऊ के विकास और 'हरियाली' रसायन शास्त्र 1 के लिए एक अभी भी पूरी तरह दोहन नहीं संभावित प्रतिनिधित्व करता है। Oxidoreductases परिचय और कार्य समूहों के संशोधन हल्के प्रतिक्रियाओं की शर्तों के तहत उत्प्रेरित और सबसे महत्वपूर्ण biocatalysts 2 के हैं की क्षमता है। अधिकांश redox परिवर्तनों ऐसे NAD (पी) के रूप में एच सहकारकों के बाहरी की आपूर्ति की आवश्यकता है। सहायक कारक के उत्थान के लिए तरीके औद्योगिक पैमाने में लागू किया गया है। हालांकि, वे अभी भी उच्च प्रक्रिया लागत, जो उच्च मूल्य के उत्पादों के लिए ज्यादातर उनके आवेदन की सीमा में परिणाम। दिलचस्प है, कई पराक्सिडेजों 3,4 और P450 monooxygenases 5 तथाकथित पेरोक्साइड अलग धकेलना के माध्यम से हाइड्रोजन पेरोक्साइड से इलेक्ट्रॉनों को स्वीकार करते हैं। जबकि एच 2 ओ 2 एक सस्ते सह अभिकर्मक है, यह कथित harmf हैकई एंजाइमों के लिए उल। सीटू के गठन में एक स्थिर हाइड्रोजन पेरोक्साइड के की कम मात्रा का एक व्यावहारिक दृष्टिकोण एंजाइम के संचालन स्थिरता आई बिना प्रतिक्रिया ड्राइव करने के लिए है।

आकृति 1
चित्रा 1. प्रायोगिक OleT जेई द्वारा फैटी एसिड की photobiocatalytic decarboxylation के सेट-अप। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

रासायनिक और जैविक प्रक्रियाओं के लिए ऊर्जा स्रोत के रूप में प्रकाश का इस्तेमाल पिछले साल 6 में बढ़ती ध्यान प्राप्त किया गया है। हाइड्रोजन पेरोक्साइड के प्रकाश संचालित पीढ़ी एक आसान और मजबूत विधि redox परिवर्तनों (चित्रा 1) के लिए हाइड्रोजन पेरोक्साइड की आपूर्ति करने के रूप में उभरा है। ऐसे adenine सोम पीला रंग के रूप में एक photocatalystonucleotide (FMN) हाइड्रोजन पेरोक्साइड, जो तब एंजाइमी oxyfunctionalization प्रतिक्रिया के लिए सहायक कारक के रूप में इस्तेमाल किया जाता है के लिए आणविक ऑक्सीजन की कमी की अनुमति देता है। संभव इलेक्ट्रॉन दाताओं ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA), एस्कॉर्बेट या सस्ती formiate हैं। विधि एच के लिए आम तौर पर लागू पराक्सिडेजों 3,4 और P450 monooxygenases 5 सहित 2 ओ 2 निर्भर एंजाइमों, है।

हमने हाल ही में olefins 8 में प्राकृतिक वसा के परिवर्तन के लिए एक उपन्यास बैक्टीरियल decarboxylase 7 के आवेदन की जांच की है। यह एक जैव आधारित स्रोत से व्यापक रूप से इस्तेमाल मंच रसायनों के संश्लेषण के लिए एक स्थायी मार्ग होगा। Decarboxylase OleT जेई ग्राम पॉजिटिव जीवाणु Jeotgalicoccus सपा से। फैटी एसिड की ऑक्सीडेटिव डिकार्बोजाइलेशन उत्प्रेरित और रूपों उत्पादों के रूप में 1-alkenes। OleT जेई बारीकी से बैक्टीरियल P450 monooxygenases से संबंधित है और इलेक्ट्रॉनों की जरूरत है चप्रतिक्रिया के लिए ROM हाइड्रोजन पेरोक्साइड।

दुर्भाग्य से, सब्सट्रेट और एंजाइम का एक समाधान करने के लिए एच 2 ओ 2 के अलावा शायद OleT जेई की स्थिरता पर हाइड्रोजन पेरोक्साइड के एक हानिकारक प्रभाव के कारण, कम रूपांतरण और परिणामों के एक गरीब reproducibility में हुई। NADPH-reductase RhFred के साथ एक संलयन प्रोटीन की पीढ़ी फिर भी एक NADPH निर्भर decarboxylation संभव। 9 बनाया, NADPH की ऊंची कीमत और एक लागत प्रभावी उत्थान के लिए वर्तमान सीमित संभावनाओं सस्ता इलेक्ट्रॉन दाताओं की जांच करने के लिए हमें प्रेरित किया। P450 monooxygenases साथ OleT जेई की समानता से प्रेरित होकर, हम एच 2 ओ 2 के आलोक उत्प्रेरित पीढ़ी का इस्तेमाल किया। हम उच्च रूपांतरण (> 95% तक) प्राप्त करने के लिए सेल मुक्त अर्क या शुद्ध एंजाइम समाधान का उपयोग कर प्रसन्न थे।

फैटी एसिड decarboxylation के उदाहरण के साथ, हम प्रकाश संचालित Enzym के लिए एक सामान्य प्रोटोकॉल प्रस्तुतatic redox FMN सहायक कारक के रूप photocatalyst और हाइड्रोजन पेरोक्साइड के रूप में उपयोग करते हुए परिवर्तनों। प्रस्तुत तरीकों ई की पुनः संयोजक सेल में एंजाइम के उत्पादन में शामिल कोलाई, एंजाइम की शुद्धि, 1-alkenes के संश्लेषण और प्रतिक्रिया उत्पादों के विश्लेषण के लिए आवेदन।

Protocol

सावधानी: उपयोग करने से पहले कृपया सभी प्रासंगिक सामग्री सुरक्षा डाटा शीट (MSDS) से परामर्श करें। इन syntheses में प्रयुक्त रसायनों के कई तीव्रता से विषाक्त और कैंसर हैं। हानिकारक कार्बनिक सॉल्वैंट्स, विशेष रूप से प्रतिक्रिया उत्पादों की निकासी और फैटी एसिड की derivatization से जुड़े सभी चरणों का व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (सुरक्षा चश्मा, दस्ताने, प्रयोगशाला कोट, पूर्ण लंबाई पैंट, बंद पैर के जूते का उपयोग कर एक धूआं हुड के तहत बाहर किया जाना चाहिए )। इस काम में आनुवंशिक रूप से संशोधित जीवों से जुड़े सभी आपरेशनों प्रतिष्ठानों कि सुरक्षा के स्तर एस 1 के आनुवंशिक रूप से संशोधित जीवों से निपटने के लिए अनुमोदित कर रहे हैं की आवश्यकता होती है।

1. ई में संयोजक decarboxylase OleT जेई की अभिव्यक्ति कोलाई

  1. उत्पादन तनाव की तैयारी
    1. Jeotgalicoccus से OleT जेई की एक कृत्रिम जीन को तैयार है और अभिव्यक्ति वेक्टर पास्क-IBA37plus के रूप में वर्णित में क्लोन। 8 ध्यान दें: बैक्टीरियल चयापचय, ई से एंजाइमों से फैटी एसिड की गिरावट से बचने के लिए फैटी एसिड गिरावट के लिए एक बेकार मार्ग के साथ कीयो संग्रह से कोलाई तनाव JW5020 इस्तेमाल किया गया था।
  2. खेती और एंजाइम अभिव्यक्ति की प्रेरण
    1. ई inoculating द्वारा एक पूर्व संस्कृति तैयार एक लेग प्लेट टेस्ट ट्यूब में दो 3 मिलीलीटर लेग-माध्यम में (100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर -1 एम्पीसिलीन युक्त) से कोलाई JW5020 OleT उत्परिवर्ती। चयन के लिए माध्यम में एक शेयर के समाधान से पिपेट एम्पीसिलीन (100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर -1) और 180 rpm पर एक मिलाते इनक्यूबेटर में 15 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    2. 1 एल हिला बोतल में, दो 200 मिलीलीटर लेग मध्यम करने के लिए पूर्व संस्कृतियों के 2 मिलीलीटर जोड़ें, जिसमें एम्पीसिलीन (100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर -1)। ऊष्मायन 37 डिग्री सेल्सियस और 180 rpm पर आय।
    3. आयुध डिपो 600nm में परिवर्तन की निगरानी टीका के बाद। आयुध डिपो के 600 0.6 के बीच एक मूल्य तक पहुँच जाता हैडी 0.8 टेट्रासाइक्लिन (0.2 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर -1) जोड़कर अभिव्यक्ति प्रेरित। 20 डिग्री सेल्सियस पर 15 घंटा और 180 आरपीएम के लिए संस्कृतियों सेते हैं।
      नोट: चूंकि OleT जेई एक हीम सहायक कारक होता है, δ-एमिनो एसिड levulinic (0.5 मिमी) प्रेरण से पहले के अलावा सहायक कारक के संश्लेषण के लिए एक अग्रदूत के साथ संस्कृति प्रदान करने की जरूरत है।
  3. कोशिका अपघटन
    1. बर्फ पर निम्न चरणों के बाहर ले। अपकेंद्रित्र ट्यूबों में decanting या pipetting द्वारा संस्कृतियों स्थानांतरण और समान वितरण सुनिश्चित करने के लिए पैमाने का उपयोग करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 12,000 XG पर 20 मिनट के लिए संस्कृतियों अपकेंद्रित्र।
    2. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला त्यागें और pipetting द्वारा 50 मिलीलीटर बफर (Tris 50 मिमी, सोडियम क्लोराइड 200 मिमी, 7.5 पीएच) में छर्रों resuspend और एक शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब में निलंबन हस्तांतरण।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 4000 XG पर 15 मिनट के लिए centrifugation के बाद सतह पर तैरनेवाला त्यागने pipetting द्वारा 3 मिलीग्राम बफर में प्रत्येक गोली resuspend।
    4. इतने से सेल को पूरा करेंबर्फ पर समाधान (तीन चक्रों x 30 सेकंड) चक्र के बीच में एक 1 मिनट ठहराव छोड़ने nicating। अपकेंद्रित्र 4 डिग्री सेल्सियस पर 15,000 XG पर 20 मिनट के लिए समाधान सेल मलबे को हटाने और एक शंक्वाकार centrifugation ट्यूब में pipetting द्वारा गोली परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला हस्तांतरण करने के लिए। गोली त्यागें।
      नोट: एक विलायक अंश biocatalysis के लिए सीधे इस्तेमाल किया जाएगा के बाद छोटे अणुओं को हटा रहे हैं। दूसरे अंश उनकी टैग OleT जेई की शुद्धि के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
  4. सेल के अर्क के छोटे अणुओं का हटाया
    1. biocatalysis में कच्चे तेल निकालने छोटे अणुओं जो हाइड्रोजन पेरोक्साइड गठन या इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 4000 XG पर एक 10 केडीए झिल्ली और सेंट्रीफ्यूज के साथ एक सेंट्रीफ्यूज फिल्टर यूनिट में सेल मुक्त निकालने के 3 मिलीलीटर pipetting द्वारा हस्तक्षेप कर सकता है निकालें का उपयोग करने से पहले। 3 मिलीग्राम Tris एचसीएल बफर में शेष प्रोटीन Resuspend।
  5. OleT की शुद्धि
  6. उनका पुर नी NTA स्पिन स्तंभों, जो संतुलन बफर (Tris 20 मिमी, सोडियम क्लोराइड 300 मिमी, imidazole 10 मिमी) के साथ पहले equilibrated दिया है करने के लिए दूसरे सेल निकालने के 3 मिलीलीटर लागू करें।
  7. नीचे प्लग और ऊपरी पेंच टोपी के साथ स्तंभों को सील करने और उन्हें हल्के से हिला तक राल सेल मुक्त निकालने के साथ समान रूप से वितरित किया जाता है। 4 डिग्री सेल्सियस पर एक उपरि प्रकार के बरतन में 30 मिनट के लिए लोड कॉलम सेते हैं।
  8. 2 मिनट के लिए 700 XG पर centrifuging द्वारा धोने बफर के 1 मिलीलीटर (Tris 20 मिमी, सोडियम क्लोराइड 300 मिमी, imidazole 20 मिमी, 7.4 पीएच) के साथ स्तंभों को धो लें। इस कदम दो बार दोहराएँ।
  9. कॉलम एक ताजा शंक्वाकार centrifugation ट्यूब में रखें और क्षालन बफर के 1 मिलीलीटर (Tris 20 मिमी, सोडियम क्लोराइड 300 मिमी, imidazole 250 मिमी, 7.4 पीएच) OleT जेई जोड़ें। 2 मिनट के लिए 700 XG पर अपकेंद्रित्र और इस कदम को दोहराने के लिए दो बार।
    नोट: Imidazole निकल करने के लिए बाध्य है और इस तरह के कॉलम से OleT जेई को हटा देगा।
  10. एक अपकेंद्रित्र फिल्टर यूनिट को क्षालन स्थानांतरण (10 केडीए मेमbrane) और 4 डिग्री सेल्सियस पर 4000 XG पर अपकेंद्रित्र imidazole हटा दें।
  11. एक एसडीएस पृष्ठ (15%)। 9 मिक्स एक एसडीएस बफर (अंतिम एकाग्रता 1x) के साथ क्षालन के 3 μl द्वारा एंजाइम की शुद्धता की जांच और विकृतीकरण के लिए 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर समाधान सेते हैं। इसके बाद एक एसडीएस पृष्ठ पर कुल राशि लागू होते हैं। 35 मा पर जेल एक वाणिज्यिक प्रोटीन मानक का उपयोग कर चलाएँ। 50 केडीए में प्रोटीन का पता लगाने।
  12. निर्धारित करने के लिए प्रोटीन एकाग्रता एक वाणिज्यिक उपलब्ध बीएसए किट का उपयोग करें। पिपेट पतला प्रोटीन के नमूने के 50 μl एक 96 अच्छी तरह से थाली में और बीएसए मानक (0, 20, 30, 40,50, 60, 80, 100 मिलीग्राम मिलीलीटर -1) (1: 500 100, 1: 200, 1) । , ब्रैडफोर्ड अभिकर्मक के 200 μl जोड़ें fluorimeter के साथ 15 मिनट के बाद 595 एनएम पर absorbance को मापने और मानक वक्र का उपयोग सांद्रता की गणना।

2. हल्के उत्प्रेरित biotransformation

  1. बिना हाइड्रोजन पेरोक्साइड अलावा Biocatalytic प्रतिक्रियाओं
    1. आसुत जल के लिए 10% (वी / वी) tergitol और 0.0284 जी स्टीयरिक अम्ल जोड़कर 10 मिमी स्टीयरिक अम्ल (एम आर 284.5 छ मोल -1) के एक 10 मिलीलीटर शेयर समाधान तैयार है। 60 डिग्री सेल्सियस के लिए एक हीटिंग चैम्बर में समाधान हीट तक फैटी एसिड पूरी तरह से भंग कर रहा है।
    2. Biocatalysis और नमूना
      1. दो 2 मिलीलीटर प्रतिक्रिया 50 मिमी EDTA, 0.01 मिमी FMN, Tris एचसीएल बफर में 0.5 मिमी स्टीयरिक अम्ल युक्त मिश्रण तैयार करें। पर्याप्त ऑक्सीजन की आपूर्ति के लिए एक चुंबकीय सरगर्मी बार जोड़ें और एक पानी के स्नान में ग्लास ट्यूब, 25 डिग्री सेल्सियस तक गर्म जगह है।
      2. प्रतिक्रिया मिश्रण से प्रत्येक के लिए शुद्ध एंजाइम की 200 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर -1 या 10% (वी / वी) सेल मुक्त निकालने जोड़ें और उन्हें प्रतिक्रिया ट्यूबों में से 15 सेमी की दूरी में एक स्पष्ट गिलास प्रकाश बल्ब (120 डब्ल्यू) के साथ रोशन।
      3. विशिष्ट समय बिंदुओं (0, 10, 30, 60 और 120 मिनट और रात में) 20 μl 37% एचसीएल के साथ प्रतिक्रिया को रोकने में 200 μl नमूने ले लो। 5 μl Myristic एसिड जोड़े (10 मिमी शेयर इसलिएआंतरिक मानक के रूप में lution)।
  2. प्रतिक्रिया उत्पादों के विश्लेषण
    1. निकासी के लिए दो बार नमूने के 500 μl एथिल एसीटेट जोड़ने के लिए, पर 13,000 एक्स जी 1 मिनट के लिए ट्यूब और अपकेंद्रित्र पलटना।
    2. सतह पर तैरनेवाला के 400 μl उतारो और विलायक पूरी तरह से लुप्त हो जाना।
    3. (Trimethylsilyl) trifluoro acetamide (MSTFA) - 200 μl एन एन -methyl- जोड़कर trimethylsilylcarboxylic एसिड में कार्बोक्जिलिक एसिड Derivatize। आदेश ethers trimethylsilyl को हाइड्रॉक्सिल समूहों में परिवर्तित करने में 30 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर समाधान सेते हैं।
    4. जीसी / खूंटी द्वारा रूपांतरण का निर्धारण
      नोट:, α- और β-हाइड्रोक्सी stearic एसिड (आरटी: 12.05 और 12.1 मिनट) और कमी सब्सट्रेट (आरटी: 11.15 मिनट): 1-heptadecene (8.34 मिनट आरटी) के गठन का निर्धारण करते जीसी का उपयोग कर / खूंटी।
      1. तापमान प्रोफ़ाइल 340 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट नीचे वर्णित इंजेक्शन तापमान सेट करें। पकड़प्रारंभिक ओवन तापमान 3.5 मिनट के लिए 90 डिग्री सेल्सियस पर है और बाद में 45 डिग्री सेल्सियस मिनट -1 के साथ वृद्धि हुई है। 220 डिग्री सेल्सियस, 2 मिनट के लिए तापमान पकड़ो। 45 डिग्री सेल्सियस मिनट -1 के एक दोहराया वृद्धि के बाद 2 मिनट के लिए 280 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर पकड़ और फिर मिनट -1 60 डिग्री सेल्सियस के साथ वृद्धि हुई है।
        नोट: 330 डिग्री सेल्सियस के अधिकतम तापमान 1.44 मिनट के लिए आयोजित किया जाता है।
      2. तेजी से वाष्पीकरण और वाहक गैस हीलियम के साथ समरूप मिश्रण पाने के लिए 5 का एक विभाजन के अनुपात के साथ, नमूना के 4 μl इंजेक्षन।
        नोट: तापमान में वृद्धि पर निर्भरता में सब्सट्रेट और उत्पादों गैस चरण में प्रवेश करेंगे। पदार्थों विशिष्ट प्रतिधारण समय पर स्तंभ गुजर जाने के बाद जीसी / खूंटी डिटेक्टर से पता चला रहे हैं और स्क्रीन पर चोटियों के रूप में प्रदर्शित कर रहे हैं। मॉनीटर पर चोटी के गठन का निरीक्षण करें।
      3. निम्नलिखित सूत्र द्वारा गठित उत्पाद की एकाग्रता की गणना:
        1 समीकरण नोट: अंशांकन कारक प्रत्येक सब्सट्रेट और derivatized पदार्थों और उनके इसी शिखर क्षेत्र के नाम से जाना जाता मात्रा से मानक वक्र की गणना के द्वारा उत्पाद के लिए इस स्तंभ के लिए विशेष रूप से निर्धारित किया गया है।
    5. जीसी / एमएस द्वारा Olefin और β-हाइड्रोक्सी एसिड चोटियों को पहचानें।
      1. जीसी / एमएस द्वारा Olefin और β-हाइड्रोक्सी एसिड चोटियों को पहचानें। तापमान प्रोफ़ाइल सेट करें। 250 डिग्री सेल्सियस के लिए इंजेक्शन तापमान सेट करें। 5 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर ओवन तापमान पकड़ो और बाद में 20 डिग्री सेल्सियस मिनट -1 के साथ वृद्धि हुई है।
        नोट: अधिकतम तापमान 7.5 मिनट के लिए आयोजित किया जाता है।
      2. 250 डिग्री सेल्सियस के लिए मास स्पेक्ट्रोमीटर डिटेक्टर तापमान सेट और इलेक्ट्रॉन प्रभाव मोड में 50 से 500 मी / z पर स्कैन।
        नोट: इलेक्ट्रॉन प्रभाव आयनीकरण एक कट्टरपंथी केशन जो बड़े पैमाने पर विश्लेषण के लिए आगे पारित हो जाएगा के गठन में जिसके परिणामस्वरूप एक इलेक्ट्रॉन को हटा। भीतर उच्च intramolar ऊर्जा सहसंयोजक बांड के कारणअणु को तोड़ने के निचले मी / z के टुकड़े का निर्माण। ये टुकड़े एक अंगुली की छाप एक पदार्थ के लिए विशेष रूप में।
      3. नमूने के 1 μl इंजेक्षन। बाद इसी फिंगरप्रिंट (चित्रा 2) से 11.4 मिनट प्रतिधारण समय का पता लगाने 1-Heptadecene।

Representative Results

प्रतिक्रिया मिश्रण करने के लिए हाइड्रोजन पेरोक्साइड के अलावा कम में हुई जबकि रूपांतरण (<10%) के लिए उदार, हाइड्रोजन पेरोक्साइड के सीटू पीढ़ी में 80% रूपांतरण करने के लिए रूपांतरण वृद्धि हुई है। जीसी / एमएस द्वारा विश्लेषण फैटी एसिड से olefins के गठन (चित्रा 2) से पता चलता है।

चित्र 2
चित्रा 2 (ए) तापमान जीसी / एमएस के मापन के लिए प्रोफ़ाइल। (बी) के 11.4 मिनट के बाद 1-heptadecene Eluting के फिंगरप्रिंट। (सी) 1-heptadecene के लिए दिखाया गया टर्मिनल olefins अनुकरणीय की विशेषता माध्यमिक सी एन एच 2n-1 टुकड़ा आयनों। यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

ई की सेल मुक्त अर्क के साथ हासिल की कोलाई। एक शुद्ध एंजाइम समाधान एंजाइम एकाग्रता और रूपांतरण के बीच एक स्पष्ट संबंध दिखाया। उच्च रूपांतरण करने के लिए प्रकाश कटाई अणु FMN नेतृत्व की एकाग्रता बढ़ रही है। हालांकि, 10 मिमी ऊपर एकाग्रता बढ़ाने के लिए आगे प्रतिक्रियाओं में तेजी लाने नहीं था, यह दर्शाता है कि हाइड्रोजन पेरोक्साइड की राशि पर्याप्त रूप से उपलब्ध है और अब सीमित कारक।

फैटी एसिड की decarboxylation के अलावा, OleT जेई भी β-स्थिति में एक hydroxylation उत्प्रेरित। स्टीयरिक अम्ल के रूपांतरण में, decarboxylation बारे में तीन बार hydroxylation से भी तेज है। 0.5 मिमी स्टीयरिक अम्ल का एक समाधान और 10 माइक्रोन के FMN का उपयोग कर एक ठेठ प्रयोग में, सब्सट्रेट के 99% के अनुपात के साथ 1-heptadecene और 2-hydroxystearic एसिड का एक मिश्रण में परिवर्तित किया गया3.3: 1 (चित्रा 3) 8। प्रकाश संचालित biocatalysis की सब्सट्रेट स्पेक्ट्रम की एक जांच से पता चला है कि अब एसाइल चेन के साथ फैटी एसिड के लिए, OleT जेई preferentially decarboxylation उत्प्रेरित, जबकि उत्पाद मिश्रण में हाइड्रॉक्सिल फैटी एसिड के रिश्तेदार राशि छोटे श्रृंखला लंबाई के साथ वृद्धि हुई है। फैटी एसिड होता है Myristic एसिड (C14) की तुलना में कम decarboxylation से गुजरना नहीं किया था।

चित्र तीन
चित्रा 3. गैस OleT जेई की chromatographic विश्लेषण 1-heptadecene (8.4 मिनट), α हाइड्रोक्सी स्टीयरिक अम्ल (12.04 मिनट) β-हाइड्रोक्सी stearic एसिड (12.1 मिनट) में स्टीयरिक अम्ल (11.15 मिनट) की decarboxylation मध्यस्थता। 2 घंटे की समय पाठ्यक्रम पर ले लिया नमूनों से शिखर क्षेत्रों के परिवर्तन दिखाया गया है। होड़ करने के लिए यहाँ क्लिक करेंयह आंकड़ा की वा बड़ा संस्करण।

हैरानी की बात है, असंतृप्त एसिड ओलिक एसिड (C18: 1d9 सीआईएस) और लिनोलेनिक एसिड (C18: 2d9d12) substrates के रूप में स्वीकार नहीं किया गया है, यह दर्शाता है कि सीआईएस डबल बांड के मुड़ विन्यास एंजाइम में एक उत्पादक बंधन मोड में समायोजित नहीं किया जा सकता। ओलिक एसिड (10%) के अलावा भी स्टीयरिक अम्ल के रूपांतरण को रोका। दिलचस्प है, स्टीयरिक अम्ल (C18: 1d9 ट्रांस) OleT जेई द्वारा परिवर्तित, फिर भी थोड़ा कम गतिविधि तो स्टीयरिक अम्ल के साथ किया गया था।

Discussion

हाइड्रोजन पेरोक्साइड की रोशनी से चलने वाली पीढ़ी के एक रेंज redox परिवर्तनों के लिए लागू किया जा सकता है, peroxygenases 3 सहित, chloroperoxidases 10 और P450 monooxygenases 5। यह एक आसान और साध्य दृष्टिकोण है। लंबे समय में, दृश्य प्रकाश का उपयोग रासायनिक परिवर्तनों के लिए सूरज की रोशनी है, जो ऊर्जा से भरपूर प्रतिक्रियाओं के लिए एक स्थायी विकल्प है का उपयोग करने के परिप्रेक्ष्य को खोलता है।

विधि शुद्ध एंजाइम के साथ या सेल मुक्त निकालने के साथ लागू है। बाद कम लागत और मेहनत की आवश्यकता है, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कच्चे तेल निकालने में छोटे अणुओं प्रकाश उत्प्रेरित रूपांतरण के साथ हस्तक्षेप कर सकता है। एक साध्य दृष्टिकोण (एक केन्द्रापसारक फिल्टर यूनिट में या डायलिसिस से, यानी centrifugation द्वारा) एक micromembrane के साथ इन छोटे घटकों को दूर करने के लिए है। प्रकाश कटाई अणु FMN की एकाग्रता हाइड्रोजन पेरोक्साइड की एकाग्रता निर्धारित करता है। AFFINI पर निर्भर करता हैoxidoreductase की Ty, इस एकाग्रता एंजाइमी गतिविधि के लिए निर्णायक है। एक अन्य महत्वपूर्ण कारक बलि इलेक्ट्रॉन दाता EDTA की एकाग्रता है। सबसे महत्वपूर्ण पैरामीटर है, तथापि, परिचालन स्थिरता और एंजाइम की गतिविधि है।

फैटी एसिड की olefinization olefins कि रसायन उद्योग के लिए प्रमुख वस्तुओं के हैं में जैव आधारित फैटी एसिड के रूपांतरण के लिए एक सुंदर प्रतिक्रिया है। प्रकाश संचालित biocatalytic decarboxylation कमरे के तापमान पर और तटस्थ पीएच, जो स्थिरता के संदर्भ में स्पष्ट लाभ प्रदान करता है पर बाहर किया जा सकता है।

हमारे परिणाम बताते हैं हाइड्रोजन पेरोक्साइड के सीटू पीढ़ी में एक रणनीति एंजाइम स्थिरता आई बिना cofactor आपूर्ति करने के लिए एक उच्च रूपांतरण के लिए अग्रणी है। सहायक कारक के उत्थान के लिए वर्तमान तरीकों कृषि उत्पादों या पेट्रोल आधारित रसायन का उपयोग करें। प्रकाश संचालित प्रतिक्रियाओं अक्षय विकल्प के रूप में उभर रहे हैं। भविष्यअनुसंधान सस्ता अणुओं द्वारा बलि अभिकर्मक EDTA के प्रतिस्थापन के लिए तरीकों को समर्पित किया जाएगा और प्रकाश कटाई अणु FMN की मात्रा को कम करने के लिए।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Ampicillin Sigma Aldrich 69-52-3
Bradford reagent Roth K015.1
BSA Sigma Aldrich 90604-29-8
DMSO Sigma Aldrich 67-68-5
Ethyl acetate Fisher Chemical 141-78-6
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Roth 8043.1
Riboflavin 5-monophosphate sodium salt hydrate Sigma Aldrich 130-40-5
Hydrochlorid acid 37% Sigma Aldrich 7647-01-0
Hydrogen peroxide 30% Sigma Aldrich 7722-84-1
δ-Amino levulinic acid Sigma Aldrich 5451-09-2
N-Methyl-N-(Trimethylsilyl)trifluoro acetamide (MSTFA) Sigma Aldrich 24589-78-4
Myristic acid >99% Sigma Aldrich 208-875-2 
Imidazole Sigma Aldrich 288-32-4
Sodium chloride Fisher Chemical 7647-14-5
Stearic acid >99% Sigma Aldrich 57-11-4
Tetracycline Sigma Aldrich 60-54-8 
Tergitol Sigma Aldrich MFCD01779855 
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan Sigma Aldrich 77-86-1
Device
Incubator shaker G-25CK New Brunswick Scientific
Ecotron Infors HT
Centrifugation Labofuge 400R Heraeus
RC 5B Plus Sorvall
Fresco 17 Thermo Scientific
Centrifugation rotors SS34 Sorvall
SLA Sorvall
Clean bench Envirco Ceag Schirp Reinraum technik
Column GC-FID  CP-Sil 5CB (30 m x 0.25 mm x 0.25 µm)  Agilent Technologies
Column GC-MS FactorFour Capillary Coloumn (VF-5 ms + 5 m EZ Guard)  Varian
GC-FID GC-2010 plus Shimadzu
GC-MS IST-40 Varian
Magnetic stirrer RCT classic IKA
pH meter SevenEasy Mettler toledo
Sonicator Branson Sonifier 250 Branson
Spectral photometer FLUOstar Omega BMG Labtech
Equipment
Affinity chromatography column His Pur Ni-NTA spin column Thermo Scientific
Centricon Vivaspin turbo 15 VWR International
Microtiter plates 96 Well Multiply®PCR Plates Sarstedt

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kourist, R., Domìnguez de Marìa, P., Miyamoto, K. Biocatalytic strategies for the asymmetric synthesis of profens - recent trends and developments. Green Chem. , 2607-2618 (2011).
  2. Holtmann, D., Fraaije, M. W., Arends, I. W., Opperman, D. J., Hollmann, F. The taming of oxygen: biocatalytic oxyfunctionalisations. Chemical Comm. 50, 13180-13200 (2014).
  3. Churakova, E., et al. Specific photobiocatalytic oxyfunctionalization reactions. Ang. Chem. In. Ed. 123, 10904-10907 (2011).
  4. Hollmann, F., Arends, I., Buehler, K. Biocatalytic Redox Reactions for Organic Synthesis: Nonconventional Regeneration Methods. ChemCatChem. 2, 762-782 (2010).
  5. Girhard, M., Kunigk, E., Tihovsky, S., Shumyantseva, V. V., Urlacher, V. B. Light-driven biocatalysis with cytochrome P450 peroxygenases. Biotechnol. Appl. Biochem. 60, 111-118 (2013).
  6. Bartsch, M., et al. Photosynthetic production of enantioselective biocatalysts. Microb. Cell. Fact. 14, 53 (2015).
  7. Rude, M. A., et al. Terminal olefin (1-alkene) biosynthesis by a novel P450 fatty acid decarboxylase from Jeotgalicoccus species. Appl. Environ. Microbiol. 77, 1718-1727 (2011).
  8. Zachos, I., et al. Photobiocatalytic decarboxylation for olefin synthesis. Chem. Comm. 51, 1918-1921 (2015).
  9. Liu, Y., et al. Hydrogen peroxide-independent production of α-alkenes by OleTJE P450 fatty acid decarboxylase. Biotechnol. Biofuels. 7, 28 (2014).
  10. Perez, D. I., Grau, M. M., Arends, I. W., Hollmann, F. Visible light-driven and chloroperoxidase-catalyzed oxygenation reactions. Chem. Comm. 40 (44), 6848-6850 (2009).

Tags

रसायन विज्ञान अंक 111 biocatalysis लाइट-कटैलिसीस हाइड्रोजन पेरोक्साइड decarboxylase ग्रीन कैमिस्ट्री सहायक कारक पीढ़ी
प्रकाश संचालित एंजाइमी decarboxylation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Köninger, K., Grote, M.,… More

Köninger, K., Grote, M., Zachos, I., Hollmann, F., Kourist, R. Light-driven Enzymatic Decarboxylation. J. Vis. Exp. (111), e53439, doi:10.3791/53439 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter