Introduction
Engenharia de tecido cardíaco avançou muito na última década, com vários grupos editoriais resultados de tecidos totalmente funcionais, batendo feitos a partir de ambos os cardiomiócitos murinos 1-6 e, mais recentemente, derivadas de células-tronco miócitos cardíacos humanos 7-12. O campo de engenharia de tecido cardíaco é impulsionado por dois objetivos primários e essencialmente independentes: 1) para desenvolver enxertos exógenos que podem ser transplantados para não corações para melhorar a função 4-6; e 2) para desenvolver modelos in vitro para estudo da fisiologia e da doença, ou como ferramentas de rastreio para o desenvolvimento terapêutico 2,7.
Tridimensional de cultura de células (3-D) é considerado essencial para o desenvolvimento de ferramentas de rastreio da próxima geração, como a matriz 3-D reflecte um microambiente cardíaca mais natural do que a cultura de células em monocamada de 2-D tradicional; na verdade, alguns aspectos da biologia celular são fundamentalmente diferentes em 2-D culturas vs. 3-D 13,14 9 ou colagénio 7,8,10) é rigorosamente controlada, a composição celular de entrada é menos bem definido, com toda a mistura de células a partir de uma diferenciação cardíaca dirigido de qualquer das as células estaminais embrionárias (ESC 7,9) ou células estaminais pluripotentes induzidas (iPSC 10,12) sendo adicionado aos tecidos. Dependendo da linha celular específica e a eficiência da diferenciação protocolo usado, a percentagem de cardiomiócitos resultante pode variar de menos do que 25% a mais de 90%, o fenótipo de cardiomiócitos específica (isto é, ventricular-, atrial-, ou pacemaker-like) também pode variar, mesmo a fracção não cardiomiócitos pode ser altamente heterogénea 15,16 e alterar a maturidade do diferenciada m cardíacayocytes 17.
Trabalhos recentes em engenharia de tecidos cardíaco tem tentado controlar a população de células de entrada, quer com uma superfície repórter cardíaca linha de células estaminais embrionárias humanas, ou células 8 marcadores de 18 a ser usado para isolar o componente miócitos cardíacos da diferenciação. Embora inicialmente um tecido composto por apenas miócitos cardíacos parece ser o ideal, este não é de facto o caso; hects compostas unicamente de miócitos cardíacos deixar de compactar em tecidos funcionais, com alguns grupos encontrar uma proporção de 3: 1 de miócitos cardíacos: fibroblastos que produzem a maior força de contração 8. Usando vários métodos de seleção de células, incluindo marcadores de superfície para triagem de células vivas, é possível criar hects com populações de células definidas. Enquanto que os marcadores de células estromais não cardíacas têm estado disponíveis durante algum tempo, tal como o marcador de fibroblastos putativo CD90 19,20, marcadores de superfície de miócitos cardíacos foram mais difícilpara identificar. SIRPα foi um dos primeiros marcadores de superfície cardíacas identificados para os miócitos cardíacos humanos 18 e foi mostrado ser altamente selectiva para a linhagem cardíaca. Recentemente, descobrimos que double-ordenação para SIRPα + e CD90 - células produz cardiomiócitos quase puros, com o CD90 + população exibindo um fenótipo de fibroblastos-like (Josowitz, observações não publicadas). Com base nestes resultados coletados, aqui nós descrevem a criação hects usando um 3: Combinação 1 de SIRPα + / CD90 - cardiomiócitos e CD90 + fibroblastos.
A capacidade de projetar um tecido cardíaco humano completamente definida é essencial não só para a criação de ferramentas de rastreio robustas, mas também para o desenvolvimento de sistemas de modelo para investigar cell- emergentes e terapias cardíacas baseadas em genes. Em particular, as numerosas terapias celulares para a insuficiência cardíaca, utilizando tipos de células, incluindo células-tronco mesenquimais (MSC) 21 22 mononucleares de medula óssea 23-25, foram testados em ensaios clínicos. Embora muitos dos resultados iniciais têm sido promissores 21,23,25, o benefício inicial, muitas vezes diminui ao longo do tempo 26-29. Uma tendência semelhante foi relatado em murino engenharia tecidos cardíacos, que apresentam um benefício funcional significativa, devido à suplementação MSC, mas o benefício não é sustentada durante a cultura de longo prazo 1. Subjacente ao desempenho abaixo do ideal é o nosso conhecimento limitado dos mecanismos que regem as terapias celulares. Uma compreensão mais profunda de como as células terapêutica exercer a sua influência benéfica, bem como potenciais consequências negativas das interações miócitos-nonmyocyte, permitiria o desenvolvimento de terapias melhoradas produzindo benefícios clinicamente significativa e sustentada, com efeitos colaterais mínimos, para pacientes com insuficiência cardíaca.
Aqui, descrevemos o uso de hects definidos para interrogComeram mecanismos da terapia à base de células. A composição do tecido controlada é essencial para identificar os fatores específicos que afetam o desempenho dos cardiomiócitos. Diretamente completando hects com o tipo de célula terapêutica de interesse (por exemplo, MSCs), pode revelar os efeitos sobre o desempenho dos miócitos cardíacos, como já demonstrado em ECTs de ratos 1.
O seguinte protocolo multi-passo começa com a diferenciação de células estaminais cardíaca dirigida, seguida de fabricação do bioreactor multi-tecido, e concluindo com uma descrição da construção do tecido e análise funcional. Nossos experimentos são realizados utilizando a linha de células estaminais embrionárias humanas NIH-aprovado H7 (hESC). No entanto, os protocolos seguintes também foram testados utilizando uma linha de células estaminais embrionárias humanas adicionais e três linhas de células estaminais pluripotentes induzidas (hiPSC) com resultados semelhantes. Verificou-se que a eficiência na diferenciação de cardiomiócitos e sucesso no HECT fabricação pode ser dependente de células de linha, especialmente folinhas r hiPSC derivadas de pacientes individuais. Seguindo este protocolo, os dois pratos de 6 poços foram semeadas com um total de 1,68 milhões de hESCs (140.000 células por poço), que produz cerca de 2,5 milhões de miócitos depois diferenciar durante 20 dias e separação, o suficiente para fazer seis tecidos definidos.
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Protocol
Nota: executar todas as manipulações de células em condições assépticas, usando uma câmara de segurança biológica filtrado HEPA-classe II e esterilizar todas as soluções, filtrando-os através de um filtro de 0,2 um. Realizar a construção de tecido e teste de função quer nas mesmas condições assépticas ou uma câmara de fluxo laminar.
1. Plantio de H7 hESCs em Preparação para Diferenciação Cardíaca
- (Dia 1) Preparação da membrana basal Matrix
- Descongelar 150 uL de aliquota da matriz da membrana basal qualificada células estaminais embrionárias humanas em gelo durante a noite a 4 ° C.
- (Dia 0-4) chapeamento de hESCs em placas revestidas
- Dilui-se a matriz descongelada em 12 ml de gelo-frio DMEM / F12 e misturar bem.
- Transferir 1 ml da solução / F12 de DMEM-matriz em cada poço de um de 6 poços de cultura de tecidos tratados prato. Cada alíquota de matriz pode revestir duas placas de 6 poços.
- Incubar as placas revestidas à temperatura ambiente durante pelo menos 1 h.
Nota: Nonossa experiência, placas revestidas seladas com parafina pode ser armazenado em solução de matriz, a 4 ° C durante até 10 dias antes da utilização. - Em aproximadamente 75% de confluência, dissociar o H7 hESCs do prato de 10 centímetros utilizando 6 ml de reagente de dissociação não enzimática. Depois de 5 minutos, suavemente raspar as células a partir da superfície da cultura usando um raspador de células descartável e transferir a suspensão de células para um tubo de centrífuga de 15 mL estéril.
- Remover 0,5 mL da solução de dissociação com as células a partir do tubo de 15 ml e de transferência para uma nova estéril 15 ml de tubo (deixando 5,5 ml do reagente de dissociação para dissociar ainda mais o hESCs) para a propagação de linha de células estaminais.
- Agregar as 0,5 ml de células a 300 xg durante 5 min a 20 ° C. Remover o sobrenadante e ressuspender cuidadosamente em 8 ml de meio de células estaminais pluripotentes contendo uma penicilina-estreptomicina%, em seguida, transferir para um novo, revestido, de 10 cm de cultura de tecidos e manter a 37 ° C e 5% de CO 2 para manter a linha de células estaminais.
Nota: Mantenha a mídia de células-tronco pluripotentes em gelo durante as mudanças de mídia. - Enquanto isso, adicionar 5,5 mL de 10 mM de inibidor ROCHA Y-27632 para a dissociação de 5,5 ml de solução restante e continuar a incubar à temperatura ambiente durante mais 5-10 minutos. Misturar suavemente as células com uma pipeta de 5 ml serológico. Continue a incubar até obter uma suspensão de célula única é conseguido, em seguida, sedimentar as células a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
- Ressuspender as células em 5 ml de meio de células estaminais pluripotentes e executar uma contagem de células utilizando um hemocitómetro.
- Semente de cada poço da placa de 6 poços a uma densidade de 140.000 células por poço. Semente duas placas de 6 poços para criar um total de seis tecidos definidos. Dispor de quaisquer células remanescentes após o plaqueamento.
- Encha as bem para 1 ml com meio de células estaminais pluripotentes e incubar a 37 ° C, 5% de CO 2. Vinte e quatro horas depois, remova a mídia e adicionar 2 ml de meio de células-tronco pluripotentes fresco a cada poço (Figura 1A
- Verifique a confluência das placas de cada dia e iniciar a diferenciação Uma vez que as células atingirem aproximadamente 75% de confluência (Figura 1B - D).
2. (dia 4-24) diferenciação de células estaminais embrionárias humanas para Cardiomyocytes 30,31
- (Dia 4-7, Diferenciação Dia 0-3) Mesoderma Indução
- Prepare meios RPMI diferenciação I (Tabela 1) por combinação de 500 mL de RPMI 1640 com suplemento de 10 ml de B27 (sem insulina) e 5 ml de solução de reserva de penicilina-estreptomicina (10000 UI / ml de penicilina, 10.000 ug / ml de estreptomicina). Aliquota, em gelo, em tubos de 50 ml e armazenar a 4 ° C.
- (Dia 4, Diferenciação Dia 0) Prepare a mídia de indução mesoderme, adicionando 2,4 ul da CHIR99021 pequena molécula inibidor de GSK3 (estoque 10 mM, 6 mM de concentração final) a 12 ml de meios de diferenciação RPMI I. Remova a mídia de células-tronco pluripotentes de cada poço umaND substitua com 2 ml de meio de indução da mesoderme por poço. Retornar a placa para a incubadora.
Nota: a morte celular significativa, tipicamente, com a adição de CHIR99021 (Figura 1E). A monocamada irá recuperar, mas é importante para lavar as células mortas de distância com a lavagem de DMEM / F12. - (Dia 5, Dia Diferenciação 1) Preparar meio de indução mesoderme frescos como descrito acima. Remover os meios de idade a partir de cada cavidade e lavar uma vez com 1 ml de DMEM / F12 por poço. Adicionar 2 ml de meio de indução mesoderme fresco a cada poço.
Nota: Lavar a cada dia desde o dia 0-10 aumenta consideravelmente o rendimento ea pureza dos miócitos cardíacos. - (Dia 6, Diferenciação Dia 2) Remova a mídia de indução cardíacos e lave uma vez com 1 ml de DMEM / F12 por poço. Substituir a lavagem com 2 ml RPMI media diferenciação I (há pequenas moléculas adicionado mas ainda com o B27 (sem insulina) suplemento) e retornar à incubadora.
- (Dia 13/07, Diferenciação Day 3-10) Cardiac Mesoderma Indução
- (Dia 7, Dia Diferenciação 3) Prepare meios de indução mesoderme cardíaca através da adição de 6 ul do inibidor de molécula pequena de Wnt IWR-1 (10 mM, 5? M final) a 12 ml de meio RPMI diferenciação I.
- Remova a mídia de cada poço, lavar uma vez com 1 ml de DMEM / F12 por poço e substituir com 2 ml de meio de indução mesoderme cardíaca por poço.
- (Dia 8, Dia Diferenciação 4) Preparar um adicional de 12 ml de meio de indução mesoderme cardíaca, tal como descrito acima. Remova o material adicionado no dia anterior, lavar uma vez com 1 ml de DMEM / F12 por poço e substituir com 2 ml de meio fresco diferenciação mesoderme cardíaca por poço e voltar para a incubadora.
- (Dia 10/09, Diferenciação Dia 5-6) Em ambos os dias, remova a mídia de indução mesoderme cardíacos e lavar cada poço com 1 ml de DMEM / F12.
- Adicionar 2 ml de meio fresco diferenciação RPMI I (há pequenas moléculas adicionado mas ainda com o B27 (sem insulina) suplemento)a cada poço e a placa de regresso para a incubadora.
- (Dia 11-24, Diferenciação Dia 7-20) HES-derivado Cardiac Organização miócitos / Maturação
- Prepara-se o meio RPMI diferenciação II (Tabela 1) por combinação de 500 mL de RPMI 1640 com suplemento de 10 ml de B27 (com insulina) e 5 ml de solução de reserva de penicilina-estreptomicina. Aliquota, em gelo, em tubos de 50 ml e armazenar a 4 ° C.
- (Dia 11, Dia Diferenciação 7) Remover RPMI meios de diferenciação (sem insulina) a partir de cada cavidade e lavar com 1 ml de DMEM / F12. Substituir com 2 ml de meio RPMI a nova diferenciação II (com a insulina) a cada poço e voltar para a incubadora.
Nota: o batimento espontâneo deve primeiro ser observado entre os dias 7 e 10. Se bater não é observado durante este tempo, ele geralmente indica baixa eficiência diferenciação. O protocolo pode ser continuada até ao dia 15, em um esforço para observar surra, mas se nenhuma batida é observado por dia 15 é melhor starte uma nova diferenciação. - (Dia 12-24, Diferenciação Dia 8-20) Todos os dias, retire a velha mídia de diferenciação e substituir com 2 ml de RPMI fresco media diferenciação II por poço para permitir a maturação celular e organização da monocamada batida (Figura 1F, Vídeo Figura 1 ).
Nota: Dependendo da morte celular residual, pode ser necessário lavar com 1 ml de DMEM / F12 até ao dia 10 de diferenciação.
3. (Dia 24, Dia 20 Diferenciação) Isolamento de cardíacos miócitos e células semelhantes a fibroblastos
- Separar as Células da monocamada
- Remova a mídia de diferenciação e lave uma vez com 1 ml PBS.
- Dissociar as monocamadas com 1 ml da solução de dissociação enzimática (0,04% de tripsina / 0,03% de EDTA) a cada poço.
- Mover placa na incubadora durante 10 min. Enquanto isso, adicionar 12 ul de inibidor ROCHA a 6 ml de solução de tripsina neutralização.
- gentlY adicionar 1 ml da solução de tripsina de neutralização que contém o inibidor ROCHA a cada poço da placa para neutralizar a solução de tripsina.
- Usando uma pipeta de transferência estéril, misture delicadamente cada poço para quebrar os aglomerados de células.
- Transferir todos os 12 ml a partir da placa de 6 poços para um tubo de centrífuga de 15 ml.
Nota: Uma vez que duas placas de 6 poços são usados neste protocolo, serão necessários dois tubos de 15 ml. - Transferência de 3 ml de PBS a um poço da placa, e, em seguida, transferir sequencialmente os mesmos 3 ml a cada poço subsequente para recolher quaisquer células residuais sobre o prato. Transferir os restantes 3 ml a partir da última bem no mesmo tubo de centrífuga de 15 ml contendo as células.
- Pelete a 300 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Prepare células de triagem de células vivas por FACS
- Preparar o tampão de coloração através da adição de 5 ml de Soro Fetal de Bovino a 45 ml de PBS em gelo com 50 ul de inibidor de ROCK.
- Retirar o sobrenadante do PEL céluladeixar (em 3.1.8) e ressuspender em 1,2 ml de tampão de coloração.
- Transferir 200 ul da suspensão de células a um, pré-arrefecido, 50 ml de tubo de centrífuga de novo em gelo. Este será o controle de coloração negativa.
- Transferir o restante 1 ml de suspensão de células a um, pré-arrefecido, 50 ml novo tubo de centrífuga em gelo e adiciona-se 2 ul SIRPα-PE / Cy7 (diluição 1: 500) e 4 uL de CD90-FITC (diluição 1: 250) . Misturar suavemente a suspensão de células com uma pipeta de transferência e retornar para o gelo.
- Incubar tanto o controlo negativo e a amostra, num agitador basculante, sobre gelo, a 4 ° C durante 1 h.
- Prepare tubos de coleta de amostra por adição de 3 ml de meio RPMI (com insulina) para dois tubos de 15 ml de centrífuga. Adicione 3 ul de inibidor ROCHA a cada tubo e armazenar no gelo.
- Agregar as células coradas a 300 xg durante 5 min a 4 ° C e lavar duas vezes com, pelo menos, 10 ml de PBS gelado por enxaguamento.
- Adicionar 1 mL de DAPI (1 ug / ml) a 5 ml de tampão de coloração. Suavementeressuspender o sedimento da amostra com 1-3 ml de tampão de coloração contendo DAPI utilizando uma pipeta de transferência.
- Adicionar 500 ul de tampão de coloração (sem DAPI adicionado) para o controlo negativo.
- Gentilmente filtrar tanto o controle negativo e amostras através de um filtro de 40 um celular para remover aglomerados de células e transferir para o poliestireno tubos de FACS em gelo. Imediatamente trazer amostras para o classificador de células.
- Semelhantes a células vivas estabeleceu os métodos de triagem 18, utilize o controlo negativo para definir as portas, selecione as células vivas (DAPI negativo) e recolher tanto o FITC + (ie, CD90 + fibroblastos) e PE / Cy7 + (ou seja, cardiomiócitos SIRPα + ) populações de forma independente a 20 psi (Figura 2).
Nota: Depois de definir as portas, o controlo negativo pode ser fixado em 4% PFA para determinar a eficiência de diferenciação através da coloração de troponina-T.
Nota: Alguns pesquisadores preferem usar umde controlo de isotipo, em vez de controlo não coradas para definir as portas, a fim de compensar a ligação não específica de anticorpos. Um controle chamado de fluorescência menos um (FMO) é outra possibilidade. Devido à distribuição bimodal clara do FITC, DAPI e sinais PE-Cy7, que fechado a partir da população positiva, conservadoramente visando longe no portão positivo, o que exclui, possivelmente, alguns verdadeiros positivos, mas ajuda a minimizar quaisquer falsos positivos.
- Reagregação celular em Preparação para Engenharia de Tecidos
- Após o tipo de células, a pelota ambos os tubos de recolha e ressuspender em 1 ml de DMEM contendo 10% de Soro Bovino neonatal, uma penicilina-estreptomicina% e 0,2% de anfotericina B ( "meios NBS").
- Recombinar os SIRPα + e CD90 + células na proporção de 3: 1 e a chapa células combinadas numa cultura de tecido não-tratada placa de Petri a uma densidade de 2 milhões de células por 60 centímetros 2 (placa de 10 cm). Adicionar 10 ml de meio NBS e 101; L de inibidor ROCHA Y-27632.
- Coloque suspensão de células no incubador de cultura de tecido durante 48 horas para permitir a reagregação de células em pequenos grupos.
4. Cardiac Human Tissue Engineering
- Fabricar o bioreactor multi-tecidos
Nota: Para complementar as ilustrações na Figura 3A, arquivos CAD com esquemas de design detalhado de biorreatores estão disponíveis mediante solicitação dos autores.- Máquina do mestre molde PDMS através da perfuração de seis furos igualmente espaçados de 0,5 mm de diâmetro em um cubóide 9 x 33 x 3,25 milímetros de politetrafluoretileno.
- Usando uma fresa de topo, máquina de um quadro de polysulfone medindo 25 x 35 x 11 mm3. O objectivo da armação é a realização de postos de PDMS (construídas a partir do molde feito acima) em alinhamento com as cavidades na placa de base.
- Usando uma fresa de topo de 1 mm, máquina de 6 poços (6 x 1 x 1 mm 3), 4 mm de distância em um pedaço de poli preto de 20 x 40 x 5 mm 3tetrafluoroetileno para formar a placa de base.
- Misture a base de elastômeros e agente de cura para polidimetilsiloxano (PDMS) em um 10: 1 w / w proporção e adicionar ao molde politetrafluoretileno personalizado (passo 4.1.1) para criar duas fileiras de seis postos de força-sensing, e incubar durante a noite e sob vácuo a 80 ° C. Após a cura, remover suavemente as PDMS do molde mestre e marcar cuidadosamente os topos de cada post com um marcador permanente preto para melhor contraste e acompanhamento pós deflexão automatizada em tempo real.
Nota: politetrafluoretileno é bastante suave e podem ser facilmente danificados. Tenha cuidado ao limpar o molde mestre antes de PDMS lançando para garantir a longevidade do sistema e de geometria consistente PDMS post. Um fio de 0,5 milímetros pode ser usado para limpar os furos para as mensagens depois de cada utilização, mas tomar cuidado para não raspar o interior dos furos.
Nota: Uma alternativa é o PDMS para desgaseificar sob vácuo durante várias horas à temperatura ambiente, em seguida, deixar a mistura de cura à pressão ambiente.Isto pode levar a menos bolhas de gás residual que se formam em PDMS durante o processo de cura. - Esterilizar todos os componentes em uma autoclave a vapor.
Nota: O molde PDMS mestre (passo 4.1.1) e quadro polysulfone (passo 4.1.2) são ambos reutilizável. Os postos de PDMS criados a partir do elenco (passo 4.1.4) também é reutilizável, mas apenas para cerca de 10 utilizações. No entanto, mais postos de PDMS podem ser criados conforme necessário usando o molde mestre.
- Coletar células cardíacas avaliação reagregada
- Remover as células avaliação reagregada da incubadora e transferir todos os 10 ml da mídia reagregação para um tubo de centrífuga de 50 ml.
- Lavar a placa com 3 ml de PBS e transferir a lavagem para o mesmo tubo de centrífuga de 50 ml contendo meios de comunicação reagregação.
- Adicionar 3 ml de 0,04% de tripsina / 0,03% de EDTA para a placa de 10 cm e de regresso para a incubadora durante 5 min.
- Após 5 min, examinar a placa com um microscópio invertido composto em 10X de ampliação para assegurar dissocia célula completação a partir do prato. Se alguns clusters residuais ainda estão ligados, agitar suavemente a placa para separar os aglomerados. Se os clusters permanecem ligados, retornar para a incubadora por mais 2-3 minutos. Não incubar mais de dez minutos ou morte celular significativa pode ocorrer.
- Uma vez que todas as células são separadas, adicionar 3 ml de solução de tripsina de neutralização. Misture suavemente a solução de neutralização com a solução de células-tripsina e transferência para o tubo de centrífuga de 50 ml que contém a mídia reagregação e lave uma vez com PBS.
- Lavar todo o prato com 5 ml de PBS e transferir para o mesmo tubo de 50 ml contendo as células.
- Agregar as células a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
- Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 1 ml de meio de NBS, em seguida, transferir para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Pelete a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente e remover o sobrenadante. As células cardíacas (células CD90 + estromais e SIRPα + miocagora ytes) estão prontos para a construção de tecidos.
- (Opcional) coletar células Complementares de interesse
Nota: Em adição aos tecidos definidas contendo apenas SIRPα + cardiomiócitos e células CD90 + de tipo fibroblasto, é possível adicionar as células adicionais de interesse para interrogar o seu efeito sobre a função do tecido. Por exemplo MSCs de rato foram mostrados para melhorar a função de rato engenharia tecidos cardíacos 1. O seguinte passo opcional descreve a coleção de células suplementares para o sistema definido.- Recolhe-se o tipo de célula suplementar de interesse (por exemplo, as células estaminais mesenquimais) usando 0,25% de tripsina / EDTA a 0,1%.
- Agregar as células a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente e em seguida ressuspender em 5 ml de meio de cultura de células apropriado para o tipo celular de interesse. Por exemplo, para as MSCs, utilizar DMEM suplementado com 20% de soro fetal bovino, 1% de penicilina-estreptomicina e 0,2% de anfotericina-B para a cultura cells.
- Executar uma contagem de células utilizando um hemocitómetro, em seguida, sedimentar as células mais uma vez a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
- Remover o sobrenadante, ressuspender em 1 ml de meio de cultura de células e transferir para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Agregar as células a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
- Remover o sobrenadante. As células suplementares estão agora prontos para a construção de tecidos.
Nota: se as células suplementares são adicionados a uma concentração de 10% do número total de células no tecido, em seguida, para os tecidos definidas, isto exigirá 50.000 células suplementares por tecido uma vez que cada tecido contém 500.000 células cardíacas (ambas as células estromais CD90 + e SIRPα miócitos +).
- Criar as Engineered cardíacas Tecidos Humanos
Nota: Armazenar todas as soluções em gelo e as células à temperatura ambiente. Todos os volumes abaixo indicados são por tecido. Tipicamente, cerca de seis tecidos pode ser construído a partir de duas-seis bem PLates de diferenciações cardíacas.- Dilui-se 60,0 ul de estoque a 5 mg de colagénio / ml a 3,125 mg / mL com 1,5 mL de NaOH 1 M, 9,6 ul de PBS 10X e 24,9 ul de água ultrapura desionizada estéril.
passo crítico: evitar a introdução de bolhas de ar para cada solução durante a preparação, como as bolhas de ar vai perturbar a formação de tecido adequado. - Adicionar 12.0 ul de MEM tanto 10x e 0,2 N de HEPES pH 9 para a mistura de colagénio diluído para criar a mistura de colagénio. Adicionar as duas soluções para baixo o lado do tubo de centrifugação de 15 ml, a fim de evitar a introdução de bolhas de ar na mistura de colagénio.
- Adicionar a matriz da membrana basal para uma concentração final de 0,9 mg / mL à mistura de colagénio e armazenar em gelo para criar a mistura final em tecido. A concentração final de colagénio deve ser de 2 mg / ml.
- Adicionar 500.000 das células avaliação reagregada à mistura de tecido (miócito + concentração é de 20 milhões de fibroblastos / ml) e enche-se a um volume final de 25 ul portecido, quer com meios isentos de células NBS ou 50.000 células do tipo de células de interesse suplementar (por exemplo, as hMSCs) e misturar bem para formar uma suspensão de células regular.
Nota: O número de células suplementadas irá variar de para diferentes aplicações. Aqui suplementação de 10% é usado. - Com cuidado, pipeta de 25 uL da suspensão celular em cada um dos seis poços na placa de base do biorreactor, sem a introdução de bolhas de ar para dentro do poço.
- Empurrar as duas filas de sensores de força PDMS em ambos os lados da armação de polissulfona, formando 6 pares de postes opostos, em seguida, invertido a estrutura na parte superior da placa de base de modo a que um par de postes entra em cada uma das cavidades contendo a suspensão de células.
Nota: O quadro polysulfone inclui guias para auxiliar no alinhamento dos PDMS. - Com cuidado, coloque o biorreator, placa de base para baixo, em um prato de 60 mm, em seguida, coloque o prato sem sua capa interior de uma placa de 10 cm, coloque a tampa 10 centímetros no topo, e mover todo o conjunto biorreator empara a incubadora de cultura de tecidos, à espera de duas horas para o tecido a gel.
- Após 2 horas, retire o biorreator da incubadora e adicione 14 ml de meio NBS para todo o conjunto, o suficiente para cobrir a placa de base. Voltar para a incubadora e alterar a metade dos meios de comunicação todos os dias.
- Quarenta e oito horas mais tarde, remova cuidadosamente a placa de base, movendo delicadamente cada lado da placa de base para fora do chassis de alguns milímetros em um momento, alterar os meios de comunicação, em seguida, retornar o biorreator, tecidos voltados para baixo, para a mídia.
- Continuar a alterar a metade do meio de cultura todos os dias NBS.
Nota: as contracções espontâneas do tecido podem ser observadas tão cedo quanto três dias após a construção do tecido, a geração de forças de contração mensuráveis tão cedo como o dia 5-7.
- Dilui-se 60,0 ul de estoque a 5 mg de colagénio / ml a 3,125 mg / mL com 1,5 mL de NaOH 1 M, 9,6 ul de PBS 10X e 24,9 ul de água ultrapura desionizada estéril.
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Representative Results
Para obter miócitos cardíacos, uma versão ligeiramente modificada dos métodos de diferenciação Boheler e Lian é usado 30,31. É imperativo que a diferenciação começa durante a fase log-do crescimento das células, mas também que a população inicial é suficientemente confluentes para obter um número de células utilizável, após separação (cerca de 75% é óptimo). Tipicamente, para H7 hESCs, plaqueamento a uma densidade de 140.000 hESCs por poço de um prato de 6 poços no essencial 8 media e 5% de CO 2 incubadora mantida a 37 ° C produz culturas suficientemente confluentes depois de 4 dias a começar a diferenciação, como ilustrado na Figura 1A - D. Uma vez que a insulina inibe a especificação cardíaca durante o processo de diferenciação 32, meios de insulina livre (diferenciação meios I, Quadro 1) é utilizado para os primeiros 10 dias de diferenciação. Uma vez que a diferenciação é iniciada através da aplicação do CHIR99021 inibidor de GSK3,morte celular significativa irá ocorrer (Figura 1E). Como consequência, é essencial para mudar a mídia todos os dias. No dia 2 de diferenciação, as células são removidas do CHIR99021 e descansou em meios de diferenciação I (sem adição de moléculas pequenas) durante 24 h. Após o descanso de 24 horas em meio de diferenciação, as células são tratadas com IWR-1 durante 48 horas, depois do qual eles começam a se auto-organizam em clusters (Figura 1F) que batem como início de sete dias a partir de iniciar a diferenciação. Desde especificação cardíaca ocorreu após a aplicação do IWR-1, a mídia é alterado para meios contendo insulina (media diferenciação II, Tabela 1). Aos 18 dias de diferenciação, as colónias de células batendo tenham ligado e parcialmente destacada da superfície da célula, formando robustamente bater "teias" em todo o prato (Vídeo Figura 1).
No dia 20, a monocamada de batimento é suavemente dissociados VIum métodos enzimáticos para obter células únicas de células vivas fluorescente associado (FACS). Usando o método de diferenciação descrito acima, de forma conservadora colheita de aproximadamente 65% da população como SIRPα + e 10% de CD90 + (Figura 2). Geralmente 1-2 milhões de células SIRPα + são obtidos por placa de 6 poços.
Depois de reagregação durante 48 horas em uma proporção de 3: 1 de SIRPα +: CD90 + células, os agregados de células são definidos misturado com um hidrogel à base de colagénio e pipetadas para poços estreitos na placa de base do bioreactor multi-tecido. Normalmente, antes da remoção do prato, pequenos agrupamentos de células 5-10 será visto batendo na superfície do prato. O biorreator tecido definido consiste em três componentes: um molde mestre para lançar os postos de PDMS; uma moldura para segurar dois PDMS prateleiras de mensagens; e uma placa de base de politetrafluoretileno preta contendo seis poços para a mistura de tecidos (Fig3A URE). Todo o processo de construção de tecido é realizada em gelo e em condições assépticas. Depois de adicionar as misturas de células-matriz líquidos aos poços, a placa de base, as mensagens de PDMS estão ligados à armação de polissulfona, e depois invertido de modo a que as mensagens alinhar com os poços na placa de base (Figura 3B). Após 48 hr de incubação, os tecidos devem ser suficientemente compactado que a placa de base pode ser removido. A placa de base é mais facilmente retirado extraindo todo o sistema a partir da mídia e suavemente remover qualquer excesso de mídia da entre as PDMS e placa de base. Se todos os meios de comunicação não for removido, a tensão superficial do líquido restante pode puxar os tecidos fora das mensagens. Uma vez que a mídia é removida, empurre cuidadosamente a placa de base para trás contra os postos de PDMS para ajudar a soltar o tecido da placa de base. Depois, gradualmente, empurre a placa de base off ao mover suavemente de um lado para cima alguns milímetros, então o outro lado a mesma quantidade. Repita este processo até que o baseplate é removido, com todos os 6 hects ligados aos seus respectivos terminais postos de PDMS (Figura 4A). Removendo a placa de base não deve demorar mais de um minuto. Substituir o sistema para o meio de cultura de células, invertida, de modo que todos os tecidos são cobertas por meio de cultura celular.
Aproximadamente um dia após a remoção da placa de base, fracas contracções localizadas deve ser observável nas hects definidos sob microscopia de campo claro. Após 7 dias, os tecidos tenham amadurecido e compactado (Figura 4B-C) com sarcómeros alinhadas (Figura 4D). Os tecidos visivelmente desviar as mensagens PDMS com uma média de 5-15 μN de força (Figura 4E). Twitch medidas de força para os tecidos cardíacos engenharia definidos pode ser medido pelo acompanhamento em tempo real da deflexão pós ponta com uma alta velocidade software de aquisição de câmera e personalizados de dados e aplicação do pós deflexão ao raio de curvatura teoria depois de determinar aO módulo de Young dos postos de silicone utilizando um transdutor de força, como explicado em maior detalhe anteriormente. 1,7 manter a esterilidade durante a aquisição de dados assegura a capacidade para medir alterações na função do tecido ao longo do tempo. Mantivemos tecidos funcionais durante várias semanas, conforme explicado em mais detalhes em outros lugares 1. Nossos resultados preliminares indicam um aumento substancial da força contrátil Hect quando os tecidos são suplementado com 10% de células-tronco mesenquimais humanas, tanto a 1 Hz e 2 frequências Hz de estimulação (Figura 4F).
Figura 1: Imagens representativas de H7 hESCs durante o processo de expansão e diferenciação cardíaca. A fase de expansão deve durar 4 dias, com o crescimento das colónias em expansão de 24 (A), a 48 (B), 72 (C (D). Após 96 horas de crescimento a diferenciação é iniciada, resultando em morte celular substancial, durante as primeiras 48 horas de tratamento CHIR99021 (E). Após dois dias de IWR 1-tratamento, reorganização ocorre (F) para formar aglomerados de células que batem tão cedo quanto o dia 7. Além disso organização em uma "web" robustamente batendo acontece do dia 7 ao dia 20, quando as monocamadas são dissociados para a criação de tecidos cardíacos de engenharia.
Vídeo Figura 1:. Monocamada cardíaca Representante, após 17 dias de diferenciação . Por favor clique aqui para ver este vídeo batida espontânea dentro da monocamada é normalmente observada pela primeira vez entre o dia 7 e no dia 10, e por 17 dias de diferenciação da monocamada formou teias interligados " "que bateu de forma robusta.
| Nome | Composição | Dias de diferenciação utilizados |
| Diferenciação Media I | RPMI 1640 B27 Supplement (menos insulina) Penicilina-Estreptomicina | D0-D1 (com CHIR99021) D2 D3-D5 (com IWR-1) D5-D7 |
| Diferenciação Media II | RPMI 1640 B27 Supplement (com insulina) Penicilina-Estreptomicina | D7-D20 |
Tabela 1: Composição de diferenciação Medias.
Figura 2: tipo de células vivas Representanteing resultados Duas amostras foram preparadas:. um controlo não corado e um controlo coradas usando diluição de 1: 500 do anticorpo SIRPα-PE / Cy7 e 1: diluição do anticorpo CD90-FITC 250. Após a coloração, as células foram separadas a 20 psi na triagem tampão composto de PBS, soro bovino neonatal 10%, 10 uM de inibidor ROCHA Y-27632, e 1 ug / ml de DAPI. Ambas as populações de células foram fechado nos perfis de dispersão frontal e lateral para excluir detritos (A, linha azul), então células individuais foram selecionados através da comparação da largura de pulso e altura (pulso análise de largura), tanto na dispersão para a frente (B, linha azul) e canais de dispersão lateral (C, linha azul). Em seguida, as células vivas foram selecionados por gating o DAPI - população (D, linha azul). As populações de células finais para coleta foram determinadas através da análise dos níveis de expressão FITC e PE-Cy7 das populações ao vivo. O controlo não corado (E, esquerda) foi usada paraestabelecer a porta apropriada para seleccionar para o FITC + (CD90) e SIRPα-PE Cy7 + (cardiomiócitos) / população presente na amostra manchado (E, à direita). O FITC e SIRPα-PE / Cy7 + poplations foram coletadas em 15 ml tubos de centrífuga separados.
Figura 3:. Esquemático do bioreactor multi-tecido e o processo de engenharia de tecido cardíaco Construção do bioreactor multi-tecido requer três componentes (A): 1) um politetrafluoroetileno mestre de molde 9 x 33 x 5 mm 3 com 6 furos uniformemente espaçados 0,5 mm de diâmetro; 2) a 25 x 35 x 11 mm 3 estrutura polysulfone para manter os postos de PDMS durante a construção e de cultura de tecidos; e 3) a cerca de 20 x 40 x 5 mm3 placa de base de politetrafluoretileno preto com 6 poços de 6 x 1 mm x 1 3 dimensões, termasced 4 mm de distância ao longo de seu comprimento. Para criar tecidos cardíacos engenharia humanos (B), os postos de PDMS são fabricados por PDMS litografia macia usando o molde mestre politetrafluoretileno, dois dos quais são, então, pressionado sobre as guias do quadro polysulfone para formar 6 pares de mensagens cantilever com sensor de força. A solução é pipetada tecidos nas cavidades na placa de base de politetrafluoretileno preto. O quadro e as mensagens são então invertido e alinhados na placa de base politetrafluoretileno para que um par de mensagens entra cada poço contendo a mistura de tecidos. Após 48 horas, a placa de base é removido e os tecidos definidos são cultivadas nos postes, permanecendo invertido em meio NBS.
Figura 4:. Imagens representativas e medidas funcionais de tecidos cardíacos humanos engenharia definidas O bioreact multi-tecidosou sistema detém seis tecidos em paralelo (A, pontas de seta). Tecidos definidos são auto-montadas dentro de sete dias após a criação de tecido (vista de cima, B e lateral oblíqua, C). (D). Parcela de um Hect definido coradas para troponina T cardíaca (cTnT). (E) Representante traçado contração mostra força bruta ao longo do tempo durante 1 Hz a estimulação por estimulação do campo eléctrico. (F) Twitch rastreio durante a estimulação de 1 Hz (0-2 seg) e 2 Hz estimulação (2-4 seg), com marcação mudança de frequência, para ambos os hects definidos não suplementadas (linha sólida) da seta e tecidos suplementado com 10% de hMSCs (linha pontilhada).
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Discussion
Construção de tecidos humanos definidos engenharia cardíacas (Hect) pode fornecer um modelo mais consistente e confiável da função dos miócitos cardíacos humano. Fundamentalmente, todos os componentes celulares e extracelulares no sistema são conhecidos e podem ser manipuladas como desejado, removendo assim a confusão influência de outros tipos celulares desconhecidos resultantes do processo de diferenciação. Para equilibrar o crescimento celular rápido e elevado rendimento, é preferível que a diferenciação começa a 75% de confluência dos hESCs, idealmente quatro dias após o plaqueamento. Além disso, a utilização de inibidor ROCHA Y-27632 durante tanto a dissociação de células e, após separação reagregação aumenta grandemente a viabilidade celular. A presença de batimento espontâneo de miócitos durante o processo de diferenciação é um importante indicador da eficiência e da saúde da diferenciação. Se o batimento espontâneo não é observado isso pode indicar baixa eficiência diferenciação, quer devido a reagentes ineficazes ou uma perdada pluripotência das células estaminais.
Durante a construção do tecido, os postos de PDMS deve alinhar corretamente com os canais na placa de base para criar tecidos bem formados que duram o tempo suficiente para medir a função contrátil. Para melhorar a facilidade de alinhamento do dispositivo, e reforçar a formação de tecido em torno dos pilares, onde eles são susceptíveis a ruptura, é possível adicionar largura extra (cerca de um diâmetro do pino em cada lado do poste) para as extremidades dos canais, como demonstrado pela "osso de cão" canais na Figura 3A em forma. Sem o alinhamento correcto do dispositivo do tecido será ou separar as mensagens logo após a cultura, ou vai permanecer no poço, quando a placa de base é removido. Se um tecido bem formado cai durante a remoção da placa de base, é possível voltar a ligar suavemente o tecido para as mensagens, utilizando fórceps finos sob um microscópio de dissecação, embora seja fácil de danificar as delicadas hects se o cuidado adequado não é tomada. </ P>
Um dos principais pontos fortes do sistema definido descrito é a capacidade de interrogar a contribuição de mecanismos de interação célula-célula diretos em terapias com células cardíacas baseada no controle específico de composição celular. A injeção de células em animais é imprecisa e sujeita a baixa viabilidade e retenção 33. Além disso, o efeito das células injectadas sobre o tecido alvo é complicada por interacções com outros sistemas fisiológicos, tais como o sistema imunitário. Como tal, a compreensão da contribuição de interações célula-célula diretos em terapias com células cardíacas é um desafio de abordar em organismos modelo. Portanto, uma vantagem para o método descrito é que as interacções célula-célula são analisados num ambiente tridimensional biomimética, preservar os aspectos fundamentais do nicho cardíaca, e na presença dos tipos de células específicas de interesse - isto é, os miócitos cardíacos e fibroblastos. A utilidade da utilização do sistema é definida HECT demonstrciado com a suplementação de 10% de hMSC derivadas de medula humana e 34,35 usados em ensaios clínicos para a mistura celular durante a criação do tecido. Esses tecidos que foram suplementadas com as hMSCs exibiu maior força contrátil do que as não suplementadas tecidos humanos definida (Figura 4F). Uma vez que o ambiente do tecido e a composição tenha sido controlada, o aumento da função do tecido com a suplementação do MSC reflecte um efeito inerente de hMSCs em função dos cardiomiócitos. Outra força para o sistema é que uma vez que os tecidos são menores do que utilizado anteriormente, 1,7 a utilização das células é mais eficiente, uma consideração importante quando se utiliza dirigidos diferenciações das células estaminais pluripotentes como a fonte de células.
Para além de estudar os mecanismos de terapia celular, o sistema de HECT definido permitiria o exame de base celular de interacções célula-célula cardiovasculares. Perturbação da biologia das células antes da const tecidosruction, por exemplo, com shRNAs, permitiria a investigação dos mecanismos moleculares que regulam as interacções célula-célula e célula-matriz. Uma vantagem adicional para o sistema de engenharia de tecidos é a formação de miofibrilas alinhados capazes de contracções funcionais. Deste modo, utilizando o sistema de HECT definido, a dinâmica de formação miofibrilar, desenvolvimento de cardiomiócitos e a organização da arquitectura dos tecidos pode ser investigada através de toda a modificação dos componentes da matriz extra-celular ou manipulação molecular das células. A natureza humana e 3-D do sistema de Hect adicionalmente aumenta a traduzibilidade dos resultados.
Enquanto o sistema descrito oferece um método poderoso para a compreensão questões básicas da biologia cardiovascular, não é sem limitações. Em primeiro lugar, os tecidos artificiais apresentam um fenótipo imaturo, de acordo com dados da força de contração publicados a partir de amostras de miocárdio de recém-nascidos 7. Enquanto oimaturidade fenotípica pode ser um fator de confusão na avaliação de mecanismos de interação celular, há evidências de que os cardiomiócitos doentes reverter para um programa gene fetal 7,36-38. Se os resultados do sistema de HECT provar ser relevante no contexto de uma falha cardíaca, isto pode ser vantajoso para testar terapias cardíacas. O protocolo também utiliza uma matriz de membrana basal qualificada células estaminais embrionárias humanas durante a construção do tecido. A composição desta matriz pode variar de lote para lote, e enquanto alternativas de matriz porão definidos estão disponíveis eles ainda têm de ser avaliadas no contexto de hects.
Outras limitações incluem a falta de um sistema vascular e não há efeitos de interacção no nível do sistema. Dado o tamanho dos tecidos, demandas metabólicas são atendidas por difusão sozinho, então não é necessário nenhum sistema vascular para garantir a viabilidade celular. No entanto, a sinalização de células endoteliais pode ser um fator importante em terapias celulares específicos. Se este for o caso, um número específico de endoThelial células podem ser simplesmente adicionados à mistura de células definido durante a construção do tecido. Enquanto interações em nível de sistemas são importantes para a compreensão completa dos mecanismos celulares, o sistema de engenharia de tecidos oferece uma abordagem reducionista para simplificar o problema, a fim de abordar o mecanismo de forma sistemática. A complexidade pode ser adicionado ao sistema de tecidos definidas, conforme necessário, através da introdução de efeitos relacionadas com os sistemas, tais como os leucócitos para incorporar uma resposta imune, ou pela adição de vizinhos tipos de tecidos para interrogar sinalização parácrina.
Como ferramenta de investigação, o sistema tecido cardíaco humano engenharia definido oferece os benefícios de células humanas específicas da espécie, um ambiente de cultura 3-D biomimético com biocomplexidade controlada, monitoramento direto e longitudinal da função contrátil, e uma composição celular e matriz definida. direções futuras para o sistema Hect incluem a manipulação do tipo de célula terapêutica de interesse with ARNsi ou ARNsh antes da introdução no tecido, a fim de investigar detalhes moleculares específicos de interacção célula-célula. Além disso, em vez de usar hESCs para formar as células cardíacas, é possível utilizar células estaminais pluripotentes induzidas (IPSCs) a partir de pacientes com uma mutação herdada num esforço para modelar as manifestações da doença cardíaca relacionadas nos tecidos manipulados. Assim, o nosso método de criação de humanos engenharia tecidos cardíacos com populações de células definidas promete abrir novos caminhos para o estudo de terapias com células cardíacas para ajudar a acelerar o desenvolvimento de novos tratamentos para pacientes com doenças cardíacas.
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Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo NIH (1F30HL118923-01A1) para TJC, NIH / NHLBI PEN contrato HHSN268201000045C a KDC, o conselho bolsa de pesquisa de Hong Kong TRS T13-706 / 11 (KDC), NIH (R01 HL113499) para BDG, o americano Heart Association (12PRE12060254) para RJ e Research Conselho Grant da RAEHK (TBR, T13-706 / 11) a RL financiamento adicional foi fornecido para TJC pelo NIH DRB 5T32GM008553-18 e, como um estágio para a Formação NIDCR-Interdisciplinar em Sistemas e desenvolvimento biologia e defeitos congénitos T32HD075735. Os autores também gostaria de reconhecer com gratidão Arthur Autz no Centro Zahn do The City College de Nova York para obter assistência com a usinagem do biorreator e Mamdouh Eldaly para assistência técnica. Agradecemos também o Dr. Kenneth Boheler para aconselhamento sobre a diferenciação cardíaca e Dr. Joshua Hare para generosamente fornecer células-tronco mesenquimais humanas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Culture | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2411 | Prepare a 2.5 mg/ml stock in DMSO and filter-sterilize |
| B27 with Insulin | Life Technologies | 17505055 | |
| B27 without Insulin | Life Technologies | A1895601 | |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | Create 6 μM stock, then aliquot and store at -20 °C. |
| Essential 8 Media | Life Technologies | A1517001 | |
| H7 Human Embryonic Stem Cells | WiCell | WA07 | |
| hESC Qualified Matrix, Corning Matrigel | Corning | 354277 | Thaw on ice at 4 °C overnight then aliquot 150 μl into separate tubes and store at -20 °C. |
| IWR-1 | Sigma-Aldrich | I0161 | Create 10 mM stock and aliquot. Store at -20 °C |
| Neonatal Calf Serum | Life Technologies | 16010159 | |
| Non-enzymatic Dissociation Reagent: Gentle Cell Dissociation Reagent | Stem Cell Technologies | 7174 | |
| Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875-093 | Keep refrigerated |
| Y-27632 (ROCK Inhibitor) | Stemgent | 04-0012 | Resuspend to a 10 mM stock concentration, aliquot and store at -20 °C. Avoid freeze thaw cycles. |
| Cell Sorting | Company | Catalog Number | Comments |
| 4’,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| CD90-FITC | BioLegend | 328107 | |
| Enzymatic Dissociation Reagent: Cell Detach Kit I (0.04 % Trypsin/ 0.03% EDTA, Trypsin neutralization solution and Hanks Buffered Salt Solution) | PromoCell | C-41200 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologics | S11250 | |
| SIRPα-PE/Cy7 | BioLegend | 323807 | |
| Tissue Construction | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin/0.1% EDTA | Fisher Scientific | 25-053-CI | Optional: For collection of supplemental cells of interest |
| 10x MEM | Sigma-Aldrich | M0275-100ML | |
| 10x PBS Packets | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Collagen, Bovine Type I | Life Technologies | A10644-01 | Keep on ice |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330057 | |
| Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM), High Glucose | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Sodium HEPES | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | NC0536757 | |
| 15 ml polyproylene centrifuge tube | Corning | 352096 | |
| 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | Corning | 352235 | With integrated 35 μm cell strainer |
| 50 ml polyproylene centrifuge tube | Corning | 352070 | |
| 6-well flat bottom tissue-culture treated plate | Corning | 353046 | |
| Cell Scraper, Disposable | Biologix | 70-2180 | |
| Polysulfone | McMaster-Carr | ||
| Polytetrafluoroethylene (Teflon) | McMaster-Carr | ||
| Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ-61 | Or similar, must have a mount for the high speed camera to attach |
| Electrical Pacing System | Astro-Med, Inc | Grass S88X Stimulator | |
| High Speed Camera | Pixelink | PL-B741U | Or similar, but must be capable of 100 frames per second for accurate data acquisition |
| Plate Temperature Control | Used to maintain media temperature during data acqusition. | ||
| Custom Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| LabView Post-tracking Program | available upon request from the authors |
References
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