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Bioengineering

निर्धारित मानव इंजीनियर कार्डिएक ऊतकों के निर्माण हृदय सेल थेरेपी के तंत्र का अध्ययन करने के लिए

doi: 10.3791/53447 Published: March 1, 2016

Introduction

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हृदय ऊतक इंजीनियरिंग पूरी तरह कार्यात्मक, पिटाई और अधिक हाल ही में दोनों murine cardiomyocytes 1-6 और, से बना ऊतकों, मानव स्टेम सेल व्युत्पन्न हृदय myocytes 7-12 के परिणामों को प्रकाशित करने के लिए कई समूहों के साथ पिछले एक दशक में काफी उन्नत है, किया गया है। हृदय ऊतक इंजीनियरिंग के क्षेत्र में दो प्राथमिक और अनिवार्य रूप से स्वतंत्र लक्ष्यों से प्रेरित है: 1) बहिर्जात ग्राफ्ट कि समारोह में 4-6 सुधार करने के लिए दिल में नाकाम रहने में प्रत्यारोपित किया जा सकता है विकसित करने के लिए; और 2) शरीर विज्ञान और रोग के अध्ययन के लिए इन विट्रो मॉडल में विकसित करने, या चिकित्सीय विकास 2,7 के लिए स्क्रीनिंग उपकरण के रूप में करने के लिए।

तीन आयामी (3-डी) सेल संस्कृति अगली पीढ़ी स्क्रीनिंग उपकरणों के विकास, के रूप में 3-डी मैट्रिक्स पारंपरिक 2-डी monolayer सेल संस्कृति की तुलना में एक अधिक प्राकृतिक हृदय microenvironment दर्शाता है के लिए आवश्यक माना जाता है; वास्तव में कोशिका जीव विज्ञान के कुछ पहलुओं को 2-डी बनाम 3-डी संस्कृतियों 13,14 में मौलिक रूप से अलग हैं 9 या कोलेजन 7,8,10) सख्ती से नियंत्रित किया जाता है, इनपुट कक्ष रचना कम अच्छी तरह से, कोशिकाओं के पूरे मिश्रण के साथ की एक निर्देशित हृदय भेदभाव से परिभाषित किया गया है या तो भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ईएससी 7.9) या प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (IPSC 10,12) ऊतकों को जोड़ा जा रहा है। विशेष सेल लाइन और भेदभाव इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल की क्षमता पर निर्भर करता है, cardiomyocytes के परिणामस्वरूप प्रतिशत, 90% से अधिक करने के लिए कम से कम 25% से लेकर कर सकते हैं विशिष्ट cardiomyocyte फेनोटाइप (यानी, ventricular-, atrial-, या पेसमेकर की तरह) यह भी भिन्न हो सकते हैं, यहां तक कि गैर cardiomyocyte अंश बेहद विषम 15,16 हो सकता है और अलग-अलग हृदय मीटर की परिपक्वता को बदल सकते हैं17 yocytes।

हाल हृदय ऊतक इंजीनियरिंग का काम या तो एक हृदय संवाददाता मानव भ्रूण स्टेम सेल लाइन 8 या कोशिका की सतह मार्करों 18 भेदभाव के हृदय myocyte घटक को अलग-थलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है, कोशिकाओं के इनपुट जनसंख्या को नियंत्रित करने का प्रयास किया गया। शुरू में एक ही हृदय myocytes से बना ऊतक आदर्श होना प्रतीत होता है, वहीं इस तथ्य नहीं मामले में है; पूरी तरह से हृदय myocytes से बना hECTs, कार्यात्मक ऊतकों में संकुचित करने में विफल कुछ समूहों 3 खोजने के साथ: हृदय myocytes की: 1 के अनुपात fibroblasts उच्चतम चिकोटी बल 8 का निर्माण किया। विभिन्न सेल चयन के तरीकों का उपयोग कर, जीना सेल छँटाई के लिए सतह मार्कर सहित करके, इसे परिभाषित सेल आबादी के साथ hECTs बनाने के लिए संभव है। जबकि गैर-हृदय stromal कोशिकाओं के मार्कर के इस तरह के ख्यात fibroblast मार्कर के रूप में कुछ समय के लिए उपलब्ध किया गया है, CD90 19,20, हृदय myocytes की सतह मार्कर अधिक मुश्किल हो गया हैपहचान करने के लिए। SIRPα पहले हृदय की सतह मार्कर मानव हृदय myocytes 18 के लिए पहचान के बीच था और हृदय वंश के लिए अत्यधिक चयनात्मक होना दिखाया गया है। हाल ही में, हमने पाया है कि डबल-छंटाई के लिए SIRPα + और ​​CD90 है - कोशिकाओं लगभग शुद्ध cardiomyocytes पैदावार, CD90 + जनसंख्या एक fibroblast-तरह phenotype (Josowitz, अप्रकाशित टिप्पणियों) प्रदर्शन के साथ। Cardiomyocytes और CD90 + fibroblasts - SIRPα + / CD90 के 1 संयोग: इन निष्कर्षों के आधार पर एकत्र, के साथ साथ हम एक 3 का उपयोग hECTs बनाने का वर्णन है।

एक पूरी तरह से परिभाषित मानव हृदय के ऊतकों इंजीनियर करने की क्षमता आवश्यक न केवल मजबूत स्क्रीनिंग उपकरण बनाने के लिए, लेकिन यह भी मॉडल प्रणाली विकसित करने में उभर सेल और जीन के आधार पर हृदय उपचारों की जांच करने के लिए है। दिल की विफलता के लिए विशेष रूप से, कई सेल उपचार, mesenchymal स्टेम सेल (एमएससी), 21 सहित प्रकार की कोशिकाओं के उपयोग में 22 और अस्थि मज्जा कोशिकाओं mononuclear 23-25, क्लिनिकल परीक्षण में परीक्षण किया गया है। हालांकि शुरुआती परिणामों के कई 21,23,25 वादा किया गया है, प्रारंभिक लाभ अक्सर समय 26-29 ओवर कम हो। ऐसा ही एक प्रवृत्ति murine इंजीनियर हृदय के ऊतकों, एमएससी पूरकता के कारण जो एक महत्वपूर्ण कार्यात्मक लाभ प्रदर्शित की रिपोर्ट में किया गया है, लेकिन लाभ लंबे समय तक संस्कृति 1 के दौरान निरंतर नहीं है। उप इष्टतम प्रदर्शन अंतर्निहित सेल उपचार गवर्निंग तंत्र के बारे में हमारी सीमित ज्ञान है। कैसे चिकित्सीय कोशिकाओं उनके लाभकारी प्रभाव है, साथ ही myocyte-nonmyocyte बातचीत के संभावित नकारात्मक परिणाम डालती की एक गहरी समझ, चिकित्सकीय महत्वपूर्ण और निरंतर लाभ उपज में सुधार उपचारों के विकास, कम से कम साइड इफेक्ट के साथ, दिल की विफलता के साथ रोगियों के लिए सक्षम होगा।

यहाँ, हम interrog को परिभाषित hECTs के उपयोग का वर्णनसेल आधारित चिकित्सा के तंत्र खा लिया। नियंत्रित ऊतक रचना cardiomyocyte प्रदर्शन को प्रभावित विशिष्ट कारकों की पहचान करने के लिए आवश्यक है। सीधे ब्याज की चिकित्सीय सेल प्रकार (जैसे, MSCs) के साथ hECTs सप्लीमेंट, हृदय myocyte प्रदर्शन पर प्रभाव प्रकट कर सकते हैं, जैसा कि हम चूहे ECTS 1 में प्रदर्शन किया है।

निम्नलिखित बहु कदम प्रोटोकॉल का निर्देश कार्डियक स्टेम सेल भेदभाव के साथ शुरू होता है, बहु-ऊतक बायोरिएक्टर के निर्माण के द्वारा पीछा किया, और ऊतकों के निर्माण और कार्यात्मक विश्लेषण का एक विवरण के साथ समापन। हमारे प्रयोगों एनआईएच को मंजूरी दे दी H7 मानव भ्रूण स्टेम सेल (hESC) लाइन का उपयोग कर प्रदर्शन कर रहे हैं। हालांकि, निम्नलिखित प्रोटोकॉल भी एक अतिरिक्त hESC लाइन और तीन प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSC) इसी तरह के परिणाम के साथ लाइनों का उपयोग कर परीक्षण किया गया है। हमने पाया है कि cardiomyocyte भेदभाव और हेक्टेयर निर्माण में सफलता में दक्षता सेल लाइन निर्भर हो सकता है, खासकर के लिएआर hiPSC लाइनों व्यक्ति के रोगियों से निकाली गई। इस प्रोटोकॉल का पालन करके, दो 6 अच्छी तरह से व्यंजन 16.8 लाख hESCs (अच्छी तरह से प्रति 140,000 कोशिकाओं) है, जो 20 दिनों के लिए फर्क और छँटाई, पर्याप्त छह परिभाषित ऊतक बनाने के बाद लगभग 25 लाख myocytes पैदावार की कुल के साथ चढ़ाया जाता है।

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Protocol

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ध्यान दें: एक HEPA फ़िल्टर वर्ग द्वितीय जैविक सुरक्षा कैबिनेट का उपयोग कर मम्मियाँ की स्थिति में सभी सेल जोड़तोड़ प्रदर्शन और एक 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से उन्हें छान कर सभी समाधान बाँझ। या तो एक ही मम्मियाँ शर्तों या एक लामिना का प्रवाह हुड में ऊतक निर्माण और समारोह परीक्षण प्रदर्शन।

कार्डिएक भेदभाव के लिए तैयारी में H7 hESCs के 1. सीडिंग

  1. (1 दिन) तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स तैयारी
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर बर्फ पर hESC योग्य तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के 150 μl विभाज्य पिघलना।
  2. (दिन 0-4) लेपित प्लेटों पर hESCs के चढ़ाना
    1. ठंडा DMEM / F12 के 12 मिलीलीटर में thawed मैट्रिक्स पतला और अच्छी तरह मिलाएँ।
    2. स्थानांतरण 6 अच्छी तरह से टिशू कल्चर इलाज पकवान के प्रत्येक कुएं में DMEM / F12 मैट्रिक्स समाधान के 1 मिलीलीटर। मैट्रिक्स कर सकते हैं कोट दो 6 अच्छी तरह से प्लेटों के प्रत्येक विभाज्य।
    3. कम से कम 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर लेपित प्लेटें सेते हैं।
      नोट: मेंहमारे अनुभव, आयल के साथ बंद लेपित व्यंजन उपयोग करने से पहले करने के लिए 10 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मैट्रिक्स समाधान में संग्रहित किया जा सकता है।
    4. लगभग 75% संगम पर गैर एंजाइमी हदबंदी अभिकर्मक के 6 मिलीलीटर का उपयोग कर 10 सेमी पकवान से H7 hESCs अलग कर देना। 5 मिनट के बाद, धीरे से एक डिस्पोजेबल सेल खुरचनी का उपयोग संस्कृति की सतह से कोशिकाओं परिमार्जन और एक बाँझ 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब सेल निलंबन हस्तांतरण।
    5. एक नया बाँझ 15 मिलीलीटर ट्यूब (हदबंदी अभिकर्मक के 5.5 मिलीलीटर छोड़ने आगे hESCs अलग कर देना) स्टेम सेल लाइन प्रचार के लिए करने के लिए 15 मिलीलीटर ट्यूब और हस्तांतरण से कोशिकाओं के साथ हदबंदी समाधान के 0.5 मिलीलीटर निकालें।
    6. 20 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर कोशिकाओं के 0.5 मिलीलीटर गोली। सतह पर तैरनेवाला निकालें और धीरे स्टेम सेल 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त मीडिया के 8 मिलीलीटर में resuspend फिर एक नया, लेपित, 10 सेमी टिशू कल्चर डिश को हस्तांतरण और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 को बनाए रखने के लिए स्टेम सेल लाइन बनाए रखने के लिए।
      नोट: मीडिया परिवर्तन के दौरान बर्फ पर स्टेम सेल मीडिया रखें।
    7. इस बीच, शेष हदबंदी के 5.5 मिलीलीटर समाधान के लिए 10 मिमी रॉक अवरोध करनेवाला वाई 27,632 के 5.5 μl जोड़ें और एक और 5-10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते जारी है। धीरे से एक 5 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक pipet के साथ कोशिकाओं मिश्रण। सेते हैं जब तक एक एकल कक्ष निलंबन हासिल की है, तो कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर गोली कोशिकाओं के लिए आगे बढ़ें।
    8. स्टेम सेल मीडिया के 5 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend और एक hemocytometer का उपयोग कर एक कोशिका गिनती प्रदर्शन करते हैं।
    9. बीज अच्छी तरह से प्रति 140,000 कोशिकाओं के घनत्व पर 6 अच्छी तरह से पकवान की हर अच्छी तरह से। छह परिभाषित ऊतकों की कुल बनाने के लिए दो 6 अच्छी तरह प्लेटें बीज। चढ़ाना के बाद किसी भी शेष कोशिकाओं के निपटान के।
    10. स्टेम सेल मीडिया के साथ अच्छी तरह से करने के लिए 1 मिलीलीटर भरें और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर सेते हैं। चौबीस घंटे बाद मीडिया को हटाने और प्रत्येक अच्छी तरह से (चित्रा 1 ए के लिए नए सिरे से स्टेम सेल मीडिया के 2 मिलीलीटर जोड़ने
    11. प्रत्येक दिन प्लेटों के संगम की जाँच करें और भेदभाव शुरू हो कोशिकाओं को एक बार लगभग 75% संगम तक पहुँचने (चित्रा 1 बी - डी)।

Cardiomyocytes 30,31 करने के लिए मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के 2. दिवस (4-24) भेदभाव

  1. (दिन 4-7, 0-3 भेदभाव डे) mesoderm प्रेरण
    1. 10 मिलीलीटर B27 पूरक (इंसुलिन के बिना) और पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन शेयर समाधान (; 10,000 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन 10,000 आइयू / एमएल पेनिसिलिन) के 5 मिलीलीटर के साथ 500 मिलीलीटर RPMI 1640 के संयोजन से RPMI भेदभाव मीडिया मैं (तालिका 1) तैयार करें। विभाज्य, बर्फ पर, 50 मिलीलीटर ट्यूबों में और दुकान 4 डिग्री सेल्सियस पर।
    2. (4 दिन, भेदभाव 0 दिन) RPMI भेदभाव मीडिया के 12 मिलीलीटर (10 मिमी शेयर, 6 माइक्रोन अंतिम एकाग्रता) छोटे अणु GSK3 अवरोध CHIR99021 के 2.4 μl जोड़कर mesoderm प्रेरण मीडिया तैयार मैं हर अच्छी तरह से स्टेम सेल मीडिया निकालें एएन डी mesoderm प्रेरण मीडिया के 2 मिलीलीटर के साथ अच्छी तरह से प्रति की जगह। इनक्यूबेटर थाली लौटें।
      नोट: महत्वपूर्ण कोशिका मृत्यु आम तौर पर CHIR99021 (चित्रा 1E) के अलावा के साथ होता है। monolayer ठीक हो जाएगी, लेकिन यह मृत कोशिकाओं DMEM / F12 कुल्ला के साथ दूर कुल्ला करने के लिए महत्वपूर्ण है।
    3. (5 दिन, भेदभाव दिवस 1) के रूप में ऊपर वर्णित ताजा mesoderm प्रेरण मीडिया तैयार करें। प्रत्येक वर्ष से मीडिया में अच्छी तरह से निकालें और अच्छी तरह से प्रति DMEM / F12 के 1 मिलीलीटर के साथ एक बार कुल्ला। प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए नए सिरे से mesoderm प्रेरण मीडिया के 2 मिलीलीटर जोड़ें।
      नोट: दिन 0-10 से प्रत्येक दिन Rinsing बहुत उपज और हृदय myocytes की शुद्धता बढ़ जाती है।
    4. (दिन 6, भेदभाव 2 दिन) हृदय की प्रेरण मीडिया निकालें और 1 मिलीलीटर DMEM / अच्छी तरह से प्रति F12 के साथ एक बार कुल्ला। 2 मिलीलीटर RPMI भेदभाव मीडिया मैं (कोई छोटे अणुओं जोड़ा है, लेकिन अभी भी B27 (बिना इंसुलिन) के पूरक के साथ) के साथ कुल्ला बदलें और इनक्यूबेटर में लौटने।
  2. (दिवस 7-13, भेदभाव दाY 3-10) कार्डिएक mesoderm प्रेरण
    1. (7 दिवस, भेदभाव दिन 3) RPMI भेदभाव मीडिया प्रथम के 12 मिलीलीटर के लिए छोटे अणु Wnt अवरोध IWR -1 (10 मिमी शेयर, 5 माइक्रोन के अंतिम) के 6 μl जोड़कर हृदय mesoderm प्रेरण मीडिया तैयार
    2. प्रत्येक से मीडिया में अच्छी तरह से निकालें, 1 मिलीलीटर DMEM / अच्छी तरह से प्रति F12 के साथ एक बार कुल्ला और अच्छी तरह से प्रति हृदय mesoderm प्रेरण मीडिया के 2 मिलीलीटर के साथ बदलें।
    3. (दिवस 8, भेदभाव 4 दिन) हृदय mesoderm प्रेरण मीडिया के एक अतिरिक्त 12 मिलीग्राम के रूप में ऊपर वर्णित तैयार करें। हटाये मीडिया से पहले दिन कहा, 1 मिलीलीटर DMEM / अच्छी तरह से प्रति F12 के साथ एक बार कुल्ला और अच्छी तरह से प्रति ताजा हृदय mesoderm भेदभाव मीडिया के 2 मिलीलीटर के साथ की जगह है और इनक्यूबेटर में लौटने।
    4. (दिवस 9-10, भेदभाव दिन 5-6) दोनों दिन पर, हृदय mesoderm प्रेरण मीडिया को हटाने और DMEM / F12 के प्रत्येक अच्छी तरह से 1 मिलीलीटर कुल्ला।
    5. ताजा RPMI भेदभाव मीडिया के 2 मिलीलीटर जोड़ें मैं (कोई छोटे अणुओं जोड़ा है, लेकिन अभी भी B27 (इंसुलिन के बिना) के पूरक के साथ)प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए और इनक्यूबेटर थाली लौटें।
  3. (दिन 11-24, भेदभाव डे 7-20) जब HES व्युत्पन्न कार्डिएक myocyte संगठन / परिपक्वता
    1. 10 मिलीलीटर B27 पूरक (इंसुलिन के साथ) और पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन शेयर समाधान के 5 मिलीलीटर के साथ 500 मिलीलीटर RPMI 1640 के संयोजन से RPMI भेदभाव मीडिया द्वितीय (तालिका 1) तैयार करें। विभाज्य, बर्फ पर, 50 मिलीलीटर ट्यूबों में और दुकान 4 डिग्री सेल्सियस पर।
    2. (दिन 11, भेदभाव दिन 7) अच्छी तरह से प्रत्येक से (इंसुलिन के बिना) RPMI भेदभाव मीडिया निकालें और 1 मिलीलीटर DMEM / F12 से कुल्ला। प्रत्येक के लिए नए RPMI भेदभाव मीडिया द्वितीय (इंसुलिन के साथ) के 2 मिलीलीटर के साथ अच्छी तरह से बदलें और इनक्यूबेटर में लौटने।
      नोट: सहज पिटाई पहले दिन 7 और 10 के बीच मनाया जाना चाहिए पिटाई के दौरान इस बार नहीं मनाया जाता है, यह आम तौर पर गरीब भेदभाव दक्षता को दर्शाता है। प्रोटोकॉल पिटाई का निरीक्षण करने के प्रयास में 15 दिन तक जारी रखा जा सकता है, लेकिन अगर कोई पिटाई 15 दिन से मनाया जाता है यह सेंट करने के लिए सबसे अच्छा हैएक नया भेदभाव कला।
    3. (दिन 12-24, भेदभाव डे 8-20) हर दिन, वर्ष भेदभाव मीडिया को हटाने और ताजा RPMI भेदभाव मीडिया द्वितीय के 2 मिलीलीटर के साथ की जगह प्रति सेल परिपक्वता और पिटाई monolayer के संगठन की अनुमति के लिए अच्छी तरह से (चित्रा 1F, वीडियो चित्रा 1 )।
      नोट: अवशिष्ट कोशिका मृत्यु पर निर्भर करता है, यह भेदभाव दिन 10 के माध्यम से DMEM के 1 मिलीग्राम / F12 के साथ कुल्ला करने के लिए आवश्यक हो सकता है।

3. दिवस (24, भेदभाव डे 20) हृदय myocytes और fibroblast कोशिकाओं की तरह का अलगाव

  1. Monolayer से कोशिकाओं को अलग कर देना
    1. भेदभाव मीडिया निकालें और 1 मिलीलीटर पीबीएस के साथ एक बार कुल्ला।
    2. अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए एंजाइमी हदबंदी समाधान (0.04% trypsin / 0.03% EDTA) के 1 मिलीलीटर के साथ monolayers अलग कर देना।
    3. 10 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में थाली ले जाएँ। इस बीच, trypsin निराकरण समाधान के 6 मिलीलीटर रॉक अवरोध के 12 μl जोड़ें।
    4. gentlY trypsin निराकरण थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए रॉक अवरोध युक्त trypsin समाधान बेअसर करने के लिए समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
    5. एक बाँझ हस्तांतरण pipet का प्रयोग, धीरे प्रत्येक मिश्रण अच्छी तरह से सेल समूहों के अलावा तोड़ने के लिए।
    6. एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब 6 अच्छी तरह से थाली से सभी 12 मिलीलीटर स्थानांतरण।
      नोट: चूंकि दो 6 अच्छी तरह प्लेटें इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल कर रहे हैं, दो 15 मिलीलीटर ट्यूबों की जरूरत होगी।
    7. प्लेट में से एक अच्छी तरह से, और उसके बाद के लिए स्थानांतरण पीबीएस के 3 मिलीलीटर क्रमिक रूप से पकवान पर किसी भी अवशिष्ट कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए प्रत्येक बाद अच्छी तरह से करने के लिए एक ही 3 मिलीलीटर हस्तांतरण। अच्छी तरह से एक ही 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं से युक्त ट्यूब में अंतिम से शेष 3 मिलीलीटर स्थानांतरण।
    8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर गोली।
  2. FACS द्वारा लाइव सेल छँटाई के लिए कोशिकाओं को तैयार
    1. रॉक अवरोध के 50 μl के साथ बर्फ पर पीबीएस के 45 मिलीलीटर भ्रूण गोजातीय सीरम के 5 मिलीलीटर जोड़कर धुंधला बफर तैयार करें।
    2. सेल PEL से सतह पर तैरनेवाला निकालें(3.1.8) में करते हैं और धुंधला बफर के 1.2 मिलीलीटर में resuspend।
    3. बर्फ पर एक नया, पूर्व ठंडा, 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब सेल निलंबन के 200 μl स्थानांतरण। यह नकारात्मक धुंधला नियंत्रण हो जाएगा।
    4. बर्फ पर एक नया, पूर्व ठंडा, 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब सेल निलंबन की शेष 1 मिलीलीटर स्थानांतरण और 2 μl SIRPα पीई / Cy7 जोड़ने (1: 500 कमजोर पड़ने) और 4 μl CD90-FITC (1: 250 कमजोर पड़ने) । धीरे से एक हस्तांतरण pipet के साथ सेल निलंबन मिश्रण और बर्फ पर वापस जाएँ।
    5. ,,, 1 घंटे के लिए दोनों नकारात्मक नियंत्रण और नमूना सेते एक घुमाव प्रकार के बरतन पर बर्फ पर 4 डिग्री सेल्सियस पर।
    6. दो 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों के लिए RPMI मीडिया (इंसुलिन के साथ) के 3 मिलीलीटर जोड़कर नमूना संग्रह ट्यूबों तैयार करें। प्रत्येक ट्यूब रॉक अवरोध के 3 μl जोड़ें और बर्फ पर दुकान।
    7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर दाग कोशिकाओं गोली और कुल्ला प्रति ठंडा पीबीएस के कम से कम 10 मिलीलीटर के साथ दो बार कुल्ला।
    8. धुंधला बफर के 5 मिलीलीटर DAPI (1 माइक्रोग्राम / एमएल) के 1 μl जोड़ें। धीरेDAPI युक्त धुंधला एक हस्तांतरण pipet का उपयोग बफर के 1-3 मिलीलीटर के साथ नमूना गोली resuspend।
    9. नकारात्मक नियंत्रण करने के लिए धुंधला बफर (कोई DAPI के साथ जोड़ा) के 500 μl जोड़ें।
    10. धीरे कोशिकाओं के गुच्छों को हटाने और बर्फ पर FACS ट्यूबों polystyrene के लिए स्थानांतरण करने के लिए एक 40 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से दोनों नकारात्मक नियंत्रण और नमूना फिल्टर। इसके तत्काल बाद सेल सॉर्टर के लिए नमूने लाने के लिए।
    11. स्थापित जीवित कोशिका के लिए इसी प्रकार छँटाई तरीकों 18, फाटकों स्थापित करने के लिए नकारात्मक नियंत्रण का उपयोग करें, जीवित कोशिकाओं के लिए चयन (DAPI नकारात्मक) और दोनों FITC + (यानी, CD90 + fibroblasts) और पीई / Cy7 + (यानी, SIRPα + cardiomyocytes इकट्ठा ) 20 साई (चित्रा 2) में स्वतंत्र रूप से आबादी।
      नोट: गेट्स स्थापित करने के बाद, नकारात्मक नियंत्रण 4% पीएफए ​​में तय किया जा सकता हृदय ट्रोपोनिन-T के लिए धुंधला द्वारा भेदभाव क्षमता का निर्धारण करने के लिए।
      नोट: कुछ शोधकर्ताओं ने एक का उपयोग करना पसंदनिर्धारण नियंत्रण के बजाय अस्थिर नियंत्रण आदेश गैर विशिष्ट एंटीबॉडी बाइंडिंग के लिए क्षतिपूर्ति करने में फाटक स्थापित करने के लिए। एक प्रतिदीप्ति शून्य से एक तथाकथित (FMO) नियंत्रण एक और संभावना है। FITC, DAPI और पीई Cy7 संकेतों के स्पष्ट bimodal वितरण के कारण, हम सकारात्मक आबादी से gated, परंपरागत ढंग सकारात्मक फाटक, जो संभवतः कुछ सच सकारात्मक शामिल नहीं है, लेकिन किसी भी झूठी सकारात्मक कम से कम करने में मदद करता है में अब तक लक्ष्य।
  3. ऊतक इंजीनियरिंग के लिए तैयारी में सेल Reaggregation
    1. सेल प्रकार के बाद, 10% नवजात गोजातीय सीरम, 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन और 0.2% Amphotericin बी ( "एनबीएस मीडिया") युक्त DMEM के 1 मिलीलीटर में गोली दोनों संग्रह ट्यूब और resuspend।
    2. एक 3 में recombine SIRPα + और ​​CD90 + कोशिकाओं: 1 के अनुपात और एक गैर टिशू कल्चर में संयुक्त कोशिकाओं प्लेट 60 सेमी 2 (10 सेमी पकवान) के अनुसार 2 लाख कोशिकाओं के घनत्व पर पेट्री डिश का इलाज किया। एनबीएस मीडिया और 10 के 10 मिलीलीटर जोड़ें1; रॉक अवरोध करनेवाला वाई 27,632 के एल।
    3. 48 घंटे के लिए टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में सेल निलंबन की जगह छोटे समूहों में सेल reaggregation की अनुमति है।

4. मानव हृदय ऊतक इंजीनियरिंग

  1. मल्टी ऊतक बायोरिएक्टर बनाना
    नोट: चित्रा 3 ए में चित्र के पूरक, विस्तृत बायोरिएक्टर डिजाइन schematics के साथ सीएडी फ़ाइलों लेखकों से अनुरोध पर उपलब्ध हैं।
    1. मशीन polytetrafluoroethylene की एक 9 x 33 x 3.25 मिमी घनाभ में 0.5 मिमी व्यास के छह समान रूप से स्थान छेद ड्रिलिंग द्वारा PDMS मास्टर ढालना।
    2. एक endmill, मशीन 25 x 35 x 11 मिमी 3 मापने polysulfone से एक फ्रेम का उपयोग करना। फ्रेम के उद्देश्य PDMS पदों baseplate में कुओं के साथ संरेखण में (ऊपर बना डाली से निर्माण) पकड़ है।
    3. एक 1 मिमी endmill का उपयोग करना, मशीन 6 कुओं (6 एक्स 1 x 1 मिमी 3), एक 20 x 40 x 5 मिमी 3 काले पाली का टुकड़ा में 4 मिमी के अलावाtetrafluoroethylene baseplate के रूप में।
    4. / डब्ल्यू डब्ल्यू अनुपात 1 और छह बल संवेदन पदों की दो पंक्तियों को बनाने के लिए कस्टम polytetrafluoroethylene ढालना (कदम 4.1.1) को जोड़ने के लिए, और रात भर और तहत सेते: में एक 10 elastomeric आधार और polydimethylsiloxane (PDMS) के लिए इलाज एजेंट मिक्स 80 डिग्री सेल्सियस पर निर्वात। इलाज करने के बाद, धीरे मास्टर मोल्ड से PDMS हटाने और ध्यान से बढ़ाया विपरीत और स्वचालित वास्तविक समय के बाद नीचे को झुकाव ट्रैकिंग के लिए एक काला स्थायी मार्कर के साथ प्रत्येक पद के सबसे ऊपर के निशान।
      नोट: Polytetrafluorethylene काफी नरम है और आसानी से क्षतिग्रस्त हो सकते हैं। जब मास्टर मोल्ड प्रणाली और लगातार PDMS पद ज्यामिति की लंबी उम्र सुनिश्चित करने के लिए कास्टिंग PDMS से पहले सफाई देखभाल का प्रयोग करें। एक 0.5 मिमी तार प्रत्येक उपयोग के बाद पदों के लिए छेद साफ है, लेकिन देखभाल के छेद के अंदर परिमार्जन नहीं करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
      नोट: एक वैकल्पिक देगास के लिए कमरे के तापमान पर कई घंटे के लिए वैक्यूम के अंतर्गत PDMS है, तो परिवेश के दबाव में मिश्रण इलाज करते हैं।यह कम अवशिष्ट गैस बुलबुले इलाज की प्रक्रिया के दौरान PDMS में गठन हो सकता है।
    5. एक भाप आटोक्लेव में सभी घटकों को जीवाणुरहित।
      नोट: PDMS मास्टर ढालना (कदम 4.1.1) और polysulfone फ्रेम (कदम 4.1.2) दोनों पुन: प्रयोज्य हैं। PDMS डाली (कदम 4.1.4) से बनाया पदों को भी पुन: प्रयोज्य लेकिन केवल लगभग 10 उपयोगों के लिए है। हालाँकि, और अधिक PDMS पदों के रूप में मास्टर फफूंदी का उपयोग जरूरत बनाया जा सकता है।
  2. Reaggregated हृदय कोशिकाओं लीजिए
    1. इनक्यूबेटर से reaggregated कोशिकाओं को हटाने और एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब reaggregation मीडिया के सभी 10 मिलीलीटर हस्तांतरण।
    2. पीबीएस के 3 मिलीलीटर के साथ थाली कुल्ला और एक ही 50 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज reaggregation मीडिया युक्त ट्यूब कुल्ला हस्तांतरण।
    3. 10 सेमी डिश के लिए 0.04% trypsin / 0.03% EDTA के 3 मिलीलीटर जोड़ें और 5 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में लौटने।
    4. 5 मिनट के बाद, 10X बढ़ाई पर एक औंधा यौगिक सूक्ष्मदर्शी के साथ थाली की जांच पूरी सेल dissocia सुनिश्चित करने के लिएडिश से tion। कुछ अवशिष्ट समूहों अभी भी जुड़ी हुई हैं, तो धीरे थाली झुरमुटों अलग करने के लिए आंदोलन। समूहों संलग्न रहते हैं, तो एक और 2-3 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में लौटने। अब से दस मिनट या महत्वपूर्ण कोशिका मृत्यु होने पर हो सकती सेते मत करो।
    5. एक बार सभी कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं, trypsin निराकरण समाधान के 3 मिलीलीटर जोड़ें। धीरे-trypsin सेल समाधान और 50 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज reaggregation मीडिया युक्त ट्यूब को हस्तांतरण के साथ निराकरण समाधान मिश्रण और पीबीएस के साथ एक बार कुल्ला।
    6. पीबीएस के 5 मिलीलीटर के साथ पूरे पकवान कुल्ला और एक ही 50 मिलीलीटर कोशिकाओं से युक्त ट्यूब को हस्तांतरण।
    7. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर गोली कोशिकाओं।
    8. तैरनेवाला निकालें और एनबीएस मीडिया के 1 मिलीलीटर में गोली resuspend, तो एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब को हस्तांतरण।
    9. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर गोली और सतह पर तैरनेवाला हटा दें। हृदय की कोशिकाओं (CD90 + stromal कोशिकाओं और SIRPα + myocytes) अब ऊतक निर्माण के लिए तैयार हैं।
  3. (वैकल्पिक) ब्याज की पूरक कोशिकाओं को इकट्ठा
    नोट: परिभाषित ऊतकों केवल SIRPα + cardiomyocytes और CD90 + fibroblast कोशिकाओं की तरह से युक्त करने के लिए इसके अलावा, यह ऊतक समारोह पर उनके प्रभाव से पूछताछ के लिए ब्याज की अतिरिक्त कोशिकाओं को जोड़ने के लिए संभव है। उदाहरण के लिए चूहे MSCs चूहे इंजीनियर हृदय के ऊतकों 1 के समारोह को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है। निम्नलिखित वैकल्पिक कदम परिभाषित प्रणाली के लिए पूरक कोशिकाओं के संग्रह का वर्णन है।
    1. ब्याज की पूरक सेल प्रकार (जैसे, mesenchymal स्टेम कोशिकाओं) 0.25% trypsin / 0.1% EDTA का उपयोग लीजिए।
    2. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर गोली कोशिकाओं तो ब्याज की सेल प्रकार के लिए उचित सेल संस्कृति मीडिया के 5 मिलीलीटर में resuspend। उदाहरण के लिए, MSCs के लिए, का उपयोग DMEM 20% भ्रूण गोजातीय सीरम, संस्कृति ग 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन और 0.2% amphotericin-बी के साथ पूरकएल।
    3. , एक hemocytometer का उपयोग एक कोशिका गिनती प्रदर्शन तो कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर फिर गोली कोशिकाओं।
    4. एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब सेल संस्कृति मीडिया और हस्तांतरण के 1 मिलीलीटर में सतह पर तैरनेवाला, resuspend निकालें।
    5. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर गोली कोशिकाओं।
    6. सतह पर तैरनेवाला निकालें। पूरक कोशिकाओं को अब ऊतक निर्माण के लिए तैयार हैं।
      नोट: पूरक कोशिकाओं ऊतकों में कुल सेल नंबर का 10% की एकाग्रता में जुड़ जाते हैं, तो फिर परिभाषित ऊतकों के लिए, इस ऊतक प्रति 50,000 पूरक कोशिकाओं के रूप में प्रत्येक ऊतक 500,000 हृदय कोशिकाओं (दोनों CD90 + stromal कोशिकाओं की आवश्यकता होगी और SIRPα + myocytes)।
  4. मानव इंजीनियर कार्डिएक ऊतकों बनाएं
    नोट: कमरे के तापमान पर बर्फ पर सभी समाधान और सेल की दुकान। नीचे सूचीबद्ध सभी संस्करणों ऊतक प्रति कर रहे हैं। आमतौर पर, लगभग छह ऊतकों दो से निर्माण किया जा सकता है 6 अच्छी तरह से पीएलहृदय differentiations की ates।
    1. 3.125 मिलीग्राम / 1 एम NaOH के 1.5 μl, 10x पीबीएस के 9.6 μl और बाँझ ultrapure विआयनीकृत पानी की 24.9 μl के साथ मिलीलीटर के लिए 5 मिलीग्राम / एमएल कोलेजन शेयर की 60.0 μl पतला।
      महत्वपूर्ण कदम: तैयारी के दौरान प्रत्येक समाधान करने के लिए हवा के बुलबुले की शुरूआत से बचने के रूप में हवा के बुलबुले उचित ऊतक गठन को बाधित करेगा।
    2. कोलेजन मिश्रण बनाने के लिए दोनों 10x सदस्य का 12.0 और 0.2 μl एन HEPES पतला कोलेजन मिश्रण करने के लिए पीएच 9 जोड़ें। 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब के नीचे की ओर दोनों के समाधान के क्रम में कोलेजन मिश्रण में हवा के बुलबुले की शुरूआत से बचने के लिए जोड़ें।
    3. 0.9 मिलीग्राम / कोलेजन मिश्रण करने के लिए मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता के लिए तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स जोड़े और अंतिम ऊतक मिश्रण बनाने के लिए बर्फ पर दुकान। कोलेजन के अंतिम एकाग्रता 2 मिलीग्राम होना चाहिए / मिलीलीटर।
    4. reaggregated कोशिकाओं की 500,000 ऊतक मिश्रण करने के लिए जोड़ें (myocyte + fibroblast एकाग्रता 20 मिलियन / एमएल) है और प्रति 25 μl के अंतिम मात्रा को भरनेया तो सेल मुक्त एनबीएस मीडिया या ब्याज (जैसे, hMSCs) का पूरक सेल प्रकार के 50,000 कोशिकाओं और अच्छी तरह से मिश्रण के साथ ऊतक एक भी सेल निलंबन के रूप में।
      नोट: पूरक कोशिकाओं की संख्या में विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए अलग अलग होंगे। यहाँ 10% पूरकता प्रयोग किया जाता है।
    5. देखभाल, pipet बायोरिएक्टर baseplate में छह कुओं में से प्रत्येक में सेल निलंबन के 25 μl, अच्छी तरह से हवा में बुलबुले शुरू करने के बिना।
    6. , Polysulfone फ्रेम के दोनों ओर पर PDMS बल सेंसर के दो पंक्तियों के पुश का विरोध पदों के 6 जोड़े के गठन, तो baseplate के शीर्ष पर फ्रेम पलटना तो यह है कि पदों में से एक जोड़ी में प्रवेश करती है हर अच्छी तरह से सेल निलंबन युक्त।
      नोट: polysulfone फ्रेम PDMS के संरेखण में सहायता करने के लिए टैब भी शामिल है।
    7. ध्यान से बायोरिएक्टर जगह है, नीचे baseplate एक 60 मिमी डिश में है, तो एक 10 सेमी पकवान के अंदर अपनी कवर के बिना पकवान जगह, शीर्ष पर 10 सेमी कवर जगह है, और पूरे बायोरिएक्टर में विधानसभा के लिए कदमटिशू कल्चर इनक्यूबेटर, जेल के लिए ऊतक के लिए दो घंटे इंतजार कर।
    8. 2 घंटे के बाद, इनक्यूबेटर से हटा दें और बायोरिएक्टर baseplate को कवर करने के लिए पर्याप्त पूरे विधानसभा के लिए एनबीएस मीडिया के 14 मिलीलीटर, जोड़ें। इनक्यूबेटर पर लौटें, और मीडिया के आधे से हर दिन बदल जाते हैं।
    9. अड़तालीस मानव संसाधन बाद में, ध्यान से, धीरे से एक समय में कुछ मिलीमीटर फ्रेम बंद baseplate के प्रत्येक पक्ष ले जाकर baseplate हटाने मीडिया बदलने के लिए, तो बायोरिएक्टर वापसी, ऊतकों, नीचे का सामना करना पड़ मीडिया के लिए।
    10. हर दिन एनबीएस संस्कृति मीडिया के आधे बदलते जारी रखें।
      नोट: ऊतक के सहज संकुचन के रूप में जल्दी के रूप में 3 दिनों के ऊतकों के निर्माण के बाद मनाया जा सकता है, measureable चिकोटी बलों पैदा करने के रूप में जल्दी 5 दिन के रूप में करने के लिए 7।

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Representative Results

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हृदय myocytes प्राप्त करने के लिए, Boheler और लियान भेदभाव के तरीकों में से एक थोड़ा संशोधित संस्करण 30,31 प्रयोग किया जाता है। ऐसा नहीं है कि भेदभाव सेल के विकास के लिए लॉग-चरण के दौरान शुरू होता है, लेकिन यह भी शुरू आबादी छँटाई (लगभग 75% इष्टतम है) के बाद कोशिकाओं के एक useable नंबर प्राप्त करने के लिए पर्याप्त रूप से मिला हुआ है कि जरूरी है। आमतौर पर, H7 hESCs के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा आवश्यक 8 मीडिया और 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 6 अच्छी तरह से पकवान की अच्छी तरह से प्रति 140,000 hESCs के घनत्व पर चढ़ाना पर्याप्त मिला हुआ संस्कृतियों पैदावार 4 दिनों के बाद के रूप में सचित्र, भेदभाव शुरू करने के लिए चित्रा 1 ए में - डी। चूंकि इंसुलिन भेदभाव प्रक्रिया के दौरान 32 कार्डियक विनिर्देश, इंसुलिन स्वतंत्र मीडिया (भेदभाव मीडिया मैं, 1 टेबल) को रोकता है भेदभाव के पहले 10 दिनों के लिए प्रयोग किया जाता है। एक बार भेदभाव GSK3 अवरोध CHIR99021 के आवेदन के माध्यम से शुरू की है,महत्वपूर्ण कोशिका मृत्यु घटित होगा (चित्रा 1E)। एक परिणाम के रूप में यह हर दिन मीडिया को बदलने के लिए आवश्यक है। भेदभाव के 2 दिन, कोशिकाओं CHIR99021 से हटा दिया है और मैं भेदभाव मीडिया में विश्राम किया 24 घंटे के लिए (के साथ कोई छोटे अणुओं) जोड़ा जाता है। भेदभाव मीडिया में 24 घंटा आराम के बाद, कोशिकाओं को 48 घंटा, जिसके बाद वे करने के लिए शुरू के लिए IWR-1 के साथ व्यवहार कर रहे हैं समूहों (चित्रा 1F) के रूप में जल्दी है कि सात दिन के रूप में भेदभाव शुरू करने से हरा में स्वयं को व्यवस्थित। चूंकि IWR -1 के आवेदन के बाद हृदय विनिर्देश हुआ है, मीडिया इंसुलिन (भेदभाव मीडिया द्वितीय, 1 टेबल) युक्त मीडिया में बदल जाता है। भेदभाव के 18 दिनों तक, कोशिकाओं की धड़कन की कालोनियों जुड़ा हुआ है और आंशिक रूप से कोशिका की सतह से अलग, मजबूती के गठन के पकवान (वीडियो चित्रा 1) के दौरान "जाले" धड़क रहा है।

20 दिन, पिटाई monolayer धीरे अलग है viएक enzymatic तरीकों को लाइव फ्लोरोसेंट जुड़े सेल छँटाई (FACS) के लिए एकल कक्षों प्राप्त करने के लिए। भेदभाव ऊपर वर्णित विधि का प्रयोग, हम परंपरागत ढंग के रूप में SIRPα + जनसंख्या का लगभग 65% और 10% के रूप में CD90 (चित्रा 2) फसल। आम तौर पर 1-2 लाख SIRPα + कोशिकाओं प्रति 6 अच्छी तरह से थाली प्राप्त कर रहे हैं।

के SIRPα + 1 के अनुपात: एक 3 में 48 घंटे के लिए reaggregation बाद CD90 + कोशिकाओं, परिभाषित सेल समुच्चय एक कोलेजन आधारित हाइड्रोजेल के साथ मिलाया और बहु ऊतक बायोरिएक्टर की baseplate में संकीर्ण कुओं में pipetted हैं। आमतौर पर, पकवान से हटाने से पहले, 5-10 कोशिकाओं के छोटे समूहों पकवान की सतह पर पिटाई देखा जाएगा। परिभाषित ऊतक बायोरिएक्टर तीन घटक होते हैं: एक मास्टर PDMS पदों के लिए डाली ढालना; एक फ्रेम पदों में से दो PDMS रैक धारण करने के लिए; और एक काले polytetrafluorethylene baseplate ऊतक मिश्रण के लिए छह कुओं से युक्त (छविUre 3 ए)। पूरे ऊतक निर्माण प्रक्रिया बर्फ पर और सड़न रोकनेवाला परिस्थितियों में किया जाता है। Baseplate में कुओं के लिए तरल सेल मैट्रिक्स मिश्रण जोड़ने के बाद, PDMS पदों polysulfone फ्रेम से जुड़े होते हैं, और फिर उल्टे इतना है कि पदों baseplate (चित्रा 3 बी) में कुओं के साथ पंक्ति में। ऊष्मायन के 48 घंटे के बाद, ऊतकों पर्याप्त ठोस कि baseplate हटाया जा सकता है किया जाना चाहिए। baseplate सबसे आसानी से मीडिया से पूरे सिस्टम को निकालने और धीरे PDMS और baseplate के बीच से किसी भी अतिरिक्त मीडिया को हटाने के द्वारा अलग किया जाता है। अगर मीडिया के सभी हटा नहीं है, शेष तरल पदार्थ की सतह तनाव पदों बंद ऊतकों खींच सकते हैं। एक बार जब मीडिया निकाल दिया जाता है, धीरे baseplate PDMS पदों के खिलाफ वापस धक्का baseplate से ऊतक को ढीला करने में मदद करने के लिए। फिर धीरे-धीरे धीरे एक तरफ कुछ मिलीमीटर, तो दूसरे पक्ष को एक ही राशि के ऊपर ले जाकर baseplate से धक्का। बीए तक इस प्रक्रिया को दोहराएंseplate, हटाया के साथ सभी 6 hECTs उनके संबंधित PDMS अंत पदों (चित्रा -4 ए) से जुड़ा हुआ है। baseplate हटाना एक मिनट से अधिक नहीं लेना चाहिए। ताकि सभी ऊतकों सेल संस्कृति मीडिया द्वारा कवर कर रहे हैं, सेल संस्कृति मीडिया, उल्टे प्रणाली में बदलें।

लगभग baseplate को हटाने के बाद एक दिन, कमजोर स्थानीय संकुचन उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी के तहत परिभाषित hECTs में नमूदार होना चाहिए। 7 दिनों के बाद, ऊतकों और परिपक्व हो चुके हैं जमा (चित्रा 4 बी-सी) गठबंधन sarcomeres (चित्रा 4D) के साथ। ऊतकों दिख बल के 5-15 μN (चित्रा 4E) के एक औसत के साथ PDMS पदों मोड़ना। बल माप चिकोटी के लिए परिभाषित इंजीनियर हृदय के ऊतकों को एक उच्च गति कैमरा और कस्टम डाटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के साथ पोस्ट टिप विक्षेपन के वास्तविक समय पर नज़र रखने से मापा जा सकता है, और निर्धारण करने के बाद सिद्धांत झुकने बीम के नीचे को झुकाव को लागू करने के पोस्टएक बल ट्रांसड्यूसर का उपयोग कर सिलिकॉन पदों की यंग मापांक, डाटा अधिग्रहण के दौरान बाँझपन बनाए रखने और अधिक विस्तार से पहले। 1,7 के रूप में समझाया समय के साथ ऊतक समारोह में परिवर्तन को मापने की क्षमता सुनिश्चित करता है। हम कई हफ्तों के लिए कार्यात्मक ऊतकों को बनाए रखा है के रूप में कहीं 1 और अधिक विस्तार से समझाया। हमारी प्रारंभिक निष्कर्षों हेक्टेयर सिकुड़ा बल की पर्याप्त वृद्धि से संकेत मिलता है जब ऊतकों दोनों 1 और 2 हर्ट्ज हर्ट्ज पेसिंग आवृत्तियों (चित्रा 4F) पर 10% मानव mesenchymal स्टेम कोशिकाओं के साथ पूरक हैं।

आकृति 1
चित्रा 1: विस्तार और हृदय भेदभाव प्रक्रिया के दौरान H7 hESCs के प्रतिनिधि छवियाँ। विस्तार के चरण 4 दिन, कालोनियों 24 (ए) से विस्तार की वृद्धि के साथ, 48 (बी), 72 को पिछले चाहिए (सी (डी)। विकास के 96 घंटे के बाद भेदभाव शुरू कर दिया है, CHIR99021 उपचार (ई) के पहले 48 घंटे के दौरान पर्याप्त कोशिका मृत्यु हो जाती है। IWR -1 उपचार के दो दिनों के बाद, पुनर्गठन होता है (एफ) कोशिकाओं के समूहों है कि के रूप में जल्दी के रूप में एक दिन मजबूती के साथ की धड़कन "वेब" 20 दिन के लिए 7 दिन से होता है, जब monolayers के लिए अलग कर रहे हैं में 7. इसके अलावा संगठन को हराया के लिए फार्म इंजीनियर हृदय के ऊतकों का निर्माण।

वीडियो चित्रा 1:। भेदभाव के 17 दिनों के बाद प्रतिनिधि हृदय monolayer । इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें monolayer भीतर सहज पिटाई आम तौर पर पहले दिन 7 और 10 दिन के बीच मनाया जाता है, और भेदभाव के 17 दिनों के द्वारा monolayer परस्पर "जाले का गठन किया है "है कि मजबूती के साथ हराया।

नाम रचना भेदभाव दिनों में इस्तेमाल किया
मैं भेदभाव मीडिया RPMI 1640
B27 पूरक (शून्य से इंसुलिन)
पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन
D0-डी 1 (CHIR99021 के साथ)
डी 2
डी 3-डी 5 (IWR-1 के साथ)
D5-D7
भेदभाव मीडिया द्वितीय RPMI 1640
B27 पूरक (इंसुलिन के साथ)
पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन
D7-D20

तालिका 1: भेदभाव Medias की संरचना है।

चित्र 2
चित्रा 2: प्रतिनिधि जीवित कोशिका प्रकारपरिणाम आईएनजी दो नमूने तैयार किए गए थे। एक अस्थिर नियंत्रण और एक दाग नियंत्रण 1 का उपयोग: SIRPα पीई / Cy7 एंटीबॉडी के 500 कमजोर पड़ने और 1: CD90-FITC एंटीबॉडी के 250 कमजोर पड़ने। धुंधला के बाद, कोशिकाओं पीबीएस, 10% नवजात गोजातीय सीरम, 10 माइक्रोन रॉक अवरोध करनेवाला वाई 27,632 और 1 माइक्रोग्राम / एमएल DAPI से बना बफर छँटाई में 20 साई पर हल किया गया। दोनों सेल आबादी आगे और पक्ष बिखराव प्रोफाइल gated थे मलबे (ए, नीली रेखा) तो एकल कक्षों पल्स चौड़ाई और ऊंचाई की तुलना द्वारा चयन किया गया था बाहर करने के लिए दोनों आगे तितर बितर (बी, नीली रेखा) में (चौड़ाई विश्लेषण नाड़ी) और ओर तितर बितर चैनल (सी, नीली रेखा)। जनसंख्या (डी, नीली रेखा) - अगला, जीवित कोशिकाओं DAPI gating द्वारा चयन किया गया था। संग्रह के लिए अंतिम सेल आबादी को लाइव आबादी के FITC और पीई Cy7 अभिव्यक्ति के स्तर का परीक्षण करके निर्धारित किया गया है। बेदाग नियंत्रण (ई, बाएं) के लिए इस्तेमाल किया गया थाके लिए FITC + (CD90) और SIRPα पीई / Cy7 + (cardiomyocyte) जनसंख्या दाग नमूने में मौजूद (ई, सही) का चयन करने के लिए उचित गेट की स्थापना। FITC और SIRPα पीई / Cy7 + poplations अलग 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में एकत्र किए गए थे।

चित्र तीन
चित्रा 3:। 1) एक polytetrafluoroethylene मास्टर मोल्ड 9 एक्स 33 एक्स 5 मिमी 3, 6 समान स्थान छेद के साथ: बहु ऊतक बायोरिएक्टर और हृदय ऊतक इंजीनियरिंग प्रक्रिया बहु ऊतक बायोरिएक्टर के निर्माण के योजनाबद्ध तीन घटकों (ए) की आवश्यकता व्यास में 0.5 मिमी; 2) एक 25 x 35 x 11 मिमी 3 polysulfone फ्रेम ऊतक निर्माण और संस्कृति के दौरान PDMS पदों का कार्यभार ग्रहण करने के लिए; और 3) एक 20 x 40 x 5 मिमी 3 काले polytetrafluorethylene 6 एक्स 1 एक्स 1 मिमी 3 आयामों के 6 कुओं के साथ baseplate, स्पाइसकी लंबाई के साथ 4 मिमी के अलावा ced। मानव हृदय के ऊतकों इंजीनियर (बी) बनाने के लिए, PDMS PDMS पदों नरम लिथोग्राफी polytetrafluorethylene मास्टर मोल्ड, जिनमें से दो तो बल संवेदन ब्रैकट पदों में से 6 जोड़े के लिए फार्म polysulfone फ्रेम के टैब पर दबाया जाता है का उपयोग करके निर्मित कर रहे हैं। ऊतक समाधान काले polytetrafluorethylene baseplate में कुओं में pipetted है। फ्रेम और पदों तो उल्टे और polytetrafluorethylene baseplate पर गठबंधन इतना है कि पदों में से एक जोड़ी में प्रवेश करती है हर अच्छी तरह से ऊतक मिश्रण युक्त होते हैं। 48 घंटे के बाद, baseplate हटा दिया जाता है और परिभाषित ऊतकों पदों पर संवर्धित कर रहे हैं, एनबीएस मीडिया में उलटा शेष।

चित्रा 4
चित्रा 4:। छवियों प्रतिनिधि और परिभाषित मानव हृदय के ऊतकों इंजीनियर के कार्यात्मक माप बहु ऊतक bioreactया सिस्टम समानांतर (ए, तीर) में छह ऊतकों रखती है। परिभाषित किया ऊतकों आत्म इकट्ठे ऊतक निर्माण के बाद सात दिनों के भीतर (ऊपर देखें, बी और परोक्ष ओर देखने, सी) कर रहे हैं। (डी)। एक परिभाषित हेक्टेयर के भाग हृदय ट्रोपोनिन-टी (cTnT) के लिए दाग। (ई) प्रतिनिधि चिकोटी ट्रेसिंग बिजली के क्षेत्र उत्तेजना से 1 हर्ट्ज पेसिंग के दौरान समय पर कच्चे बल चलता। (एफ) 1 हर्ट्ज (0-2 सेकंड) और 2 हर्ट्ज (2-4 सेकंड) पेसिंग पर उत्तेजना के दौरान ट्रेसिंग, तीर (ठोस लाइन) आवृत्ति में परिवर्तन, दोनों unsupplemented परिभाषित hECTs के लिए अंकन के साथ चिकोटी और ऊतकों 10% hMSCs के साथ पूरक (बिंदुयुक्त रेखा)।

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Discussion

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परिभाषित मानव इंजीनियर हृदय के ऊतकों (हेक्टेयर) का निर्माण मानव हृदय myocyte समारोह का एक और अधिक सुसंगत और विश्वसनीय मॉडल प्रदान कर सकते हैं। गंभीर, सिस्टम में सभी सेलुलर और बाह्य घटकों में जाना जाता है और इस प्रकार के रूप में वांछित अन्य अज्ञात भेदभाव प्रक्रिया से उत्पन्न प्रकार की कोशिकाओं के confounding प्रभाव को दूर करने चालाकी से किया जा सकता है। तेजी से कोशिकाओं के विकास और उच्च उपज को संतुलित करने के लिए, यह है कि भेदभाव hESCs के 75% संगम, आदर्श चार दिन चढ़ाना के बाद से शुरू होता है बेहतर है। इसके अतिरिक्त, छंटाई के बाद दोनों सेल हदबंदी और reaggregation दौरान रॉक अवरोध करनेवाला वाई 27,632 का उपयोग बहुत सेल व्यवहार्यता को बढ़ाता है। भेदभाव की प्रक्रिया के दौरान myocytes की सहज पिटाई की उपस्थिति दक्षता और भेदभाव के स्वास्थ्य का एक महत्वपूर्ण सूचक है। तो सहज पिटाई नहीं मनाया जाता है इस गरीब भेदभाव दक्षता, अप्रभावी अभिकर्मकों या एक नुकसान के लिए या तो कारण का संकेत हो सकतास्टेम सेल के pluripotency की।

ऊतक निर्माण के दौरान, PDMS पदों baseplate अच्छी तरह से बनाई ऊतकों कि सिकुड़ा समारोह को मापने के लिए पिछले लंबे समय पर्याप्त बनाने के लिए चैनल के साथ ठीक से पंक्ति में होगा। डिवाइस संरेखण की आसानी बढ़ाने के लिए, और पदों को तोड़ने के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं, जहां वे के आसपास ऊतक गठन को मजबूत बनाने, यह चैनलों के छोर तक अतिरिक्त चौड़ाई (लगभग एक के बाद व्यास पद के प्रत्येक पक्ष पर) जोड़ने के लिए के रूप में प्रदर्शन संभव है "कुत्ते हड्डी" द्वारा आकार चित्रा 3 ए में चैनल। उचित डिवाइस संरेखण के बिना ऊतक या तो पदों से अलग होगा शीघ्र ही संस्कृति के बाद, या अच्छी तरह से में रहेगा जब baseplate निकाल दिया जाता है। एक अच्छी तरह से बनाई ऊतक baseplate हटाने के दौरान बंद हो जाता है, तो यह, धीरे से एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत ठीक संदंश का उपयोग पदों के लिए ऊतक पुनः अनुलग्न करने के लिए संभव है, हालांकि यह नाजुक hECTs को नुकसान करने के लिए आसान है अगर पर्याप्त देखभाल नहीं लिया जाता है। </ P>

वर्णित परिभाषित प्रणाली का एक प्रमुख ताकत सेल रचना की विशेष नियंत्रण पर आधारित हृदय सेल उपचार में प्रत्यक्ष सेल सेल संपर्क तंत्र के योगदान से पूछताछ करने की क्षमता है। पशुओं में कोशिकाओं के इंजेक्शन imprecise और कम व्यवहार्यता और प्रतिधारण 33 के अधीन है। इसके अतिरिक्त, लक्ष्य ऊतक पर इंजेक्शन कोशिकाओं के प्रभाव में इस तरह के प्रतिरक्षा प्रणाली के रूप में अन्य शारीरिक प्रणाली, के साथ बातचीत से जटिल है। जैसे, हृदय सेल उपचार में प्रत्यक्ष सेल सेल बातचीत के योगदान को समझने के मॉडल जीवों में संबोधित करने के लिए चुनौती दे रहा है। इसलिए, वर्णित विधि के लिए एक लाभ यह है कि सेल सेल बातचीत एक biomimetic तीन आयामी वातावरण में विश्लेषण कर रहे हैं, हृदय आला के प्रमुख पहलुओं के संरक्षण, और ब्याज की विशेष प्रकार की कोशिकाओं की उपस्थिति में है - अर्थात्, हृदय myocytes और fibroblasts। परिभाषित हेक्टेयर प्रणाली का उपयोग करने की उपयोगिता demonstr है10% hMSCs मानव मज्जा 34,35 से ली गई है और ऊतक निर्माण के दौरान सेल मिश्रण करने के लिए नैदानिक ​​परीक्षण में इस्तेमाल की पूरकता के साथ पैदा। उन ऊतकों कि hMSCs के साथ पूरक थे unsupplemented परिभाषित मानव ऊतकों (चित्रा 4F) से भी बड़ा सिकुड़ा बल का प्रदर्शन किया। चूंकि ऊतक पर्यावरण और रचना नियंत्रित किया गया है, एमएससी पूरकता के साथ ऊतक समारोह की वृद्धि cardiomyocyte समारोह पर hMSCs का एक अंतर्निहित प्रभाव को दर्शाता है। व्यवस्था करने के लिए एक और ताकत के बाद से ऊतकों छोटे से पहले से इस्तेमाल कर रहे हैं, 1,7 सेल का प्रयोग अधिक कुशल है, एक महत्वपूर्ण विचार है कि जब सेल स्रोत के रूप में स्टेम कोशिकाओं का निर्देश दिया differentiations का उपयोग कर रहा है।

सेल थेरेपी के तंत्र के अध्ययन के अलावा, परिभाषित हेक्टेयर प्रणाली हृदय सेल सेल बातचीत के सेलुलर आधार की परीक्षा के लिए सक्षम होगा। ऊतक const के लिए कोशिकाओं की जीव विज्ञान की गड़बड़ी से पहलेगड़बड़ाहट, shRNAs साथ उदाहरण के लिए, सेल सेल और सेल मैट्रिक्स बातचीत गवर्निंग आणविक तंत्र की जांच की अनुमति होगी। ऊतक इंजीनियरिंग सिस्टम के लिए एक अतिरिक्त लाभ यह गठबंधन कार्यात्मक संकुचन में सक्षम पेशीतंतुओं के गठन है। इस प्रकार, परिभाषित हेक्टेयर प्रणाली का उपयोग कर, myofibril गठन, cardiomyocyte विकास और ऊतक वास्तुकला के संगठन की गतिशीलता सभी अतिरिक्त सेलुलर मैट्रिक्स या कोशिकाओं की आणविक हेरफेर के घटकों के संशोधन के माध्यम से जांच की जा सकती है। Hect प्रणाली के मानव और 3 डी प्रकृति अतिरिक्त निष्कर्षों के translatability बढ़ जाती है।

वर्णित प्रणाली हृदय जीव विज्ञान के बुनियादी सवालों को समझने के लिए एक शक्तिशाली तरीका प्रदान करता है, यह सीमाओं के बिना नहीं है। सबसे पहले, इंजीनियर ऊतकों एक अपरिपक्व phenotype, नवजात दौरे के नमूने 7 से प्रकाशित चिकोटी बल डेटा के साथ संगत दिखा रहे हैं। जबकिप्ररूपी अपरिपक्वता सेल संपर्क तंत्र के मूल्यांकन में एक confounding कारक हो सकता है, वहाँ सबूत है कि रोगग्रस्त cardiomyocytes एक भ्रूण जीन कार्यक्रम 7,36-38 पर वापस लौटने के लिए है। Hect प्रणाली से निष्कर्ष एक असफल दिल के संदर्भ में प्रासंगिक साबित करते हैं, तो यह हृदय के उपचारों के परीक्षण के लिए फायदेमंद हो सकता है। प्रोटोकॉल भी ऊतक निर्माण के दौरान एक hESC योग्य तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स का उपयोग करता है। इस मैट्रिक्स की रचना बहुत से बहुत भिन्न हो सकते हैं, और जब परिभाषित तहखाने मैट्रिक्स विकल्प उपलब्ध हैं वे अभी तक hECTs के संदर्भ में मूल्यांकन किया जाना है।

अन्य सीमाओं के एक नाड़ी तंत्र की कमी और कोई सिस्टम स्तरीय बातचीत के प्रभाव शामिल हैं। ऊतकों के आकार को देखते हुए, चयापचय की मांग प्रसार द्वारा अकेले मुलाकात कर रहे हैं ताकि कोई नाड़ी तंत्र सेल व्यवहार्यता सुनिश्चित करने की जरूरत है। हालांकि, endothelial सेल संकेतन विशेष सेल उपचार में एक महत्वपूर्ण कारक हो सकता है। इस मामले में, एंडो की एक विशिष्ट संख्या हैthelial कोशिकाओं बस के ऊतकों के निर्माण के दौरान परिभाषित सेल मिश्रण में जोड़ा जा सकता है। जबकि सिस्टम स्तरीय बातचीत सेल तंत्र की पूरी समझ के लिए महत्वपूर्ण हैं, इंजीनियर ऊतक प्रणाली एक न्यूनीकारक दृष्टिकोण आदेश व्यवस्थित तंत्र को संबोधित करने में समस्या को आसान बनाने के लिए प्रदान करता है। के रूप में इस तरह के ल्यूकोसाइट्स एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, या पैराक्राइन सिगनल से पूछताछ करने के लिए पड़ोसी प्रकार के ऊतकों को जोड़कर शामिल करने के रूप में सिस्टम से संबंधित प्रभाव, के माध्यम से परिचय की जरूरत जटिलता परिभाषित ऊतक प्रणाली को जोड़ा जा सकता है।

एक खोजी उपकरण, परिभाषित मानव हृदय के ऊतकों इंजीनियर प्रणाली प्रजातियों विशिष्ट मानव कोशिकाओं का लाभ प्रदान करता है, नियंत्रित जैव-जटिलता, सिकुड़ा समारोह का सीधा और अनुदैर्ध्य निगरानी के साथ एक biomimetic 3-डी संस्कृति, पर्यावरण और एक परिभाषित सेलुलर और मैट्रिक्स संरचना के रूप में। Hect प्रणाली के लिए भविष्य के निर्देश ब्याज बुद्धि के चिकित्सीय सेल प्रकार जोड़ तोड़ में शामिलज siRNA या shRNA आदेश सेल सेल बातचीत के विशिष्ट आणविक विवरण की जांच करने में ऊतकों में शुरूआत से पहले। इसके अतिरिक्त, बल्कि hESCs हृदय कोशिकाओं का उपयोग कर के रूप में करने की तुलना में, यह संभव इंजीनियर के ऊतकों में संबंधित हृदय रोग अभिव्यक्तियों मॉडल करने के प्रयास में एक विरासत में मिला उत्परिवर्तन के साथ रोगियों से प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (IPSCs) का उपयोग करने के लिए है। इस प्रकार, परिभाषित सेल आबादी के साथ मानव हृदय के ऊतकों को इंजीनियर बनाने के हमारे विधि हृदय रोग के साथ रोगियों के लिए उपन्यास उपचार के विकास में तेजी लाने में मदद करने के लिए हृदय सेल उपचार के अध्ययन के लिए नए रास्ते खोलने का वादा किया।

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Acknowledgments

यह काम एनआईएच (1F30HL118923-01A1) TJC, KDC, हांगकांग टीआरएस T13-706 / 11 (KDC), एनआईएच (R01 HL113499) BDG करने के लिए, अमेरिकी के अनुसंधान अनुदान परिषद के लिए एनआईएच / NHLBI कलम अनुबंध HHSN268201000045C द्वारा समर्थित किया गया हार्ट एसोसिएशन (12PRE12060254) आरजे करने के लिए, और HKSAR के अनुसंधान अनुदान परिषद (TBRS, T13-706 / 11) अतिरिक्त धन आरएल को एनआईएच DRB 5T32GM008553-18 द्वारा और सिस्टम्स और विकास में NIDCR-अंतःविषय प्रशिक्षण पर एक ट्रेनिंग के रूप में TJC करने के लिए प्रदान किया गया जीवविज्ञान और जन्म दोष T32HD075735। लेखकों को भी कृतज्ञता बायोरिएक्टर और तकनीकी सहायता के लिए Mamdouh Eldaly मशीनिंग के साथ सहायता के लिए न्यूयॉर्क के सिटी कॉलेज के Zahn सेंटर में आर्थर Autz स्वीकार करना चाहते हैं। हम यह भी उदारता से मानव mesenchymal स्टेम सेल प्रदान करने के लिए हृदय भेदभाव पर सलाह के लिए डॉ केनेथ Boheler, और डॉ यहोशू हरे धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Culture Company Catalog Number Comments
Amphotericin B Sigma-Aldrich A2411 Prepare a 2.5 mg/ml stock in DMSO and filter-sterilize
B27 with Insulin Life Technologies 17505055
B27 without Insulin Life Technologies A1895601
CHIR99021 Stemgent 04-0004 Create 6 μM stock, then aliquot and store at -20 °C.
Essential 8 Media Life Technologies A1517001
H7 Human Embryonic Stem Cells WiCell WA07
hESC Qualified Matrix, Corning Matrigel Corning 354277 Thaw on ice at 4 °C overnight then aliquot 150 μl into separate tubes and store at -20 °C.
IWR-1 Sigma-Aldrich I0161 Create 10 mM stock and aliquot. Store at -20 °C
Neonatal Calf Serum Life Technologies 16010159
Non-enzymatic Dissociation Reagent: Gentle Cell Dissociation Reagent Stem Cell Technologies 7174
Penicillin-Streptomycin Corning 30-002-CI
RPMI 1640 Life Technologies 11875-093 Keep refrigerated
Y-27632 (ROCK Inhibitor) Stemgent 04-0012 Resuspend to a 10 mM stock concentration, aliquot and store at -20 °C. Avoid freeze thaw cycles.
Cell Sorting Company Catalog Number Comments
4’,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) Life Technologies D1306
CD90-FITC BioLegend 328107
Enzymatic Dissociation Reagent: Cell Detach Kit I (0.04 % Trypsin/ 0.03% EDTA, Trypsin neutralization solution and Hanks Buffered Salt Solution)  PromoCell C-41200
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologics S11250
SIRPα-PE/Cy7 BioLegend 323807
Tissue Construction Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin/0.1% EDTA Fisher Scientific 25-053-CI Optional: For collection of supplemental cells of interest
10x MEM Sigma-Aldrich M0275-100ML
10x PBS Packets Sigma-Aldrich P3813
Collagen, Bovine Type I Life Technologies A10644-01 Keep on ice
DMEM/F12 Life Technologies 11330057
Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM), High Glucose Sigma-Aldrich D5648
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning Sylgard 184
Sodium HEPES Sigma-Aldrich H3784
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich 221465
Materials Company Catalog Number Comments
1.5 ml microcentrifuge tubes Fisher Scientific NC0536757
15 ml polyproylene centrifuge tube Corning 352096
5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube Corning 352235 With integrated 35 μm cell strainer
50 ml polyproylene centrifuge tube Corning 352070
6-well flat bottom tissue-culture treated plate Corning 353046
Cell Scraper, Disposable Biologix 70-2180
Polysulfone McMaster-Carr
Polytetrafluoroethylene (Teflon) McMaster-Carr
Equipment Company Catalog Number Comments
Dissecting Microscope Olympus SZ-61 Or similar, must have a mount for the high speed camera to attach
Electrical Pacing System Astro-Med, Inc Grass S88X Stimulator
High Speed Camera Pixelink PL-B741U Or similar, but must be capable of 100 frames per second for accurate data acquisition
Plate Temperature Control Used to maintain media temperature during data acqusition.
Custom Materials Company Catalog Number Comments
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References

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निर्धारित मानव इंजीनियर कार्डिएक ऊतकों के निर्माण हृदय सेल थेरेपी के तंत्र का अध्ययन करने के लिए
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Cashman, T. J., Josowitz, R., Gelb, B. D., Li, R. A., Dubois, N. C., Costa, K. D. Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy. J. Vis. Exp. (109), e53447, doi:10.3791/53447 (2016).More

Cashman, T. J., Josowitz, R., Gelb, B. D., Li, R. A., Dubois, N. C., Costa, K. D. Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy. J. Vis. Exp. (109), e53447, doi:10.3791/53447 (2016).

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