Abstract
la recherche d'aérosol extérieure utilise couramment les matières particulaires échantillonné sur les filtres. Cette procédure permet à diverses caractérisations des particules collectées à effectuer en parallèle. Le but de la méthode présentée ici est d'obtenir une analyse très précise et fiable de l'endotoxine et l'ADN contenu des bio-aérosols extraits de filtres. L'extraction de poids moléculaire élevé des molécules organiques, telles que des lipopolysaccharides, des filtres échantillonnés consiste à secouer l'échantillon dans un milieu à base d'eau exempte de pyrogènes. L'analyse qui suit est basée sur une réaction enzymatique qui peut être détectée au moyen d'une mesure turbidimétrique. En conséquence de la teneur organique élevée sur les filtres de l'échantillon, l'extraction de l'ADN à partir des échantillons est effectuée en utilisant un kit d'extraction d'ADN du commerce qui a été conçu à l'origine pour les sols et modifié pour améliorer le rendement de l'ADN. La détection et la quantification des espèces microbiennes spécifiques à l'aide Reacti en chaîne par polymérase quantitativesur (q-PCR) sont décrits et par rapport aux autres méthodes disponibles.
Introduction
Des prélèvements d'air sur les filtres est un outil de base dans la recherche sur les aérosols atmosphériques. 1 Les filtres échantillonnés sont le point de départ pour diverses caractérisations biologiques des particules ambiantes recueillies chimiques, physiques, et. 2-11 L'avantage de cette approche est que différentes analyses peuvent être effectuée hors ligne sur le même échantillon. Compiler les données de toutes les différentes analyses permet au chercheur d'obtenir une bonne compréhension des caractéristiques des particules collectées et les aides à la résolution des questions complexes dans les sciences de l' atmosphère. 12,13 Par exemple, l' air-échantillons marins et intérieures prises au cours de la même période peut être comparé en ce qui concerne la toxicité des particules échantillonnée et la composition biologique. 14 pour cette étude, les lipopolysaccharides (LPS), des composants sur bactériennes parois cellulaires gram-négatives, également connu sous endotoxines ont été extraites des filtres échantillonnés à terre et à un site intérieur, et ont été évalués en utilisant lelimule amébocyte lysat (LAL). En parallèle, une évaluation génomique de la teneur en bactéries (bactéries totales, Gram-négatives, et les cyanobactéries) a été effectuée sur le même échantillon en utilisant la réaction en chaîne par polymérase quantitative (Q-PCR). Le test LAL est basée sur des mesures de turbidité formées suite à l'ajout d'un extrait aqueux de amœbocytes de la limule, Limulus polyphemus, à une solution aqueuse contenant les endotoxines. Plus la concentration d'endotoxine dans l'échantillon, la turbidité se développe rapidement. 15 L'analyse Q-PCR est basée sur un signal de fluorescence émis sous forme d' un fragment spécifique d'ADN est amplifiée. 16 Par suivi en temps réel du signal pendant la phase exponentielle de la PCR réaction et étalonnage avec une courbe standard, la quantité d'ADN initial peuvent être quantifiés. La combinaison de ces deux analyses avec d' autres, comme détaillé ailleurs, 14 peuvent fournir une bonne estimation des niveaux d'endotoxines et de laquantité de bactéries d'origine dans les échantillons.
Le but de la méthode présentée ici est d'obtenir une analyse très précise et fiable de l'endotoxine et l'ADN contenu des bio-aérosols extraits de filtres. Bien que les méthodes d'échantillonnage des caractéristiques physico - chimiques et inorganiques des aérosols sont bien connus et, plus récemment, des méthodes ont été développées pour enquêter sur sa composante de matière organique, 17 il y a eu peu de recherches sur la composante biologique des aérosols. 18 La raison pour laquelle le courant méthode consiste à combler cette lacune en présentant en détail une méthode robuste pour extraire, analyser et identifier la fraction biologique des aérosols atmosphériques 14.
La méthode détaillée ici devrait trouver une large utilisation dans les projets intérieurs et extérieurs biologiques aérosol recherche impliquant l' analyse du filtre. 20-24
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Protocol
Note: Une liste détaillée de tous les matériaux et instruments utilisés dans ce protocole est indiqué dans la section des matériaux.
1. Air Sampling sur Filtres
- Préparation des filtres
- Pour l' échantillonnage à volume élevé, utilisez 20,3 x 25,4 cm 2 filtres. Choisissez le type de filtre qui correspond le mieux aux besoins de la recherche, ainsi que la taille de coupure du filtre, le cas échéant. 1 Ici, les filtres en microfibres utilisation de quartz.
- filtres pré-cuisson servant au prélèvement du composé organique et biologique pour détruire les résidus organiques. Pour pré-cuire les filtres, les envelopper individuellement dans une feuille d'aluminium, puis les faire cuire dans un four de laboratoire à 450 ° C pendant au moins 5 heures.
- Conserver les filtres cuits à -20 ° C jusqu'à ce que l'échantillonnage.
- Manipulation de l'instrument et d'échantillonnage d'air
- la poussière résiduelle propre de la tête de l'échantillonneur à volume élevé. Essuyez les pièces avec des lingettes en papier propres et leur permettre de befo d'air secre les reconnecter à l'échantillonneur.
- Désinfecter la cassette de filtre avec de l'éthanol, et de travailler avec des gants et une blouse en tout temps.
- Placer un filtre pré-cuit à l'intérieur de la cassette de filtre propre, et procéder selon le manuel de l'échantillonneur à volume élevé.
- Marquez la date et les conditions météorologiques inhabituelles, le cas échéant (par exemple la pluie, tempête de poussière) sur la pellicule d'aluminium, et enregistrez - le dans un endroit propre jusqu'à la fin de l' échantillonnage.
- Recueillir le filtre échantillonné et le plier en deux, avec le côté échantillonné vers l'intérieur.
- Enveloppez le filtre dans la feuille d'aluminium d'origine et conserver à -20 ° C jusqu'à l'analyse.
Remarque: Si le délai entre le prélèvement et l'analyse est plus de 2 mois, stocker l'échantillon à -80 ° C pour éviter la dégradation de la matière organique et biologique.
2. Analyse des endotoxines
Note: Désinfecter la surface de travail avec 70% d'éthanold travail avec apyrogènes tubes, des conseils et des réactifs seulement. Si la verrerie sont utilisés, pré-chauffage à 250 ° C pendant 30 minutes, ou 200 ° C pendant 60 minutes est nécessaire. 25 Préparer tous les réactifs dans une enceinte de sécurité biologique de classe II et de travailler avec des gants et une blouse en tout temps.
- Préparation des réactifs
- Suivre le protocole du fabricant LAL kit pour réhydrater le lysat peu avant l' utilisation. 26 Tapez doucement le flacon pour déloger LAL restant sur les parois de la bouteille. Soulevez le bouchon doucement pour casser le vide. En utilisant une seringue aiguilleté, ajouter 5 ml d'eau apyrogène (PFW) dans le flacon pour réhydrater tout le contenu de lysat et mélanger doucement pour éviter la formation de mousse.
- Sceller le flacon avec un film de paraffine plastique lorsqu'ils ne sont pas en cours d'utilisation et conserver à 4 ° C pendant jusqu'à deux jours. Rangez tout lysat restant à -20 ° C pendant jusqu'à trois mois.
Remarque: Ce réactif peut être congelé une seule fois. - Réhydrater le contrôle endotoxine standard (CSE), qui contient 0,5 μ; g E. coli, en conformité avec le protocole du fabricant. 27 Déterminer la quantité spécifique d'eau à ajouter au flacon CSE à partir du site Web du fabricant 28 en entrant le numéro de lot du kit où spécifié sur le site. La concentration finale de E. coli dans le flacon, est mesuré en unités d'endotoxines (UE, où 10 UE = 1 ng). Nommez ce flacon ed0.
- Sceller le flacon CSE avec un film de paraffine plastique lorsqu'ils ne sont pas en cours d'utilisation et conserver à 4 ° C pendant jusqu'à 4 semaines.
- Courbe standard et préparation Pointu-filtre
- Dans une biosécurité armoire de classe II, préparer 22 tubes de 2 ml de centrifugeuse libre de pyrogènes contenant des quantités décroissantes de CSE (tubes Ed1-ED11) ou pas du CST (le tube ne contenant que PFW) pour produire une série de dilutions d'endotoxine dupliqué, comme indiqué dans le tableau 1.
- Dans une armoire biologique avec écoulement circulaire, couper 22 pièces circulaires de nettoyage filtre, pré-cuit en utilisant un désinfectée 1.1 2 cm de diamètre perce-bouchon.
- Placer les paires de filtres dans des boîtes de Pétri stériles.
- Spike 50 ul de chaque membre de la série endotoxine de dilution Ed2-ED11 et de l'ébauche de tube sur une paire correspondante de filtres.
- Laissez les boîtes de Petri contenant les filtres dopés ouverts sous la hotte à sécher pendant 30 minutes.
- Placer chaque élément de filtre dans un tube de 2 ml apyrogène.
| Tube | Concentration d'endotoxine final (UE ml -1) | Le volume d'endotoxine standard (ml) | Volume d'eau Apyrogène (ml) | volume total (ml) | ed0 | 2.500 | solution de stock * | 5 |
| Ed1 | 1000 | 80 (à partir ed0) | 120 | 200 |
| Ed2 | 100 | 20 (à partir Ed1) | 180 | 200 |
| Ed3 | 50 | 10 (à partir Ed1) | 190 | 200 |
| Ed4 | 25 | 5 (à partir Ed1) | 195 | 200 |
| ED5 | 12.5 | 2,5 (à partir Ed1) | 197,5 | 200 |
| ED6 | 6,25 | 1,25 (à partir Ed1) | 198,75 | 200 |
| Ed7 | 3.125 | 6,25 (à partir Ed2) | 193.75 | 200 |
| Ed8 | 1.563 | 6,25 (à partir Ed3) | 193.75 | 200 |
| ED9 | 0.781 | 6,25 (à partir Ed4) | 193.75 | 200 |
| ED10 | 0,391 | 6,25 (à partir ED5) | 193.75 | 200 |
| ED11 | 0,195 | 6,25 (à partir ED6) | 193.75 | 200 |
| Blanc | 0 | 0 | 200 | 200 |
Tableau 1:. Endotoxine standard Courbe concentration des endotoxines, le volume d'endotoxine standard et de l' eau apyrogène à ajouter, et le volume total obtenu sont détaillés pour chaque tube de dilution dans la courbe d'étalonnage.
- Extraction des endotoxines de l'expérimental et Filtres Pointu
- Dans une armoire biologique avec écoulement circulaire, couper les filtres de prélèvement (de l'étape 1.2) en morceaux circulaires en utilisant un désinfectée 1,12 cm de diamètre perce-bouchon, et placez-les, ainsi que les filtres standards enrichis (de l'étape 2.2) dans 2 apyrogène tubes ml (ie, les tubes d'échantillons).
- Ajouter 1 ml PFW les tubes et les secouer pendant 60 min à température ambiante, en utilisant un agitateur de laboratoire.
- Centrifuger les tubes d'échantillon dans une microcentrifugeuse à 375 xg pendant 10 min. 29
- e Transferte surnageant, qui contient les endotoxines, dans un nouveau tube 2 ml apyrogène.
- Limulus Amebocyte Lysate (LAL)
- Déterminer la concentration d'endotoxine dans les échantillons en effectuant le test LAL dans une microplaque à 96 puits apyrogène avec un fond plat et d'un couvercle.
- Planifier la matrice de la plaque à l' avance, comme le montre la figure 1. Inclure une courbe standard préparée directement à partir de solutions étalons d'endotoxine Ed2-ED11 (et donc couvrant la gamme de concentration de 100-0.195 UE / ml (voir section 2.2)) dans chaque plaque en cours d' exécution . La courbe standard doit occuper les puits 1-10 de lignes A et B de la plaque. Mettez de côté les puits 11-12 dans ces lignes pour des échantillons blancs (soit un total de quatre blancs).
- Activer le lecteur de microplaque et le programmer pour une réaction cinétique impliquant l'incubation de la microplaque à 37 ° C et en agitant toutes les 5 minutes, suivie par des mesures d'absorption à 405 nm. Répétez 18 fois pendant 1,5 heure.
- Déterminer le efficiency avec laquelle les endotoxines sont extraites des filtres de prélèvement (ie., les échantillons obtenus à partir des filtres standards enrichis) via la division de la quantité d'endotoxine calculée par le montant initial ensemencés.
- Démarrez le test en plaçant 50 ul des solutions d'endotoxines standards (de l'étape 2.4.2), ou de l'extrait de filtre à pointes et ses ébauches (de la section 2.3), ou des échantillons expérimentaux et ses ébauches (également de la section 2.3), selon la plaque-matrice prévue (Figure 1) et fermez le couvercle.
- Pour chaque puits, ajouter rapidement 50 pi de solution LAL, et secouez doucement la plaque horizontalement alors qu'il est placé sur la table avant de le soulever dans le lecteur.
- Placer la plaque dans le lecteur de plaque et commencer la course expérimentale.
Figure 1:. Plaque de matrice endotoxines Un exsuffisamment d'un tableau d'analyse des endotoxines dans une microplaque à 96 puits.
3. Analyse génomique
Remarque: Pour l'extraction d'ADN, désinfecter la surface de travail avec 70% d'éthanol et de travailler avec des tubes stériles, des conseils et des réactifs seulement. Pour l'analyse q-PCR de l'ADN, désinfecter la surface de travail avec la surface de l'ADN-décontaminant. Préparer tous les réactifs dans une armoire de biosécurité de classe II et de travailler avec des gants et une blouse en tout temps.
- Préparation des ADN Amorces et sondes
- Avant l' extraction d'ADN, soit pour un ensemble disponible dans le commerce d'amorces et d' une sonde (si la méthode de la sonde d'hydrolyse est appliquée), ou concevoir un nouvel ensemble d'amorces et une sonde en utilisant l' amorce de la conception des outils de calcul. 30
- Réhydrater les amorces selon le protocole du fabricant en utilisant soit 10 mM de Tris-0,1 mM d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) (tampon TE) ou de l'eau de qualité PCR.
Remarque: Il est recommandé de dissoudre l'amorce PCR initiale stock dans un tampon TE à faible EDTA (0,1%), telle qu'elle empêche la dégradation de l'amorce, lorsqu'il est conservé pendant des durées plus longues. Utiliser de l'eau PCR de qualité pour les dilutions ultérieures pour réduire les quantités d'EDTA qui pourraient inhiber les réactions de PCR. - Préparer des aliquotes de 50 ul ou 100 ul de l'amorce et de la sonde dans 0,5 ml tubes stériles et conserver à -20 ° C jusqu'à l'analyse.
- Norme d'évaluation cellule de concentration avant l'extraction de l'ADN
- Dans un tube de centrifugeuse de taille appropriée, préparer une solution standard de cellule des espèces microbiennes d'intérêt (OD0 le tube, le tableau 2A). Mélanger la suspension de cellules par pipetage vers le haut et vers le bas dans le tube 7-10 fois à l'aide d'une pipette avec un petit alésage.
- Si les cellules sont colorées (par exemple , certaines spores fongiques), ne pas effectuer une procédure de coloration. Si la coloration des cellules est nécessaire, diluer la suspension cellulaire dans un colorant approprié pour la détection microscopique des cellules d'intérêt. 31
- Nettoyez la lamelle et hemocytomEter avec de l'éthanol. Mouiller et apposer le lamelle à l'hémocytomètre.
- Chargez environ 8 pi de la suspension cellulaire dans les deux chambres de hémocytomètre en touchant soigneusement le bord de la lamelle avec la pointe de la pipette et le remplissage de la chambre par action capillaire. Ne pas remplir sur / sous la chambre.
- Déterminer le nombre de cellules en les regardant au microscope à un grossissement de 400X (40X dans l'objectif et 10X dans oculaire). Neuf carrés mesurant 1 x 1 mm 2 et disposés en une grille de 3 x 3 doivent être considérées. Concentrez le microscope sur l'une des quatre cases de coins de la grille (un grossissement plus élevé peut être utilisé). Le 2 mm carré 1 x 1 devrait contenir 16 petits carrés.
- Compter toutes les cellules dans les quatre 1 x 1 mm 2 carrés d'angle, ainsi que sur la place centrale de la grille 3 x 3. S'il y a trop ou trop peu de cellules pour compter, répéter la procédure, soit la concentration ou la dilution de la suspension cellulaire d'origine, le cas échéant (15-50 cellules devraient recouvrir une 1 mm 2 zone singulariser).
- Calculer la concentration des cellules (cellules ml -1) dans la suspension de cellules standard OD0 de la cellule comptent en moyenne sur les cinq carrés comptés comme suit: carré de comptage cellulaire count ml -1 = cellule moyenne -1 Dilution Factor 10 4.
- L'évaluation de l'efficacité d'extraction d'ADN
- Préparer neuf stériles tubes de 0,5 ml , conformément au tableau 2A.
- Diluer la solution de cellules standard (OD0) contient environ 10 7 cellules ml - 1 dans un volume total de 20 ul (OD1).
- Ajouter 18 ul d'eau PCR de qualité stérile sans nucléase (SNF) aux tubes Od2-OD8 et 20 pi au tube vide, OD9.
- Transfert de 2 ul de la solution cellulaire à partir OD1 en Od2. Pipette doucement pour mélanger et transférer 2 pl du tube Od2 à OD3. Continuer à diluer les cellules de la même manière le long des tubes jusqu'à et y compris le tube OD8 à obtenir une dilution en série de 10 7 -10 0 cellules ml -1.
- Dans une armoire biologique avec écoulement circulaire, couper 18 pièces circulaires propre filtre, pré-cuit, en utilisant un désinfectée 1,12 cm de diamètre perce-bouchon. Placez les filtres par paires dans des boîtes de Petri stériles.
- Spike 10 ul de dilutions à OD1 OD8 et du tube-ébauche OD9 sur chacun des filtres couplés, de sorte qu'il y a une paire de filtres correspondant à chaque concentration de cellules standard.
- Laissez les boîtes de Pétri ouvertes sous le capot et les laisser sécher pendant 30 minutes.
- Placez chaque morceau de filtre dans une vis-top 2 ml tube stérile et extraire l'ADN selon la procédure détaillée dans la section 3.4.
- Extraction de l'ADN de l'expérimental et Filtres Pointu
Remarque: Pour l'extraction d'ADN à partir des filtres, en utilisant des kits commerciaux destinés à l'extraction d'ADN à partir du sol selon le protocole du fabricant avec les modifications suivantes.- Pour chaque filter échantillon (OD1-OD8), préparer un mélange de billes acide lavé verre dans un tube stérile de 0,5 ml. En utilisant 0,1 g de perles ayant un diamètre de 425-600 um et 0,3 g de billes ayant un diamètre de ≤106 nm.
- Dans une armoire biologique avec écoulement circulaire, couper trois pièces circulaires à partir d'emplacements choisis au hasard sur chaque échantillon de filtre à l'aide d'un désinfectée 1,12 cm de diamètre perce-bouchon, et les placer dans vissable tubes de 2 ml.
- Ajouter le mélange de perles de verre dans les tubes.
- Ajouter le tampon de lyse cellulaire fourni avec le kit d'extraction pour chacun des tubes dans l'armoire biologique, la quantité indiquée dans le protocole du fabricant.
- Préparer un seau de glace et de perturber les cellules mécaniquement à l'aide d'un batteur à billes.
- Battre les perles pendant 1 min, puis placez-les sur la glace pendant 1 min. Répétez cinq fois.
- Procédez avec le protocole du fournisseur de kit de l'étape de post-lyse.
- Après élution avec le tampon d'élution fourni (contenant 10 mM de Tris buffer) ou SNF, rechargent l'échantillon élué à travers la colonne à nouveau pour améliorer le rendement de l'ADN.
Nota: Dans le cas contraire analysés le même jour que l'extraction d'ADN, les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C jusqu'à l'analyse.
| A- Préparation de la norme série de cellules de Dilution | ||||
| Tube | La concentration finale de cellules (cell ml -1) | volume de cellule standard (ml) | volume d'eau exempte de nucléase (ml) | Volume total (ml) |
| OD0 | déterminer avec Hemocytometer chambre de comptage | |||
| øD1 | doit être élue dans la plage de 10 7 cellules ml -1 | 20 | ||
| Od2 | 10 -1 øD1 | 2 øD1 | 18 | 20 |
| OD3 | 10 -2 øD1 | 2 Od2 | 18 | 20 |
| OD4 | 10 -3 øD1 | 2 OD3 | 18 | 20 |
| OD5 | 10 -4 øD1 | 2 OD4 | 18 | 20 |
| Od6 | 10 -5 øD1 | 2 OD5 | 18 | 20 |
| Od7 | 10 -6 øD1 | 2 Od6 | 18 | 20 |
| OD8 | 10 -7 øD1 | 2 Od7 | 18 | 20 |
| Blanc | 0 | 0 | 20 | 20 |
| B- Préparation de la courbe standard d' ADN | ||||
| Tube | Concentration finale de l' ADN (mg ml -1) | le volume de l'ADN standard (ml) | volume d'eau exempte de nucléase (ml) | Volume total (ml) |
| déterminer avec NanoDrop | ||||
| Dd1 | devrait être élue à la gamme de 10 à 1 mg ml -1 | 20 | ||
| Dd2 | 10 -1 Dd1 | 2 Dd1 | 18 | 20 |
| DD3 | 10 -2 Dd1 | 2 Dd2 | 18 | 20 |
| DD4 | 10 -3 Dd1 | 2 DD3 | 18 | 20 |
| DD5 | 10 -4 Dd1 | 2 DD4 | 18 | 20 |
| Dd6 | 10 -5 Dd1 | 2 DD5 | 18 | 20 |
| DD7 | 10 -6 Dd1 | 2 Dd6 | 18 | 20 |
| DD8 | 10 -7 Dd1 | 2 DD7 | 18 | 20 |
| Blanc | 0 | 0 | 20 | 20 |
. Tableau 2: Courbe standard d' ADN standard série de dilutions de cellules de micro - organisme (A) détaillé du volume normal de la cellule, le volume SNF, et le volume total dans chaque tube de dilution. Préparation ADN standard de la courbe (B), détaillé pour le volume standard d'ADN, le volume SNF, et le volume total dans chaque tube de dilution.
- Préparation courbe standard ADN
- Utiliser un spectrophotomètre pour déterminer la concentration d'ADN de l'échantillon d'ADN standard (DD0) à 260 nm.
- Préparer neuf stériles tubes de 0,5 ml à partir de laquelle pour préparer une courbe standard d'ADN, comme indiqué dans le tableau 2B.
- Si nécessaire, diluer la solution d'ADN standard DD0 à l' intérieur d' une plage de concentrations de 1-10 pg ml - 1 dans le premier tube (Dd1) dans un volume total de 20 ul.
- Ajouter 18 pi de SNF aux tubes Dd2-DD8 et 20 pi au tube vide.
- Transfert 2 pl de la solution d'ADN standard de Dd1 en Dd2. Pipet doucement pour mélanger puis transférer 2 pl de Dd2 à DD3. Continuer la dilution de l'ADN de la même manière le long des tubes pour parvenir à une dilution en série de 10 0 -10 -7 Dd2 dans des tubes-DD8 conjointement avec un tube vide containing seulement SNF.
Remarque: Dans le cas contraire analysés le jour même de l'extraction, conserver les échantillons à -20 ° C jusqu'à l'analyse.
- Allumez l'instrument q-PCR à l'avance pour se réchauffer.
- Dans un nouveau fichier de programme, insérer les détails pour le q-PCR exécuter dans le logiciel de l' appareil fonctionnant comme détaillé dans le tableau 3.
Remarque: Différents instruments ont différents moment optimal pour chaque étape du cycle thermique. Cette entrée est spécifiée dans le manuel de l'instrument. - Désinfecter la surface de travail avec la surface de l'ADN-décontaminant et de travailler uniquement avec des tubes stériles, des conseils et des réactifs.
- Préparer un seau de glace à côté du banc de travail. Magasin Taq-polymérase mélange sur la glace.
- Calculer le nombre total de puits de réaction qui seront occupés dans la plaque. Faire provision théorique pour des réactions supplémentaires (5%) et multiplier le nombre élargi de réactions par le volume par réaction pour calculer la reactio totalen volume.
- Préparer la piscine de réaction mixte, à partir de SNF, les amorces, la sonde, et enfin le mélange de polymerase Taq. Voir l' exemple pour les calculs de volume pour la piscine mixte dans le tableau 4.
- Stocker le mélange de réaction dans l'obscurité et sur la glace jusqu'à utilisation.
- Placer 1 pi d'ADN standard, l'ADN de l'échantillon, ou SNF (comme témoin négatif) à l'intérieur des puits dans la microplaque q-PCR en triple exemplaire.
- Faire en sorte que la plaque est un support de plaque pour l'empêcher de toucher la surface de travail et pour le maintenir propre.
- Ajouter 9 pi de la piscine mixte (tableau 4) dans chaque puits de réaction.
- Couvrir la plaque avec un film adhésif optique et sceller hermétiquement de tous les côtés.
- Isoler la plaque dans une centrifugeuse avec des seaux de plaque pendant 1 min à 1000 xg avant de le placer dans le dispositif q-PCR.
- Placer la plaque dans l'instrument et activer le programme en cours d'exécution.
| Paramètre | Détails | commentaires |
| Méthode de détection | sonde d'hydrolyse quantitative | |
| Les conditions de cyclage thermique | ||
| Dénaturation initiale et l'activation de l'enzyme | 95 ° C pendant 10 min | |
| Dénaturation | 95 ° C pendant 15 sec | répéter 45 fois |
| Recuit et l'extension | 60 ° C pendant 60 sec | |
| array Plate | ||
| courbe standard | Dd1 - DD8 | 3 répétitions par dilution dans 1-8 puits à 3 rangées supérieures |
| Contrôle non-template (NTC) | eau libre nucléase (SNF) | 3 répétitions dans le 9 ème et au sommet3 rangées. |
| Les échantillons analysés | ADN extrait des filtres | 3 répétitions par échantillon dans les puits restants. |
| Amorce | par chaque puits | |
| volume d'échantillon | 10 ml |
Tableau 3:. Détails pour le logiciel d' exploitation q-PCR Détails des paramètres d'analyse pour être entrés dans le fichier de programme q-PCR.
| Réactif | Volume par réaction (ml) | Nombre de réactions | Provision pour erreur(5%) | Mix volume total (ml) |
| Taq polymérase mix | 5 | 50 | 52,5 | 262,5 |
| F amorce (10 mM) | 0,5 | 50 | 52,5 | 26.25 |
| R primaire (10 mM) | 0,5 | 50 | 52,5 | 26.25 |
| eau libre nucléase | 3 | 50 | 52,5 | 157,5 |
| ADN - 1 ml sera ajouté directement dans les puits de cibles dans la plaque 96. | ||||
Tableau 4:. Quantitative-PCR Réaction Mix Calcul Volume par réaction, nombre de réactions, l' allocation pour l' erreur, et le volume total calculé à ajouter dans le mélange de réaction par réactif sont détaillées.
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Representative Results
Il est commun pour étudier les aérosols atmosphériques en utilisant "off-line" analyses de filtres échantillonnés (voir la figure 2). 32 Les analyses chimiques de la matière comprennent organique (par exemple les protéines, les molécules d'hydrocarbures, saccharides) et inorganiques (métaux, sels) contenu échantillonné . Les analyses biologiques comprennent le contenu viable et non viable microorganisme, l'identification des espèces en utilisant une approche de l'ADN ou de la microscopie, ainsi que la quantification à base d'ADN.
Figure 2: Filer tableau échantillon de flux d'analyse du filtre après air-échantillonnage (A), la préparation du filtre pour les analyses en aval (B), et l' analyse des composants de l' échantillon (C)..
e = "1"> Pour l'extraction des endotoxines, des sous-échantillons de filtre (1,12 cm 2) sont agités dans 1 ml PFW pendant 60 min à température ambiante. Les échantillons sont ensuite centrifugés pendant 10 min à 375 x g. Les vitesses de centrifugation différentes peuvent conduire à différentes efficacités d'extraction, comme indiqué sur la figure 3A.
Un essai préliminaire pour l'efficacité de l'extraction doit être effectuée pour le filtre spécifique choisi et le protocole effectué. Sur la figure 3B, la hausse des rendements d'extraction sont obtenus à partir de dopage propre par rapport aux filtres à quartz échantillonnés, et ces deux rendements sont inférieurs à celle obtenue par détection directe de la solution standard. Comme on le verra d' ailleurs, la nature des aérosols ambiants de l' échantillon sur le filtre peut également affecter l'efficacité d'extraction d'endotoxine. 14,33
g3.jpg "/>
Figure 3: Efficacité d'extraction d' endotoxine L'effet de la vitesse de centrifugation (A) et la charge du filtre (B) sur l' efficacité d'extraction d'endotoxine.. Les barres d'erreur représentent l' écart - type. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
La réaction pour la détection d'endotoxine comprend un rapport 1: 1 de réactif LAL à la norme de l'endotoxine, les endotoxines extraites de l'échantillon, ou les ébauches. Il est recommandé d'utiliser triplicats pour l'analyse de l'échantillon. Cependant, pour des courbes standard, les doublons sont suffisantes. Lorsque les lectures d'absorption (à 405 nm) sont terminées, la densité optique résultante (OD) est analysé après l'exportation dans un programme de tableur d'analyse de données pour une analyse ultérieure des données.
Comme dans l'extraction d'endotoxine, il est important d'effectuer une analyse préliminaire de l'efficacité de l'extraction de l'ADN dans les conditions expérimentales spécifiques. Ceci est réalisé en ensemençant une quantité connue d'une solution de cellules d'un organisme étalon sur une pièce découpée à partir du filtre, en suivant le protocole d'extraction d'ADN décrit ci-dessus. La concentration du micro-organisme cible extrait des aérosols de l'échantillon est déterminée en utilisant Q-PCR. Ici , la technique de la sonde d'hydrolyse est utilisé, ce qui présente l'avantage d' une grande spécificité, en raison de la sonde supplémentaire liée à l'ADN matrice. 35 La méthode vert SYBR peut également être utilisé à cet effet. Des courbes d'étalonnage sont obtenues à partir d'ADN extrait à partir des organismes choisis d'intérêt, en utilisant la méthode d'extraction décrite ci-dessus. Un pool mixte des composés de réaction, à l'exclusion de l'échantillon d'ADN, standard, ou le contrôle, est préparé et maintenu dans l'obscurité et sur la glace jusqu'à ce que nécessaire. Ensuite, une partie aliquote du pool mixte est ajouté dans chaque puits dans une plaque à 96 micropuits optique. La norme de l'ADN, l'échantillon ou du contrôle est ajouté après le mélange de réaction selon le tableau de la plaque. Une fois que tous les réactifs ont été introduits dans la plaque, il est marinconduit à un film adhésif optique et centrifugés pour recueillir toutes les gouttelettes au fond des puits. La plaque est introduite dans de l'instrument q-PCR pour l'amplification du cycle thermique et la détection du signal. Les données de sortie sont des valeurs Ct PCR, qui sont définis comme le nombre de cycles à laquelle la quantité d'ADN amplifié atteint le niveau de seuil. En utilisant les valeurs d'étalonnage de la courbe, la concentration de l' ADN cible peut être obtenue (voir la figure 4). 36 Les concentrations de cellules de micro - organisme peut être calculé à partir des valeurs de Ct de l'efficacité de l' extraction par rapport à un nombre de hémocytomètre de la solution d'organisme standard. 37 
Figure 4: Quantitative-PCR graphique d'amplification (A) et calibrat.courbe ion comprise entre 2 x 10 -4 -2 x 10 2 (B) réalisée pour l' ADN bactérien Gram négatif représentant. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Cet ouvrage décrit les méthodes d'extraction et de détection pour quantifier les endotoxines et de l'ADN présent dans des échantillons d'aérosols collectés sur des filtres. Les méthodes nécessitent des routines précises et peuvent être réalisées facilement aussi longtemps que l'expérimentateur adhère à quelques points essentiels et importants discutés ici.
Pour l'étape de détection d'endotoxine, notons que la solution de lysat est tout à fait visqueux et tend à produire des bulles lors de pipetage. Il est difficile d'enlever te bulles, et ils conduisent à des changements dans les valeurs microplaque-reader. Par conséquent, il est important d'abord placer l'échantillon dans la plaque et seulement après s'être assuré que toutes les bulles disparaissent, continuer avec l'addition de la solution de lysat. Une technique utile pour prévenir la formation de bulles dans cette étape est de travailler lentement avec la pipette, et de ne pas appuyer sur tout le chemin lors de la vidange du lysat dans les puits. En réaction commence immédiatement une fois que le lysat est ajouté à la endotoxin extrait, il est essentiel de commencer la lecture dès que possible. Pour raccourcir l'étape d'addition du lysat, une pipette à canaux multiples peut être utilisé. A noter que dans certains kits et protocoles il y a une étape supplémentaire de pré-incubation des échantillons à 37 ° C pendant 10 min, puis elle est placée dans la plaque de micro titter. 29 seulement après cette étape, le lysat peut être ajouté.
Un point important pour l' extraction de l' échantillon environnemental des endotoxines est la présence d'inhibiteurs dans les échantillons (par exemple en haute pollution échantillon d'air). Dans ce cas, la dilution devient critique, et peut prévenir fausse amélioration, généralement observée pour l' échantillon non dilué. 38
De même, il y a plusieurs points importants pour assurer le succès et la fiabilité de la détection q-PCR. 1) Lorsque le volume des solutions est très faible, si elles ne sont pas placées au fond du puits, la teneur en eau dans la goutte d'ADN pourrait être réduit par évaporation while agencer les échantillons sur la plaque. Pour éviter ce problème, placer l'échantillon d'ADN au niveau du fond du puits, refroidir la plaque en le plaçant sur de la glace ou une autre plate-forme de refroidissement, et tout préparer à l'avance pour accélérer cette étape, autant que possible. 2) Lors de la préparation du mélange réactionnel q-PCR (tableau 4), couvrir le tube de papier d'aluminium pour empêcher la photo-dégradation. 3) La présente expérience, on décrit la préparation d'une réaction de 10 ul. Néanmoins, dans certains instruments q-PCR, le volume de réaction est de 20 pi, et ensuite le volume de chaque réactif est multiplié en conséquence. 4) Les conditions thermiques optimales de cycle peuvent varier pour les différentes amorces et des mélanges de polymerases. 39 Par exemple, la température de recuit doit être réglée à environ la température de fusion des amorces, et est déterminé de manière empirique comme étant la température à laquelle l' amplification se produit le plus efficacement possible . Pour cette raison, il est également important de préparer une courbe d'étalonnage pour chaque q-PCR analysésla plaque, afin d'assurer que la quantification est exacte. Les courbes d'étalonnage ainsi que les filtres standard-dopés servent également comme témoin positif, pour garantir que l'absence d'inhibition se produit. Pour éviter l'inhibition, il est recommandé d'utiliser des kits d'extraction conçus pour éliminer les inhibiteurs à partir d'échantillons environnementaux. 5) Le nombre de cycles thermiques dans cette expérience a été réglé sur le nombre maximal, 45, afin d'augmenter la sensibilité que les concentrations d'ADN à partir des extraits de filtration était très faible. 6) Veiller à ce que les cycles de seuil (Cτ) des valeurs pour tous les échantillons d'ADN sont dans la plage dynamique de la courbe d'étalonnage. veiller à ce que toute l'amplification d'un échantillon témoin négatif est d'au moins huit cycles supérieur à celui des échantillons d'ADN. 7) Si vous travaillez avec le réactif SYBR Green, assurez-vous qu'il n'y a pas de multiples pics de température de fusion par réaction.
Pour le test turbidimétrique, deux méthodes de quantification des endotoxines sont disponibles: la méthode cinétique et l'Résultant méthode chromogénique. Dans l'approche cinétique, comme réalisé dans ce protocole, le temps requis pour l'échantillon d'atteindre l'absorbance maximale est mesurée. Ici, un intervalle de réaction plus court indique une concentration plus élevée d'endotoxine dans l'échantillon. Dans le procédé chromogénique noeud final, l'absorption de lumière est mesurée après un temps d'incubation définie pour déterminer la concentration en endotoxine. Ces deux méthodes nécessitent une courbe d'étalonnage standard pour la quantification 40.
Bien que la précision et l' exactitude de l'extraction d'endotoxine décrit ci - dessus est très élevée, 14 l'efficacité d'extraction peut être amélioré. Il est possible qu'un autre type de filtre ou de l'addition d'un détergent (tel que le polysorbate 20) à la procédure d'extraction pourrait améliorer le rendement de l'endotoxine extraite du filtre. Efficacité de l' extraction des endotoxines peut également être influencée par différentes particules échantillonnées en parallèle sur le filtre. 33 Pour notre configuration expérimentale, lela limite de la méthode de détection est estimée à 0,001 UE m -3. 14
Les techniques de quantification de l'extrait d'ADN qui pourrait servir comme une alternative à q-PCR comprennent l'approche de clonage et gouttelette numérique PCR (DD-PCR). Les avantages de Q-PCR sur l'approche de clonage pour l'identification des espèces sont sa grande sensibilité et qu'elle nécessite une concentration d'ADN plus faible pour l'étape d'amplification initiale. En outre, à la différence q-PCR, le procédé de clonage, ce qui est laborieux et prend du temps, est non quantitative. Une méthode alternative pour la quantification de l'ADN extrait est DD-PCR. 19 L'avantage de cette technique est qu'elle ne nécessite pas une courbe d'étalonnage, car la détection est basée sur une contrainte d'ADN unique dans chaque goutte. Cependant, pour les échantillons environnementaux, aucune méthode fiable existe à ce jour pour gouttelette-détection de l'ADN extrait des filtres.
L'efficacité avec laquelle l'ADN est extrait from le filtre, ainsi que l'exactitude et la précision des mesures de l' ADN, peuvent être influencés par des facteurs tels que le type de filtre, les micro - organismes cibles, et l' instrumentation. 34,41 Par conséquent , il doit être défini avant l'analyse des échantillons. Dans notre configuration expérimentale, la limite de détection peut atteindre jusqu'à 3,5 m -3 génome. 14
Pour conclure, la méthode décrite ici est applicable pour l'identification et la quantification des espèces biologiques air échantillonné provenant de sources anthropiques et naturelles. utilisation précise du dosage approprié permet des enquêtes précieuses de questions environnementales complexes à entreprendre.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Filter sampling | |||
| HiVol 3000 - High Volume Air Sampler | Ecotech | ||
| Quartz Microfiber Filters | Whatman | 1851-865 | 203 mm x 254 mm |
| ELF - Laboratory Chamber Furnaces | Carbolite | ELF 11series | |
| Aluminum foil | Opal | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Endotoxin | |||
| Ethanol | Sigma Aldrich | 16368 | Laboratory Reagent, 96% |
| Airstream Class II Biological Safety Cabinet AC-4E1 | ESCO | 10011712 | |
| Pyrotell -T | Associates of Cape Cod, Inc. | T0051 | |
| Control Standard Endotoxin | Associates of Cape Cod, Inc. | E0005-1 | Escherichia coli O113:H10, 0.5 µg/vial 1 Pack |
| LAL Reagent Water | Associates of Cape Cod, Inc. | W0051 | |
| 10 ml sterile syringe with Luer-Lok Tip | Becton-Dickinson & Co. | 309605 | |
| BD Precisionglide syringe needle | Becton-Dickinson & Co. | 305129 | Sterile |
| Parafilm-M sealing tape | Parafilm | P7543 | Sigma catalog number |
| Microtubes | Axigen | MCT-200-C | 2 ml, pyrogen free |
| 1.12 cm diameter Cork Borer | Boekel Scientific | 1601 BD Series - Steel | Part of a cork borer set containing borers with various diameters. |
| 50 mm Petri Dish | Miniplast Ein-Shemer | 72050-01 | Aseptic |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries, inc. | SI-0297 | |
| Microcentrifuge 5415 D | Eppendorf | 22621408 | |
| TC MicroWell 96 F SI w/lid | Nunc | 167008 | Flat bottom wells (with lid (individually wrapped)), sterile, pyrogen free |
| Synergy HT Multi-Detection Microplate Reader | Biotek | 7091000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNA | |||
| DNA away | Sigma Aldrich | 7010 | |
| Standard DNA of the microbial species of interest | ATCC or other culture collection | Either the appropriate microbial strain for DNA extraction or the extracted DNA | |
| Neubauer-improved | Marienfeld | 640030 | hemocytometer |
| TE buffer, Low EDTA | Life Technologies | 12090-015 | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) 0.1 mM EDTA |
| Nuclease-free PCR-grade water | Sigma Aldrich | 3315959001 | |
| PCR primers | Sigma Aldrich | Targets the microbial species of interest | |
| Dual-Labeled Probes | Sigma Aldrich | Targets the microbial species of interest | |
| Screw cap tubes | Axigen | ST-200-SS | 2 ml |
| PowerSoil DNA extraction kit | Mo Bio Laboratories | 12888-100 | |
| Glass beads, acid-washed 425-600 µm | Sigma Aldrich | G8772-100G | |
| Glass beads, acid-washed <106 µm | Sigma Aldrich | G4649-100G | |
| PowerSoil Solution C1 | Mo Bio Laboratories | 12888-100-1 | Cell lysis buffer , Power soil Kit |
| Magic Touch ice bucket | Bel-Art | 18848-4001 | |
| Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | 607EUR | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385612 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4370048 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 ml | Applied Biosystems | 4346906 | |
| MicroAmp Splash-Free 96-Well Base | Applied Biosystems | 4312063 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4311971 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5811 000.010 | Rotor A-4-62 with MTP buckets |
References
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