Introduction
Aktive Flow Technology Columns
Active flyt teknologi (AFT) kromatografikolonner ble nylig utviklet for å overvinne ineffektivitet i separasjoner forbundet med flyt heterogenitet 1-6, og også for å muliggjøre multiplexed deteksjon. I denne spesielle kommunikasjonen vi detalj den operative fremgangsmåte for parallell segmentert strømmen (PSF) kolonne med multiplekset deteksjons. De viktigste funksjonelle fordelene med PSF kolonnen er: (1) strømmen fra den radiale midtområdet av kolonnelaget er isolert fra det perifere eller veggområdet av strøm, (2) volumet av mobil fase som må behandles av en deteksjons kilde er redusert, og (3) påvisning kilder kan bli multiplekset for å utvide utvalget informasjon uten instilling forsinkelser deteksjons over hver deteksjonsprosessen, eller etter nødvendiggjør splitting av et innlegg kolonne strømning 7,8. Det sentrale trekk ved utformingen av PSF kolonnen som gjør det mulig for endvantage av multiplekset deteksjons er det nye uttaket montering og frit montering. Figur 1 er et fotografi av AFT kolonnen sammenlignet med en konvensjonell kolonne. Det er viktig å forstå at kløyving oppnådd ved anvendelse av parallelle segmenterte strømnings kolonner er ikke det samme som post-kolonne strømning splitting. I et innlegg kolonne strømmen splittes hele prøven båndet fra den ledende kanten til endene av halen blir samplet likt (dvs. aksialt), derved, er lik med hensyn til effektivitet og følsomhet hver strømningsstrøm; størrelsen av den følsomhet derved dividert med antall delinger. I PSF imidlertid kløyving prøvene bandet radialt, ikke aksialt. Som sådan, den sentrale port prøvene toppen apex - den mest konsentrerte delen av toppen. Således er den høyeste følsomhet her som toppen ikke er fortynnet med diffuse tailing regionen. Prøven eluering fra de perifere portene er ikke så effektiv som i central sone, men, ettersom båndet blir samplet radialt, i stedet for aksialt, er bredden av toppen smalere enn det som ville være tilfelle for en samplingsprosess som skiller toppen i aksial retning, dvs. en delt post-kolonne. Derav følsomhet med en konsentrasjonsavhengig detektoren ikke er redusert.
I PSF kolonnen, omfatter utløps montering av flere utløpsåpninger, og på innsiden av denne endefestet er det plassert en ringformet frit. Den indre del av dette ringformede kanaler frit strømme ut av søylen via den radiale sentrale utløpsporten, mens den ytre radiale del av utløpskanaler frit strømme ut av kolonnen gjennom det perifere eller veggregioner utlØps-strømningsåpninger. De indre og ytre partier av utløps fritten er atskilt med en ugjennomtrengelig barriere som hindrer cross flow mellom disse strømnings regionene 2. Som en konsekvens av denne konstruksjon den sentrale radialstrømningsforløp gjennom kolonnelaget er adskilt fra veggområdet strømnings inside kolonnen. Den relative andel av strømningen fra disse to regionene kan varieres på nesten hvilken som helst ønsket forhold ved trykkstyring for å optimalisere ulike funksjonelle aspekter teknologi av kolonne, slik som separasjonseffektiviteten eller deteksjonsfølsomhet. I hovedsak dette designet som etablerer effektivt i større format kolonne et "virtuelt" kolonnen, som har en smalere innvendig diameter, og dermed fungerer kolonnen som en sann vegg mindre kolonnen, overvinne kolonne seng heterogenitet og vegg effekter 9,10.
De største fordelene med PSF kolonner er forbedringer i kolonne effektivitet, minimering av løsningsmidlet behandling for påvisning kilden (e) og muliggjør multiplekset deteksjons. Det er imidlertid en fordel at siden tailing og fron regionene i alle bånd er fjernet fra den totale elueringsprofilen oppløst stoff ved eluering eller deteksjon er tilstede i en høyere konsentrasjon enn det som ellers ville bli observert for de samme sforankrede injeksjon og konsentrasjonen belastning på en konvensjonell kolonne, avhengig av segmenterforholdet som anvendes. Som en konsekvens er det ofte observeres en gevinst i signalintensitet for separasjoner utført på PSF kolonnene 2. Faktisk, hvis segmenter forholdet er justert slik at 25% av strømnings utganger fra hver av de fire utløpsåpninger, signalintensiteten som er observert ved bruk av ultrafiolett (UV) deteksjon viser praktisk talt den samme signalintensiteten som det fremgår ved hjelp av en konvensjonell kolonne hvor hele (100%) av den mobile fase analyseres 7. Videre finjustering av utløps forholdet mellom de sentrale og veggstrømnings regioner kan effektiviteten av kolonnen som skal optimaliseres. Gevinsten i kolonne effektivitet observert ved anvendelse av AFT kolonner kan ikke angis til en enkelt verdi, siden disse effektivitetsgevinster er en funksjon av tre faktorer: (1) strømningshastigheten, (2) segmenterforhold, og (3) det oppløste retensjonsfaktor . Likevel, effektivitetsgevinster i forhold til conventional kolonner er nesten alltid overholdes, og noen ganger disse gevinstene er mer enn 100% i antall teoretiske plater 1,2. Evnen til å justere forholdet segmentering kan analytikeren for effektivt å skreddersy diameteren av "virtuell" kolonne, og dette er en viktig faktor i forhold til deteksjonsprosessen. For eksempel er en virtuell 2,1 mm innvendig diameter (id) kolonne etablert fra en fysisk 4,6 mm id kolonne når segmenterforholdet er 21% av mobil fase eluering fra det sentrale radiale utløpsåpningen. Under disse betingelser, utfører den virtuelle 2,1 mm id kolonne med en effektivitet som kan være mer enn 70% større enn den konvensjonelle 2,1 mm id kolonne, avhengig av strømningshastigheten, og oppløst stoff retensjonsfaktor 10.
Den nåværende PSF kolonne design som brukes for multiplekset deteksjon omfatter en fire-port utløpsfittings, men kan kolonnen være utstyrt med en to-port ende-fitting også begrenser imidlertid dette deteksjons to bare to detektorer. Den grunnleggende drift av disse kolonnene er imidlertid den samme, bortsett fra at fire detektorer kan kobles samtidig til de fire-port utløp PSF kolonne utvide omfanget for multiplekset deteksjon. Bortsett fra pre- og post-kolonne binde rør, er de eneste ytterligere krav for å drive en PSF kolonne rør som kan kobles til de perifere utløpsporter, og en anordning ved hjelp av hvilken mengden av mobil fase passerer gjennom hvert rør kan måles, vanligvis enten en massemåling eller en volumetrisk måling. For enkel justering, bør den innvendige diameter av alle utløpsstrømningsrøret være den samme. Strømningsforholdet mellom det perifere og radiale sentrale utgangsåpningene blir så varieres ved hjelp av trykkstyring, ganske enkelt ved å endre lengden av røret som ligger på den perifere utløps montering, eller lengden av slangen post detektor på den radiale sentrale utløpsporten.
Multiplex Detection Bruke PSF Columns
En viktig fordel med PSF søyler er at hver av utløpsutgangsåpningene kan kobles direkte til en deteksjonskilde, og dermed gjør multiplekset deteksjons. I en godt designet detection system en enkelt analyse med multiplex deteksjon kan gi betydelig informasjon i forhold til naturen av komponentene i prøven. Viktigere, kan destruktive og ikke-destruktive undersøkelser utføres på nøyaktig samme tid, uten påvisning forsinkelse. Dette tillater den absolutte tildelingen av, for eksempel, anti-oksidanter ved hjelp av DPPH • reagens, med komponenter observert å eluere med UV og / eller massespektrometri (MS) deteksjon responser 7,11. Derfor kan fire uavhengige detektorer brukes samtidig med passende deler av strømmen som ledes til hver detektor via en hvilken som helst av de fire utløpsåpninger. Siden strømningen gjennom disse porter kan lett justeres mengden av oppløst stoff å nå en hvilken som helst av detektorene kan justeres for å passefølsomheten for en gitt kilde-detektor. Det bør imidlertid bemerkes, at den mest effektive oppløste stoffet migrasjon er observert gjennom den radielle sentrale utløpsporten. Hver av de perifere porter har tilsvarende separasjonseffektivitet, som når den er satt til 25% gjennom hver port, er bare litt mindre effektivt enn en konvensjonell kolonne. Som sådan, er det viktig at den kvantitative detektoren innstilles for å analysere prøven fra det sentrale radiale utløpsåpningen.
Ved å sette opp en PSF kolonne i den hensikt å multipleksing deteksjon er det en rekke hensyn som må gjøres for å oppnå en effektiv og høy kvalitet resultater; som er rørdimensjoner for hver port, valg av hvilken port for en type detektor og justering flyt.
Rørdimensjoner for hver port
I kromatografi lengden post kolonne rør av spiller en avgjørende rolle i effektiviteten og ytelsen til separasjon. Stor dead-volum som et resultat av langt eller bredt id slangen fra kolonne utløp til detektoren vil resultere i et tap av effektivitet, oppløsning og følsomhet. Dermed må passende slangedimensjoner benyttes når du setter opp PSF kolonne for å oppnå den maksimale potensial i å tilby effektiv separasjon samtidig gi fordelene av multipleksing.
Port til Detector
Figur 2 er en illustrasjon av et eksempel på oppsett av multiplekset deteksjons (Ultra-Violet Synlig (U-Vis), massespektrometer (MS) og 2,2-difenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH •) deteksjon). Illustrasjonen viser den sentrale porten er festet til MS-detektor, mens DPPH • og UV-Vis-detektorene er koblet til de perifere porter. Siden MS er den mest følsomme detektor av de tre, flyte til denne detektoren var rettet fra den sentrale utløpsporten. Som DPPH • påvisning er selektiv til presence av antioksidanter, og den minst følsomme og mest tolerante overfor båndet utvidelse, flyte til denne detektoren ble rettet fra en perifer port. UV-Vis var et sekundært "generisk" detektor, så flyte til denne detektoren ble rettet fra en andre perifer port.
Flow Adjustment
Når den aktuelle produksjonsrøret har blitt koblet fra en havn til detektoren, kan den utgående strømning fra hver av detektorene bli justert til den nødvendige mengde. En enkel måte å måle mengden av strømning som kommer ut fra hver detektor er å veie mengden av mobil fase som elueres gjennom hver port over en gitt tidsperiode. Den prosentvise strømningen kan således bestemmes, og strømforhold kan justeres ved enten å forkorte eller forlenge slangen er festet til utløpsledningen på detektorene tilsvarende for å dekke kravene til detektorene valg. Forskjellige detektorer har forskjellige krav til strømning, for eksempel strømmen av celleer ikke en fluorescens-detektor (FLD) strømningshastighet begrenset, men forsiktighet må utvises for å unngå overtrykk i strømningscellen. Derav kontroll av strømningen gjennom FLD oppnås vanligvis ved å justere trykkfallet over de øvrige detektorer, og resten av strømmen går deretter gjennom den FLD. En detektor som er følsom for strømningsmengden som leveres er MS. Vanligvis kan dagens høye end massespektrometre lett behandle omkring 1 til 1,5 ml / min av moderat vandig mobil fase. Over denne strømningshastighet, kan oversvømmelse av kilden gjør MS ubrukelig. Imidlertid er følsomhet i de fleste massespektrometre dratt nytte av å bruke lavere strømningsrater; derav PSF strømnings splitting evner er svært nyttig for applikasjoner som involverer MS deteksjon. Høy kolonne volumetriske strømningshastigheter kan benyttes, men med lavt volum masse transportert til MS-detektoren. Justering av strømningen til MS detektoren, må imidlertid gjøres ved å justere trykkfallet førMS-detektor i stedet for post MS. Her, er bruken av smale utboring rør (0,1 mm ID) meget nyttig, ettersom trykket lett kan justeres uten å tilsette upassende dødvolum.
Avhengig av typen av detektor justering av segmenterforholdet kan gjøres enten før eller etter detektoren. Hvis en ikke-destruktiv detektor, slik som UV-Vis anvendes, vil strømningen måles i prosent og avstemt etter detektor. Hvis en enkelt destruktiv detektor benyttes i multipleks sette opp strømmen prosenten bestemmes ved beregning tilbake med hensyn til andre port strømnings prosenter. Hvis et reagens basert detektor blir brukt som DPPH • blir strømmen målt i prosent stolpe detektoren uten tilsetning av reagenset; og hvis to eller flere destruktive detektorer blir brukt, blir strømningsforholdet blir målt pre-detektor. Detection systemer som kan kreve ytterligere instrumentering, som DPPH • vil ha ekstra systemtrykk som kan endre strømningsprosent gang koblet til deteksjonssystemet. Derfor bør nøye overveielse bli utbetalt til systemtrykk på en destruktiv detektor, når du justerer flyt prosent pre-detektor. Uavhengig av strømningsforholdet som er definert ved en hvilken som helst av portene, bør kvantitativ informasjon innhentes gjennom passende standardisering. Når strømforhold er angitt, men de er robuste, og de endrer ikke selv under gradienteluering betingelser 7,
Den detaljerte video protokollen følger dette manuskriptet er ment å vise hvordan en fungerende PSF kolonne for å bruke og stille inn en multiplekset modus for gjenkjenning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: Denne protokollen inneholder instruksjoner om hvordan du bruker en PSF kolonne på en HPLC system kombinert med flere detektorer for multiplexed deteksjon. Protokollen er skrevet forutsatt at leseren har grunnleggende kunnskap og erfaring i kromatografi og ulike HPLC deteksjonsmetoder.
Forsiktig: Se sikkerhetsdatablad (HMS) for alle materialer og reagenser før bruk (dvs. datablad for metanol). Sørg for bruk av alle nødvendige sikkerhetsrutiner ved håndtering av løsemidler og High Performance væskekromatografi (HPLC) elueringsmiddel. Sikre riktig bruk av tekniske kontroller av HPLC, analytisk balanse og detektor instrumentering, og sikre bruk av personlig verneutstyr (vernebriller, hansker, frakk, full lengde bukser og lukket-toe sko).
1. Oppsett av HPLC Instrument
- Klargjør HPLC instrument med ultrarent vann (for eksempel 100% Milli-Q vann) for line A og 100% metanol i linje B som den mobile fase og rense pumpene som per produsentens kravet. Dersom en av detektorene som brukes er MS, som her, tilsett 0,1% maursyre til både mobile fasene A og B.
- Sett opp HPLC instrumentelle komponenter og detektorer som illustrert i figur 2. Dette krever praktiske plassering av detektorene i forhold til søylen for å minimalisere dødvolumet mellom detektor og kolonne. Fleksibilitet i HPLC-systemet konfigurasjonen er ønskelig.
2. Oppsett av UV-Vis og MS Detektorer
- Still UV-Vis-detektor til den ønskede bølgelengden avhengig av prøven av interesse (for eksempel 280 nm).
- Sett MS detektor i positiv modus for Total Ion Count (TIC) analyse ved hjelp av Full Scan påvisningsmetoden. Juster også følgende MS parametere tilsvarende fordampertemperatur: 500 ° C, kapillær temperatur 350 ° C, kappe gass satt ved en hastighet på 60 enheter, hjelpe gasstrømmen40 og feie gasstrøm på 5 enheter, og spray spenning 3,5 kV. Disse innstillingene kan justeres senere for spesifikke brukerkrav avhengig av prøven blir analysert.
3. Utarbeidelse av 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl Radical (DPPH •) Reagens Oppsett av DPPH • System Detector
- Vei 25 mg av DPPH • og oppløses i 250 ml metanol i en målekolbe.
- Tilsett 250 ul av maursyre til DPPH • reagens. Dekk kolben i folie for å hindre eksponering for lys.
- Sonikere kolbe som inneholdt den DPPH • reagensen i 10 minutter.
- Rense DPPH • pumpen med forberedt DPPH • reagent som per produsentens krav.
- Sett opp DPPH • systemet i henhold til figur 2 ved å feste pumpeledningen til innløpet til et T-stykke.
- Fest en 100 mL reaksjon spole til the utløpet av T-stykket, og feste den andre enden av reaksjons spolen til detektoren.
- Encase reaksjonen spiral i varmeapparatet en kolonne og kolonnen varmeapparat innstilt temperaturen til 60 ° C.
- Sett DPPH • UV-Vis detektor til 520 nm.
4. Oppsett av PSF Column
- Koble innløpet til PSF kolonnen til HPLC-instrumentet.
- Kople den sentrale porten til MS-detektor, ved hjelp av en 15 cm lengde av 0,13 mm ID-rør.
- Koble en ytre port på UV-Vis-detektor ved hjelp av en 15 cm lengde av 0,13 mm ID-rør.
- Koble en annen periferi port til T-stykke av DPPH • deteksjonssystemet ved hjelp av en 15 cm lengde av 0,13 mm ID-rør.
- Blokkere ubrukt perifere port stopperen en kolonne bruker.
- Bringe strømningshastigheten av HPLC-pumpen til 1 ml min -1 ved 100% etter linjen B - 100% Metanol (0,1% maursyre).
- Ekvilibrer kolonnen med 100% metanol mobil phase i 20 minutter for en 4,6 mm ID x 250 mm lengde kolonne. Denne gang er skalert i henhold til dimensjonene av andre kolonner kan brukeren benytter.
5. Tuning PSF kolonne for Multiplexed Detection
- Måle massen av minst to tomme oppsamlingsfartøy (en for porten er koblet til den UV-Vis detektor og en for DPPH • detektor) ved anvendelse av en analytisk vekt.
- Samle mobile fasen fra UV-Vis og DPPH • portene inn i to separate, forhånds veide innsamlingsfartøy (5.1). Spill tidsperioden for samlingen. Samle minst 500 mg av oppløsningsmidlet i hvert kar.
- Veie innsamlingsårene og bestemme massen av mobilfase. På grunn av tettheten av metanolen 0,791 g ml -1, bestemme volumet av mobil fase samlet opp fra hver enkelt port.
- Ved differanse, det vil si nominell pumpeaggregatet strømningshastighet minus strømningshastigheten gjennom DPPH • og UV-Vis Detector strømningsporter, bestemme strømningshastigheten til MS-detektor. Uttrykk andel hver strømnings som en prosentandel av den totale vannmengden.
Merk: Ideelt sett strømnings prosenter er: til MS er 18% av den totale strømningshastighet til den UV-Vis 22%, i den DPPH • detektoren 60%. - Hvis ikke, justere strømnings prosenter ved å endre mottrykket i UV-vis detektor. For eksempel, dersom strømningen til den UV-Vis er for høy, reduseres andelen ved tilsetning legge til en 15 cm seksjon av 0,13 mm id rør til utløpet av den UV-vis detektor. Gjenta deretter trinn 05.01 til 05.05.
6. Endelige Setup betingelser
- Innstille strømningsmengden av DPPH • reagensen pumpen til den samme strømningshastighet som kommer ut av utløpsåpningen som er koblet til DPPH • detektoren.
Merk: PSF kolonne multiplekset med UV-Vis, er DPPH • og MS nå klar for analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En multiplekset HPLC-analyse ble utført ved anvendelse av en AFT-kolonne i PSF modus (figur 1) og satt opp som vist i figur 2. Denne typen oppsett tillates en kaffe prøven som skal analyseres samtidig, ved hjelp av UV-Vis, DPPH • og MS i Total Ion Count (TIC) modus. Forbindelsene av kaffe prøven som svarte DPPH • kunne da være lett tilpasses til UV-Vis og MS - TIC responser basert på justeringen av retensjonstiden som illustrert i figur 3, siden kromatogrammene ble registrert samtidig. Dersom en positiv respons ble sett fra MS-TIC detektor, ble den molekylære massen av toppnivået. Tabell 1 viser retensjonstiden for de DPPH • toppene, og responsen av slike topper i UV-Vis og / eller MS detektor, som således gitt molekylmasse. Det er utrolig lett i matchende topper mellom ulike deteksjons prosesser tillatt for afast og mer effektiv form for screening og karakterisering for en sammensatt prøve, slik som kaffe.
Figur 1. Et bilde av Active Flow Technology kolonne i forhold til en konvensjonell kolonne. Den AFT kolonnen er utstyrt med en fire-port utløp montering som huser ring frit slik at peak prøvetaking over radialt tverrsnitt av en prøve band. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Et eksempel illustrasjon av en multiplekset HPLC ordning, ved hjelp av en PSF kolonne med DPPH •, UV-Vis og MS-detektorer. Hver Detecto r er festet til en separat utløpsåpning. I dette tilfellet MS brukes for kvantifisering og er satt til å samle inn prøver fra radial sentrale utgangsporten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. kromatogrammer av en kaffeprøven analysert via en multiplekset HPLC-system, ved hjelp av en PSF kolonne med DPPH •, UV-Vis og MS detektorer: (a) DPPH • 520 nm, (b) UV-Vis 280 nm, (c ) MS - TIC. Hver detektor trase er helt sammenfallende i tid, slik at ingen offsetjustering er nødvendig for å kompensere for døde tid mellom hver detektor.Arget = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Kaffe DPPH • Peak Response og Mass | |||||
| DPPH • Peak | Oppholdstid | DPPH • | UV-Vis | MS - TIC Response | Masse |
| (min) | Svar | Svar | |||
| 1 | 6,74 | Ja | Ja | Ja | 123,84 |
| 2 </ td> | 7,54 | Ja | Ja | Ja | 125,83 |
| 3 | 8.94 | Ja | Nei | Nei | - |
| 4 | 10.05 | Ja | Nei | Ja | 135,83 |
| 5 | 13.15 | Ja | Nei | Nei | - |
| 6 | 16.22 | Ja | Nei | Nei | - |
| 7 | 18.14 | Ja | Ja | Ja | 126,82 |
| 8 | 19.4 | Ja | Ja | Ja | 162,81 |
| 9 | 20.46 | Ja | Ja | Ja | 187,89 |
| 10 | 24.71 | Ja | Ja | Ja | 162,81 |
| 11 | 26,27 | Ja | Ja | Ja | 162,8 |
| 12 | 26,97 | Ja | Ja | Ja | 194,87 |
| 1. 3 | 31.84 | Ja | Ja | Ja | 162,8 |
| 14 | 32.02 | Ja | Ja | Ja | 162,78 | 15 | 32.56 | Ja | Ja | Ja | 176,82 |
| 16 | 33.94 | Ja | Ja | Ja | 176,83 |
| 17 | 41.26 | Ja | Ja | Nei | - |
| 18 | 42.72 | Ja | Nei | Ja | 284,93 |
| 19 | 46.07 | Ja | Ja | Ja | 190,83 |
| 20 | 49.21 | Ja | Ja | Ja | 162,75 |
Tabell 1. Detected DPPH • topper respons på UV-Vis og MS - TIC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne studien omfatter karakterisering og profilering av kaffe ved bruk av HPLC med multiplekset deteksjon ansette en parallell segmentert flow (PSF) kolonnen. Multiplekset HPLC ved anvendelse av PSF kolonnene gjør det mulig for karakterisering og identifikasjon av viktige kjemiske entiteter ved å redusere data kompleksiteten av prøven samtidig å oppnå en større grad av molekyl-spesifikk informasjon innenfor en brøkdel av den tiden det tar å bruke konvensjonelle multi-deteksjonsprosesser. PSF kolonne gir ikke bare en plattform for multiplekset deteksjon, men også kombinasjonen av både destruktive og ikke-destruktive detektorer, uten ytterligere dødvolum og slangen. DPPH •, UV-Vis og MS (TIC) ble multiplekset for analysen av espressokaffe.
En fire-port PSF-kolonne ble benyttet for den multipleksfordelte analyse av kaffe ved hjelp av de tre forskjellige detektorer. Den sentrale port utløp PSF kolonnen med var koblet til MS-detektor og to av trelage perifere porter var koblet til enten en DPPH • deteksjonssystem eller et UV-Vis-detektor. Den tredje tilgjengelige perifere port ble ikke benyttet, og derfor sperret stopperen en kolonne med, men dette kunne ha vært brukt til innsamling av prøven, eller for en annen detektor. Tuning prosessen med denne multiplexed satt opp var bestemt til detektoren, hvor måling av segmentering flyt skjedde etter detektor for UV-Vis og DPPH • deteksjonssystemer. Siden MS er en destruktiv detektor, ble strømmen prosent, bestemt ved differansen (total nominell strømnings minus strømmen fra de andre utløpsporter).
I denne studien kaffen analyse med DPPH • reagensen resulterte i 20 godt oppløste topper, hvorav 13 viste også en respons i UV-Vis og MS-detektorer. Figur 3 sammenligner kromatogrammene oppnådd ved hver detektor. Det er fire regioner som har den samme kromatografiske profil innenfor hvertkromatogram, angitt med de røde boksene. I disse bokser, hvor UV-Vis og MS viste liten respons på disse forbindelser, var det en sterk respons fra DPPH • detektoren. Fire komponenter som svarte på DPPH • reagensen ble ikke oppdaget enten ved UV-Vis eller MS detektorer og tre av de komponentene som svarte på DPPH • reagent ga ingen UV-Vis eller MS respons i det hele tatt. Den molekylære massen av komponentene som svarte til MS er angitt i tabell 1. Den komponent som eluerte ved 10 min hadde en sterk DPPH • respons, med ingen respons fra UV-Vis detektor og bare en meget liten respons fra MS detektoren .
Kobling av en AFT kolonne i PSF modus ga mulighet til å kjøre flere detektorer i multipleksfordelt-modus, hvor alle detektorene uavhengig av HPLC-detektor krav ble kjørt samtidig, i en enkelt injeksjon og separering av dette komplekset sample. Den multi-port ende montering utformingen av AFT kolonnen tilbyr den ekstra fordelen av å gi muligheter for multipleksing gjenkjenning prosesser, noe som gir detaljerte prøven informasjon og absolutt pålitelighet i tilordning mellom hver deteksjon modus. Multipleksede deteksjon med PSF søyler tilgjengelig en stor mengde prøve informasjon, tre detektorer som drives samtidig i løpet av driftstiden som er nødvendig for en enkelt detektor. Den eksakte match av oppholdstid på toppene innenfor hver deteksjon modus var mulig. To av detektorene som ble brukt var destruktive detektorer.
Multipleksing egenskapene til en PSF kolonne er imidlertid begrenset av de tilgjengelige HPLC instrumentelle komponenter og deteksjon instrumentering. Teknikken krever flere deteksjonsmetoder og nødvendige tilleggsprogrammer for hver enkelt modus for deteksjon, dvs, pumper, reaksjons spoler, varmeovner etc. Den primære fordelen med multipleksing deteksjon ved hjelp av et PSF kolonnen er reduction i analysen tid ved opptil fire ganger (hvis 4 detektorer brukes), noe som minimerer sample variasjon mellom analyser for hver enkelt modus for gjenkjenning. Videre tilordne komponent relasjonene i detektert fra en detektor til en annen prøve er langt enklere og mindre utsatt for feil enn om hver detektor ble benyttet hver for seg. Dette unngår uoverensstemmelse i komponentoppgaver, som ofte er et problem i analyse av komplekse prøver.
Det er viktig å gjenta at kvantifisering bør gjøres basert på detektoren som ligger på den radiale sentrale utløpsporten ettersom separasjonseffektivitet her er den høyeste dermed maksimal tailing effekter er minimale og kvantifisering er således den mest nøyaktige. Flyten segmentering har vist seg å være robust gjennom analyser, men enda så er det god laboratoriepraksis å holde jevnlig standardisering. Følgelig i noen kvantitativ arbeid er det viktig å kjøre standarder som passer. Hvis en detektor blir brukt renly som et middel til å forstå prøven kompleksiteten ved visuell avbildning av prøvebestanddeler, kan kvantifiseringen ikke være nødvendig, slik tilfellet er her for antioksydant responsdeteksjon protokollen.
Vi har vist her et eksempel på trippel deteksjon, UV, MS og antioksidant responsive deteksjon. Multipleksede deteksjonssystemer benytter AFT kolonner kan brukes i nesten alle situasjoner der en analytikere krever flerdimensjonale sample informasjon og dette innebærer flere deteksjons protokoller. Bruke AFT kolonner vil i stor grad forenkle og fremskynde prosessen med prøve characterizations.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HPLC instrument | Multiple detectors of choice for multiplexed detection. Detectors of choice may require additional instrumentation, e.g., pump. | ||
| Parallel Segmented Flow HPLC column | Thermo Fisher Scientific | Not Defined | Soon to be commercialized |
| Methanol | Any brand | HPLC Grade | |
| PEEK tubing | Any brand | Various lengths and i.d. | |
| Column stoppers | Any brand | For blocking unused peripheral ports. | |
| PEEK tube cutter | Any brand | ||
| Analytical Scale Balance | Any brand | ||
| Stop watch | Any brand | ||
| Eluent collection vessels | Any brand | 1-2 ml sample vials can be used as eluent collection vessels |
References
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. The design of a new concept chromatography column. Analyst. 136 (24), 5127-5130 (2011).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. Enhanced separation performance using a new column technology: Parallel segmented outlet flow. J. Chromatogr, A. 1232, 47-51 (2012).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. Active flow management in preparative chromatographic separations: A preliminary investigation into enhanced separation using a curtain flow inlet fitting and segmented flow outlet. 35 (3), 410-415 (2012).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. Gradient elution chromatography with segmented parallel flow column technology: A study on 4.6mm analytical scale columns. J. Chromatogr., A. 1270, 204-211 (2012).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. Improving HPLC separation performance using parallel segmented flow chromatography. Microchem. J. 111, 3-7 (2013).
- Shalliker, R. A., Ritchie, H. Segmented flow and curtain flow chromatography: Overcoming the wall effect and heterogeneous bed structures. J. Chromatogr, A. 1335, 122-135 (2014).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. Evaluating active flow technology HPLC columns as a platform for multiplexed detection. Microchem. J. 110, 473-479 (2013).
- Camenzuli, M., et al. Parallel segmented outlet flow high performance liquid chromatography with multiplexed detection. Anal. Chim. Acta. 803, 154-159 (2013).
- Shalliker, R. A., Camenzuli, M., Pereira, L., Ritchie, H. J. Parallel segmented flow chromatography columns: Conventional analytical scale column formats presenting as a 'virtual' narrow bore column. J. Chromatogr., A. 1262, 64-69 (2012).
- Soliven, A., et al. Improving the performance of narrow-bore HPLC columns using active flow technology. Microchem. J. 116, 230-234 (2014).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. Parallel segmented flow chromatography columns with multiplexed detection: An illustration using antioxidant screening of natural products. Microchem. J. 110, 726-730 (2013).
