Abstract
Utomhus aerosol forskning använder vanligen partiklar provtas på filter. Detta förfarande gör det möjligt för olika karakteriseringar av de uppsamlade partiklarna som skall utföras parallellt. Syftet med den metod som presenteras här är att erhålla en mycket noggrann och tillförlitlig analys av den endotoxin och DNA-innehållet i bio-aerosoler extraherade från filter. Extraktionen av högmolekylära organiska molekyler, såsom lipopolysackarider, från filter samplade involverar skakning av provet i ett pyrogenfritt vattenbaserat medium. Den efterföljande analysen bygger på en enzymatisk reaktion som kan detekteras med hjälp av en turbidimetrisk mätning. Som ett resultat av den höga organiska innehållet på filtren samplade utförs extraktionen av DNA från proverna utfördes med användning av en kommersiell DNA-extraktion kit som ursprungligen var avsedd för jordar och modifierad för att förbättra DNA-utbyte. Detektion och kvantifiering av specifika mikrobiella som använder kvantitativa polymerasked Reactipå (q-PCR) analys beskrivs och jämförs med andra tillgängliga metoder.
Introduction
Luftprovtagning på filter är ett grundläggande verktyg i atmosfären aerosoler forskning. 1 Filtren samplade utgångspunkten för olika kemiska, fysikaliska och biologiska beskrivningar av de uppsamlade omgivande partiklarna. 2-11 Fördelen med denna metod är att olika analyser kan vara utförs off-line på samma prov. Sammanställning av data från alla olika analyser gör det möjligt för forskare att få en god förståelse av egenskaperna hos de uppsamlade partiklarna och hjälpmedel för att lösa komplexa frågor i meteorologi. 12,13 Till exempel, marina och inre luftprover under samma period kan jämföras med avseende på toxicitet samplade partiklar och biologiska sammansättning. 14 för denna studie, lipopolysackarider (LPS), komponenter på gramnegativa bakteriella cellväggar, även känd som endotoxiner, extraherades från filter samplas på land och på en inlands webbplats, och utvärderades med användning avlimulus amöbocytlysat (LAL) test. Parallellt en genomisk utvärdering av bakteriehalt (total bakterier, gramnegativ, och cyanobakterier) utfördes på samma prov med användning av kvantitativ polymeraskedjereaktion (q-PCR). LAL-testet är baserat på mätningar av grumlighet som bildas efter tillsats av ett vattenhaltigt extrakt av amebocytes från hästskokrabban, Limulus polyphemus, till en vattenlösning innehållande de endotoxiner. Ju högre endotoxin koncentrationen i provet, utvecklar den snabbare grumlighet. 15 den q-PCR-analys är baserad på en fluorescenssignal som utsänds som ett specifikt DNA-fragment amplifieras. 16 Genom realtidsövervakning av den signalen under den exponentiella fasen av PCR reaktion och kalibrering med en standardkurva, kan den initiala DNA mängden kvantifieras. Kombinationen av dessa två analyser tillsammans med andra, som beskrivs på annat håll, kan 14 ge en god uppskattning av halterna av endotoxin och denMängden av käll bakterier i proverna.
Syftet med den metod som presenteras här är att erhålla en mycket noggrann och tillförlitlig analys av den endotoxin och DNA-innehållet i bio-aerosoler extraherade från filter. Även metoder för provtagning de fysiska och oorganiska kemiska egenskaper aerosoler är välkända och, på senare tid, metoder har utvecklats för att undersöka dess organiskt material komponent, 17 har det varit föga forskning om biologisk komponent av aerosoler. 18 Skälet till den nuvarande metod är att ta itu med denna brist genom att presentera i detalj en robust metod för att extrahera, analysera och identifiera biologiska fraktionen av luftburna aerosoler. 14
Metoden beskrivs här förväntas hitta utbredd användning i biologiska inomhus och utomhus aerosol forskningsprojekt där filteranalys. 20-24
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: En detaljerad lista över alla material och instrument som används i detta protokoll visas i avsnittet Material.
1. luftprovtagning på Filter
- Framställning av Filters
- För hög volym provtagning använda 20,3 x 25,4 cm 2 filter. Välj den specifika typ av filter som bäst passar forskningsbehov, liksom filterbrytstorlek om tillämpligt. 1 Här används kvarts mikrofilter.
- Pre-baka filter avsedda för organisk och biologisk förening provtagning för att förstöra organiska rester. Till pre-baka filtren, linda in dem individuellt i aluminiumfolie och sedan baka dem i en laboratorieugn vid 450 ° C under minst 5 tim.
- Lagra de bakade filtren vid -20 ° C tills provtagning.
- Instrument Hantering och luftprovtagning
- Ren resterande damm från huvudet på den höga volymen provtagaren. Torka delarna med rent papper servetter och låta dem lufttorka before återansluta dem till provtagaren.
- Desinficera filterkassetten med etanol, och arbeta med handskar och en laboratorierock vid alla tidpunkter.
- Placera en pre-bakade filtret i ren filterkassetten, och fortsätt enligt den höga volymen provtagaren manual.
- Markera datum och ovanliga väderförhållanden, i förekommande fall (t.ex. regn, damm storm) på aluminium wrap, och spara den i en ren plats tills avslutad provtagning.
- Samla den samplade filtret och vik den på mitten, med den samplade sidan vänd inåt.
- Linda in filtret i den ursprungliga aluminiumfolie och förvara vid -20 ° C fram till analys.
Obs: Om tidsfördröjningen mellan provtagning och analys är längre än 2 månader, förvara provet vid -80 ° C för att undvika nedbrytning av organiskt och biologiskt material.
2. Endotoxin Analys
Obs: Desinficera arbetsytan med 70% etanol end arbete med pyrogenfria rör, tips och reagens bara. Om glas används, förvärmning vid 250 ° C under 30 minuter, eller 200 ° C under 60 minuter krävs. 25 Förbered alla reagenser i en klass II biosäkerhet skåp och arbeta med handskar och en laboratorierock vid alla tidpunkter.
- reagens~~POS=TRUNC
- Följ LAL kit tillverkarens protokoll att rehydrera lysatet strax före användning. 26 Tryck försiktigt på flaskan för att lossa LAL kvar på flaskväggarna. Lyft proppen försiktigt för att bryta vakuumet. Med hjälp av en nålad spruta, tillsätt 5 ml pyrogenfritt vatten (PFW) till flaskan för att rehydrera hela lysat innehåll och blanda försiktigt för att undvika skumbildning.
- Täta flaskan med plast paraffin film när den inte används och förvara vid 4 ° C i upp till två dagar. Lagra alla återstående lysat vid -20 ° C i upp till tre månader.
Obs: Detta reagens kan frysas en gång. - Rehydrera kontrollstandard endotoxin (CSE), som innehåller 0,5 μ; g E. coli, i enlighet med tillverkarens protokoll. 27 Bestäm viss mängd vatten som skall tillsättas till CSE flaskan från tillverkarens webbplats 28 genom att ange lotnumret för satsen där anges på hemsidan. Den slutliga koncentrationen av E. coli i flaskan, mäts i endotoxinenheter (EU, där 10 EU = 1 ng). Märk denna flaska Ed0.
- Täta CSE flaskan med plast paraffin film när den inte används och förvara vid 4 ° C i upp till fyra veckor.
- Standardkurva och spetsade-filter Beredning
- I en klass II biosäkerhet skåp, förbereda 22 pyrogenfria 2 ml centrifugrör innehållande minskande mängder av CSE (rören ED1-Ed11) eller ingen CSE (den tomma rör innehållande enbart PFW) för att producera en dupliceras endotoxin spädningsserier, såsom visas i tabell 1.
- I ett biologiskt skåp med kretslopp, skär 22 runda bitar av ren, pre-bakade filtret med en desinficerad 1.1 2 cm kork diameter borr.
- Placera filterparen i sterila petriskålar.
- Spike 50 pl från varje medlem i endotoxin spädningsserie Ed2-Ed11 och från den tomma röret på ett motsvarande par av filter.
- Lämna petriskålar innehållande spetsade filter öppna under huven för att torka i 30 minuter.
- Placera varje filterstycke i en pyrogenfri 2 ml rör.
| Rör | Slutlig endotoxinkoncentration (EU ml -1) | Standard endotoxin volym (ml) | Pyrogenfritt vatten volym (ml) | total volym (ml) | Ed0 | 2500 | stamlösning * | 5 |
| ED1 | 1000 | 80 (från Ed0) | 120 | 200 |
| ED2 | 100 | 20 (från ED1) | 180 | 200 |
| ED3 | 50 | 10 (från ED1) | 190 | 200 |
| ED4 | 25 | 5 (från ED1) | 195 | 200 |
| ED5 | 12,5 | 2,5 (från ED1) | 197,5 | 200 |
| Ed6 | 6,25 | 1,25 (från ED1) | 198,75 | 200 |
| ed7 | 3,125 | 6,25 (från Ed2) | 193,75 | 200 |
| Ed8 | 1,563 | 6,25 (från ED3) | 193,75 | 200 |
| Ed9 | 0,781 | 6,25 (från ED4) | 193,75 | 200 |
| ED10 | 0,391 | 6,25 (från ED5) | 193,75 | 200 |
| Ed11 | 0,195 | 6,25 (från Ed6) | 193,75 | 200 |
| Tom | 0 | 0 | 200 | 200 |
Tabell 1:. Endotoxin Standard Curve endotoxinkoncentration, volymen standard endotoxin och av pyrogenfritt vatten som skall tillsättas, och den totala volymen som erhölls anges i detalj för varje utspädning rör i kalibreringskurvan.
- Endotoxin Extraktion från den experimentella preparerade filter
- I ett biologiskt skåp med kretslopp, skär provtagningsfiltren (från steg 1,2) i runda bitar med hjälp av en desinficeras 1,12 cm kork diameter borr, och placera dem tillsammans med de spetsade standardfilter (från steg 2,2), i pyrogenfri 2 ml rör (dvs. provrör).
- Tillsätt 1 ml PFW till rören och skaka dem under 60 min vid rumstemperatur, med användning av en laboratorie shaker.
- Centrifugera provrören i en mikrocentrifug vid 375 xg under 10 min. 29
- överförings the supernatant, som innehåller de endotoxiner, till en ny pyrogenfri 2 ml rör.
- Limulus amöbocytlysat (LAL) Test
- Bestämma endotoxin-koncentrationen i proverna genom att utföra LAL-testet i en pyrogenfri 96-brunnars mikroplatta med en platt botten och ett lock.
- Planera plattgrupp i förväg, som visas i figur 1. Inkludera en standardkurva framställas direkt från endotoxin standardlösningar Ed2-Ed11 (och därmed täcker koncentrationsintervallet 100-0.195 EU / ml (se avsnitt 2.2)) i varje kör platta . Standardkurvan bör uppta brunnar 1-10 rader A och B i plattan. Avsätt brunnar 11-12 i dessa rader för blankprover (vilket ger totalt fyra ämnen).
- Slå på mikroplattläsare och programmera den för en kinetisk reaktion som involverar inkubering av mikroplattan vid 37 ° C och skakning var 5 min, följt av absorptionsmätningar vid 405 nm. Upprepa 18 gånger i 1,5 timmar.
- Bestämma efficiency som endotoxiner extraheras från provtagningsfiltren (dvs., de prov som erhålls från spetsade standardfilter) via uppdelning av den beräknade endotoxin belopp det ursprungliga beloppet spetsade.
- Starta analysen genom att placera 50 pl av standard endotoxinlösningar (från steg 2.4.2), eller den preparerade filterextraktet och dess ämnen (från avsnitt 2.3), eller av de experimentella proverna och dess ämnen (även från avsnitt 2.3), enligt den planerade platt array (Figur 1) och stäng locket.
- Till varje brunn, snabbt lägga 50 pl LAL-lösning och försiktigt skaka plattan horisontellt medan den är placerad på bordet innan du lyfter den i läsaren.
- Placera plattan i plattläsaren och starta den experimentella körningen.
Figur 1:. Endotoxin array platta En exriklig av ett endotoxin analys array i en 96-brunnars mikroplatta.
3. Genomisk Analys
Obs! För DNA-extraktion, desinficera arbetsytan med 70% etanol och arbeta med sterila rör, tips och reagens bara. För q-PCR-analys av DNA, desinficera arbetsytan med ytan DNA-sanerings. Förbered alla reagenser i en klass II biosäkerhet skåp och arbeta med handskar och en laboratorierock vid alla tidpunkter.
- Framställning av DNA-primers och prober
- Före DNA-extraktion, antingen beställa en kommersiellt tillgänglig uppsättning primers och en sond (om hydrolys sondmetoden tillämpas), eller utforma en ny uppsättning av primers och prob med hjälp av primer utforma beräkningsverktyg. 30
- Rehydrera primrarna enligt tillverkarens protokoll med användning av antingen 10 mM Tris-0,1 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA) (TE-buffert) eller PCR-kvalitet vatten.
Obs: Det rekommenderas att lösa den första PCR-primer stock i TE-buffert med låg EDTA (0,1%) som den förhindrar primer nedbrytning vid förvaring under längre tider. Använd PCR-kvalitet vatten för efterföljande utspädning för att minska EDTA belopp som skulle kunna hindra PCR-reaktioner. - Framställa alikvoter av 50 pl eller 100 pl av primer och sond i sterila 0,5 ml rör och förvara vid -20 ° C fram till analys.
- Standard Cell Koncentration Utvärdering Före DNA-extraktion
- I en lämplig storlek centrifugrör, förbereda en standard cell lösning av mikroben av intresse (rör Od0 tabell 2A). Blanda cellsuspensionen genom att pipettera upp och ner i röret 7-10 gånger med användning av en pipett med en liten borrning.
- Om cellerna är färgade (t.ex. vissa svampsporer), inte utför en färgningsproceduren. Om cellfärgning krävs, späda cellsuspensionen i ett lämpligt färgämne för mikroskopisk detektion av cellerna av intresse. 31
- Rengör täckglas och hemocytomEter med etanol. Fukta och anbringa locket glida till hemocytometer.
- Ladda ca 8 | j, l av cellsuspensionen till båda hemocytometer kamrarna genom att försiktigt röra vid kanten av locket glida med spetsen av pipetten och fyllning av kammaren genom kapillärverkan. Inte över / under fylla kammaren.
- Bestämma antalet celler genom att visa dem under ett mikroskop vid 400X förstoring (40X objektiv och 10X i okulär). Nio kvadrater som mäter 1 x 1 mm 2 och arrangerade i en 3 x 3 rutnät bör ses. Fokusera mikroskop på en av de fyra hörn torgen i gallret (kan en högre förstoring användas). 1 x 1 mm2 kvadrat bör innehålla 16 mindre kvadrater.
- Räkna alla celler i fyra 1 x 1 mm 2 hörn torg, liksom i mitten kvadraten på 3 x 3 rutnät. Om det finns för många eller för få celler att räkna, upprepa proceduren, antingen koncentrera eller späda den ursprungliga cellsuspensionen som är lämpligt (15-50 celler bör lägga en peka 1 mm 2-område).
- Beräkna koncentrationen av celler (celler ml -1) i standard cellsuspensionen Od0 från kroppar genomsnitt över fem räknade rutor enligt följande: Cell count ml -1 = Average celltal kvadrat -1 spädningsfaktorn 10 4.
- Utvärdering av DNA-extraktion Effektivitet
- Förbered nio sterila 0,5 ml rör enligt tabell 2A.
- Späd standard cell lösning (Od0) för att innehålla cirka 10 7 celler ml -1 i en total volym av 20 | il (OD1).
- Lägg 18 l sterilt nukleasfritt PCR-grade vatten (NFW) att rören OD2-Od8 och 20 pl till den tomma röret, Od9.
- Transfer 2 pl av cellen lösningen från OD1 till OD2. Pipetten lätt att blanda och överföra 2 pl från röret OD2 till Od3. Fortsätt späda cellerna på samma sätt längs rören till och med rör Od8 till obtain en serieutspädning av 10 7 -10 0 celler ml -1.
- I ett biologiskt skåp med kretslopp, skär 18 runda bitar av ren, pre-bakad filter, med hjälp av en desinficerad 1,12 cm kork diameter borr. Placera filtren i par till sterila petriskålar.
- Spik 10 pl från utspädningar OD1 till Od8 och från den tomma tuben Od9 på var och en av de parade filter, så att det finns ett filterpar som motsvarar varje standardcellkoncentration.
- Lämna petriskålarna öppna under huven och låt dem torka i 30 min.
- Placera varje filterstycke i en steril skruvlock 2 ml rör och extrahera DNA enligt det förfarande som beskrivs i avsnitt 3.4.
- DNA-extraktion från den experimentella preparerade filter
Notera: För DNA-extraktion från filter, använda kommersiella kit utformade för DNA-extraktion från jord i enlighet med tillverkarens protokoll med följande modifieringar.- För varje filter prov (OD1-Od8), förbereda en blandning av syratvättade glaspärlor i en 0,5 ml sterilt rör. Använda 0,1 g pärlor med en diameter av 425-600 | j, m och 0,3 g pärlor med en diameter av ≤106 im.
- I ett biologiskt skåp med kretslopp, skär tre runda bitar från slumpmässigt utvalda platser på varje filterprov med hjälp av en desinficerad 1,12 cm kork diameter borr, och placera dem i skruvlock 2 ml rör.
- Lägga glaskornsblandningen till rören.
- Tillsätt cell lysbuffert levereras med utvinning kit till varje rör i den biologiska skåp, med det belopp som anges i tillverkarens protokoll.
- Förbered en hink med is och sönderdela cellerna mekaniskt med en pärla beater.
- Vispa pärlorna under 1 minut och sedan placera dem på is under 1 minut. Upprepa fem gånger.
- Fortsätt med satsen leverantörens protokoll från efter lys steg.
- Efter eluering med den medföljande elueringsbuffert (innehåller 10 mM Tris bUffer) eller NFW, ladda det eluerade provet genom kolonnen igen för att förbättra DNA avkastning.
Obs: Om inte analyseras på samma dag som den DNA-extraktion, kan proverna förvaras vid -20 ° C fram till analys.
| A- Beredning av standard cell utspädningsserie | ||||
| Rör | Slutlig cellkoncentration (cell ml -1) | Standard cell volym (ml) | Nukleasfritt vatten volym (ml) | Total volym (ml) |
| Od0 | bestämma med Hemocytometer räknekammare | |||
| OD1 | bör elueras till intervallet 10 7 celler ml -1 | 20 | ||
| OD2 | 10 -1 OD1 | 2 av OD1 | 18 | 20 |
| Od3 | 10 -2 OD1 | 2 av OD2 | 18 | 20 |
| od4 | 10 -3 OD1 | 2 av Od3 | 18 | 20 |
| Od5 | 10 -4 OD1 | 2 av od4 | 18 | 20 |
| Od6 | 10 -5 OD1 | 2 av Od5 | 18 | 20 |
| Od7 | 10 -6 OD1 | 2 av Od6 | 18 | 20 |
| Od8 | 10 -7 OD1 | 2 av Od7 | 18 | 20 |
| Tom | 0 | 0 | 20 | 20 |
| B- Framställning av DNA-standardkurva | ||||
| Rör | Slutlig DNA-koncentration (mg ml -1) | Standard-DNA volym (ml) | Nukleasfritt vatten volym (ml) | Total volym (ml) |
| bestämma med Nanodrop | ||||
| DD1 | bör elueras till intervallet 10 1 mg ml -1 | 20 | ||
| DD2 | 10 -1 DD1 | 2 av DD1 | 18 | 20 |
| DD3 | 10 -2 DD1 | 2 av DD2 | 18 | 20 |
| DD4 | 10 -3 DD1 | 2 av DD3 | 18 | 20 |
| DD5 | 10 -4 DD1 | 2 av DD4 | 18 | 20 |
| DD6 | 10 -5 DD1 | 2 av DD5 | 18 | 20 |
| DD7 | 10 -6 DD1 | 2 av DD6 | 18 | 20 |
| DD8 | 10 -7 DD1 | 2 av DD7 | 18 | 20 |
| Tom | 0 | 0 | 20 | 20 |
Tabell 2:. DNA Standardkurva Standardmikroorganismcellutspädningsserie (A) detaljerad för standardcellvolymen, NFW volym, och den totala volymen i varje utspädning rör. DNA standardkurva beredning (B), detaljerad för standard DNA volymen NFW volym, och den totala volymen i varje utspädning rör.
- DNA standardkurvan Förberedelse
- Använda en spektrofotometer för bestämning av DNA-koncentrationen av standard-DNA-prov (Dd0) vid 260 nm.
- Förbereda nio sterila 0,5 ml rör för att förbereda en DNA-standardkurva, såsom visas i tabell 2B.
- Om så är nödvändigt, späd standard-DNA-lösning Dd0 till inom ett koncentrationsintervall av 1-10 | j, g ml -1 i det första röret (DD1) i en total volym av 20 | il.
- Lägg 18 pl NFW att rören DD2-DD8 och 20 pl till den tomma röret.
- Transfer 2 pl av standard DNA-lösningen från DD1 till DD2. Pipett försiktigt för att blanda och sedan överföra 2 pl från DD2 till DD3. Fortsätta att späda DNA på samma sätt längs rören för att uppnå en serieutspädning av 10 0 -10 -7 i rör DD2-DD8 tillsammans med en tom tub containing endast NFW.
Obs: Om inte analyseras på samma dag av extraktion, lagra proverna vid -20 ° C fram till analys.
- Slå på q-PCR-instrumentet i förväg för att värma upp.
- I en ny programfil sätter detaljerna för q-PCR köras i instrumentoperativprogrammet enligt tabell 3.
Obs: Olika instrument har olika optimala tidpunkten för varje termisk cykel steg. Denna ingång anges i instrumentets bruksanvisning. - Desinficera arbetsytan med ytan DNA-sanerings och fungerar endast med sterila rör, tips och reagens.
- Förbered en hink med is bredvid arbetsbänken. Store Taq-polymeras mix på is.
- Beräkna det totala antalet reaktionsbrunnar som kommer att upptas i plattan. Göra teoretiska hänsyn till extra reaktioner (5%) och multiplicera den utvidgade antal reaktioner med volymen per reaktion för att beräkna total reaction volym.
- Förbered reaktionen blandad poolen, från NFW, primers, sond, och slutligen Taq-polymeras mix. Se exempel för de volymberäkningar för den blandade poolen i tabell 4.
- Lagra reaktionsblandningen i mörker och på is fram till användning.
- Placera 1 pl standard DNA, prov-DNA, eller NFW (som negativ kontroll) inuti brunnarna i Q-PCR mikro i tre exemplar.
- Se till att plattan är i en plåthållare för att förhindra den från att röra vid arbetsytan och för att hålla den ren.
- Lägga 9 pl av den blandade poolen (tabell 4) i varje reaktionsbrunn.
- Täck plattan med optiska limfilm stänger till ordentligt från alla sidor.
- Spinn ner plattan i en centrifug med plåthinkar under 1 minut vid 1000 xg innan den placeras i Q-PCR-enhet.
- Placera plattan in i instrumentet och aktivera programmet som kör.
| Parameter | detaljer | kommentarer |
| detektionsmetod | Kvantitativ hydrolys sond | |
| Termiska cykelbetingelser | ||
| Initial denaturering och enzymaktivering | 95 ° C under 10 min | |
| denaturering | 95 ° C under 15 sek | upprepa 45 gånger |
| Hybridisering och förlängning | 60 ° C under 60 sek | |
| plattgrupp | ||
| standard~~POS=TRUNC kurva~~POS=HEADCOMP | DD1 - DD8 | 3 upprepningar per utspädning i 1-8 brunnar upptill 3 rader |
| Icke-mall-kontroll (NTC) | Nukleasfritt vatten (NFW) | 3 upprepningar i 9: e och på toppen3 rader. |
| analyserade prover | DNA extraherat från filter | 3 upprepningar per prov på de återstående brunnarna. |
| primeruppsättning | per varje brunn | |
| provvolym | 10 ml |
Tabell 3:. Mer information om Q-PCR operativprogrammet Detaljer om analysparametrarna som skall föras in i Q-PCR programfilen.
| Reagens | Volym per reaktion (ml) | Antal reaktioner | Ersättning för fel(5%) | Total volym mix (ml) |
| Taq-polymeras mix | 5 | 50 | 52,5 | 262,5 |
| F primer (10 mM) | 0,5 | 50 | 52,5 | 26,25 |
| R-primer (10 mM) | 0,5 | 50 | 52,5 | 26,25 |
| Nukleasfritt vatten | 3 | 50 | 52,5 | 157,5 |
| DNA - 1 ml kommer att läggas direkt i mål brunnar i 96 plattan. | ||||
Tabell 4:. Kvantitativ-PCR-reaktionsblandning volymberäkning per reaktion, antal reaktioner, ersättning för fel, och den totala beräknade volymen som skall tillsättas till reaktionsblandningen per reagens är detaljerade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det är vanligt att studera atmosfären aerosoler med hjälp av "off-line" analyser av filter i urvalet (se figur 2). 32 Kemiska analyser av ärendet inkludera organiska (t.ex. protein, kolvätemolekyler, sackarider) och oorganiska (t.ex. metaller, salter) innehåll samplas . Biologiska analyser inkluderar livskraftiga och icke livskraftiga mikroorganismer innehåll, artbestämning med hjälp av en DNA-metod eller mikroskopi, samt DNA-baserad kvantifiering.
Figur 2: Filer provanalys flödesschema Filter efter luft provtagning (A), utarbetande av filtret för analyser nedströms (B), och analys av provkomponenterna (C)..
e = "1"> För endotoxin-extraktion, är filterunderprover (1,12 cm 2) skakades i en ml PFW under 60 min vid rumstemperatur. Proverna centrifugeras därefter i 10 min vid 375 x g. Olika centrifugeringshastigheter kan resultera i olika extraktionsmetoder effektiviteter, såsom indikeras i figur 3A.
Ett preliminärt test för utvinning effektivitet bör genomföras för det specifika filtret väljs och protokoll utförs. I figur 3B är högre utvinningseffektivitet som erhållits från spiking ren jämfört med kvartsfilter samplade, och båda dessa effektivitetsvinster är lägre än vad som uppnås genom direkt detektion av standardlösningen. Såsom diskuterats på annat ställe, kan arten av de omgivande aerosoler samplade på filtret också påverka endotoxin extraktionseffektivitet. 14,33
g3.jpg "/>
Figur 3: Endotoxin extraktion effektivitet Effekten av centrifugeringsvarvtal (A) och filterbelastning (B) på endotoxin utvinning effektivitet.. Felstaplar representerar standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Reaktionen med avseende på endotoxin detektering involverar en 1: 1 förhållande av LAL-reagens till endotoxin standard, prov-extraherade endotoxiner eller tomrummen. Det rekommenderas att använda tre exemplar för provanalys. Men för standardkurvor, dubbletter är tillräckliga. När absorptionsegenskaper avläsningar (vid 405 nm) är klara, är den resulterande optiska densiteten (OD) analyserades efter att exportera den till en dataanalys kalkylprogram för vidare analys av data.
Liksom i endotoxin-extraktion, är det viktigt att utföra en preliminär analys av DNA-extraktion effektivitet under de särskilda experimentella betingelser. Detta görs genom att spiking en känd mängd av en standardorganism cellösning på en bit skuren från filtret, efter DNA-extraktion protokollet beskrivet ovan. Koncentrationen av målmikroorganismen extraheras från aerosoler samplade bestäms med användning av q-PCR. Här hydrolys sondtekniken används, vilket har fördelen av hög specificitet, på grund av den ytterligare proben bunden till schablon-DNA. 35 Den SYBR grön metod kan också tillämpas för detta ändamål. Kalibreringskurvor är härledda från DNA som extraherats från de valda organismerna av intresse, genom att använda extraktionsmetoden beskriven ovan. En blandad pool av reaktionsföreningar, med undantag för DNA-provet, standard, eller kontroll, framställes och förvaras i mörker och på is fram till användning. Därefter tillsätts en alikvot av den blandade poolen till varje brunn i en 96 mikro optiska plattan. DNA-standard, prov eller kontroll tillsätts efter reaktionsblandningen enligt plattgrupp. Efter att alla reagens har satts in i plattan, är det havetlett med ett optiskt adhesiv film och centrifugerades ned för att samla in alla dropparna i botten av brunnarna. Plattan är än in i Q-PCR instrument för termisk cykel förstärkning och signaldetektering. Utgångsdata består av PCR-Ct-värden, som definieras som antalet cykler vid vilken den förstärkta DNA beloppet når tröskelnivån. Användning av kalibreringskurvan värden kan erhållas koncentrationen av mål-DNA (se figur 4). 36 mikroorganismen är cellkoncentrationer kan beräknas från CT-värdena för utvinning verkningsgrad jämfört med en hemocytometer räkna av standard organismen lösning. 37 
Figur 4: Kvantitativ-PCR-amplifiering plot (A) och KAL.ion kurva i intervallet mellan 2 x 10 -4 -2 x 10 2 (B) utförs för representativa gramnegativa bakterie-DNA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta arbete beskriver utvinning och detektionsmetoder för att kvantifiera både endotoxiner och DNA närvarande i aerosol prover som samlats på filter. Metoderna kräver noggranna rutiner och kan utföras enkelt så länge experimentalist vidhäftar några viktiga och viktiga punkter som diskuteras här.
För steg endotoxin upptäckt, notera att lysatlösningen är ganska viskös och tenderar att producera bubblor på pipettering. Det är svårt att ta bort dig bubblor, och de leder till förändringar i mikro-läsare värden. Därför är det viktigt att först placera provet i plattan och endast efter att se till att alla bubblor försvunnit, fortsätter med tillsatsen av lysatlösningen. En användbar teknik för att förhindra bubbelbildning i detta steg är att arbeta långsamt med pipetten, och inte för att trycka den hela vägen vid avtappning lysatet i brunnarna. Som en reaktion startar omedelbart när lysatet adderas till endotoxin extrahera, är det viktigt att starta behandlingen så snart som möjligt. Att förkorta lysat tillsättningssteget, kan användas en flerkanalspipett. Observera att i vissa kit och protokoll finns det en ytterligare förinkubation steget av proverna vid 37 ° C under 10 min, efter att den är placerad i mikro titter plattan. 29 Först efter detta steg, kan lysatet tillsättas.
En viktig punkt för miljöprov utvinning av endotoxiner är förekomsten av inhibitorer i proverna (t.ex. i hög luftföroreningar prov). I detta fall blir utspädning kritisk, och kan förhindra falsk förbättring, typiskt observeras för icke-utspädda provet. 38
Likaså finns det flera punkter som är viktiga för att säkerställa framgång och tillförlitligheten hos Q-PCR-detektion. 1) Eftersom volymen av lösningarna är mycket liten, om de inte är placerade på botten av brunnen, kan vatteninnehållet i DNA droppe minskas genom indunstning while ordna proverna på plattan. För att förhindra detta problem genom att placera DNA-provet vid botten av brunnen, kyla plattan genom att placera den på is eller annan kylning plattform, och förbereda allt i förväg för att påskynda detta steg så mycket som möjligt. 2) Vid framställning av Q-PCR-reaktionsblandningen (tabell 4), täcka röret med aluminiumfolie för att förhindra fotonedbrytning. 3) Den föreliggande experimentet beskriver framställningen av en 10 pl reaktion. Icke desto mindre, i vissa q-PCR-instrument, är reaktionsvolymen 20 pl och sedan volymen av varje reagens multipliceras i enlighet därmed. 4) De optimala termiska cykelförhållanden kan ändras för olika primrar och polymerasblandningar. 39 Till exempel bör glödgningstemperaturen vara satt till cirka smälttemperaturen hos primrarna, och bestäms empiriskt som den temperatur vid vilken amplifiering sker mest effektivt. Av detta skäl är det också viktigt att framställa en kalibreringskurva för varje analyserat q-PCRplatta, för att säkerställa att kvantifieringen är korrekt. Kalibreringskurvor samt standard-spetsade filter fungerar också som en positiv kontroll för att säkerställa att ingen inhibition sker. För att undvika inhibition, är det rekommenderat att använda extraktion kit för att avlägsna inhibitorer från miljöprover. 5) Antalet termiska cykler i detta experiment var inställd till det maximala antalet, 45, i syfte att öka känsligheten som de DNA-koncentrationer från filter extrakten var mycket låga. 6) Se till att Cykler till Threshold (Cτ) värden för alla DNA-prover är inom det dynamiska området för kalibreringskurvan. Också se till att alla förstärkning av en negativ kontrollprov är minst åtta cykler större än den hos DNA-proven. 7) Om man arbetar med SYBR Green reagens, se till att det inte finns några flera smälttemperaturtoppar per reaktion.
För turbidimetrisk test två endotoxin kvantifieringsmetoder finns: den kinetiska metod och Resultant kromogen metod. I den kinetiska tillvägagångssättet, som utförs i detta protokoll, den tid som krävs för provet nå maximal absorption mäts. Här, indikerar en kortare reaktionstid intervall en högre endotoxinkoncentration i provet. I slutpunkten kromogena metoden Ijusabsorption uppmättes efter en viss inkubationstid för att bestämma endotoxin koncentrationen. Båda metoderna kräver en standardkalibreringskurva för kvantifiering. 40
Även om precision och noggrannhet av endotoxin utvinning ovan beskrivna är mycket hög, kan 14 utvinning effektiviteten förbättras. Det är möjligt att en annan typ av filter eller genom tillsats av en detergent (såsom Polysorbat 20) till extraktionsförfarande kan förbättra utbytet av endotoxin utvinns från filtret. Endotoxin utvinning effektivitet kan också påverkas av olika partiklar i urvalet parallellt på filtret. 33 För vår experimentuppställning, denmetodens detektionsgräns beräknas vara 0,001 EU m -3. 14
Tekniker för att kvantifiera DNA-extrakt som skulle kunna fungera som ett alternativ till Q-PCR inkluderar kloning strategi och digital droppe PCR (DD-PCR). Fördelarna med q-PCR över klonings tillvägagångssätt för artbestämning är dess större känslighet och att den kräver en lägre DNA-koncentration för den initiala amplifieringssteget. Dessutom, till skillnad från q-PCR, kloning metoden, som är arbetskrävande och tidskrävande, inte är kvantitativ. En alternativ metod för kvantifiering av DNA-extraktet är DD-PCR. 19 Fördelen med denna teknik är att den inte kräver en kalibreringskurva, som detekterings är baserad på en enda DNA-stam i varje droppe. Men för miljöprover, föreligger ingen tillförlitlig metod hittills för droppdetektering av DNA som extraherats från filter.
Effektiviteten med vilken DNA extraheras frOm filtret, samt noggrannhet och precision av DNA-mätningarna kan påverkas av faktorer såsom filter typ, målmikroorganismer och instrumentering. 34,41 Därför bör definieras före provanalysen. I vår experimentuppställning, kan detektionsgränsen nå ned till 3,5 genom m -3. 14
Avslutningsvis, är den här beskrivna metoden tillämpas för identifiering och kvantifiering av luft samplade biologiska arter från både antropogena och naturliga källor. Exakt användning av lämplig analys möjliggör värdefulla undersökningar av komplexa miljöfrågor som skall genomföras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Filter sampling | |||
| HiVol 3000 - High Volume Air Sampler | Ecotech | ||
| Quartz Microfiber Filters | Whatman | 1851-865 | 203 mm x 254 mm |
| ELF - Laboratory Chamber Furnaces | Carbolite | ELF 11series | |
| Aluminum foil | Opal | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Endotoxin | |||
| Ethanol | Sigma Aldrich | 16368 | Laboratory Reagent, 96% |
| Airstream Class II Biological Safety Cabinet AC-4E1 | ESCO | 10011712 | |
| Pyrotell -T | Associates of Cape Cod, Inc. | T0051 | |
| Control Standard Endotoxin | Associates of Cape Cod, Inc. | E0005-1 | Escherichia coli O113:H10, 0.5 µg/vial 1 Pack |
| LAL Reagent Water | Associates of Cape Cod, Inc. | W0051 | |
| 10 ml sterile syringe with Luer-Lok Tip | Becton-Dickinson & Co. | 309605 | |
| BD Precisionglide syringe needle | Becton-Dickinson & Co. | 305129 | Sterile |
| Parafilm-M sealing tape | Parafilm | P7543 | Sigma catalog number |
| Microtubes | Axigen | MCT-200-C | 2 ml, pyrogen free |
| 1.12 cm diameter Cork Borer | Boekel Scientific | 1601 BD Series - Steel | Part of a cork borer set containing borers with various diameters. |
| 50 mm Petri Dish | Miniplast Ein-Shemer | 72050-01 | Aseptic |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries, inc. | SI-0297 | |
| Microcentrifuge 5415 D | Eppendorf | 22621408 | |
| TC MicroWell 96 F SI w/lid | Nunc | 167008 | Flat bottom wells (with lid (individually wrapped)), sterile, pyrogen free |
| Synergy HT Multi-Detection Microplate Reader | Biotek | 7091000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNA | |||
| DNA away | Sigma Aldrich | 7010 | |
| Standard DNA of the microbial species of interest | ATCC or other culture collection | Either the appropriate microbial strain for DNA extraction or the extracted DNA | |
| Neubauer-improved | Marienfeld | 640030 | hemocytometer |
| TE buffer, Low EDTA | Life Technologies | 12090-015 | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) 0.1 mM EDTA |
| Nuclease-free PCR-grade water | Sigma Aldrich | 3315959001 | |
| PCR primers | Sigma Aldrich | Targets the microbial species of interest | |
| Dual-Labeled Probes | Sigma Aldrich | Targets the microbial species of interest | |
| Screw cap tubes | Axigen | ST-200-SS | 2 ml |
| PowerSoil DNA extraction kit | Mo Bio Laboratories | 12888-100 | |
| Glass beads, acid-washed 425-600 µm | Sigma Aldrich | G8772-100G | |
| Glass beads, acid-washed <106 µm | Sigma Aldrich | G4649-100G | |
| PowerSoil Solution C1 | Mo Bio Laboratories | 12888-100-1 | Cell lysis buffer , Power soil Kit |
| Magic Touch ice bucket | Bel-Art | 18848-4001 | |
| Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | 607EUR | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385612 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4370048 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 ml | Applied Biosystems | 4346906 | |
| MicroAmp Splash-Free 96-Well Base | Applied Biosystems | 4312063 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4311971 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5811 000.010 | Rotor A-4-62 with MTP buckets |
References
- Methods of Air Sampling and Analysis. Lodge, J. P. J. , 3rd ed, Lewis Publishers, Inc. (1988).
- Costa, V., et al. Characteristics of carbonaceous aerosols in Emilia-Romagna (Northern Italy) based on two fall/winter field campaigns. Atmos. Res. , (2015).
- Brent, L. C. Development, enhancement, and evaluation of aircraft measurement techniques for national ambient air quality standard criteria pollutants [dissertation]. , University of Maryland, College Park. Thesis 3682591 (2014).
- Okuda, T., Schauer, J. J., Shafer, M. M. Improved methods for elemental analysis of atmospheric aerosols for evaluating human health impacts of aerosols in East Asia. Atmos. Environ. 97, 552-555 (2014).
- Hospodsky, D., et al. Characterizing airborne fungal and bacterial concentrations and emission rates in six occupied children's classrooms. Indoor air. , (2014).
- Bottos, E., Woo, A., Zawar-Reza, P., Pointing, S., Cary, S. Airborne Bacterial Populations Above Desert Soils of the McMurdo Dry Valleys, Antarctica. Microb. Ecol. 67, 120-128 (2014).
- Ovadnevaite, J., et al. Submicron NE Atlantic marine aerosol chemical composition and abundance: Seasonal trends and air mass categorization. J. Geophys. Res. Atmos. 119, (2014).
- Lodge, J. Jr ES&T Books: Methods of Air Sampling and Analysis, 3rd ed. Environ. Sci. Technol. 23, 938 (1989).
- Aerosol Measurement: Principles, Techniques, and Applications. Pramod, K., Baron, P. A., Willeke, K. , John Wiley & Sons. (2011).
- Vincent, J. H. Aerosol Sampling: Science, Standards, Instrumentation and Applications. , John Wiley & Sons. (2007).
- Duquenne, P., Marchand, G., Duchaine, C. Measurement of Endotoxins in Bioaerosols at Workplace: A Critical Review of Literature and a Standardization Issue. Ann. Occup. Hyg. 57, 137-172 (2013).
- Okuda, T., Schauer, J. J., Shafer, M. M. Improved methods for elemental analysis of atmospheric aerosols for evaluating human health impacts of aerosols in East Asia. Atmos. Environ. 97, 552-555 (2014).
- Lewtas, J. Air pollution combustion emissions: Characterization of causative agents and mechanisms associated with cancer, reproductive, and cardiovascular effects. Mutat. Res.-Rev. Mutat. 636, 95-133 (2007).
- Lang-Yona, N., Lehahn, Y., Herut, B., Burshtein, N., Rudich, Y. Marine aerosol as a possible source for endotoxins in coastal areas. Sci. Total. Environ. 499, 311-318 (2014).
- Levin, J., Bang, F. B. Clottable protein in Limulus: its localization and kinetics of its coagulation by endotoxin. Thromb. Diath. Haemorrh. 19, 186-197 (1968).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6, 986-994 (1996).
- O'Dowd, C. D., de Leeuw, G. Marine aerosol production: a review of the current knowledge. Phil. Trans. R. Soc. A. 365, 1753-1774 (2007).
- O'Dowd, C. D., et al. Biogenically driven organic contribution to marine aerosol. Nature. 431, 676-680 (2004).
- Yang, R., Paparini, A., Monis, P., Ryan, U. Comparison of next-generation droplet digital PCR (ddPCR) with quantitative PCR (qPCR) for enumeration of Cryptosporidium oocysts in faecal samples. Int. J. Parasitol. 44, 1105-1113 (2014).
- Stetzenbach, L. D., Buttner, M. P., Cruz, P. Detection and enumeration of airborne biocontaminants. Curr. Opin. Biotechnol. 15, 170-174 (2004).
- Dannemiller, K. C., Gent, J. F., Leaderer, B. P., Peccia, J. Influence of housing characteristics on bacterial and fungal communities in homes of asthmatic children. Indoor air. , (2015).
- Yamamoto, N., Hospodsky, D., Dannemiller, K. C., Nazaroff, W. W., Peccia, J. Indoor emissions as a primary source of airborne allergenic fungal particles in classrooms. Environ. Sci. Technol. 49, 5098-5106 (2015).
- Yamamoto, N., et al. Particle-size distributions and seasonal diversity of allergenic and pathogenic fungi in outdoor air. ISME J. 6, 1801-1811 (2012).
- Karottki, D. G., et al. Cardiovascular and lung function in relation to outdoor and indoor exposure to fine and ultrafine particulate matter in middle-aged subjects. Environ Int. 73, 372-381 (2014).
- Guy, D. Endotoxins and Depyrogenation. Industrial Pharmaceutical Microbiology: Standards and Controls. Hodges, N., Hanlon, G. , Euromed. 12.1-12.15 (2003).
- Associates of Cape Cod Incorporated. Limulus Amebocyte Lysate - PYROTELL-T. , Available from: http://www.acciusa.com/pdfs/accProduct/inserts/PyrotellT.pdf (2006).
- Associates of Cape Cod Incorporated. Endotoxin (E. coli O113:H10) Control Standard Endotoxin (CSE). , Available from: http://www.acciusa.com/pdfs/accProduct/pisheets/CSE%200.5ug.pdf (2007).
- Associates of Cape Cod Incorporated. Cape Cod Certificate of Analysis. , Available from: http://www.acciusa.com/pageCOA.php (2015).
- Thorne, P. S., Bartlett, K. H., Phipps, J., Kulhankova, K. Evaluation of Five Extraction Protocols for Quantification of Endotoxin in Metalworking Fluid Aerosol. Ann. Occup. Hyg. 47, 31-36 (2003).
- Thornton, B., Basu, C. Real-time PCR (qPCR) primer design using free online software. Biochem. Mol. Biol. Educ. 39, 145-154 (2011).
- Madigan, M. T., Clark, D. P., Stahl, D., Martinko, J. M. Brock Biology of Microorganisms. , 13th ed, Benjamin Cummings. (2011).
- Watson, J. G., Chow, J. C. Aerosol Measurement: Principles and Techniques. , 3rd ed, John Wiley & Sons, Inc. 591-613 (2011).
- Mueller-Anneling, L., Avol, E., Peters, J. M., Thorne, P. S. Ambient endotoxin concentrations in PM10 from Southern California. Environ. Health Perspect. 112, 583-588 (2004).
- Hospodsky, D., Yamamoto, N., Peccia, J. Accuracy, Precision, and Method Detection Limits of Quantitative PCR for Airborne Bacteria and Fungi. Appl. Environ. Microbiol. 76, 7004-7012 (2010).
- Kutyavin, I. V., et al. 3′-Minor groove binder-DNA probes increase sequence specificity at PCR extension temperatures. Nucleic Acids Res. 28, 655-661 (2000).
- Brankatschk, R., Bodenhausen, N., Zeyer, J., Bürgmann, H. Simple absolute quantification method correcting for quantitative PCR efficiency variations for microbial community samples. Appl. Environ. Microbiol. 78, 4481-4489 (2012).
- Strober, W. Appendix 3B, Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Hollander, A., Heederik, D., Versloot, P., Douwes, J. Inhibition and enhancement in the analysis of airborne endotoxin levels in various occupational environments. Am Ind Hyg Assoc J. 54, 647-653 (1993).
- Kennedy, S. PCR troubleshooting and optimization : the essential guide. , Caister Academic Press. (2011).
- Joiner, T. J., Kraus, P. F., Kupiec, T. C. Comparison of Endotoxin Testing Methods for Pharmaceutical Products. Int J Pharm Compd. 6, 408-409 (2002).
- Ebentier, D. L., et al. Evaluation of the repeatability and reproducibility of a suite of qPCR-based microbial source tracking methods. Water Res. 47, 6839-6848 (2013).
