Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Environment

Air-samplet Filter Analyse for endotoksiner og DNA innhold

doi: 10.3791/53444 Published: March 7, 2016

Abstract

Utendørs aerosol forskning bruker ofte svevestøv samples på filtre. Denne fremgangsmåten gjør det mulig for forskjellige karakteristikk av de oppsamlede partikler som skal utføres i parallell. Hensikten med fremgangsmåten som presenteres her, er å oppnå en meget nøyaktig og pålitelig analyse av endotoksin og DNA-innhold av bio-aerosoler ekstrahert fra filtrene. Utvinningen av høy molekylvekt, organiske molekyler, slik som lipopolysakkarider, fra samplede filtre innbefatter risting av prøven i et pyrogenfritt vann-basert medium. Den etterfølgende analyse bygger på en enzymatisk reaksjon som kan detekteres ved hjelp av en turbidimetrisk måling. Som et resultat av det høye organiske innhold i de samplede filtre, er ekstraksjon av DNA fra prøvene utført ved anvendelse av et kommersielt kit DNA-ekstraksjon som opprinnelig ble utviklet for jord og modifiseres for å fremme DNA-utbytte. Påvisning og kvantifisering av spesifikke mikrobielle arter som bruker kvantitativ polymerase chain Reactipå (q-PCR) -analyse er beskrevet og sammenlignet med andre tilgjengelige metoder.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Luft sampling på filtrene er et grunnleggende verktøy i atmosfære aerosoler forskning. 1 De samplede filtrene er utgangspunktet for en rekke kjemiske, fysiske og biologiske karakterisering av de innsamlede omgivelses partiklene. 2-11 Fordelen med denne tilnærmingen er at ulike analyser kan bli utføres off-line på samme prøve. Sammenstille dataene fra alle de ulike analyser gjør det mulig for forskeren å få en god forståelse av hva som kjennetegner de innsamlede partikler og hjelpemidler i å løse komplekse spørsmål i atmosfærisk vitenskap. 12,13 for eksempel marine og innland luftprøver tatt i løpet av samme periode kan sammenlignes med hensyn til det samplede partikkel giftighet og biologisk preparat. 14 for denne studien, lipopolysakkarider (LPS) komponenter på gram-negative bakteriecellevegger, også kjent som endotoksiner, ble ekstrahert fra filtrene samplet på land og ved en innlandet området, og ble evaluert ved bruk avLimulus amebocyttlysat (LAL) test. Parallelt ble en genomisk evaluering av bakterieinnhold (totalt antall bakterier, gram-negative, og cyanobakterier) ble utført på den samme prøven ved hjelp av kvantitativ polymerasekjedereaksjon (q-PCR). LAL-testen er basert på målinger av turbiditet som dannes etter tilsetning av et vandig ekstrakt av amebocytes fra hesteskokrabbe, Limulus Polyfemos, til en vandig oppløsning som inneholder endotoksiner. Jo høyere endotoksin-konsentrasjonen i prøven, utvikler raskere turbiditet. 15 q-PCR-analyse er basert på en fluorescens-signal som sendes ut som et spesifikt DNA-fragment blir amplifisert. 16 Av sanntids overvåkning av signalet i løpet av den eksponensielle fase av PCR reaksjon og kalibrerings med en standardkurve, kan den opprinnelige mengde DNA kvantifiseres. Kombinasjonen av disse to analyser sammen med andre, som beskrevet andre steder, kan 14 tilveiebringe en god estimering av nivåene av endotoksin ogMengden av kilde bakterier i prøvene.

Hensikten med fremgangsmåten som presenteres her, er å oppnå en meget nøyaktig og pålitelig analyse av endotoksin og DNA-innhold av bio-aerosoler ekstrahert fra filtrene. Mens metoder for prøvetaking av fysiske og uorganiske kjemiske karakteristika for aerosoler er velkjente og, mer nylig, metoder har blitt utviklet for å undersøke dens organiske bestanddeler komponent, 17 har det vært snaut forskning på den biologiske komponenten av aerosoler. 18 Bakgrunnen for den aktuelle metode er å ta opp dette gapet ved å presentere i detalj en robust metode for å utvinne, analysere og identifisere biologiske brøkdel av luftbårne aerosoler. 14

Det forventes Metoden beskrevet her for å finne utbredt bruk i biologiske innendørs og utendørs aerosol forskningsprosjekter som involverer filter analyse. 20-24

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Filter sampling
HiVol 3000 - High Volume Air Sampler Ecotech
Quartz Microfiber Filters Whatman 1851-865 203 mm x 254 mm
ELF - Laboratory Chamber Furnaces Carbolite ELF 11series
Aluminum foil Opal
Name Company Catalog Number Comments
Endotoxin
Ethanol Sigma Aldrich 16368  Laboratory Reagent, 96%
Airstream Class II Biological Safety Cabinet AC-4E1 ESCO 10011712
Pyrotell -T Associates of Cape Cod, Inc. T0051
Control Standard Endotoxin Associates of Cape Cod, Inc. E0005-1 Escherichia coli O113:H10, 0.5 µg/vial 1 Pack
LAL Reagent Water Associates of Cape Cod, Inc. W0051
10 ml sterile syringe with Luer-Lok Tip Becton-Dickinson & Co. 309605
BD Precisionglide syringe needle Becton-Dickinson & Co. 305129 Sterile 
Parafilm-M sealing tape Parafilm P7543 Sigma catalog number
Microtubes Axigen MCT-200-C 2 ml, pyrogen free
1.12 cm diameter Cork Borer Boekel Scientific 1601 BD Series - Steel Part of a cork borer set containing borers with various diameters. 
50 mm Petri Dish Miniplast Ein-Shemer 72050-01 Aseptic
Vortex Genie 2  Scientific Industries, inc. SI-0297
Microcentrifuge 5415 D Eppendorf 22621408
TC MicroWell 96 F SI w/lid Nunc 167008 Flat bottom wells (with lid (individually wrapped)), sterile, pyrogen free
Synergy HT Multi-Detection Microplate Reader Biotek 7091000
Name Company Catalog Number Comments
DNA
DNA away Sigma Aldrich 7010
Standard DNA of the microbial species of interest ATCC or other culture collection Either the appropriate microbial strain for DNA extraction or the extracted DNA
Neubauer-improved Marienfeld 640030 hemocytometer
TE buffer, Low EDTA Life Technologies 12090-015 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) 0.1 mM EDTA 
Nuclease-free PCR-grade water  Sigma Aldrich 3315959001
PCR primers Sigma Aldrich Targets the microbial species of interest
Dual-Labeled Probes Sigma Aldrich Targets the microbial species of interest
Screw cap tubes Axigen ST-200-SS 2 ml 
PowerSoil DNA extraction kit  Mo Bio Laboratories 12888-100
Glass beads, acid-washed 425-600 µm Sigma Aldrich G8772-100G
Glass beads, acid-washed <106 µm Sigma Aldrich G4649-100G
PowerSoil Solution C1 Mo Bio Laboratories 12888-100-1 Cell lysis buffer , Power soil Kit
Magic Touch ice bucket Bel-Art 18848-4001
Mini-Beadbeater-16 BioSpec 607EUR
StepOnePlus Real-Time PCR System Applied Biosystems 4376600
Fast SYBR Green Master Mix Applied Biosystems 4385612
TaqMan Gene Expression Master Mix Applied Biosystems 4370048
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 ml Applied Biosystems 4346906
MicroAmp Splash-Free 96-Well Base Applied Biosystems 4312063
MicroAmp Optical Adhesive Film Applied Biosystems 4311971
Centrifuge 5810 R Eppendorf 5811 000.010 Rotor A-4-62 with MTP buckets 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Methods of Air Sampling and Analysis. Lodge, J. P. J. 3rd ed, Lewis Publishers, Inc. (1988).
  2. Costa, V., et al. Characteristics of carbonaceous aerosols in Emilia-Romagna (Northern Italy) based on two fall/winter field campaigns. Atmos. Res. (2015).
  3. Brent, L. C. Development, enhancement, and evaluation of aircraft measurement techniques for national ambient air quality standard criteria pollutants [dissertation]. University of Maryland, College Park. Thesis 3682591 (2014).
  4. Okuda, T., Schauer, J. J., Shafer, M. M. Improved methods for elemental analysis of atmospheric aerosols for evaluating human health impacts of aerosols in East Asia. Atmos. Environ. 97, 552-555 (2014).
  5. Hospodsky, D., et al. Characterizing airborne fungal and bacterial concentrations and emission rates in six occupied children's classrooms. Indoor air. (2014).
  6. Bottos, E., Woo, A., Zawar-Reza, P., Pointing, S., Cary, S. Airborne Bacterial Populations Above Desert Soils of the McMurdo Dry Valleys, Antarctica. Microb. Ecol. 67, 120-128 (2014).
  7. Ovadnevaite, J., et al. Submicron NE Atlantic marine aerosol chemical composition and abundance: Seasonal trends and air mass categorization. J. Geophys. Res. Atmos. 119, (2014).
  8. Lodge, J. Jr ES&T Books: Methods of Air Sampling and Analysis, 3rd ed. Environ. Sci. Technol. 23, 938 (1989).
  9. Aerosol Measurement: Principles, Techniques, and Applications. Pramod, K., Baron, P. A., Willeke, K. John Wiley & Sons. (2011).
  10. Vincent, J. H. Aerosol Sampling: Science, Standards, Instrumentation and Applications. John Wiley & Sons. (2007).
  11. Duquenne, P., Marchand, G., Duchaine, C. Measurement of Endotoxins in Bioaerosols at Workplace: A Critical Review of Literature and a Standardization Issue. Ann. Occup. Hyg. 57, 137-172 (2013).
  12. Okuda, T., Schauer, J. J., Shafer, M. M. Improved methods for elemental analysis of atmospheric aerosols for evaluating human health impacts of aerosols in East Asia. Atmos. Environ. 97, 552-555 (2014).
  13. Lewtas, J. Air pollution combustion emissions: Characterization of causative agents and mechanisms associated with cancer, reproductive, and cardiovascular effects. Mutat. Res.-Rev. Mutat. 636, 95-133 (2007).
  14. Lang-Yona, N., Lehahn, Y., Herut, B., Burshtein, N., Rudich, Y. Marine aerosol as a possible source for endotoxins in coastal areas. Sci. Total. Environ. 499, 311-318 (2014).
  15. Levin, J., Bang, F. B. Clottable protein in Limulus: its localization and kinetics of its coagulation by endotoxin. Thromb. Diath. Haemorrh. 19, 186-197 (1968).
  16. Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6, 986-994 (1996).
  17. O'Dowd, C. D., de Leeuw, G. Marine aerosol production: a review of the current knowledge. Phil. Trans. R. Soc. A. 365, 1753-1774 (2007).
  18. O'Dowd, C. D., et al. Biogenically driven organic contribution to marine aerosol. Nature. 431, 676-680 (2004).
  19. Yang, R., Paparini, A., Monis, P., Ryan, U. Comparison of next-generation droplet digital PCR (ddPCR) with quantitative PCR (qPCR) for enumeration of Cryptosporidium oocysts in faecal samples. Int. J. Parasitol. 44, 1105-1113 (2014).
  20. Stetzenbach, L. D., Buttner, M. P., Cruz, P. Detection and enumeration of airborne biocontaminants. Curr. Opin. Biotechnol. 15, 170-174 (2004).
  21. Dannemiller, K. C., Gent, J. F., Leaderer, B. P., Peccia, J. Influence of housing characteristics on bacterial and fungal communities in homes of asthmatic children. Indoor air. (2015).
  22. Yamamoto, N., Hospodsky, D., Dannemiller, K. C., Nazaroff, W. W., Peccia, J. Indoor emissions as a primary source of airborne allergenic fungal particles in classrooms. Environ. Sci. Technol. 49, 5098-5106 (2015).
  23. Yamamoto, N., et al. Particle-size distributions and seasonal diversity of allergenic and pathogenic fungi in outdoor air. ISME J. 6, 1801-1811 (2012).
  24. Karottki, D. G., et al. Cardiovascular and lung function in relation to outdoor and indoor exposure to fine and ultrafine particulate matter in middle-aged subjects. Environ Int. 73, 372-381 (2014).
  25. Guy, D. Endotoxins and Depyrogenation. Industrial Pharmaceutical Microbiology: Standards and Controls. Hodges, N., Hanlon, G. Euromed. 12.1-12.15 (2003).
  26. Associates of Cape Cod Incorporated. Limulus Amebocyte Lysate - PYROTELL-T. Available from: http://www.acciusa.com/pdfs/accProduct/inserts/PyrotellT.pdf (2006).
  27. Associates of Cape Cod Incorporated. Endotoxin (E. coli O113:H10) Control Standard Endotoxin (CSE). Available from: http://www.acciusa.com/pdfs/accProduct/pisheets/CSE%200.5ug.pdf (2007).
  28. Associates of Cape Cod Incorporated. Cape Cod Certificate of Analysis. Available from: http://www.acciusa.com/pageCOA.php (2015).
  29. Thorne, P. S., Bartlett, K. H., Phipps, J., Kulhankova, K. Evaluation of Five Extraction Protocols for Quantification of Endotoxin in Metalworking Fluid Aerosol. Ann. Occup. Hyg. 47, 31-36 (2003).
  30. Thornton, B., Basu, C. Real-time PCR (qPCR) primer design using free online software. Biochem. Mol. Biol. Educ. 39, 145-154 (2011).
  31. Madigan, M. T., Clark, D. P., Stahl, D., Martinko, J. M. Brock Biology of Microorganisms. 13th ed, Benjamin Cummings. (2011).
  32. Watson, J. G., Chow, J. C. Aerosol Measurement: Principles and Techniques. 3rd ed, John Wiley & Sons, Inc. 591-613 (2011).
  33. Mueller-Anneling, L., Avol, E., Peters, J. M., Thorne, P. S. Ambient endotoxin concentrations in PM10 from Southern California. Environ. Health Perspect. 112, 583-588 (2004).
  34. Hospodsky, D., Yamamoto, N., Peccia, J. Accuracy, Precision, and Method Detection Limits of Quantitative PCR for Airborne Bacteria and Fungi. Appl. Environ. Microbiol. 76, 7004-7012 (2010).
  35. Kutyavin, I. V., et al. 3′-Minor groove binder-DNA probes increase sequence specificity at PCR extension temperatures. Nucleic Acids Res. 28, 655-661 (2000).
  36. Brankatschk, R., Bodenhausen, N., Zeyer, J., Bürgmann, H. Simple absolute quantification method correcting for quantitative PCR efficiency variations for microbial community samples. Appl. Environ. Microbiol. 78, 4481-4489 (2012).
  37. Strober, W. Appendix 3B, Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  38. Hollander, A., Heederik, D., Versloot, P., Douwes, J. Inhibition and enhancement in the analysis of airborne endotoxin levels in various occupational environments. Am Ind Hyg Assoc J. 54, 647-653 (1993).
  39. Kennedy, S. PCR troubleshooting and optimization : the essential guide. Caister Academic Press. (2011).
  40. Joiner, T. J., Kraus, P. F., Kupiec, T. C. Comparison of Endotoxin Testing Methods for Pharmaceutical Products. Int J Pharm Compd. 6, 408-409 (2002).
  41. Ebentier, D. L., et al. Evaluation of the repeatability and reproducibility of a suite of qPCR-based microbial source tracking methods. Water Res. 47, 6839-6848 (2013).
Air-samplet Filter Analyse for endotoksiner og DNA innhold
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lang-Yona, N., Mazar, Y., Pardo, M., Rudich, Y. Air-sampled Filter Analysis for Endotoxins and DNA Content. J. Vis. Exp. (109), e53444, doi:10.3791/53444 (2016).More

Lang-Yona, N., Mazar, Y., Pardo, M., Rudich, Y. Air-sampled Filter Analysis for Endotoxins and DNA Content. J. Vis. Exp. (109), e53444, doi:10.3791/53444 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter