Summary
نحن تصف بروتوكول للجيل المحفزة خفيفة من بيروكسيد الهيدروجين - عامل مساعد للتحولات الأكسدة.
Abstract
إنزيم أكسدة-اختزال تنتمي إلى الانزيمات الصناعية الأكثر تطبيقها. ومع ذلك، فإنها تحتاج الإلكترونات الخارجية التي إمدادات غالبا ما تكون مكلفة وصعبة. إعادة تدوير NADH الجهات المانحة الإلكترون أو NADPH يتطلب استخدام الانزيمات إضافية وركائز فداء. ومن المثير للاهتمام، عدة إنزيم أكسدة-اختزال تقبل بيروكسيد الهيدروجين متبرع الإلكترون. في حين يجري غير مكلفة، وهذا كاشف غالبا ما يقلل من الاستقرار من الإنزيمات. والحل لهذه المشكلة هو الجيل الموقع من العامل المساعد في. على امدادات مستمرة من العامل المساعد في تركيز منخفض يدفع رد الفعل دون المساس الاستقرار الانزيم. توضح هذه الورقة طريقة لضوء المحفز في مجال توليد الموقعي من بيروكسيد الهيدروجين مع مثال كربوكسيل الأحماض الدهنية التي تعتمد على الهيم OleT JE. تم اكتشاف الأحماض الدهنية كربوكسيل OleT JE بسبب قدرتها الفريدة على إنتاج سلسلة طويلة-1-الألكينات من الأحماض الدهنية، والأنزيمية غير معروف حتى الآنرد فعل. وتستخدم على نطاق واسع 1-الألكينات المضافة لصناعة المواد البلاستيكية ومواد التشحيم. وقد تبين OleT JE لقبول الإلكترونات من بيروكسيد الهيدروجين لنزع الكربوكسيل التأكسدي. بينما إضافة الهيدروجين بيروكسيد الأضرار الانزيم والنتائج في العائدات المنخفضة، في جيل الموقع من العامل المساعد تلتف هذه المشكلة. ويبين النظام photobiocatalytic مزايا واضحة بشأن نشاط انزيم والعائد، مما أدى إلى نظام بسيط وفعال لنزع الكربوكسيل الأحماض الدهنية.
Introduction
تغير المناخ واستنزاف المنظور من الموارد المتجددة يشكل تهديدا خطيرا لمجتمعنا. في هذا السياق، يمثل انزيم الحفز إمكانية تزال غير مستغلة بالكامل لتنمية مستدامة و'خضرة' الكيمياء 1. إنزيم أكسدة-اختزال لديها القدرة على تحفيز إدخال وتعديل المجموعات الوظيفية في ظل ظروف ردود الفعل خفيفة وتنتمي إلى البيولوجية الحفازة أهم 2. تتطلب معظم التحولات الأكسدة توريد الخارجية من العوامل المساعدة مثل NAD (P) H. طبقت أساليب لتجديد العامل المساعد في نطاق صناعي. ومع ذلك، فإنها لا تزال تؤدي إلى تكاليف عملية عالية، مما يحد من تطبيقها في معظمها إلى منتجات عالية القيمة. ومن المثير للاهتمام، والعديد من مستخلصات 3،4 وmonooxygenases P450 5 تقبل الإلكترونات من بيروكسيد الهيدروجين عن طريق ما يسمى تحويلة بيروكسيد. بينما H 2 O 2 هي رخيصة المشارك كاشف، فإنه يقال harmfالمجاهدين للعديد من الإنزيمات. وثابت في تشكيل الموقعي تركيزات منخفضة من بيروكسيد الهيدروجين هو نهج عملي لحملة رد الفعل دون أن ينال من الاستقرار التشغيلي للإنزيم.
الشكل 1. التجريبية مجموعة المتابعة لنزع الكربوكسيل photobiocatalytic من الأحماض الدهنية التي كتبها OleT JE. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
استخدام الضوء كمصدر للطاقة لعمليات كيميائية وبيولوجية تم باهتمام متزايد في السنوات الأخيرة 6. وقد برز جيل ضوء يحركها من بيروكسيد الهيدروجين باعتباره طريقة سهلة وقوية لتزويد بيروكسيد الهيدروجين لتحولات الأكسدة (الشكل 1). وضوئي مثل فلافين الأدينين مونonucleotide (FMN) يسمح للالحد من الأوكسجين الجزيئي لبيروكسيد الهيدروجين، والتي يتم بعد ذلك استخدام العامل المساعد للتفاعل الإنزيمي oxyfunctionalization. الجهات المانحة الإلكترون الممكنة ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA)، أسكوربات أو formiate غير مكلفة. طريقة قابلة للتطبيق بشكل عام لH 2 O 2 الانزيمات معتمد على، بما في ذلك مستخلصات 3،4 وmonooxygenases P450 5.
لقد حققت مؤخرا تطبيق كربوكسيل البكتيرية رواية (7) لتحويل الدهون الطبيعية في الأوليفينات 8. وهذا سيكون طريقا المستدام لتركيب المواد الكيميائية منصة تستخدم على نطاق واسع من مصدر الحيوي القائم. وكربوكسيل OleT JE من البكتيريا Jeotgalicoccus س إيجابية الجرام. يحفز نزع الكربوكسيل التأكسدي من الأحماض الدهنية ويشكل 1-الألكينات عن المنتجات. يرتبط OleT JE ارتباطا وثيقا monooxygenases P450 البكتيرية ويحتاج الإلكترونات ومدمج بيروكسيد الهيدروجين للتفاعل.
للأسف، أدت إضافة H 2 O 2 إلى حل الركيزة والانزيم في التحويلات منخفضة واستنساخ سوء النتائج، ويفترض بسبب تأثير ضار من بيروكسيد الهيدروجين على استقرار OleT JE. جيل من البروتين الانصهار مع NADPH اختزال RhFred إجراء نزع الكربوكسيل تعتمد على NADPH ممكن. 9 ومع ذلك، فإن ارتفاع أسعار NADPH والإمكانيات المحدودة الحالية لتجديد فعالة من حيث التكلفة دفعنا للتحقيق المانحين الإلكترون أرخص. مستوحاة من تشابه OleT JE مع monooxygenases P450، كنا الجيل المحفزة خفيفة من H 2 O 2. كنا سعداء للحصول على تحويلات عالية (تصل إلى> 95٪) باستخدام مقتطفات خالية من الخلايا أو حلول الانزيم النقاء.
مع المثال من الأحماض الدهنية نزع الكربوكسيل، نقدم بروتوكول عام لانزيمات يحركها الضوءآتيك الأكسدة التحولات باستخدام FMN كما ضوئي والهيدروجين بيروكسيد كما العامل المساعد. وتشمل طرق عرض إنتاج الإنزيم في الخلية المؤتلف من E. القولونية، وتنقية للانزيم، وتطبيق لتركيب 1-الألكينات وتحليل نواتج التفاعل.
Protocol
تنبيه: يرجى التشاور مع جميع بيانات سلامة المواد ذات الصلة (MSDS) قبل الاستخدام. العديد من المواد الكيميائية المستخدمة في هذه التوليفات هي شديدة السمية ومسرطنة. يجب أن تتم جميع الخطوات التي تنطوي على المذيبات العضوية الضارة، وخاصة استخراج منتجات التفاعل واشتقاق من الأحماض الدهنية تحت غطاء الدخان باستخدام معدات الحماية الشخصية (النظارات الواقية والقفازات ومعطف المختبر، والسراويل كامل طول والأحذية المغلقة اصبع القدم ). جميع العمليات التي تنطوي على الكائنات المعدلة وراثيا في هذا العمل تتطلب المنشآت التي تمت الموافقة عليها للتعامل مع الكائنات المعدلة وراثيا من S1 مستوى السلامة.
1. التعبير عن المؤتلف كربوكسيل OleT JE في E. القولونية
- إعداد سلالة إنتاج
- إعداد الجينات الاصطناعية من OleT JE من Jeotgalicoccus والمستنسخة في ناقلات التعبير باسك-IBA37plus كما هو موضح 8 ملاحظة: لتجنب تدهور الأحماض الدهنية من الانزيمات من عملية التمثيل الغذائي البكتيري، E. تم استخدام كولاي سلالة JW5020 من مجموعة كيو مع مسار مختلة لتدهور الأحماض الدهنية.
- زراعة وتحريض التعبير عن الانزيمات
- إعداد الثقافة قبل، فحقن هاء القولونية JW5020 OleT متحولة من LB لوحة (تحتوي على 100 ميكروغرام مل -1 الأمبيسلين) في اثنين من 3 مل LB المتوسطة في أنابيب الاختبار. ماصة الأمبيسلين (100 ميكروغرام مل -1) من محلول المخزون في المتوسط لاختيار واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 15 ساعة في حاضنة تهتز في 180 دورة في الدقيقة.
- إضافة 2 مل من الثقافات السابقة لمدة 200 مل LB المتوسطة، التي تحتوي على الأمبيسلين (100 ميكروغرام مل -1)، في 1 قوارير L هزة. العائدات الحضانة عند 37 درجة مئوية و 180 دورة في الدقيقة.
- مراقبة التغيير في ل 600Nm OD بعد التلقيح. عندما OD 600 تصل قيمة بين 0.6 إلىد 0.8 لحث على التعبير عن طريق إضافة التتراسيكلين (0.2 ميكروغرام مل -1). احتضان الثقافات لمدة 15 ساعة على 20 درجة مئوية و 180 دورة في الدقيقة.
ملاحظة: منذ OleT JE يحتوي على العامل المساعد الهيم، لا بد من إضافة حمض الليفولينيك δ الأمينية (0.5 ملم) قبل الحث على تقديم الثقافة مع تمهيدا لتخليق العامل المساعد.
- تحلل الخلية
- تنفيذ الخطوات التالية على الجليد. نقل الثقافات التي كتبها الصب أو pipetting لفي أنابيب الطرد المركزي واستخدام مقياس لضمان التوزيع العادل. أجهزة الطرد المركزي الثقافات لمدة 20 دقيقة في 12000 x ج في 4 درجات مئوية.
- بعناية تجاهل طاف و resuspend الكريات في 50 مل العازلة (تريس 50 مم، كلوريد الصوديوم 200 ملم، ودرجة الحموضة 7.5) من قبل pipetting ونقل تعليق في أنبوب الطرد المركزي مخروطي.
- بعد الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 4000 x ج في 4 درجات مئوية تجاهل طاف، resuspend كل بيليه في 3 مل العازلة من قبل pipetting.
- أداء تحلل الخلية التي كتبها sonicating الحلول على الجليد (ثلاث دورات × 30 ثانية) ترك وقفة 1 دقيقة في فترة ما بين الدورات. الطرد المركزي الحلول لمدة 20 دقيقة في 15000 x ج في 4 درجات مئوية لإزالة الحطام خلية ونقل طاف في أنبوب الطرد المركزي مخروطي الشكل من دون إزعاج بيليه من قبل pipetting. تجاهل بيليه.
ملاحظة: سيتم استخدام واحد جزء المذيبات مباشرة لbiocatalysis بعد إزالة جزيئات صغيرة. سيتم استخدام جزء ثان لتنقية OleT JE صاحب الموسومة.
- إزالة جزيئات صغيرة من الخلايا مقتطفات
- قبل استخدام استخراج النفط الخام في biocatalysis إزالة الجزيئات الصغيرة التي قد تتداخل مع تشكيل بيروكسيد الهيدروجين أو نقل الإلكترون من قبل pipetting 3 مل من مستخلص خالية من الخلايا في وحدة تصفية الطرد المركزي مع 10 غشاء كيلو دالتون وأجهزة الطرد المركزي في 4000 x ج في 4 درجات مئوية. Resuspend والبروتين المتبقية في 3 مل تريس، حمض الهيدروكلوريك العازلة.
- تنقية OleT
- تطبيق 3 مل من استخراج الخلايا الثاني لصاحب بور ني NTA أعمدة الدوران، والتي تم معايرتها قبل العازلة مع موازنة (تريس 20 مم، كلوريد الصوديوم 300 ملم، ايميدازول 10 ملم).
- ختم الأعمدة مع المقابس السفلية والعلوية المسمار قبعات ويهز لهم برفق حتى يتم توزيع الراتنج على قدم المساواة مع استخراج خالية من الخلايا. احتضان الأعمدة تحميل لمدة 30 دقيقة في شاكر النفقات العامة في 4 درجات مئوية.
- غسل الأعمدة مع 1 مل من غسل العازلة (تريس 20 مم، كلوريد الصوديوم 300 ملم، ايميدازول 20 ملم، ودرجة الحموضة 7.4) بواسطة الطرد المركزي في 700 x ج لمدة 2 دقيقة. كرر هذه الخطوة مرتين.
- وضع الأعمدة في أنبوب الطرد المركزي المخروطية الطازجة وإضافة 1 مل من شطف العازلة (تريس 20 مم، كلوريد الصوديوم 300 ملم، ايميدازول 250 ملم، ودرجة الحموضة 7.4) OleT JE. أجهزة الطرد المركزي في 700 x ج لمدة 2 دقيقة وكرر هذه الخطوة مرتين.
ملاحظة: سوف إيميدازول ربط النيكل، وبالتالي إزالة OleT JE من العمود. - نقل شطف إلى وحدة تصفية الطرد المركزي (10 كيلو دالتون الفنزويليةالغشاء) وأجهزة الطرد المركزي في 4000 x ج في 4 درجات مئوية لإزالة ايميدازول.
- تحقق نقاء الانزيم من قبل SDS-الصفحة (15٪). 9 مزيج 3 ميكرولتر من شطف مع SDS العازلة (تركيز 1X النهائي)، واحتضان الحل في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتمسخ. تطبيق في وقت لاحق المبلغ الإجمالي على SDS-الصفحة. تشغيل هلام في 35 مللي أمبير باستخدام معيار البروتين التجاري. اكتشاف بروتين في 50 كيلو دالتون.
- لتحديد تركيز البروتين يستخدم التجارية المتاحة BSA-عدة. ماصة 50 ميكرولتر من عينات البروتين المخفف (1: 100، 1: 200، 1: 500) ومستوى BSA (0، 20، 30، 40،50، 60، 80، 100 ملغ مل -1) في لوحة 96-جيدا . إضافة 200 ميكرولتر من برادفورد الكاشف، قياس الامتصاصية في 595 نانومتر بعد 15 دقيقة مع مقياس التألق وحساب تركيزات باستخدام المنحنى القياسي.
2. التحول الأحيائي الضوء المحفز
- ردود الفعل Biocatalytic دون إضافة بيروكسيد الهيدروجين
- يعد حل 10 مل الأسهم من 10 ملي حمض دهني (M ص 284.5 غرام مول -1) وذلك بإضافة 10٪ (ت / ت) tergitol و0.0284 غرام حامض دهني إلى الماء المقطر. الحرارة الحل في غرفة التدفئة إلى 60 درجة مئوية حتى يذوب الأحماض الدهنية تماما.
- Biocatalysis وأخذ العينات
- إعداد اثنين 2 مل مخاليط رد فعل تحتوي على 50 ملي EDTA، 0.01 ملي FMN، 0.5 ملي حمض دهني في تريس، حمض الهيدروكلوريك العازلة. إضافة شريط التحريك المغناطيسي لتوفير ما يكفي من الأوكسجين ووضع أنابيب الزجاج في حمام مائي، تسخينها إلى درجة حرارة 25 درجة مئوية.
- إضافة 200 ميكروغرام مل -1 انزيم المنقى أو 10٪ (ت / ت) استخراج خالية من الخلايا لكل من خليط التفاعل وتضيء لهم لمبة ضوء الزجاج واضحة (120 W) في 15 سم المسافة بين أنابيب رد فعل.
- أخذ 200 عينة ميكرولتر في نقطة زمنية محددة (0، 10، 30، 60، و 120 دقيقة، وأكثر من ليلة) وقف رد الفعل مع 20 ميكرولتر 37٪ حمض الهيدروكلوريك. إضافة 5 ميكرولتر حمض الميريستيك (10 ملي الأسهم حتىlution) وفقا لمعايير الداخلي.
- تحليل المنتجات رد فعل
- لاستخراج إضافة 500 ميكرولتر خلات الإيثيل للعينات مرتين، عكس الأنابيب وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 13000 ز س.
- خلع 400 ميكرولتر من طاف والسماح للمذيب تتبخر تماما.
- Derivatize الأحماض الكربوكسيلية إلى حمض trimethylsilylcarboxylic بإضافة 200 ميكرولتر N السلفون N - (trimethylsilyl) trifluoro اسيتاميد (MSTFA). احتضان الحل عند 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة من أجل تحويل مجموعات الهيدروكسيل إلى trimethylsilyl الاسترات.
- تقرير من التحويل عن طريق GC / ااا
ملاحظة: تحديد تشكيل 1-heptadecene (RT: 8.34 دقيقة)، حامض دهني ألفا و-β هيدروكسي (RT: 12.05 و 12.1 دقيقة) وانخفاض الركيزة (RT: 11.15 دقيقة) باستخدام GC / ااا.- ضبط الوضع في درجة الحرارة هو موضح أدناه مجموعة من درجة حرارة الحقن إلى 340 درجة مئوية. عقددرجة حرارة الفرن الأولية في 90 درجة مئوية لمدة 3.5 دقيقة، وبعد ذلك مع زيادة 45 ° C دقيقة -1. في 220 درجة مئوية، مع الاستمرار على درجة الحرارة لمدة 2 دقيقة. بعد زيادة المتكررة من 45 درجة مئوية دقيقة -1، مع الاستمرار على درجة حرارة 280 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ثم زيادة مع 60 ° C دقيقة -1.
ملاحظة: درجة الحرارة القصوى 330 درجة مئوية يقام لل1،44 دقيقة. - حقن 4 ميكرولتر من العينة، مع نسبة الانقسام من 5 للحصول على التطاير السريع وخلط متجانس مع الهيليوم الغاز الناقل.
ملاحظة: في الاعتماد على درجات الحرارة وزيادة الركيزة ومنتجات سيدخل مرحلة الغاز. تم الكشف عن المواد التي GC / ااا كاشف بعد اجتياز عمود في بعض الأحيان الاحتفاظ محددة ويتم عرضها كما القمم التي تظهر على الشاشة. مراقبة تشكيل الذروة على الشاشة. - حساب تركيز المنتج يتكون من الصيغة التالية:
ملاحظة: تم تحديد عامل المعايرة خصيصا لهذا العمود لكل الركيزة والمنتج عن طريق حساب منحنى قياسي من كميات معروفة من المواد derivatized ومنطقة ذروة المقابلة.
- ضبط الوضع في درجة الحرارة هو موضح أدناه مجموعة من درجة حرارة الحقن إلى 340 درجة مئوية. عقددرجة حرارة الفرن الأولية في 90 درجة مئوية لمدة 3.5 دقيقة، وبعد ذلك مع زيادة 45 ° C دقيقة -1. في 220 درجة مئوية، مع الاستمرار على درجة الحرارة لمدة 2 دقيقة. بعد زيادة المتكررة من 45 درجة مئوية دقيقة -1، مع الاستمرار على درجة حرارة 280 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ثم زيادة مع 60 ° C دقيقة -1.
- تحديد القمم حمض أولفين وβ هيدروكسي بواسطة GC / MS.
- تحديد القمم حمض أولفين وβ هيدروكسي بواسطة GC / MS. ضبط الوضع في درجة الحرارة. ضبط درجة الحرارة حقن إلى 250 درجة مئوية. عقد درجة حرارة الفرن إلى 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وبعد ذلك زيادة مع 20 ° C دقيقة -1.
يقام الحد الأقصى لدرجة الحرارة لمدة 7.5 دقيقة: ملاحظة. - تعيين الجماعية درجة الحرارة مطياف كاشف إلى 250 درجة مئوية، ومسح على 50 إلى 500 م / ض في وضع تأثير الإلكترون.
ملاحظة: الكترون تأثير التأين يزيل الكترون واحد مما أدى إلى تشكيل الموجبة الراديكالية التي سيتم تمريرها إلى الأمام للتحليل الشامل. نظرا لروابط تساهمية الطاقة intramolar عالية داخلكسر جزيء خلق شظايا أقل م / ض. هذه الشظايا تشكل بصمة محددة للمادة. - حقن 1 ميكرولتر من العينة. كشف 1-Heptadecene بعد 11.4 دقيقة الوقت الاحتفاظ من قبل بصمة المقابلة (الشكل 2).
- تحديد القمم حمض أولفين وβ هيدروكسي بواسطة GC / MS. ضبط الوضع في درجة الحرارة. ضبط درجة الحرارة حقن إلى 250 درجة مئوية. عقد درجة حرارة الفرن إلى 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وبعد ذلك زيادة مع 20 ° C دقيقة -1.
ملاحظة: تم تحديد عامل المعايرة خصيصا لهذا العمود لكل الركيزة والمنتج عن طريق حساب منحنى قياسي من كميات معروفة من المواد derivatized ومنطقة ذروة المقابلة. Representative Results
في حين أدت إضافة بيروكسيد الهيدروجين لخليط التفاعل في منخفض إلى متوسط التحويلات (<10٪)، في جيل الموقعي من بيروكسيد الهيدروجين زيادة تحويل ما يصل الى تحويل 80٪. تحليل من قبل GC / MS يظهر تشكيل الأوليفينات من الأحماض الدهنية (الشكل 2).
الشكل 2. (أ) لمحة درجة الحرارة لقياس GC / MS. (ب) بصمة ليبلغ حجمه 1-heptadecene بعد 11.4 دقيقة. (C) المميزة الثانوية أيونات C ن H 2N-1 جزء من الأوليفينات محطة نموذجية تعرض ل1-heptadecene. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
-together.within الصفحات = "1"> إن رد الفعل المحفز خفيفة تحقيق التحويلات عالية مع مقتطفات خالية من الخلايا من E. القولونية. وأظهر حل انزيم المنقى وجود علاقة واضحة بين تركيز الانزيم والتحويل. زيادة تركيز ضوء حصاد جزيء FMN تؤدي إلى تحويلات أعلى. ومع ذلك، زيادة تركيز أعلى من 10 ملي لا زيادة تسريع وتيرة ردود الفعل، مشيرا إلى أن كمية بيروكسيد الهيدروجين متاح بما فيه الكفاية وأنه لم يعد العامل المحدد.
وبالإضافة إلى نزع الكربوكسيل من الأحماض الدهنية، OleT JE أيضا يحفز على الهيدروكسيل في β-الموقف. في تحويل حامض دهني، ونزع الكربوكسيل حوالي ثلاث مرات أسرع من الهيدروكسيل. في تجربة نموذجية باستخدام محلول من 0.5 ملي حمض دهني و 10 ميكرومتر FMN، تم تحويل 99٪ من الركيزة إلى خليط من 1 heptadecene وحمض 2-hydroxystearic مع نسبة3.3: 1 (الشكل 3) 8. وأظهر التحقيق من الطيف الركيزة للbiocatalysis يقودها ضوء أن للأحماض الدهنية مع سلاسل أسيل أطول، OleT JE يحفز تفضيلي نزع الكربوكسيل، في حين زادت كمية النسبي للأحماض الدهنية الهيدروكسيل في خليط المنتجات مع أقصر طول السلسلة. لم الأحماض الدهنية أقصر من حمض الميريستيك (C14) لا تخضع لنزع الكربوكسيل.
الشكل 3. الغاز التحليل الكروماتوغرافي من OleT JE بوساطة نزع الكربوكسيل من حمض دهني (11.15 دقيقة) إلى 1-heptadecene (8.4 دقيقة)،-α هيدروكسي حمض دهني (12.04 دقيقة)، β هيدروكسي حمض دهني (12.1 دقيقة). ويظهر التغير في المناطق الذروة من العينات التي أخذت أكثر من الوقت طبعا من 2 ساعة. يرجى النقر هنا للتنافسوا نسخة أكبر من هذا الرقم.
والمثير للدهشة، والأحماض غير المشبعة حمض الأوليك (C18: 1d9 رابطة الدول المستقلة) وحمض اللينوليك (C18: 2d9d12) لم تقبل بمثابة ركائز، مشيرا إلى أن التكوين الملتوية روابط مزدوجة رابطة الدول المستقلة لا يمكن استيعابها في وضع ملزم منتجة في الانزيم. إضافة حمض الأوليك (10٪) أيضا منع تحويل حمض دهني. ومن المثير للاهتمام، حامض دهني: تم تحويل (C18 1d9 العابرة) من خلال OleT JE، ولكن مع انخفاض النشاط قليلا ثم حامض دهني.
Discussion
الجيل مدفوعة خفيفة من بيروكسيد الهيدروجين يمكن تطبيقها لتحولات نطاق الأكسدة، بما في ذلك peroxygenases 3، chloroperoxidases 10 و P450 monooxygenases 5. وهو نهج سهل وعملي. وعلى المدى الطويل، واستخدام الضوء المرئي يفتح منظور للاستفادة من أشعة الشمس لمدة التحولات الكيميائية، وهو بديل مستدام لردود الفعل الغنية بالطاقة.
والطريقة تنطبق مع انزيم النقي أو مع استخراج خالية من الخلايا. في حين أن هذا الأخير يتطلب أقل تكلفة والعمل، وتجدر الإشارة إلى أن الجزيئات الصغيرة في استخراج النفط الخام قد تتداخل مع تحويل ضوء المحفز. نهج عملي لإزالة هذه المكونات الصغيرة مع micromembrane (أي عن طريق الطرد المركزي في وحدة تصفية الطرد المركزي أو عن طريق غسيل الكلى). تركيز جزيء ضوء حصاد FMN يحدد تركيز بيروكسيد الهيدروجين. اعتمادا على AFFINIتاي من مؤكسدة مختزلة، وهذا التركيز هو الحاسم في النشاط الأنزيمي. عامل آخر مهم هو تركيز الذبيحه EDTA المانحة الإلكترون. المعلمة الأكثر أهمية، ومع ذلك، هو الاستقرار التشغيلي ونشاط الإنزيم.
وolefinization من الأحماض الدهنية غير رد فعل أنيقة لتحويل الأحماض الدهنية الحيوية ومقرها في الأوليفينات التي تنتمي إلى السلع الرئيسية للصناعات الكيماوية. يمكن أن يتم biocatalytic نزع الكربوكسيل يحركها الضوء في درجة حرارة الغرفة وفي محايد الرقم الهيدروجيني، والذي يوفر مزايا واضحة من حيث الاستدامة.
وتشير النتائج التي توصلنا إليها في الجيل الموقعي من بيروكسيد الهيدروجين هو استراتيجية لتزويد العامل المساعد دون المساس الاستقرار الإنزيم، مما أدى إلى تحويل عالية. الأساليب الحالية لتجديد العامل المساعد استخدام المنتجات الزراعية أو المواد الكيميائية القائمة على البنزين. ردود الفعل يقودها ضوء آخذة في الظهور كبديل المتجددة. مستقبلسيخصص الأبحاث إلى طرق لإحلال EDTA كاشف الأضاحي من قبل جزيئات أرخص ولتقليل كمية من جزيء FMN ضوء حصاد.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Ampicillin | Sigma Aldrich | 69-52-3 | |
| Bradford reagent | Roth | K015.1 | |
| BSA | Sigma Aldrich | 90604-29-8 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | 67-68-5 | |
| Ethyl acetate | Fisher Chemical | 141-78-6 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Roth | 8043.1 | |
| Riboflavin 5-monophosphate sodium salt hydrate | Sigma Aldrich | 130-40-5 | |
| Hydrochlorid acid 37% | Sigma Aldrich | 7647-01-0 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Sigma Aldrich | 7722-84-1 | |
| δ-Amino levulinic acid | Sigma Aldrich | 5451-09-2 | |
| N-Methyl-N-(Trimethylsilyl)trifluoro acetamide (MSTFA) | Sigma Aldrich | 24589-78-4 | |
| Myristic acid >99% | Sigma Aldrich | 208-875-2 | |
| Imidazole | Sigma Aldrich | 288-32-4 | |
| Sodium chloride | Fisher Chemical | 7647-14-5 | |
| Stearic acid >99% | Sigma Aldrich | 57-11-4 | |
| Tetracycline | Sigma Aldrich | 60-54-8 | |
| Tergitol | Sigma Aldrich | MFCD01779855 | |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethan | Sigma Aldrich | 77-86-1 | |
| Device | |||
| Incubator shaker | G-25CK | New Brunswick Scientific | |
| Ecotron | Infors HT | ||
| Centrifugation | Labofuge 400R | Heraeus | |
| RC 5B Plus | Sorvall | ||
| Fresco 17 | Thermo Scientific | ||
| Centrifugation rotors | SS34 | Sorvall | |
| SLA | Sorvall | ||
| Clean bench | Envirco | Ceag Schirp Reinraum technik | |
| Column GC-FID | CP-Sil 5CB (30 m x 0.25 mm x 0.25 µm) | Agilent Technologies | |
| Column GC-MS | FactorFour Capillary Coloumn (VF-5 ms + 5 m EZ Guard) | Varian | |
| GC-FID | GC-2010 plus | Shimadzu | |
| GC-MS | IST-40 | Varian | |
| Magnetic stirrer | RCT classic | IKA | |
| pH meter | SevenEasy | Mettler toledo | |
| Sonicator | Branson Sonifier 250 | Branson | |
| Spectral photometer | FLUOstar Omega | BMG Labtech | |
| Equipment | |||
| Affinity chromatography column | His Pur Ni-NTA spin column | Thermo Scientific | |
| Centricon | Vivaspin turbo 15 | VWR International | |
| Microtiter plates | 96 Well Multiply®PCR Plates | Sarstedt |
References
- Kourist, R., Domìnguez de Marìa, P., Miyamoto, K. Biocatalytic strategies for the asymmetric synthesis of profens - recent trends and developments. Green Chem. , 2607-2618 (2011).
- Holtmann, D., Fraaije, M. W., Arends, I. W., Opperman, D. J., Hollmann, F. The taming of oxygen: biocatalytic oxyfunctionalisations. Chemical Comm. 50, 13180-13200 (2014).
- Churakova, E., et al. Specific photobiocatalytic oxyfunctionalization reactions. Ang. Chem. In. Ed. 123, 10904-10907 (2011).
- Hollmann, F., Arends, I., Buehler, K. Biocatalytic Redox Reactions for Organic Synthesis: Nonconventional Regeneration Methods. ChemCatChem. 2, 762-782 (2010).
- Girhard, M., Kunigk, E., Tihovsky, S., Shumyantseva, V. V., Urlacher, V. B. Light-driven biocatalysis with cytochrome P450 peroxygenases. Biotechnol. Appl. Biochem. 60, 111-118 (2013).
- Bartsch, M., et al. Photosynthetic production of enantioselective biocatalysts. Microb. Cell. Fact. 14, 53 (2015).
- Rude, M. A., et al. Terminal olefin (1-alkene) biosynthesis by a novel P450 fatty acid decarboxylase from Jeotgalicoccus species. Appl. Environ. Microbiol. 77, 1718-1727 (2011).
- Zachos, I., et al. Photobiocatalytic decarboxylation for olefin synthesis. Chem. Comm. 51, 1918-1921 (2015).
- Liu, Y., et al. Hydrogen peroxide-independent production of α-alkenes by OleTJE P450 fatty acid decarboxylase. Biotechnol. Biofuels. 7, 28 (2014).
- Perez, D. I., Grau, M. M., Arends, I. W., Hollmann, F. Visible light-driven and chloroperoxidase-catalyzed oxygenation reactions. Chem. Comm. 40 (44), 6848-6850 (2009).
