Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

Bygging av Definert menneske Engineered Hjerte Vev å studere mekanismer Cardiac Cell Therapy

doi: 10.3791/53447 Published: March 1, 2016

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Cardiac tissue engineering har avansert kraftig i det siste tiåret, med flere grupper publisering resultatene av fullt funksjonelle, slo vev laget av både murine cardiomyocytes 1-6 og, mer nylig, menneskestamcelle-avledet hjertemuskelceller 7-12. Den hjerte tissue engineering feltet er drevet av to primære og hovedsak uavhengige mål: 1) å utvikle eksogene grafts som kan transplanteres inn i sviktende hjerter for å bedre funksjon 4-6; og 2) å utvikle seg in vitro modell for å studere fysiologi og sykdom, eller som screening verktøy for utvikling av terapeutiske medikamenter 2,7.

Tre-dimensjonal (3-D) cellekultur er ansett som nødvendig for å utvikle neste generasjon screening verktøy, som 3-D matrise reflekterer en mer naturlig hjertemikromiljøet enn tradisjonelle to-D monolagscellekultur; faktisk noen aspekter av cellebiologi er fundamentalt forskjellig i 2-D vs 3-D kulturer 13,14 9 eller kollagen 7,8,10) er strengt kontrollert, inngangscellen sammensetningen blir mindre godt definert, med hele blandingen av celler fra en rettet kardial differensiering av enten embryonale stamceller (ESC 7,9) eller induserte pluripotente stamceller (IPSC 10,12) blir lagt til vevene. Avhengig av den spesifikke cellelinjen og effektiviteten av differensiering protokollen som brukes, kan den resulterende prosentandelen av kardiomyocytter varierer fra under 25% til over 90%, det spesifikke kardiomyocytt fenotype (dvs. ventricular-, atrial-, eller pacemaker-lignende) kan også variere, selv de ikke-kardiomyocytt brøkdel kan være svært heterogen 15,16 og endre modenhet av differensiert hjerte myocytes 17.

Nylige hjertevev ingeniørarbeid har forsøkt å kontrollere inngangs populasjon av celler, med enten en hjerte reporter humane embryonale stamceller linje 8 eller celleoverflatemarkører 18 blir brukt til å isolere den kardiale myocyte komponenten av differensiering. Selv om utgangspunktet en vev sammensatt av bare i hjertemuskelceller ville synes å være den ideelle, er dette faktisk ikke er tilfelle; hECTs sammensatt utelukkende av hjertemuskelceller mislykkes i å komprimere i funksjonelle vev, med enkelte grupper finne et 3: 1 forhold av hjertemuskelceller: fibroblaster fremstilling av det høyeste trekning kraft 8. Ved hjelp av forskjellige celleutvelgelsesmetoder, inkludert overflatemarkører for levende cellesortering, er det mulig å lage hECTs med definerte celle populasjoner. Mens markører for ikke-hjerte stromale celler har vært tilgjengelige i noen tid, slik som den antatte fibroblast markør CD90 19,20, har overflatemarkører av hjertemuskelceller vært vanskeligereå identifisere. SIRPα var blant de første kardiale overflatemarkører som er identifisert for menneskehjertemuskelceller 18 og har vist seg å være meget selektive for hjerte avstamning. Nylig har vi funnet ut at dobbel-sortering for SIRPα + og CD90 - celler gir nesten rene cardiomyocytes, med CD90 + befolkningen viser en fibroblast-lignende fenotype (Josowitz, upubliserte observasjoner). Basert på disse funnene er samlet, heri beskriver vi skape hECTs ved anvendelse av en 3: 1 blanding av SIRPα + / CD90 - kardiomyocytter og CD90 + fibroblaster.

Evnen til å konstruere et fullstendig definert humant hjertevev er viktig ikke bare for å lage robuste screening verktøy, men også for å utvikle modellsystemer for å undersøke frem celle- og gen-baserte hjerte terapier. Spesielt mange cellen terapi for hjertesvikt, utnytte celletyper, inkludert mesenchymale stamceller (MSC) 21 22 og benmarg mononukleære celler 23-25, har blitt testet i kliniske studier. Mens mange av de første resultatene har vært lovende 21,23,25, minsker den første fordelen ofte over tid 26-29. En lignende trend har blitt rapportert i murine utviklet hjerte vev, som viser en betydelig funksjonell fordel på grunn av MSC tilskudd, men fordelen er ikke vedvarende ved langtids kultur 1. Underliggende sub-optimal ytelse er vår begrensede kunnskap om mekanismene som styrer cellen terapi. En dypere forståelse av hvordan terapeutiske celler utøve sin gunstig innflytelse, samt mulige negative konsekvenser av myocyte-nonmyocyte interaksjoner, vil muliggjøre utvikling av bedre behandlingsformer som gir klinisk signifikante og vedvarende fordeler, med minimale bivirkninger, for pasienter med hjertesvikt.

Her beskriver vi bruk av definerte hECTs til interrogspiste mekanismer for cellebasert terapi. Den kontrollerte vevssammensetning er avgjørende for å identifisere spesifikke faktorer som påvirker kardiomyocytt ytelse. Direkte supplere hECTs med den terapeutiske celletype av interesse (f.eks MSC), kan avsløre effekter på hjertets muskelceller ytelse, som vi har vist i rotte studiepoeng 1.

Den følgende flertrinns protokoll begynner med rettet hjertestamcelledifferensiering, etterfulgt av fremstillingen av multi-vev bioreaktor, og avsluttende med en beskrivelse av vev konstruksjon og funksjonell analyse. Våre eksperimenter er utført ved hjelp av NIH-godkjent H7 humane embryonale stamceller (hESC) linje. Imidlertid har de følgende protokoller også blitt testet ved hjelp av en ekstra hESC linje og tre induserte pluripotent stamcelle (hiPSC) linjer med lignende resultater. Det er funnet at effektiviteten i kardiomyocytt differensiering og suksess i hect fabrikasjon kan være avhengige cellelinje, spesielt for hiPSC linjene fra individuelle pasienter. Ved å følge denne protokoll, er to seks-brønners skåler belagt med et total på 1,68 millioner hESCs (140.000 celler per brønn), noe som gir ca. 2,5 millioner myocytter etter differensiering i 20 dager og sortering, nok til å gjøre seks definerte vev.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Merk: Utfør alle celle manipulasjoner i aseptiske forhold ved hjelp av et HEPA-filtrert klasse II biologisk sikkerhetskabinett og sterilisere alle løsninger ved å filtrere dem gjennom et 0,2 mikrometer filter. Utfør vev konstruksjon og funksjonsprøving i enten samme aseptiske forhold eller en laminær hette.

1. Seeding av H7 hESCs i Forberedelse til Cardiac Differensiering

  1. (Dag 1) Klarbasalmembran Matrix
    1. Tine 150 ul delmengde av hESC kvalifiserte basalmembran matrix på is natten ved 4 ° C.
  2. (Dag 0-4) Plating av hESCs på belagte plater
    1. Fortynne tint matrisen inn i 12 ml iskald DMEM / F12 og bland godt.
    2. Overføre 1 ml av DMEM / F12-matriseløsning i hver brønn i en 6-brønners vevskultur behandlede tallerken. Hver aliquot av matrise av maling kan legge to seks-brønns plater.
    3. Inkuber de belagte platene ved romtemperatur i minst 1 time.
      Merk: Ivår erfaring, kan belagt retter forseglet med parafin lagres i matriseoppløsning ved 4 ° C i opp til 10 dager før bruk.
    4. Ved omtrent 75% konfluens, dissosiere H7 hESCs fra 10 cm plate ved anvendelse av 6 ml av den ikke-enzymatiske dissosiasjon reagens. Etter 5 minutter ble forsiktig skrape cellene fra kulturoverflaten ved hjelp av en engangscelleskrape og overføre cellesuspensjonen til et sterilt 15 ml sentrifugerør.
    5. Fjern 0,5 ml av dissosiasjon løsning med cellene fra 15 ml rør og overføring til en ny sterilt 15 ml rør (forlater 5,5 ml av dissosiasjonen reagens for ytterligere å dissosiere hESCs) for stamcellelinje forplantning.
    6. Pellet 0,5 ml celler ved 300 xg i 5 minutter ved 20 ° C. Fjern supernatanten og resuspender forsiktig i 8 ml pluripotent stamcelle-medium inneholdende 1% penicillin-streptomycin og deretter overføre til en ny, overdrag, 10 cm vevskulturskål og opprettholde 37 ° C og 5% CO2 for å opprettholde den stamcellelinjen.
      Merk: Hold pluripotent stamcelle media på isen under medie endringer.
    7. I mellomtiden, tilsett 5,5 pl 10 mM ROCK-inhibitor Y-27632 til den gjenværende 5,5 ml av dissosiasjon løsning, og fortsette å inkubere ved romtemperatur i ytterligere 5-10 min. Bland forsiktig cellene med en 5 ml serologisk pipette. Fortsett å inkubere til en enkelt cellesuspensjon blir oppnådd, så pellet cellene ved 300 xg i 5 minutter ved romtemperatur.
    8. Resuspender cellene i 5 ml pluripotent stamcelle media og utføre en celletelling ved hjelp av et hemocytometer.
    9. Frø hver brønn på 6-brønners skål ved en tetthet på 140.000 celler per brønn. Seed to 6-brønns plater til å lage en total av seks definerte vev. Kast eventuelle gjenværende celler etter plating.
    10. Fyll brønnen til 1 ml med pluripotent stamcelle media og inkuber ved 37 ° C, 5% CO2. Tjuefire timer senere, tar ut mediene, og tilsett 2 ml frisk pluripotent stamcelle media til hver brønn (figur 1A
    11. Sjekk samløpet av platene hver dag og begynne differensiering når cellene når ca 75% samløpet (Figur 1B - D).

2. (dag 4-24) Differensiering av humane embryonale stamceller til cardiomyocytes 30,31

  1. (Dag 4-7 Differensiering Dag 0-3) mesoderm Induksjon
    1. Forbered RPMI differensiering media I (tabell 1) ved å kombinere 500 ml RPMI 1640 med 10 ml B27 supplement (uten insulin) og 5 ml penicillin-streptomycin-stamløsning (10 000 IU / ml penicillin, 10 000 pg / ml streptomycin). Delmengde, på is, i 50 ml rør og oppbevar ved 4 ° C.
    2. (Dag 4, Differensiering dag 0) Forbered mesoderm induksjon media ved å tilsette 2,4 mL av lite molekyl gsk3 inhibitor CHIR99021 (10 mM lager, 6 mM endelig konsentrasjon) til 12 ml RPMI differensiering media I. Fjern pluripotent stamcelle medier fra hver brønn ennd erstatte med 2 ml mesoderm induksjon media per brønn. Returnere platen til inkubatoren.
      Merk: Betydelig celledød oppstår vanligvis med tillegg av CHIR99021 (figur 1E). Den monolayer vil komme seg, men det er viktig å skylle de døde cellene bort med DMEM / F12 skylling.
    3. (Dag 5, Differensiering dag 1) Klargjør ferske mesoderm induksjons media som beskrevet ovenfor. Fjern de gamle medier fra hver brønn og skyll en gang med 1 ml DMEM / F12 per brønn. Tilsett 2 ml friskt mesoderm induksjons media til hver brønn.
      Merk: Skylling hver dag fra dag 0-10 i stor grad øker utbyttet og renhet av hjertemuskelceller.
    4. (Dag 6, Differensiering Dag 2) Fjern de hjerteinduksjons media og skyll en gang med 1 ml DMEM / F12 per brønn. Bytt skyll med 2 ml RPMI differensiering media I (ingen små molekyler lagt til, men fortsatt med B27 (uten insulin) supplement) og gå tilbake til inkubatoren.
  2. (Dag 7-13, Differensiering Day 3-10) Cardiac mesoderm Induksjon
    1. (Dag 7, Differensiering Dag 3) Forbered hjertestans mesoderm induksjon media ved å tilsette 6 mL av lite molekyl Wnt inhibitor IWR-1 (10 mm lager, 5 mM endelig) til 12 ml RPMI differensiering media I.
    2. Fjern materialet fra hver brønn, skyll en gang med 1 ml DMEM / F12 per brønn og erstatte med 2 ml av hjertestans mesoderm induksjon media per brønn.
    3. (Dag 8, Differensiering Dag 4) Utarbeide ytterligere 12 ml hjerte mesoderm induksjons media som beskrevet ovenfor. Fjern materialet lagt dagen før, skyll en gang med 1 ml DMEM / F12 per brønn og erstatte med 2 ml frisk hjertestans mesoderm differensiering media per brønn og gå tilbake til inkubatoren.
    4. (Dag 9-10, Differensiering Dag 5-6) På begge dager, fjern hjerte mesoderm induksjons media og skyll hver brønn med 1 ml DMEM / F12.
    5. Tilsett 2 ml av frisk RPMI differensiering media I (ingen små molekyler lagt til, men fortsatt med B27 (uten insulin) supplement)til hver brønn og returnere platen til inkubatoren.
  3. (Dag 11-24, Differensiering Dag 7-20) HMS-avledet Cardiac myocyte Organisasjon / Modning
    1. Klargjør RPMI differensiering media II (tabell 1) ved å kombinere 500 ml RPMI 1640 med 10 ml B27 supplement (med insulin) og 5 ml penicillin-streptomycin-stamløsning. Delmengde, på is, i 50 ml rør og oppbevar ved 4 ° C.
    2. (Dag 11, Differensiering Dag 7) Fjern RPMI differensiering media (uten insulin) fra hver brønn og skyll med 1 ml DMEM / F12. Erstatte med 2 ml av den nye RPMI differensiering media II (med insulin) til hver brønn, og går tilbake til inkubatoren.
      Merk: Spontan juling bør først observert mellom dag 7 og 10. Hvis juling ikke er observert i løpet av denne tiden, er det vanligvis en indikasjon på dårlig differensiering effektivitet. Protokollen kan fortsette til dag 15 i et forsøk på å observere juling, men hvis ingen slo observeres etter dag 15 er det best å stkunst en ny differensiering.
    3. (Dag 12-24, Differensiering Dag 8-20) Hver dag, fjern de gamle differensiering media og erstatte med 2 ml av frisk RPMI differensiering media II per brønn for å tillate cellemodning og organisering av juling monolaget (figur 1F, Video Figur 1 ).
      Merk: Avhengig av den gjenværende celledød, kan det være nødvendig å skylle med 1 ml DMEM / F12 gjennom differensiering dag 10.

3. (Dag 24, Differensiering Dag 20) Isolering av hjertemuskelceller og fibroblast-lignende celler

  1. Distansere Celler fra ett lag
    1. Fjern differensiering media og skyll en gang med 1 ml PBS.
    2. Dissosiere monolagene med 1 ml av den enzymatiske dissosiasjon oppløsning (0,04% trypsin / 0,03% EDTA) til hver brønn.
    3. Bevege platen inn i inkubator i 10 min. I mellomtiden, tilsett 12 mL av ROCK hemmer 6 ml trypsin nøytralisering løsning.
    4. Gently tilsett 1 ml av trypsin nøytralisering oppløsningen inneholdende ROCK inhibitor til hver brønn på platen for å nøytralisere trypsin-løsning.
    5. Ved hjelp av en steril overføring pipette, forsiktig blande hver brønn for å bryte fra hverandre celleklynger.
    6. Overføre alle 12 ml fra den 6-brønns plate i et 15 ml sentrifugerør.
      Merk: Fordi to seks-brønns plater er brukt i denne protokollen, vil to 15-ml-rør være nødvendig.
    7. Transfer 3 ml PBS til en brønn på platen, og deretter sekvensielt å overføre de samme 3 ml til hver påfølgende godt til å samle eventuelle gjenværende celler på fatet. Overfør de resterende 3 ml fra den siste brønnen inn i den samme 15 ml sentrifugerør inneholdende cellene.
    8. Pellet ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
  2. Forbered celler for Live Cell Sorting ved FACS
    1. Klargjør flekker buffer ved å legge til 5 ml Fetal Bovine Serum 45 ml PBS på is med 50 ul ROCK hemmer.
    2. Fjern supernatanten fra cellen pella (i 3.1.8) og resuspender i 1,2 ml flekker buffer.
    3. Overfør 200 ul av cellesuspensjonen til en ny, på forhånd avkjølt, 50 ml sentrifugerør på is. Dette vil være den negative fargings kontrollen.
    4. Overfør den gjenværende 1 ml av cellesuspensjonen til en ny, på forhånd avkjølt, 50 ml sentrifugerør på is og tilsett 2 ul SIRPα-PE / Cy7 (1: 500 fortynning) og 4 pl CD90-FITC (1: 250 fortynning) . Bland forsiktig cellesuspensjonen med en overføring pipette og gå tilbake til isen.
    5. Inkuber både den negative kontrollen og prøve, på en rocker shaker, på is ved 4 ° C i 1 time.
    6. Forbered prøven samling rør ved å tilsette 3 ml RPMI media (med insulin) til to 15 ml sentrifugerør. Legg 3 mL av ROCK hemmer til hvert rør og lagre på is.
    7. Pellet fargede celler ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C og skylles to ganger med minst 10 ml iskald PBS per skylling.
    8. Tilsett 1 mL av DAPI (1 pg / ml) til 5 ml av flekker buffer. Skånsomtresuspender pelleten prøven med 1-3 ml av DAPI holdige flekker buffer ved hjelp av en overføring pipette.
    9. Legg 500 mL av farging buffer (uten tilsatt DAPI) til den negative kontroll.
    10. filtrere forsiktig både den negative kontrollen og prøven gjennom en 40 mikrometer celle sil for å fjerne klumper av celler og overføre til polystyren FACS rør på is. Umiddelbart bringe prøvene til cellen sorter.
    11. I likhet med etablerte levende celle sortering metoder 18, bruker du negativ kontroll for å sette portene, velg for levende celler (DAPI negativ) og samle begge FITC + (dvs. CD90 + fibroblaster) og PE / Cy7 + (dvs. SIRPα + cardiomyocytes ) populasjoner uavhengig ved 20 psi (figur 2).
      Merk: Etter at portene, kan den negative kontrollen festes i 4% PFA å bestemme differensiering effektivitet ved farging for hjerte troponin-T.
      Merk: Noen forskere foretrekker å bruke enisotype kontroll heller enn uten flekker kontroll for å stille portene for å kompensere for ikke-spesifikk antistoffbinding. En såkalt fluorescens minus en (FMO) kontroll er en annen mulighet. På grunn av den klare bimodal fordeling av FITC, DAPI og PE-Cy7 signaler, vi gated fra den positive befolkningen, konservativt sikter langt inn i positive gate, som muligens utelukker noen sanne positive, men bidrar til å minimere eventuelle falske positiver.
  3. Cell reaggregering i Forberedelse til Tissue Engineering
    1. Etter cellesorterings, pellet både prøverør og resuspender i 1 ml DMEM inneholdende 10% nyfødt bovint serum, 1% penicillin-streptomycin og 0,2% Amphotericin B ( "NBS media").
    2. Rekombinerer den SIRPα + og CD90 + -celler i en 3: 1-forhold og plate de kombinerte cellene i et ikke-vevskultur behandlede petriskål ved en tetthet på 2 millioner celler per 60 cm 2 (10 cm skål). Tilsett 10 ml NBS media og 10.1; l ROCK inhibitor Y-27632.
    3. Plasser cellesuspensjon i vevskultur-inkubator i 48 timer for å tillate celle reaggregering i små klynger.

4. Menneskelig Cardiac Tissue Engineering

  1. Dikte Multi-vev bioreaktor
    Merk: For å supplere illustrasjonene i figur 3A, CAD-filer med detaljert bioreaktor utforming skjemaer er tilgjengelige på anmodning fra forfatterne.
    1. Machine PDMS mester mold ved å bore seks jevnt fordelte hull med diameter 0,5 mm inn i en 9 x 33 x 3,25 mm cuboid av polytetrafluoretylen.
    2. Ved hjelp av en endmill, maskin en ramme fra polysulfon måler 25 x 35 x 11 mm 3. Hensikten med rammen er å holde PDMS innlegg (konstruert fra det støpte laget ovenfor) på linje med brønnene i grunnplaten.
    3. Ved hjelp av en 1-mm endmill, maskin 6 brønner (6 x 1 x 1 mm 3), 4 mm fra hverandre i en 20 x 40 x 5 mm 3 stykke svart polytetrafluoroethylene å danne bunnplate.
    4. Bland elastomer base og herder for polydimethylsiloxane (PDMS) i et 10: 1 w / w-forholdet og legge til egendefinerte polytetrafluoretylen mold (trinn 4.1.1) for å lage to rader med seks tvangs sensing innlegg, og inkuber natten og under vakuum ved 80 ° C. Etter herding, forsiktig fjerne PDMS fra master mold og nøye merke toppen av hver stolpe med en svart sprittusj for forbedret kontrast og automatisert sanntid post nedbøyning sporing.
      Merk: Polytetrafluorethylen er ganske myk, og kan lett bli skadet. Vær forsiktig når du rengjør master mold før PDMS casting for å sikre lang levetid for systemet og konsekvent PDMS post geometri. En 0,5 mm ledning kan brukes til å rense hullene for innlegg etter hver bruk, men ta vare å ikke skrape innsiden av hullene.
      Merk: Et alternativ er å avgasse de PDMS under vakuum i flere timer ved værelsestemperatur, deretter la blandingen herde ved omgivelsestrykk.Dette kan føre til færre restgassbobler som dannes i den PDMS under herdeprosessen.
    5. Steriliser alle komponenter i en autoklave.
      Merk: PDMS mester mold (trinn 4.1.1) og polysulfon ramme (trinn 4.1.2) er begge gjenbrukes. PDMS innlegg som er opprettet fra cast (trinn 4.1.4) er også gjenbrukbare, men bare i ca 10 bruksområder. Imidlertid kan flere PDMS innlegg opprettes etter behov ved hjelp av master mold.
  2. Samle reaggregert hjerteceller
    1. Fjern de reaggregert celler fra inkubatoren og overføre alle 10 ml av reaggregering mediet til et 50 ml sentrifugerør.
    2. Skyll plate med 3 ml PBS og overfør skylle til det samme 50 ml sentrifugerør inneholdende reaggregering media.
    3. Tilsett 3 ml av 0,04% trypsin / 0,03% EDTA i 10 cm plate, og går tilbake til inkubatoren i 5 min.
    4. Etter 5 min undersøke plate med et invertert mikroskop forbindelse ved 10X forstørrelse for å sikre fullstendig celle dissociasjon fra fatet. Hvis noen rest klynger er fortsatt festet, forsiktig agitere platen for å løsne klumper. Hvis klynger forbli festet, gå tilbake til inkubatoren for en annen 2-3 min. Ikke inkuberes lenger enn ti minutter eller betydelig celledød kan forekomme.
    5. Når alle cellene er frittliggende, tilsett 3 ml trypsin nøytralisering løsning. Bland forsiktig nøytralisering løsningen med trypsin-celleløsning og overføring til 50 ml sentrifugerør inneholdende de reaggregering media og skylles en gang med PBS.
    6. Skyll hele fatet med 5 ml PBS og overføres til det samme 50 ml rør inneholdende cellene.
    7. Pellet cellene ved 300 xg i 5 minutter ved romtemperatur.
    8. Fjern supernatanten og resuspender pelleten i 1 ml NBS media, og deretter overføre til et 1,5 ml mikrosentrifugerør.
    9. Pellet ved 300 xg i 5 min ved romtemperatur og fjern supernatanten. De hjerteceller (CD90 + stromale celler og SIRPα + myocytes) er nå klar for vev konstruksjon.
  3. (Valgfritt) Samle Supplerende Celler av interesse
    Merk: I tillegg til de som er definert vev som kun inneholder SIRPα + kardiomyocytter og CD90 + fibroblast-lignende celler, er det mulig å legge til flere celler av interesse å avhøre deres effekt på vev funksjon. For eksempel rotte MSC har vist seg å forbedre funksjonen av rotte konstruert kardiale vev 1. Følgende valgfrie trinnet beskriver samlingen av supplerende celler for det definerte systemet.
    1. Samle supplerende celletype av interesse (f.eks stamceller) med 0,25% trypsin / 0,1% EDTA.
    2. Pellet cellene ved 300 xg i 5 minutter ved romtemperatur og deretter resuspender i 5 ml av passende cellekulturmedium for den celletype av interesse. For eksempel, for MSCer, bruk DMEM supplert med 20% føtalt bovint serum, 1% penicillin-streptomycin og 0,2% amfotericin-B til kulturen calen.
    3. Utføre en celletelling ved hjelp av et hemocytometer, og deretter pellet cellene på nytt ved 300 xg i 5 minutter ved romtemperatur.
    4. Fjern supernatanten, resuspender i 1 ml av cellekulturmedier og overføring til et 1,5 ml mikrosentrifugerør.
    5. Pellet cellene ved 300 xg i 5 minutter ved romtemperatur.
    6. Fjern supernatanten. De supplerende celler er nå klar for vev konstruksjon.
      Merk: Hvis det supplerende celler tilsettes i en konsentrasjon på 10% av det totale celleantall i vev, da for de definerte vev, vil dette kreve 50.000 supplerende celler pr vev som hvert vev inneholder 500.000 hjerteceller (både CD90 + stromaceller og SIRPα + muskelceller).
  4. Lag Human Engineered Hjerteservietter
    Merk: Oppbevar alle løsninger på is og cellene ved romtemperatur. Alle volumer oppført nedenfor er per vev. Vanligvis kan omtrent seks vev være konstruert av to seks-brønns plAtes av hjerte differentiations.
    1. Fortynn 60,0 ul av 5 mg / ml kollagen lager til 3,125 mg / ml med 1,5 ul 1 M NaOH, 9,6 ul av 10 x PBS og 24,9 ul sterilt ultrarent deionisert vann.
      Kritisk trinn: Unngå innføring av luftbobler til hver løsning under forberedelse som luftbobler vil forstyrre riktig vev formasjon.
    2. Legg 12,0 mL av både 10 x MEM og 0,2 N HEPES pH 9 med fortynnet kollagen blandingen for å skape den kollagen blandingen. Legg begge løsninger ned på siden av 15 ml sentrifugerør for å unngå innføring av luftbobler inn i kollagen blandingen.
    3. Tilsett basalmembranen matriksen til en endelig konsentrasjon på 0,9 mg / ml til kollagen blandingen og lagres på is for å skape det endelige vev blandingen. Den endelige konsentrasjonen av kollagen bør være 2 mg / ml.
    4. Legg 500000 av reaggregert cellene til vevet mix (myocyte + fibroblast-konsentrasjonen er 20 millioner / ml) og fyll opp til et endelig volum på 25 ul pervev med enten cellefrie NBS media eller 50.000 celler av supplerende celletype av interesse (f.eks hMSCs) og bland godt til å danne en jevn cellesuspensjon.
      Merk: Antallet supplert cellene vil variere fra for ulike bruksområder. Her 10% tilskudd er i bruk.
    5. Med forsiktighet, pipette 25 ul av cellesuspensjonen i hver av de seks brønnene i bioreaktoren basisplaten, uten å innføre luftbobler inn i brønnen.
    6. Push to rader av PDMS kraftsensorer på hver side av polysulfon ramme, som danner 6 par motstående innlegg, deretter snu rammen på toppen av basisplaten, slik at ett par av innleggene entrer hver brønn inneholdende cellesuspensjonen.
      Merk: polysulfon rammen inneholder faner for å hjelpe til med justering av PDMS.
    7. plassere bioreaktor nøye, grunnplaten ned, inn i en 60 mm tallerken, og sett fatet uten trekk inne i en 10 cm tallerken, legg 10 cm dekselet på toppen, og flytte hele bioreaktor forsamlingen itil vevskultur-inkubator, venter på to timer for vev til gel.
    8. Etter 2 timer, fjerne bioreaktor fra inkubatoren og tilsett 14 ml NBS media til hele forsamlingen, nok til å dekke basisplate. Gå tilbake til inkubatoren, og endre halvparten av media hver dag.
    9. Førti-åtte timer senere, forsiktig fjerne bunnplaten ved å forsiktig flytte hver side av bunnplate av rammen noen millimeter om gangen, endre media, deretter returnere bioreaktor, vev vendt ned, til media.
    10. Fortsette å endre halvparten av NBS kulturmediet hver dag.
      Merk: Spontane sammentrekninger av vevet kan bli observert så tidlig som 3 dager etter vev konstruksjon, genererer målbare rykk krefter så tidlig som dag 5-7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

For å få hjertemuskelceller, er en litt modifisert versjon av Boheler og Lian differensiering metoder brukt 30,31. Det er viktig at differensieringen begynner i løpet av log-fasen av cellevekst, men også at utgangspopulasjon er tilstrekkelig konfluent for å oppnå en brukbar antall celler etter sortering (ca. 75% er optimalt). Typisk for H7 hESCs, plettering ved en tetthet på 140.000 hESCs per brønn i en 6-brønners skål i vesentlig 8 medier og 5% CO2 inkubator holdt ved 37 ° C gir tilstrekkelig løpende kulturer etter 4 dager for å begynne differensiering, som vist i Figur 1A - D. Siden insulin hemmer hjerte spesifikasjon under differensieringsprosessen 32, insulinfrie medier (differensiering media I, tabell 1) blir brukt for de første 10 dagene av differensiering. Når differensiering initieres via anvendelsen av GSK3p-inhibitor CHIR99021,betydelig celledød vil oppstå (figur 1E). Som en konsekvens er det vesentlig å endre media hver dag. På dag 2 av differensiering, blir cellene fjernet fra CHIR99021 og hvilte i differensiering media I (uten tilsatt små molekyler) i 24 timer. Etter 24 timers hvile i differensiering media, blir cellene behandlet med IWR-en i 48 timer, etter som de begynner å selv organisere i klynger (figur 1F) som slo så tidlig som syv dager fra start av differensiering. Siden hjerte spesifikasjonen har oppstått etter påføring av IWR-en, er det media endret til medier som inneholder insulin (differensiering media II, tabell 1). Ved 18 dager med differensiering, har kolonier av celler slår tilkoblet og delvis løsrevet fra celleoverflaten, danner robust slo «webs» gjennom hele fatet (Video figur 1).

På dag 20, er det bankende monolaget forsiktig dissosiert VIen enzymatiske metoder for å skaffe enkeltceller for live fluorescerende forbundet celle sortering (FACS). Ved hjelp av differensiering fremgangsmåten beskrevet ovenfor, vi konservativt høste omtrent 65% av befolkningen som SIRPα + og 10% som CD90 + (figur 2). Vanligvis 1-2 millioner SIRPα + celler ble oppnådd pr seks-brønns plate.

Etter reaggregering i 48 timer i et 3: 1 forhold av SIRPα +: CD90 + celler, blir de definerte celleaggregater blandet med et kollagenbasert hydrogel og pipettert inn i trange brønner i basisplaten av multi-vev bioreaktor. Vanligvis, før fjernelse fra formen, små klynger av 5-10 celler vil bli sett å slå på overflaten av fatet. Den definerte vev bioreaktor består av tre komponenter: en master mold å støpe PDMS innlegg; en ramme for å holde to PDMS rack av innlegg; og en svart polytetrafluoretylen bunnplante som inneholder seks brønner for vevet mix (Figure 3A). Hele vevet byggeprosessen utføres på is og i aseptiske betingelser. Etter tilsetning av de flytende celle-matriks-blandinger til brønnene i grunnplaten, er PDMS innleggene er festet til rammen polysulfon, og deretter snus opp ned slik at stolpene på linje med brønnene i linjalen (figur 3B). Etter 48 timers inkubasjon, bør vevene være tilstrekkelig komprimert at grunnplaten kan fjernes. Grunnplaten er lettest frittliggende ved å trekke ut hele systemet fra media og forsiktig fjerne overflødig utskriftsmateriale fra mellom PDMS og bunnplate. Hvis alle mediene ikke er fjernet, kan overflatespenningen av de gjenværende væske trekke vevet utenfor stolpene. Når media er fjernet, skyv fotplaten tilbake mot PDMS innlegg for å hjelpe løsne vev fra platen. Deretter gradvis presse bunnplate av ved forsiktig å flytte en side opp et par millimeter, deretter den andre siden opp samme beløp. Gjenta denne prosessen til BAseplate er fjernet, med alle 6 hECTs knyttet til sine respektive PDMS slutt innlegg (Figur 4A). Fjerne bunnplate bør ikke ta mer enn ett minutt. Erstatte systemet inn i cellekulturmedier, invertert, slik at alle vev dekkes av cellekulturmedier.

Omtrent en dag etter å ha fjernet bunnplaten, bør svake lokaliserte sammentrekninger kunne observeres i de definerte hECTs henhold lyse felt mikroskopi. Etter 7 dager er vevet modnet og komprimeres (figur 4B-C) med fluktende sarcomeres (Figur 4D). Vev synlig avlede PDMS innleggene med et gjennomsnitt på 5-15 μN av kraft (figur 4E). Twitch kraft målinger for de definerte utviklet hjertevevet kan måles ved sanntids sporing av innlegget spissen utslag med en høyhastighets kamera og tilpassede datainnsamling programvare, og bruke innlegget nedbøyning å stråle bøying teori etter å bestemmeYoungs modul av silikon innleggene ved hjelp av en kraft transduser, som forklart i mer detalj tidligere. 1,7 opprettholde sterilitet under innhentning av data sørger for evnen til å måle endringer i vev funksjon over tid. Vi har opprettholdt funksjonelle vev i flere uker, som forklart i mer detalj et annet sted en. Våre foreløpige funn tyder på en betydelig forbedring av hect sammentrekningskraft når vev er supplert med 10% menneskelige stamceller både en Hz og 2 Hz pace frekvenser (Figur 4F).

Figur 1
Figur 1: Representative bilder av H7 hESCs under ekspansjon og hjerte differensiering prosessen. Ekspansjonsfasen bør vare i 4 dager, med vekst av koloniene utvide fra 24 (A) til 48 (B), 72 (C- (D). Etter 96 timer av vekst differensiering er begynt, hvilket resulterer i betydelig celledød i løpet av første 48 timer av CHIR99021 behandling (E). Etter to dager med IWR-1-behandling, skjer omstilling (F) for å danne grupper av celler som slår så tidlig som dag 7. Ytterligere organisering til en robust slå "web" forekommer fra dag 7 til dag 20, da monolagene blir dissosiert for skape konstruerte hjertevevet.

Video Figur 1:. Representant hjertestans enkeltlag etter 17 dager med differensiering . Klikk her for å se denne videoen Spontan juling i monolaget er vanligvis først observert mellom dag 7 og dag 10, og etter 17 dager med differensiering monolaget har dannet sammenhengende "webs "som slo robust.

Navn sammensetning Differensiering dager brukt
Differensiering i media Jeg RPMI 1640
B27 Supplement (minus insulin)
Penicillin-Streptomycin
D0-D1 (med CHIR99021)
D2
D3-D5 (med IWR-1)
D5-D7
Differensiering Media II RPMI 1640
B27 Supplement (med insulin)
Penicillin-Streptomycin
D7-D20

Tabell 1: Sammensetning av differensiering Medias.

Figur 2
Figur 2: Representant levende celle sorteringing resultater To prøver ble fremstilt:. et unstained kontroll og en farget kontroll under anvendelse av 1: 500 fortynning av SIRPα-PE / Cy7 antistoff og 1: 250 fortynning av CD90-FITC antistoff. Etter farging ble cellene sortert ved 20 psi i sortering buffer bestående av PBS, 10% nyfødt bovint serum, 10 uM inhibitor ROCK Y-27632, og 1 ug / ml DAPI. Begge cellepopulasjoner ble gated i forover- og sidesprednings profiler for å utelukke smuss (A, blå linje) så enkle celler ble valgt ved å sammenligne pulsbredde og høyde (pulsbredde analyse) i både forover spredning (B, blå linje) og side scatter kanaler (C, blå linje). Deretter ble levende celler valgt av gating DAPI - befolkningen (D, blå linje). De endelige cellepopulasjoner for innsamling ble bestemt ved å undersøke FITC og PE-Cy7 uttrykk nivåer av levende populasjoner. De ufargede kontroll (E, venstre) ble anvendt for åetablere den riktige porten for å velge for FITC + (CD90) og SIRPα-PE / Cy7 + (kardiomyocytt) befolkningen til stede i farget prøven (E, høyre). FITC og SIRPα-PE / Cy7 + poplations ble samlet inn i separate 15 ml sentrifugerør.

Figur 3
Fig. 3: Skjematisk fremstilling av multi-vev bioreaktor og hjertevevet engineering prosessen Konstruksjon av fler vev bioreaktor krever tre komponenter (A): 1) en polytetrafluoretylen hovedform 9 x 33 x 5 mm 3, med 6 jevnt fordelte hull 0,5 mm i diameter; 2) en 25 x 35 x 11 mm 3 polysulfon ramme for å holde de PDMS innlegg under vev konstruksjon og kultur; og 3) en 20 x 40 x 5 mm 3 sort polytetrafluoretylen bunnplate med 6 brønner med 6 x 1 x 1 mm tre dimensjoner, spasert 4 mm avstand fra hverandre langs sin lengde. For å lage menneskelige utviklet hjertevevet (B), er PDMS innlegg fabrikkert av PDMS myk litografi ved hjelp av polytetrafluoretylen mester mold, hvorav to er så presset på kategoriene i polysulfon ramme for å danne 6 par force-sensing cantilever innlegg. Vevet oppløsningen blir pipettert inn i brønnene i den sorte polytetrafluoretylen platen. Rammen og innleggene blir så snudd og justert på polytetrafluoretylen sokkelen slik at ett par av innleggene kommer hver brønn som inneholder vev mix. Etter 48 timer, er det bunnplate fjernet og de definerte vev er dyrket på innleggene, rester invertert i NBS media.

Figur 4
Figur 4:. Representative bilder og funksjonelle måling av definerte menneske utviklet hjertevevet Den multi-vev bioreacteller system har seks vev i parallelle (A, pilspisser). Definerte vev er selv-montert innen syv dager etter vev skapelse (sett ovenfra, B og skrå fra siden, C). (D). Del av en definert hect farget for hjerte troponin-T (cTnT). (E) Representant rykk sporing viser rå kraft over tid i løpet av en Hz pacing av elektrisk felt stimulering. (F) nappe tracing i løpet av stimuleringen ved 1 Hz (0-2 sekunder) og 2 Hz (2-4 sek) pacing, med pilmarkeringen endring i frekvens, for begge usupplert definerte hECTs (heltrukket linje) og vev supplert med 10% hMSCs (stiplet linje).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bygging av definerte menneske konstruerte kardiale vev (hect) kan gi en mer konsistent og pålitelig modell av menneskelig hjerte myocyte funksjon. Kritisk, blir alle cellulære og ekstracellulære komponenter i det system som er kjent og kan manipuleres etter ønske, og dermed fjerne den forvirrende innvirkning av andre ukjente celletyper som følge av differensieringsprosessen. For å balansere rask cellevekst og høyt utbytte, er det foretrukket at differensieringen starter ved 75% konfluens av de hESCs, helst fire dager etter plettering. I tillegg er bruken av ROCK-inhibitor Y-27632 både under celledissosiasjon og reaggregering etter sortering forbedrer cellelevedyktighet. Tilstedeværelsen av spontan juling av muskelceller under differensiering prosessen er en viktig indikator på effektivitet og helsen til differensiering. Hvis spontan juling ikke overholdes kan dette tyde på dårlig differensiering effektivitet, enten på grunn av ineffektiv reagenser eller et tapav pluripotency av stamceller.

Under vev konstruksjon, må de PDMS innlegg justert riktig med kanalene i linjalen for å skape godt dannet vev som varer lenge nok til å måle kontraktile funksjon. For å forbedre den enkle enheten innretting, og styrke vev dannelse rundt innleggene der de er utsatt for brytende, er det mulig å legge til ekstra bredde (ca. en stolpe diameter på hver side av stolpen) til endene av kanalene, som demonstrert av "hundeben" -formet kanaler i figur 3A. Uten riktig enhet justering vevet vil enten løsne fra innleggene kort tid etter kultur, eller vil forbli i brønnen når bunnplaten er fjernet. Hvis en velformet vev faller av under bunnplate fjerning, er det mulig å forsiktig feste vev til innlegg ved hjelp av fin pinsett under et dissekere mikroskop, selv om det er lett å skade den skjøre hECTs hvis tilstrekkelig omsorg er ikke tatt. </ P>

En stor styrke av det beskrevne definert system er evnen til å avhøre bidraget fra direkte celle-celleinteraksjons mekanismer hos hjertecelleterapi basert på spesifikk kontroll av cellesammensetningen. Injeksjon av celler hos dyr er upresis og underlagt lav levedyktighet og oppbevaring 33. I tillegg er virkningen av de injiserte cellene på målvevet kompliseres ved interaksjoner med andre fysiologiske systemer, så som immunsystemet. Som sådan, forstå bidraget fra direkte celle-celle interaksjoner i hjertecelleterapi er utfordrende å håndtere i modellorganismer. Derfor er en fordel for den beskrevne metoden er at celle-celle-interaksjoner er analysert i en biomimetisk tredimensjonalt miljø, bevare sentrale deler av hjerte nisje, og i nærvær av de spesifikke celletyper av interesse - nemlig hjertemuskelceller og fibroblaster. Nytten av å bruke den definerte hect systemet er demonstrrerte med tilskudd av 10% hMSCs avledet fra humant marg 34,35 og brukt i kliniske studier til celleblandingen under vev skapelse. De vev som ble supplert med hMSCs utstilt større sammentrekningskraft enn de usupplerte definerte menneskelig vev (Figur 4F). Ettersom vevet miljø og sammensetningen er kontrollert, forbedring av vevsfunksjon med MSC supplemente skyldes en iboende virkning av hMSCs på kardiomyocytt funksjon. En annen styrke til systemet er at siden vev er mindre enn tidligere anvendt, er 1,7 celle bruk mer effektiv, en viktig faktor ved bruk av rettede differensiering av pluripotente stamceller som cellekilde.

Utover å studere mekanismer for celleterapi, ville det definerte hect systemet aktivere undersøkelse av mobilnettet grunnlag av kardiovaskulære celle-celle interaksjoner. Forstyrrelse av biologi av cellene før vev construction, for eksempel med shRNAs, ville tillate undersøkelse av molekylære mekanismer som styrer celle-celle og celle-matriks-interaksjoner. En ytterligere fordel til vevet engineering system er dannelsen av innrettede myofibrils stand til funksjonelle sammentrekninger. Således, ved å bruke den definerte hect system, dynamikken i myofibril dannelse, kardiomyocytt utvikling og organisering av vev arkitektur kan alle bli undersøkt via modifikasjon av komponentene i den ekstracellulære matriks eller molekylær manipulering av cellene. Den menneskelige og 3-D natur hect system i tillegg øker translatability av funnene.

Mens det beskrevne systemet tilbyr en kraftig metode for å forstå grunnleggende spørsmål om hjerte- og biologi, er det ikke uten begrensninger. Først utviklet vev viser en umoden fenotype, i samsvar med publiserte rykk force data fra nyfødte hjerteinfarkt prøver 7. Mensfenotypiske umodenhet kan være en konfunderende faktor i å vurdere celleinteraksjonsmekanismer, er det bevis for at syke cardiomyocytes gå tilbake til en foster gen program 7,36-38. Dersom funn fra hect systemet viser seg å være relevant i forbindelse med et sviktende hjerte, kan dette være en fordel for å teste hjerte terapi. Protokollen bruker også en hESC kvalifisert basalmembran matrix under vev konstruksjon. Sammensetningen av denne matrisen kan variere fra parti til parti, og samtidig definerte kjeller matrise alternativer er tilgjengelige de har ennå å bli vurdert i sammenheng med hECTs.

Andre begrensninger omfatter mangel på en karsystemet og ingen systemer-nivå samspilleffekter. Gitt størrelsen på vev, er metabolske krav oppfylles ved diffusjon alene slik at ingen vaskulære system er nødvendig for å sikre at cellenes levedyktighet. Imidlertid kan endotelial cellesignalisering være en viktig faktor i spesifikke celleterapi. Dersom dette er tilfelle, et bestemt antall endothelial celler kan ganske enkelt tilsettes til det definerte celleblandingen i løpet av vev konstruksjon. Mens systemer nivå samhandling er viktig for fullstendig forståelse av cellemekanismer, tilbyr konstruert vevsystem en reduksjonistisk tilnærming for å forenkle problemet for å løse mekanismen systematisk. Kompleksiteten kan tilsettes til det definerte vev systemet etter behov gjennom innføring av systemmessige effekter, slik som leukocytter for å innlemme en immunrespons, eller ved tilsetning av nabo vevstyper å avhøre parakrin signalering.

Som en undersøkende verktøy, det definerte menneskelig konstruert hjertevev systemet tilbyr fordelene av artsspesifikke menneskelige celler, en biomimetic 3-D kultur miljø med kontrollert biologiske mangfoldet, grei og langsgående overvåking av kontraktile funksjon, og en definert cellulære og matrise sammensetning. Fremtidige retninger for hect systemet inkluderer manipulere den terapeutiske celle type interesse viddh siRNA eller shRNA før innføring i vevet for å undersøke bestemte molekylære detaljer om celle-celleinteraksjon. I tillegg, i stedet for å bruke hESCs for å danne de kardiale celler, er det mulig å anvende induserte pluripotente stamceller (iPSCs) fra pasienter med en arvelig mutasjon i et forsøk på å modellere i forbindelse hjertesykdomsmanifestasjoner i utviklet vev. Dermed lover vår metode for å skape menneskelig konstruert hjertevevet med definerte cellepopulasjoner for å åpne nye veier for å studere hjerte cellen terapi for å bidra til å akselerere utviklingen av nye behandlingsmetoder for pasienter med hjertesykdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av NIH (1F30HL118923-01A1) til TJC, NIH / NHLBI PEN kontrakt HHSN268201000045C til KDC, forskningsstipend rådet av Hong Kong TRS T13-706 / 11 (KDC), NIH (R01 HL113499) til BDG, den amerikanske heart Association (12PRE12060254) til RJ, og stipend Norges HKSAR (TBRS, T13-706 / 11) til RL Ytterligere midler ble gitt til TJC ved NIH DRB 5T32GM008553-18 og som en traineestilling på NIDCR-Tverrfaglig opplæring i systemer og Utviklings Biologi og fødselsskader T32HD075735. Forfatterne ønsker også å takknemlig erkjenne Arthur Autz på The Zahn Center of The City College of New York for å få hjelp med maskinering bioreaktor og Mamdouh Eldaly for teknisk assistanse. Vi takker også Dr. Kenneth Boheler for råd om hjerte differensiering, og Dr. Joshua Hare for sjenerøst gi menneskelige stamceller.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Culture Company Catalog Number Comments
Amphotericin B Sigma-Aldrich A2411 Prepare a 2.5 mg/ml stock in DMSO and filter-sterilize
B27 with Insulin Life Technologies 17505055
B27 without Insulin Life Technologies A1895601
CHIR99021 Stemgent 04-0004 Create 6 μM stock, then aliquot and store at -20 °C.
Essential 8 Media Life Technologies A1517001
H7 Human Embryonic Stem Cells WiCell WA07
hESC Qualified Matrix, Corning Matrigel Corning 354277 Thaw on ice at 4 °C overnight then aliquot 150 μl into separate tubes and store at -20 °C.
IWR-1 Sigma-Aldrich I0161 Create 10 mM stock and aliquot. Store at -20 °C
Neonatal Calf Serum Life Technologies 16010159
Non-enzymatic Dissociation Reagent: Gentle Cell Dissociation Reagent Stem Cell Technologies 7174
Penicillin-Streptomycin Corning 30-002-CI
RPMI 1640 Life Technologies 11875-093 Keep refrigerated
Y-27632 (ROCK Inhibitor) Stemgent 04-0012 Resuspend to a 10 mM stock concentration, aliquot and store at -20 °C. Avoid freeze thaw cycles.
Cell Sorting Company Catalog Number Comments
4’,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) Life Technologies D1306
CD90-FITC BioLegend 328107
Enzymatic Dissociation Reagent: Cell Detach Kit I (0.04 % Trypsin/ 0.03% EDTA, Trypsin neutralization solution and Hanks Buffered Salt Solution)  PromoCell C-41200
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologics S11250
SIRPα-PE/Cy7 BioLegend 323807
Tissue Construction Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin/0.1% EDTA Fisher Scientific 25-053-CI Optional: For collection of supplemental cells of interest
10x MEM Sigma-Aldrich M0275-100ML
10x PBS Packets Sigma-Aldrich P3813
Collagen, Bovine Type I Life Technologies A10644-01 Keep on ice
DMEM/F12 Life Technologies 11330057
Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM), High Glucose Sigma-Aldrich D5648
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning Sylgard 184
Sodium HEPES Sigma-Aldrich H3784
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich 221465
Materials Company Catalog Number Comments
1.5 ml microcentrifuge tubes Fisher Scientific NC0536757
15 ml polyproylene centrifuge tube Corning 352096
5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube Corning 352235 With integrated 35 μm cell strainer
50 ml polyproylene centrifuge tube Corning 352070
6-well flat bottom tissue-culture treated plate Corning 353046
Cell Scraper, Disposable Biologix 70-2180
Polysulfone McMaster-Carr
Polytetrafluoroethylene (Teflon) McMaster-Carr
Equipment Company Catalog Number Comments
Dissecting Microscope Olympus SZ-61 Or similar, must have a mount for the high speed camera to attach
Electrical Pacing System Astro-Med, Inc Grass S88X Stimulator
High Speed Camera Pixelink PL-B741U Or similar, but must be capable of 100 frames per second for accurate data acquisition
Plate Temperature Control Used to maintain media temperature during data acqusition.
Custom Materials Company Catalog Number Comments
LabView Post-tracking Program available upon request from the authors

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Serrao, G. W., et al. Myocyte-depleted engineered cardiac tissues support therapeutic potential of mesenchymal stem cells. Tissue Eng. Part A. 18, (13-14), 1322-1333 (2012).
  2. Hansen, A., et al. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. Circ. Res. 107, (1), 35-44 (2010).
  3. Fink, C., Ergün, S., Kralisch, D., Remmers, U., Weil, J., Eschenhagen, T. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. FASEB J. 14, (5), 669-679 (2000).
  4. Yildirim, Y., et al. Development of a biological ventricular assist device: preliminary data from a small animal model. Circulation. 116, Suppl 11. 16-23 (2007).
  5. Sekine, H., et al. Cardiac Cell Sheet Transplantation Improves Damaged Heart Function via Superior Cell Survival in Comparison with Dissociated Cell Injection. Tissue Eng. Part A. 17, (23-24), 2973-2980 (2011).
  6. Lesman, A., et al. Transplantation of a tissue-engineered human vascularized cardiac muscle. Tissue Eng. Part A. 16, (1), 115-125 (2010).
  7. Turnbull, I. C., et al. Advancing functional engineered cardiac tissues toward a preclinical model of human myocardium. FASEB J. 28, (2), 644-654 (2014).
  8. Thavandiran, N., Dubois, N., et al. Design and formulation of functional pluripotent stem cell-derived cardiac microtissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, (49), 4698-4707 (2013).
  9. Schaaf, S., et al. Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology. PloS One. 6, (10), e26397 (2011).
  10. Tulloch, N. L., et al. Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture. Circ. Res. 109, (1), 47-59 (2011).
  11. Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 10, (8), 781-787 (2013).
  12. Ma, Z., et al. Three-dimensional filamentous human diseased cardiac tissue model. Biomaterials. 35, (5), 1367-1377 (2014).
  13. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J. Cell Sci. 125, (13), 3015-3024 (2012).
  14. Pontes Soares, C., Midlej, V., de Oliveira, M. E. W., Benchimol, M., Costa, M. L., Mermelstein, C. 2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression. PloS One. 7, (5), e38147 (2012).
  15. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of De Novo Cardiomyocytes: Human Pluripotent Stem Cell Differentiation and Direct Reprogramming. Cell Stem Cell. 10, (1), 16-28 (2012).
  16. Mummery, C. L., Zhang, J., Ng, E. S., Elliott, D. A., Elefanty, A. G., Kamp, T. J. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ. Res. 111, (3), 344-358 (2012).
  17. Kim, C., et al. Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation. Stem Cells Dev. 19, (6), 783-795 (2010).
  18. Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnol. 29, (11), 1011-1018 (2011).
  19. Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers. J. Mol. Cell. Cardiol. 42, (5), 991-1000 (2007).
  20. Gago-Lopez, N., et al. THY-1 receptor expression differentiates cardiosphere-derived cells with divergent cardiogenic differentiation potential. Stem Cell Reports. 2, (5), 576-591 (2014).
  21. Hare, J. M., Traverse, J. H., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled, dose-escalation study of intravenous adult human mesenchymal stem cells (prochymal) after acute myocardial infarction. J. Am. Coll. Cardiol. 54, (24), 2277-2286 (2009).
  22. Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet. 378, (9806), 1847-1857 (2011).
  23. Wollert, K. C., et al. Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomised controlled clinical trial. Lancet. 364, (9429), 141-148 (2004).
  24. Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of autologous mononuclear bone marrow cells or peripheral mononuclear blood cells after primary percutaneous coronary intervention: rationale and design of the HEBE trial--a prospective, multicenter, randomized trial. Am. Heart. J. 152, (3), 434-441 (2006).
  25. Jeevanantham, V., Butler, M., Saad, A., Abdel-Latif, A., Zuba-Surma, E. K., Dawn, B. Adult bone marrow cell therapy improves survival and induces long-term improvement in cardiac parameters: a systematic review and meta-analysis. Circulation. 126, (5), 551-568 (2012).
  26. Meyer, G. P., et al. Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction: 5-year follow-up from the randomized-controlled BOOST trial. Eur. Heart J. 30, (24), 2978-2984 (2009).
  27. Meyer, G. P., et al. Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction: eighteen months' follow-up data from the randomized, controlled BOOST (BOne marrOw transfer to enhance ST-elevation infarct regeneration) trial. Circulation. 113, (10), 1287-1294 (2006).
  28. Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of mononuclear cells from bone marrow or peripheral blood compared with standard therapy in patients after acute myocardial infarction treated by primary percutaneous coronary intervention: results of the randomized controlled HEBE trial. Eur. Heart J. 32, (14), 1736-1747 (2011).
  29. Simari, R. D., et al. Bone marrow mononuclear cell therapy for acute myocardial infarction: a perspective from the cardiovascular cell therapy research network. Circ. Res. 114, (10), 1564-1568 (2014).
  30. Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. J. Vis. Exp. (91), e52010 (2014).
  31. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, (27), 1848-1857 (2012).
  32. Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PloS One. 6, (4), e18293 (2011).
  33. Kean, T. J., Lin, P., Caplan, A. I., Dennis, J. E. MSCs: Delivery Routes and Engraftment, Cell-Targeting Strategies, and Immune Modulation. Stem Cells Int. 732742 (2013).
  34. Trachtenberg, B., et al. Rationale and design of the Transendocardial Injection of Autologous Human Cells (bone marrow or mesenchymal) in Chronic Ischemic Left Ventricular Dysfunction and Heart Failure Secondary to Myocardial Infarction (TAC-HFT) trial: A randomized, double-blind, placebo-controlled study of safety and efficacy. Am. Heart J. 161, (3), 487-493 (2011).
  35. Williams, A. R., et al. Intramyocardial stem cell injection in patients with ischemic cardiomyopathy: functional recovery and reverse remodeling. Circ. Res. 108, (7), 792-796 (2011).
  36. Razeghi, P., Young, M. E., Alcorn, J. L., Moravec, C. S., Frazier, O. H., Taegtmeyer, H. Metabolic gene expression in fetal and failing human heart. Circulation. 104, (24), 2923-2931 (2001).
  37. Rajabi, M., Kassiotis, C., Razeghi, P., Taegtmeyer, H. Return to the fetal gene program protects the stressed heart: a strong hypothesis. Heart Fail. Rev. 12, (3-4), 331-343 (2007).
  38. Taegtmeyer, H., Sen, S., Vela, D. Return to the fetal gene program: a suggested metabolic link to gene expression in the heart. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1188, 191-198 (2010).
Bygging av Definert menneske Engineered Hjerte Vev å studere mekanismer Cardiac Cell Therapy
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cashman, T. J., Josowitz, R., Gelb, B. D., Li, R. A., Dubois, N. C., Costa, K. D. Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy. J. Vis. Exp. (109), e53447, doi:10.3791/53447 (2016).More

Cashman, T. J., Josowitz, R., Gelb, B. D., Li, R. A., Dubois, N. C., Costa, K. D. Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy. J. Vis. Exp. (109), e53447, doi:10.3791/53447 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter