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Análise Filtro amostrado-Air para endotoxinas e conteúdo de DNA

doi: 10.3791/53444 Published: March 7, 2016

Abstract

Aerosol Research Outdoor comumente utiliza partículas amostradas em filtros. Este procedimento permite que várias caracterizações das partículas recolhidas para ser realizado em paralelo. O objectivo do método aqui apresentado consiste em obter uma análise precisa e altamente fiável do conteúdo de endotoxina e de ADN de bio-aerossóis extraídos de filtros. A extracção de moléculas orgânicas de elevado peso molecular, tais como lipopolissacáridos, de filtros amostrados envolve a agitação da amostra, num meio à base de água livre de pirogénio. A subsequente análise baseia-se numa reacção enzimática que pode ser detectada utilizando uma medição turbidimétrica. Como resultado do elevado teor orgânico nos filtros da amostra, a extracção de ADN a partir de amostras é realizada usando um kit de extracção de DNA comercial que foi originalmente concebido para solos e modificados para melhorar o rendimento de ADN. A detecção e quantificação de espécies microbianas específicas usando Reacti cadeia da polimerase quantitativaem análise (Q-PCR) são descritos e comparados com outros métodos disponíveis.

Introduction

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Amostragem de ar em filtros é uma ferramenta básica na investigação aerossóis atmosférica. 1 Os filtros são amostrados o ponto de partida para várias propriedades químicas, físicas e biológicas das caracterizações partículas ambiente recolhida. 2-11 A vantagem desta abordagem é que várias análises podem ser realizado fora de linha na mesma amostra. Compilando os dados de todas as diferentes análises permite ao pesquisador obter uma boa compreensão das características das partículas e auxiliares colhidos em resolver questões complexas nas ciências atmosféricas. 12,13 Por exemplo, aparelhos de ar amostras marinhas e fluviais tomada durante o mesmo período pode ser comparado com respeito à toxicidade de partículas amostrado e composição biológica. 14 para este estudo, lipopolissacáridos (LPS), componentes de células, as paredes bacterianas gram-negativas, também conhecidos como endotoxinas, foram extraídos a partir de filtros amostrados em terra e em um site para o interior, e foram avaliados usando olimulus amebócito lisado (LAL) de teste. Em paralelo, uma avaliação do conteúdo genómico bacteriano (bactérias totais, bactérias gram negativas, e cianobactérias) foi realizada na mesma amostra, utilizando a reacção em cadeia da polimerase quantitativa (Q-PCR). O teste LAL baseia-se em medições de turvação formada após a adição de um extracto aquoso de amebócitos do caranguejo-ferradura, Limulus polyphemus, a uma solução aquosa que contém as endotoxinas. Quanto maior for a concentração de endotoxinas na amostra, a turbidez mais rapidamente se desenvolve. 15 A análise Q-PCR baseia-se num sinal de fluorescência emitido como um fragmento de ADN específico é amplificado. 16 por monitorização em tempo real do sinal durante a fase exponencial da PCR reacção e de calibragem com uma curva padrão, a quantidade inicial de ADN pode ser quantificada. A combinação destas duas análises em conjunto com os outros, como detalhado em outra parte, 14 pode fornecer uma boa estimativa dos níveis de endotoxina e aquantidade de bactérias nas amostras de origem.

O objectivo do método aqui apresentado consiste em obter uma análise precisa e altamente fiável do conteúdo de endotoxina e de ADN de bio-aerossóis extraídos de filtros. Embora os métodos para a amostragem das características físico-químicas e inorgânicos dos aerossóis são bem conhecidos e, mais recentemente, têm sido desenvolvidos métodos para investigar a sua componente de matéria orgânica, 17 houve uma pesquisa escassa no componente biológico de aerossóis. 18 A razão para a corrente de método é preencher esta lacuna, apresentando em pormenor um método robusto para extrair, analisar e identificar a fração biológica de aerossóis 14.

O método detalhado aqui é esperado para encontrar uma ampla utilização em projectos de investigação biológicos interiores e exteriores de aerossol que envolvem a análise de filtro 20-24.

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Protocol

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Nota: Uma lista detalhada de todos os materiais e instrumentos utilizados neste protocolo é mostrado na seção Materiais.

1. Amostragem de Ar em filtros

  1. Preparação de Filtros
    1. Para a amostragem de alto volume, utilize 20,3 x 25,4 cm2 filtros. Escolha o tipo específico de filtro que melhor se adapta às necessidades de investigação, bem como o tamanho de corte do filtro, se for o caso. 1 Aqui, filtros de microfibra de uso de quartzo.
    2. filtros de pré-cozer servem para a extracção de compostos orgânicos e biológico para destruir os resíduos orgânicos. Para pré-bake os filtros, envolvê-los individualmente em papel alumínio e, em seguida, fazê-los em um forno de laboratório a 450 ° C durante pelo menos 5 horas.
    3. Armazenar os filtros de forno à temperatura de -20 ° C até à colheita.
  2. Manuseamento instrumento e Air Sampling
    1. pó residual limpa da cabeça do amostrador de grande volume. Limpe as peças com toalhetes de papel limpo e permitir-lhes befo de ar secore reconectar-los para o amostrador.
    2. Desinfectar a cassete do filtro com etanol, e trabalhar com luvas e uma bata de laboratório em todos os momentos.
    3. Colocar um filtro de pré-cozido dentro da cassete de filtro limpo, e proceder de acordo com o manual amostrador de grande volume.
    4. Marque a data e quaisquer condições meteorológicas incomuns, se for o caso (por exemplo, chuva, tempestade de areia) sobre o envoltório de alumínio, e salve-o em um local limpo até a conclusão da amostragem.
    5. Recolher o filtro de amostragem e dobre-o ao meio, com o lado amostrados voltado para dentro.
    6. Envolver o filtro na folha de alumínio original e armazenamento a -20 ° C até à análise.
      Nota: Se o intervalo de tempo entre a amostragem e análise é mais do que 2 meses, armazenar a amostra a -80 ° C para evitar a degradação do material orgânico e biológica.

Análise 2. endotoxina

Nota: desinfectar a superfície de trabalho com 70% de etanold trabalho com acesso de pirogénios tubos, apenas dicas e reagentes. Se material de vidro são usados, pré-aquecimento a 250 ° C durante 30 min, ou a 200 ° C durante 60 minutos é necessária. 25 Prepara todos os reagentes numa câmara de biosegurança classe II e trabalhar com luvas e uma bata de laboratório em todos os momentos.

  1. Preparação de Reagentes
    1. Siga o protocolo do fabricante kit da LAL para reidratar o ligado imediatamente antes da utilização. 26 Toque suavemente no frasco para desalojar LAL restantes nas paredes do frasco. Retirar o tampão suavemente para quebrar o vácuo. Usando uma seringa com agulha, adicionar 5 ml de água isenta de pirogénios (PFW) para o frasco para hidratar todo o conteúdo lisado e misturar delicadamente para evitar a formação de espuma.
    2. Fecha-se o frasco com uma película de parafina de plástico quando não em uso e armazenar a 4 ° C durante até dois dias. Armazenar qualquer lisado restante à temperatura de -20 ° C durante até três meses.
      Nota: Este reagente pode ser congelado apenas uma vez.
    3. Reidratar o controle endotoxina padrão (CSE), que contém 0,5 μ; g E. coli, de acordo com o protocolo do fabricante. 27 Determinar a quantidade específica de água a ser adicionada ao frasco CSE a partir do site do fabricante 28, digitando o número do lote do kit quando especificado no site. A concentração final de E. coli no frasco, é medido em unidades de endotoxina (UE; UE onde 10 = 1 ng). Marque esse frasco ed0.
    4. Selar o frasco CSE com filme plástico de parafina quando não em uso e armazenar a 4 ° C por até 4 semanas.
  2. Curva padrão e Preparação cravado-filter
    1. Em uma cabine de segurança biológica de classe II, preparar 22 tubos de 2 ml de centrifugação isentos de pirogénios contendo quantidades decrescentes de CSE (tubos Ed1-Ed11) ou nenhuma CSE (o tubo em branco contendo apenas PFW) para produzir uma série de diluições de endotoxina duplicado, como mostrado na Tabela 1.
    2. Em um gabinete biológico com fluxo circular, cortar 22 pedaços circulares de filtro limpo, pré-cozidos usando um desinfectada 1.1 2 centímetros broca do diâmetro da rolha.
    3. Colocar os pares de filtros em placas de Petri estéreis.
    4. Pico de 50 ul a partir de cada membro da série de diluição endotoxina Ed2-Ed11 e do tubo em branco para um par correspondente de filtros.
    5. Deixar as placas de Petri contendo os filtros perfurantes abertas sob o capô para secar por 30 min.
    6. Coloque cada pedaço de filtro num tubo livre de pirogénio 2 ml.
">
Tubo A concentração final de endotoxina (UE mL -1) Volume de endotoxina padrão (ml) Pyrogen volume de água livre (ml) volume total (mL)
ed0 2.500 solução Estoque * 5
Ed1 1.000 80 (a partir de ed0) 120 200
Ed2 100 20 (a partir de Ed1) 180 200
ED3 50 10 (a partir de Ed1) 190 200
ED4 25 5 (de Ed1) 195 200
ED5 12,5 2.5 (a partir de Ed1) 197,5 200
ED6 6.25 1,25 (a partir de Ed1) 198,75 200
Ed7 3,125 6,25 (a partir Ed2) 193,75 200
Ed8 1.563 6,25 (a partir ED3) 193,75 200
ED9 0,781 6,25 (a partir ED4) 193,75 200
ED10 0,391 6,25 (a partir de ED5) 193,75 200
Ed11 0,195 6,25 (a partir ED6) 193,75 200
Em branco 0 0 200 200

Tabela 1:. A endotoxina padrão da curva de concentração de endotoxinas, o volume de endotoxina padrão e de água isenta de pirogénios a ser adicionado, e o volume total obtido são detalhados para cada tubo de diluição na curva de calibração.

  1. Extração de endotoxina do Experimental e Filtros cravado
    1. Em um armário biológica com fluxo circular, cortar os filtros de recolha (a partir do passo 1.2) em pedaços circulares usando um 1,12 centímetros broca do diâmetro da rolha desinfectados, e colocá-los, em conjunto com os filtros convencionais perfurantes (do passo 2.2), em 2 isenta de pirogénio- tubos ml (ou seja, os tubos de amostra).
    2. Adicionar 1 ml PFW para os tubos e agitá-los, durante 60 min à temperatura ambiente, usando um agitador laboratorial.
    3. Centrifugar os tubos de amostra em uma microcentrífuga a 375 xg durante 10 min. 29
    4. th de transferênciae sobrenadante, que contém as endotoxinas, para um novo tubo livre de pirogénio 2 ml.
  2. Limulus Amebocyte Lysate (LAL) Teste
    1. Determinar a concentração de endotoxina nas amostras por realizar o teste LAL numa microplaca de 96 poços isenta de pirogénios, com um fundo plano e uma tampa.
    2. Plano do arranjo de placas previamente, como se mostra na Figura 1. Incluir uma curva padrão preparada directamente a partir de soluções-padrão de endotoxina Ed2-Ed11 (e, portanto, cobrindo a gama de concentrações de 100-0.195 UE / ml (ver secção 2.2)) em cada placa de execução . A curva padrão deve ocupar cavidades 1-10 de linhas A e B da placa. Separe poços 11-12 nestas linhas para amostras em branco (perfazendo um total de quatro espaços em branco).
    3. Ligue o leitor de microplacas e programá-la para uma reacção cinética que envolve a incubação da microplaca a 37 ° C e agitação a cada 5 min, seguida por medidas de absorção a 405 nm. Repetir 18 vezes durante 1,5 h.
    4. Determinar a eficiêncy com que as endotoxinas são extraídos a partir dos filtros de recolha (isto é., as amostras obtidas a partir dos filtros padrão perfurantes) através de divisão da quantidade calculada de endotoxina por o montante original é cravado.
    5. Iniciar o ensaio colocando 50 ul das soluções de endotoxina padrão (do passo 2.4.2), ou do extrato filtro espetado e os seus espaços em branco (de secção 2.3), ou das amostras experimentais e seus espaços em branco (também do ponto 2.3), , conforme a placa-matriz planeada (Figura 1) e fechar a tampa.
    6. Para cada cavidade, adicionar rapidamente 50 ml de solução de LAL, e agitar suavemente a placa horizontalmente, enquanto é colocado sobre a mesa, antes de levantar-o no leitor.
    7. Coloque a placa no leitor de placas e iniciar a execução experimental.

figura 1
Figura 1:. Placa matriz endotoxina Um examplo de uma matriz de análise de endotoxinas em uma microplaca de 96 poços.

3. Análise Genômica

Nota: Para a extração de DNA, desinfectar a superfície de trabalho com 70% de etanol e trabalhar com tubos estéreis, apenas dicas e reagentes. Para a análise Q-PCR de ADN, desinfectar a superfície de trabalho com a superfície ADN-descontaminante. Prepare todos os reagentes em uma cabine de segurança biológica classe II e trabalhar com luvas e uma bata de laboratório em todos os momentos.

  1. Preparação dos iniciadores e sondas de DNA
    1. Antes de extração de DNA, qualquer ordem de um conjunto disponível no mercado de primers e uma sonda (se o método da sonda de hidrólise é aplicada), ou projetar um novo conjunto de primers e uma sonda utilizando o iniciador concepção de ferramentas computacionais. 30
    2. Re-hidratar os iniciadores de acordo com o protocolo do fabricante usando 10 mM de Tris-ácido etilenodiaminotetraacético 0,1 mM (EDTA) (tampão TE) ou água de grau de PCR.
      Nota: Recomenda-se a dissolver o iniciador de PCR inicial stock em tampão TE baixo com EDTA (0,1%), uma vez que evita a degradação do iniciador quando mantidos durante tempos mais longos. Use água PCR-grade para diluições subsequentes para reduzir a quantidade de EDTA que pode inibir reações de PCR.
    3. Preparar alíquotas de 50 uL ou de 100 uL do iniciador e da sonda em 0,5 ml estéreis tubos e armazenar a -20 ° C até à análise.
  2. Avaliação celular concentração padrão Antes da Extracção de DNA
    1. Num tubo de centrífuga de tamanho adequado, preparar uma solução de células padrão das espécies microbianas de interesse (tubo Od0, TABELA 2A). Misture a suspensão de células por pipetagem para cima e para baixo no tubo de 7-10 vezes usando uma pipeta com um pequeno furo.
    2. Se as células são coloridas (por exemplo, certos esporos fúngicos), não realizar um procedimento de coloração. Se a coloração de células é necessária, dilui-se a suspensão de células em um corante adequado para a detecção microscópica das células de interesse. 31
    3. Limpe a lâmina de cobertura e hemocytometer com etanol. Umedecer e apor a lamela ao hemocitômetro.
    4. Carregar cerca de 8 ul da suspensão de células em ambas as câmaras hemocitómetro tocando cuidadosamente a extremidade da lamela com a ponta da pipeta e o enchimento da câmara, por acção capilar. Não acima / abaixo encher a câmara.
    5. Determinar o número de células por vê-las sob um microscópio com aumento de 400x (40x na objetiva e 10X no ocular). Nove quadrados medindo 1 x 1 mm e 2 dispostos numa grelha de 3 x 3 deve ser visto. Concentre o microscópio sobre uma das quatro esquinas da grelha (uma ampliação mais elevada pode ser usado). O 1 x 1 mm2 quadrado deve conter 16 quadrados menores.
    6. Contagem de todas as células nos quadrados dos cantos quatro 1 x 2 1 mM, bem como no quadrado do meio da grelha de 3 x 3. Se houver muitas ou poucas células para contar, repetir o procedimento, quer se concentrar ou diluir a suspensão de células original como apropriado (15-50 células devem sobrepor uma área singularização 2 1 mM).
    7. Calcula-se a concentração das células (células ml -1) na suspensão de células padrão Od0 a partir do número de células na média entre os cinco quadrados contadas como se segue: contagem celular ml -1 = contagem celular média quadrada -1 Factor de diluição 10 4.
  3. Avaliação da Eficiência DNA Extraction
    1. Prepare nove estéreis de 0,5 ml tubos de acordo com a Tabela 2A.
    2. Dilui-se a solução de células padrão (Od0) para conter cerca de 10 7 mL -1 células num volume total de 20 ul (DO1).
    3. Adicionar 18 mL de água PCR-grade livre de nuclease estéril (NFW) para tubos OD2-Od8 e 20 l para o tubo em branco, Od9.
    4. Transferência de 2 ul da solução de células de OD1 OD2 em. Pipeta suavemente para misturar e transferir 2 mL de tubo de DO2 para OD3. Continuar diluindo as células da mesma maneira ao longo dos tubos até e incluindo o tubo para o Od8btain uma diluição em série de 10 -10 7 0 ml de células -1.
    5. Em um gabinete biológico com fluxo circular, cortar 18 pedaços circulares de filtro limpo, pré-cozidos, utilizando uma desinfectada 1,12 centímetros broca do diâmetro da rolha. Coloque os filtros em pares em placas de Petri estéreis.
    6. Pico de 10 ul de diluições para OD1 Od8 e a partir da estrutura de tubo Od9 em cada um dos filtros emparelhados, de tal modo que existe um par de filtro que corresponde a cada concentração de células padrão.
    7. Deixar as placas de Petri abertas sob o capô e deixá-los secar por 30 min.
    8. Coloque cada pedaço de filtro num tubo ml estéril com tampa de rosca 2 e extrai-se o ADN de acordo com o procedimento pormenorizado na secção 3.4.
  4. Extração de DNA a partir do Experimental e Filtros cravado
    Nota: Para a extração de DNA a partir de filtros, utilize kits comerciais projetados para a extração de DNA a partir do solo de acordo com o protocolo do fabricante com as seguintes modificações.
    1. Para cada filTer amostra (DO1-Od8), preparar uma mistura de esferas de vidro lavadas com ácido em um tubo estéril de 0,5 ml. Use 0,1 g grânulos com um diâmetro de 425-600 ^ m e 0,3 g de grânulos com um diâmetro de ≤106 uM.
    2. Em um gabinete biológico com fluxo circular, cortar três peças circulares a partir de locais selecionados aleatoriamente em cada amostra de filtro usando um desinfectada 1,12 centímetros broca do diâmetro da rolha, e colocá-los em parafuso-top 2 ml tubos.
    3. Adicionar a mistura de pérolas de vidro para os tubos.
    4. Adicionar o tampão de lise de células-fornecido com o kit de extracção de cada tubo no armário biológica, com a quantidade indicada no protocolo do fabricante.
    5. Prepare um balde de gelo e perturbar as células mecanicamente usando um batedor de talão.
    6. Bater as esferas durante 1 minuto e, em seguida, colocá-los em gelo durante 1 min. Repita cinco vezes.
    7. Prosseguir com o protocolo do fornecedor kit da etapa pós-lise.
    8. Depois da eluição com o tampão de eluição fornecido (contém 10 mM de Tris bpode ser prejudicado) ou NFW, recarregar a amostra eluída através da coluna novamente para melhorar o rendimento DNA.
      Nota: Se não analisados ​​no mesmo dia em que a extracção do ADN, as amostras podem ser armazenadas a -20 ° C até à análise.
1 "style =" height: 21px; "> Dd0
A- Preparação de Série celular Diluição Padrão
Tubo A concentração celular final (ml -1 de células) volume da célula padrão (ml) Nuclease volume de água livre (ml) O volume total (mL)
Od0 determinar com Hemocytometer câmara de contagem
DO1 deve ser eluida para a gama de 10 ml-1 7 Células 20
OD2 10 -1 DO1 2 de DO1 18 20
OD3 10 -2 OD1 2 de DO2 18 20
Od4 10 -3 OD1 2 de OD3 18 20
Od5 10 -4 OD1 2 de Od4 18 20
OD6 10 -5 OD1 2 de Od5 18 20
Od7 10 -6 OD1 2 de OD6 18 20
Od8 10 -7 OD1 2 de Od7 18 20
Em branco 0 0 20 20
B- Preparação de ADN Curva Padrão
Tubo Concentração final de ADN (mg ml-1) volume de ADN standard (ml) Nuclease volume de água livre (ml) O volume total (mL)
determinar com NanoDrop
DD1 deve ser eluida para a gama de 10 a 1 mg ml -1 20
Dd2 10 -1 DD1 2 de DD1 18 20
DD3 10 -2 DD1 2 de Dd2 18 20
DD4 10 -3 DD1 2 de DD3 18 20
DD5 10 -4 DD1 2 de DD4 18 20
DD6 10 -5 DD1 2 de DD5 18 20
DD7 10 -6 DD1 2 de DD6 18 20
DD8 10 -7 DD1 2 de DD7 18 20
Em branco 0 0 20 20

Tabela 2:. ADN Curva Padrão série de diluições de células microorganismo Padrão (A) detalhado para o volume padrão de células, o volume NFW, e o volume total em cada tubo de diluição. ADN preparação padrão curva (B), detalhado para o volume padrão de DNA, o volume NFW, e o volume total em cada tubo de diluição.

  1. DNA Curve Preparação Padrão Extracto de ADN directamente a partir de uma amostra padrão do microrganismo de interesse (Dd0) utilizando o mesmo procedimento tal como descrito para os filtros experimentais no passo 3.4.
  2. Utilizar um espectrofotómetro para determinar a concentração de ADN de amostras de ADN normal (Dd0) a 260 nm.
  3. Prepare nove estéreis de 0,5 ml a partir do qual os tubos para preparar uma curva padrão de DNA, como mostrado na Tabela 2B.
  4. Se necessário, dilui-se a solução de ADN padrão Dd0 para dentro de uma gama de concentração de 1-10 ng mL -1 no primeiro tubo (DD1) num volume total de 20 ul.
  5. Adicionar 18 ul de NFW aos tubos Dd2-DD8 e 20 ul para o tubo vazio.
  6. Transferência de 2 ul da solução padrão de ADN DD1 em Dd2. Pipeta suavemente para misturar e depois transferir 2 mL de Dd2 para DD3. Continuar diluir o ADN da mesma maneira ao longo dos tubos para conseguir uma diluição em série de 10 0 -7 -10 em tubos Dd2-DD8 em conjunto com um tubo em branco containing única NFW.
    Nota: Se não analisados ​​no mesmo dia de extracção, armazenar amostras a -20 ° C até à análise.
  • Análise Quantitativa-PCR
    1. Ligue o instrumento q-PCR com antecedência para se aquecer.
    2. Em um novo arquivo de programa, insira os detalhes para a q-PCR executado no software operacional instrumento como detalhado na Tabela 3.
      Nota: instrumentos diferentes têm melhor momento diferente para cada etapa do ciclo térmico. Esta entrada é especificado no manual do instrumento.
    3. Desinfectar a superfície de trabalho com a superfície DNA-descontaminante e trabalhar apenas com tubos estéreis, dicas e reagentes.
    4. Prepare um balde de gelo ao lado do banco de funcionamento. Loja mix Taq-polimerase no gelo.
    5. Calcular o número total de poços de reacção que serão ocupadas na placa. Adicione subsídio teórico para reacções adicionais (5%) e multiplicar o número aumentado de reacções por o volume por reacção para calcular o total de reactiovolume de n.
    6. Prepare a reação misturada piscina, a partir NFW, primers, sonda, e por último a mistura de polimerase Taq. Ver exemplo para os cálculos de volume para a piscina misturado na Tabela 4.
    7. Armazenar a mistura reaccional no escuro e em gelo até à sua utilização.
    8. Coloque 1 ul de DNA padrão, o ADN da amostra, ou NFW (como controlo negativo) dentro dos poços da microplaca em Q-PCR em triplicado.
    9. Certifique-se de que a placa está no um suporte da placa para evitar que não toque a superfície de trabalho e para manter limpa.
    10. Adicionar 9 ul da piscina misto (Tabela 4) em cada poço de reacção.
    11. Cobrir a placa com película adesiva óptica e feche-o bem de todos os lados.
    12. Girar a placa em uma centrífuga com baldes placa durante 1 min a 1000 x g antes de o colocar no dispositivo de Q-PCR.
    13. Coloque a placa no instrumento e ativar o programa em execução.
  • Parâmetro detalhes Comentários
    método de detecção sonda de hidrólise quantitativa
    condições de ciclos térmicos
    A desnaturação inicial e activação de enzimas 95 ° C durante 10 min
    desnaturação 95 ° C durante 15 seg repetir 45 vezes
    O recozimento e a extensão 60 ° C durante 60 seg
    arranjo de placas
    curva padrão DD1 - DD8 3 repetições por diluição em 1-8 poços nas 3 principais linhas
    controle não-modelo (NTC) água livre de nuclease (NFW) 3 repetições no bem no topo3 linhas.
    amostras analisadas ADN extraído de filtros 3 repetições por amostra nos poços restantes.
    conjunto de primers por cada poço
    volume da amostra 10 ml

    Tabela 3:. Detalhes para o software operacional q-PCR Os detalhes dos parâmetros de análise a ser celebrado o arquivo de programa q-PCR.

    Reagente Volume por reacção (ml) Número de reacções Tolerância para erros(5%) Mistura de volume total (mL)
    Taq Polymerase Mix 5 50 52,5 262,5
    F iniciador (10 mM) 0,5 50 52,5 26.25
    R iniciador (10 mM) 0,5 50 52,5 26.25
    água livre de nuclease 3 50 52,5 157,5
    ADN - 1 ml vai ser adicionado directamente nos poços de alvo na placa 96.

    Tabela 4:. Quantitative-PCR Mix Reaction Cálculo Volume por reacção, número de reacções, tolerância para erros, e o volume total calculado a ser adicionado à mistura de reacção por reagente são detalhados.

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    Representative Results

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    É comum para estudar aerossóis atmosféricos usando "off-line" análises de filtros amostra (ver Figura 2). Analisa 32 química do material incluem orgânico (por exemplo, proteínas, as moléculas de hidrocarboneto, sacáridos) e inorgânico (por exemplo, metais, sais) conteúdo amostrado . análises biológicas incluem conteúdo viáveis ​​e não viáveis ​​microrganismo, identificação de espécie utilizando uma abordagem de ADN ou microscopia, bem como a quantificação baseado no ADN.

    Figura 2
    Figura 2: Filer gráfico de exemplo de fluxo de análise Filtro de pós-recolha de ar (A), a preparação do filtro para análises a jusante (B), e análise dos componentes da amostra (C)..

    E = "1"> Para a extracção de endotoxina, filtros de sub-amostras (1,12 cm 2) são agitados em 1 ml PFW durante 60 min à temperatura ambiente. As amostras são então centrifugadas durante 10 min a 375 x g. Diferentes velocidades de centrifugação pode resultar em diferentes eficiências de extracção, tal como indicado na Figura 3A.

    Um teste preliminar para eficiência de extração devem ser conduzidos para o filtro específico escolhido e protocolo realizado. Na Figura 3B, as eficiências de extracção mais elevados são obtidos a partir spiking limpo em comparação com filtros de quartzo amostrados, e ambas essas eficiências são mais baixos do que a conseguida através da detecção directa da solução padrão. Como discutido noutro lugar, a natureza dos aerossóis ambiente amostrados no filtro também pode afectar a eficiência da extracção endotoxina 14,33.

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    Figura 3: Endotoxina eficiência da extracção O efeito da velocidade de centrifugação (A) e filtro de carga (B) na eficiência de extracção endotoxina.. As barras de erro representam o desvio padrão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    A reacção para a detecção de endotoxina envolve uma proporção de 1: 1 de reagente LAL para o padrão de endotoxinas, as endotoxinas extraiu-amostra, ou os espaços em branco. Recomenda-se usar triplicados para a análise da amostra. No entanto, para curvas padrão, duplicatas são suficientes. Quando as leituras de absorção (a 405 nm) são concluídas, a densidade óptica resultante (OD) é analisada depois exportá-lo em um programa de planilha de análise de dados para análise posterior dos dados.

    Tal como na extracção endotoxina, é importante para executar uma análise preliminar da eficiência de extracção de ADN sob as condições experimentais específicas. Isto é feito pela adição de uma quantidade conhecida de uma solução padrão celular do organismo para uma peça cortada a partir do filtro, seguindo o protocolo de extracção de DNA acima descrito.

    A concentração do microrganismo alvo extraído dos aerossóis da amostra é determinada usando Q-PCR. Aqui, a técnica de hidrólise da sonda é utilizada, o que tem a vantagem de especificidade elevada, por causa da sonda adicional ligada ao ADN molde. 35 O método de verde SYBR também pode ser aplicado para o efeito.

    As curvas de calibração são obtidos a partir do ADN extraído a partir dos organismos escolhidos de interesse, utilizando o método de extracção descrito acima. Uma associação mista dos compostos de reacção, com excepção da amostra de ADN, padrão ou controlo, é preparada e mantida no escuro e em gelo até serem necessárias. Em seguida, uma alíquota da piscina mista é adicionada a cada poço de uma placa de micropoços óptico 96. O padrão de ADN, a amostra ou controlo é adicionado após a mistura da reacção de acordo com o arranjo de placas. Depois de todos os reagentes terem sido inseridos na placa, que é marconduzido com uma película adesiva óptica e centrifugadas para recolher todas as gotículas no fundo dos poços. A placa é que inserida no instrumento Q-PCR para a amplificação de ciclo termal e detecção de sinal.

    Os dados consistem em valores de saída de PCR Ct, que são definidas como o número do ciclo em que a quantidade de ADN amplificado alcança o nível de limiar. Utilizando os valores curva de calibração, pode ser obtida a concentração de ADN alvo (ver Figura 4). 36 As concentrações de células do microrganismo pode ser calculada a partir dos valores do Ct de a eficiência da extracção em comparação com uma contagem de hemocitómetro da solução padrão organismo. 37

    Figura 4
    Figura 4: Lote de amplificação de PCR quantitativa em (A) e Calibrat.curva de ion que varia entre 2 x 10 -4 -2 x 10 2 (B) realizada para DNA bacteriano gram negativa representativa. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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    Discussion

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    Este trabalho descreve métodos de extração e detecção para quantificar tanto endotoxinas e DNA presente em amostras de aerossóis recolhidas em filtros. Os métodos requerem rotinas precisas e pode ser executada facilmente, desde que o experimentalista adere a alguns pontos essenciais e importantes discutidos aqui.

    Para o passo de detecção de endotoxina, note que o lisado solução é bastante viscosa e tende a produzir bolhas mediante pipetagem. É difícil de remover ti bolhas, e eles levam a alterações nos valores de microplacas-reader. Portanto, é importante para o primeiro lugar a amostra na placa e apenas depois de se assegurar que todas as bolhas desapareceu, continuar com a adição da solução de lisado. Uma técnica útil para prevenir a formação de bolhas no presente passo consiste em trabalhar-se lentamente com a pipeta, e não para pressionar todo o caminho durante a drenagem do lisado para os poços. Como reacção começar imediatamente uma vez que o lisado está a ser adicionado à endotoXin extrair, que é essencial para iniciar a leitura o mais cedo possível. Para encurtar o passo lisado disso, uma pipeta de múltiplos canais pode ser usado. Note-se que em alguns kits e protocolos existe uma etapa de pré-incubação adicional das amostras a 37 ° C durante 10 min, após o que é colocado na placa de micro titter. 29 Só após esta etapa, o lisado pode ser adicionado.

    Um ponto importante para a extracção da amostra ambiental de endotoxinas é a presença de inibidores das amostras (por exemplo, na amostra de ar de alta poluição). Neste caso, a diluição torna-se crítico, e pode evitar falsa reforço, tipicamente observado para a amostra não diluída. 38

    Da mesma forma, existem vários pontos de importância para garantir o sucesso e confiabilidade da detecção q-PCR. 1) Como o volume das soluções é muito pequena, se eles não são colocados no fundo do poço, o teor de água na gota de ADN pode ser reduzida por evaporação while dispor as amostras na placa. Para evitar este problema, colocar a amostra de ADN no fundo do poço, arrefece-se a placa, colocando-o em gelo ou outra plataforma de arrefecimento, e preparar-se tudo com antecedência para acelerar este passo, tanto quanto possível. 2) Quando se prepara a mistura de reacção de Q-PCR (Tabela 4), ​​cobrir o tubo com folha de alumínio para evitar a foto-degradação. 3) O presente experimento descreve a preparação de uma reacção de 10 ul. No entanto, em alguns instrumentos Q-PCR, o volume de reacção é de 20 uL e, em seguida, o volume de cada reagente é multiplicado em conformidade. 4) As condições de ciclos térmicos pode alterar óptimas para diferentes iniciadores e misturas de polimerase 39. Por exemplo., A temperatura de recozimento deve ser fixado em torno da temperatura de fusão dos iniciadores, e é determinado empiricamente como a temperatura à qual ocorre a amplificação mais eficiente. Por esta razão, é também importante para preparar uma curva de calibração para cada analisado Q-PCRplaca, para assegurar que a quantificação é preciso. As curvas de calibração, bem como filtros-padrão cravado também servir como um controlo positivo, para assegurar que não ocorre inibição. Para evitar a inibição, é recomendado o uso de kits de extracção destinadas a eliminar os inibidores a partir de amostras ambientais. 5) O número de ciclos térmicos nesta experiência foi definido como o número máximo, de 45, a fim de aumentar a sensibilidade como as concentrações de ADN a partir dos extractos de filtro foram muito baixos. 6) Certifique-se de que os ciclos para Threshold (Cτ) valores para todas as amostras de DNA estão dentro do alcance dinâmico da curva de calibração. Também garantir que qualquer amplificação de uma amostra de controlo negativo é, pelo menos, oito ciclos maior do que a das amostras de DNA. 7) Se estiver trabalhando com o reagente Verde SYBR, certifique-se de que não existem vários picos de temperatura de fusão por reacção.

    Para o teste turbidimétrico, dois métodos de quantificação de endotoxinas estão disponíveis: o método de cinética ea endpoint método cromogénico. Na abordagem cinética, como realizado no presente protocolo, o tempo necessário para a amostra atingir a absorvância máxima é medida. Aqui, um intervalo de reacção mais curto indica uma concentração mais elevada de endotoxinas na amostra. No método cromogénico ponto de extremidade, a absorção de luz é medida após um tempo de incubação definido para determinar a concentração de endotoxinas. Ambos os métodos exigem uma curva de calibração padrão para quantificação 40.

    Embora a precisão e exactidão da endotoxina extracção acima descrito é muito alta, a eficiência de extracção 14 pode ser melhorada. É possível que um tipo diferente de filtro ou a adição de um detergente (tal como o polissorbato 20) para o procedimento de extracção pode melhorar o rendimento de endotoxina extraída a partir do filtro. A eficiência da extracção de Endotoxina pode também ser influenciado por diferentes partículas ensaiadas em paralelo sobre o filtro. 33 Para o nosso sistema experimental, olimite do método de detecção é estimada como sendo de 0,001 m -3 UE 14.

    Técnicas para quantificar o extracto de ADN que pode servir como uma alternativa à Q-PCR incluem abordagem de clonagem por PCR e gota digitais (DD-PCR). As vantagens de Q-PCR em relação à abordagem de clonagem para a identificação de espécies são a sua maior sensibilidade e que requer uma concentração de DNA mais baixa para o passo de amplificação inicial. Além disso, ao contrário de Q-PCR, o método de clonagem, o que é trabalhoso e demorado, não é quantitativa. Um método alternativo para a quantificação do extracto de ADN é DD-PCR. 19 A vantagem desta técnica é que ele não necessita de uma curva de calibração, tal como a detecção baseia-se numa única estirpe de ADN em cada gotícula. No entanto, para as amostras ambientais, nenhum método fiável existe até agora para de detecção de gota de DNA extraído a partir de filtros.

    A eficiência com que o DNA é extraído FRom o filtro, bem como a exactidão e precisão das medições de ADN, pode ser influenciado por factores como o tipo de filtro, microrganismos alvo, e instrumentação. 34,41 Por conseguinte, deve ser definida antes da análise de amostras. Em nossa configuração experimental, o limite de detecção pode chegar até 3,5 genoma m -3. 14

    Para concluir, o método descrito aqui é aplicável para a identificação e quantificação de espécies biológicas amostragem de ar, tanto de fontes naturais e antropogênicas. uso preciso do ensaio apropriado permite investigações valiosas de questões ambientais complexas a serem realizadas.

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Filter sampling
    HiVol 3000 - High Volume Air Sampler Ecotech
    Quartz Microfiber Filters Whatman 1851-865 203 mm x 254 mm
    ELF - Laboratory Chamber Furnaces Carbolite ELF 11series
    Aluminum foil Opal
    Name Company Catalog Number Comments
    Endotoxin
    Ethanol Sigma Aldrich 16368  Laboratory Reagent, 96%
    Airstream Class II Biological Safety Cabinet AC-4E1 ESCO 10011712
    Pyrotell -T Associates of Cape Cod, Inc. T0051
    Control Standard Endotoxin Associates of Cape Cod, Inc. E0005-1 Escherichia coli O113:H10, 0.5 µg/vial 1 Pack
    LAL Reagent Water Associates of Cape Cod, Inc. W0051
    10 ml sterile syringe with Luer-Lok Tip Becton-Dickinson & Co. 309605
    BD Precisionglide syringe needle Becton-Dickinson & Co. 305129 Sterile 
    Parafilm-M sealing tape Parafilm P7543 Sigma catalog number
    Microtubes Axigen MCT-200-C 2 ml, pyrogen free
    1.12 cm diameter Cork Borer Boekel Scientific 1601 BD Series - Steel Part of a cork borer set containing borers with various diameters. 
    50 mm Petri Dish Miniplast Ein-Shemer 72050-01 Aseptic
    Vortex Genie 2  Scientific Industries, inc. SI-0297
    Microcentrifuge 5415 D Eppendorf 22621408
    TC MicroWell 96 F SI w/lid Nunc 167008 Flat bottom wells (with lid (individually wrapped)), sterile, pyrogen free
    Synergy HT Multi-Detection Microplate Reader Biotek 7091000
    Name Company Catalog Number Comments
    DNA
    DNA away Sigma Aldrich 7010
    Standard DNA of the microbial species of interest ATCC or other culture collection Either the appropriate microbial strain for DNA extraction or the extracted DNA
    Neubauer-improved Marienfeld 640030 hemocytometer
    TE buffer, Low EDTA Life Technologies 12090-015 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) 0.1 mM EDTA 
    Nuclease-free PCR-grade water  Sigma Aldrich 3315959001
    PCR primers Sigma Aldrich Targets the microbial species of interest
    Dual-Labeled Probes Sigma Aldrich Targets the microbial species of interest
    Screw cap tubes Axigen ST-200-SS 2 ml 
    PowerSoil DNA extraction kit  Mo Bio Laboratories 12888-100
    Glass beads, acid-washed 425-600 µm Sigma Aldrich G8772-100G
    Glass beads, acid-washed <106 µm Sigma Aldrich G4649-100G
    PowerSoil Solution C1 Mo Bio Laboratories 12888-100-1 Cell lysis buffer , Power soil Kit
    Magic Touch ice bucket Bel-Art 18848-4001
    Mini-Beadbeater-16 BioSpec 607EUR
    StepOnePlus Real-Time PCR System Applied Biosystems 4376600
    Fast SYBR Green Master Mix Applied Biosystems 4385612
    TaqMan Gene Expression Master Mix Applied Biosystems 4370048
    MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 ml Applied Biosystems 4346906
    MicroAmp Splash-Free 96-Well Base Applied Biosystems 4312063
    MicroAmp Optical Adhesive Film Applied Biosystems 4311971
    Centrifuge 5810 R Eppendorf 5811 000.010 Rotor A-4-62 with MTP buckets 

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    References

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    Análise Filtro amostrado-Air para endotoxinas e conteúdo de DNA
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    Lang-Yona, N., Mazar, Y., Pardo, M., Rudich, Y. Air-sampled Filter Analysis for Endotoxins and DNA Content. J. Vis. Exp. (109), e53444, doi:10.3791/53444 (2016).More

    Lang-Yona, N., Mazar, Y., Pardo, M., Rudich, Y. Air-sampled Filter Analysis for Endotoxins and DNA Content. J. Vis. Exp. (109), e53444, doi:10.3791/53444 (2016).

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