Introduction
Colunas Fluxo de Tecnologia ativos
Tecnologia de fluxo Ativa (AFT) colunas de cromatografia foram recentemente desenvolvidas para superar a ineficiência nas separações associados a heterogeneidade de fluxo de 1-6 e também para permitir a detecção multiplexada. Nesse particular detalhe comunicação que o processo operacional do paralelo segmentado coluna de fluxo (PSF), com detecção multiplexada. As vantagens funcionais da coluna PSF são: (1) o fluxo a partir da região central radial do leito da coluna é isolado a partir da região periférica ou parede de fluxo, (2) o volume de fase móvel que devem ser processados por uma detecção fonte é reduzida e as fontes (3) detecção podem ser multiplexados para expandir a informação da amostra sem atrasos de detecção de incutir em cada processo de detecção, ou posteriormente, necessitando a divisão de um fluxo de fluxo pós-coluna 7,8. A característica essencial no desenho da coluna PSF que permite que o umdvantage de detecção é a saída multiplexada acessório de montagem e frita de novo. A Figura 1 é uma fotografia da coluna AFT comparada com uma coluna convencional. É importante compreender que o processo de separação obtido utilizando colunas de fluxo paralelas segmentado não é o mesmo que o fluxo de fluxo pós-coluna de divisão. Em uma corrente de fluxo pós-coluna dividir toda a banda de amostra a partir da borda para as extremidades da cauda é igualmente incluídos na amostra (isto é, axialmente), desse modo, cada corrente de escoamento é igual no que respeita à eficiência e sensibilidade; a magnitude da sensibilidade, assim, ser divididos pelas divisões numéricas. Em PSF, no entanto, as amostras do processo de divisão da banda radialmente, não axialmente. Como tal, as amostras de portas centrais vértice do pico - a região mais concentrada do pico. Assim, a sensibilidade mais elevada aqui é como o pico não é diluída pela região da cauda difusa. A amostra eluindo a partir das portas periféricas não é tão eficiente como no CentraL zona, mas, uma vez que a banda é amostrado radialmente, ao invés de axial, a largura do pico é mais estreito do que seria o caso para um processo de amostragem que divide o pico na direcção axial, isto é, uma separação pós-coluna. Por conseguinte, a sensibilidade do detector com uma concentração dependente não é reduzida.
Na coluna PSF, o acessório de saída compreende várias portas de saída e no interior desta extremidade encaixe ali está alojado um filtro poroso anelar. A porção interior de canais de frita anulares esta fluir para fora da coluna através da porta de saída central radial, enquanto que a porção radial exterior dos canais de tomada de frita de fluir para fora da coluna através das portas de fluxo de saída periférica ou zona da parede. As porções interior e exterior da frita de saída são separadas por uma barreira impermeável que impede o escoamento transversal entre estas regiões de fluxo 2. Como consequência desta concepção da corrente central de fluxo radial através do leito da coluna está separado do fluxo de parede ins regiãoide a coluna. A parte relativa de fluxo a partir destas duas regiões pode ser variado para se quase qualquer proporção desejada através de uma gestão de pressão, a fim de optimizar vários aspectos funcionais da tecnologia de coluna, tais como a eficiência de separação ou a sensibilidade da detecção. Em essência, este projeto estabelece de forma eficaz dentro da grande coluna de formato de uma coluna de 'virtual', com um diâmetro interno estreito, e, portanto, as funções de coluna como uma coluna na parede menos verdadeiro, superando coluna de leito heterogeneidade e os efeitos de parede 9,10.
Os principais benefícios do colunas PSF são melhorias na eficiência da coluna, a minimização do solvente de processamento para a detecção de fonte (s) e permite a detecção multiplexado. No entanto, uma vantagem é que uma vez que a cauda e as regiões de frente de qualquer banda são removidos a partir do perfil de eluição geral na eluição do soluto ou detecção está presente em uma concentração mais elevada do que de outro modo seriam observados para os mesmos solute injecção e a concentração de carga em uma coluna convencional, dependendo da relação de segmentação empregue. Como consequência, é muitas vezes observado um ganho na intensidade do sinal para separações conduzidas em colunas 2 PSF. Na verdade, se o rácio de segmentação é ajustada de tal modo que 25% das saídas de fluxo de cada uma das quatro aberturas de saída, a intensidade do sinal que é observada usando violeta (UV) de detecção ultra mostra praticamente a mesma intensidade de sinal exacto como aparente, utilizando uma convencional coluna onde a totalidade (100%) da fase móvel é analisada 7. Além disso, o ajuste fino da relação de saída de fluxo entre as regiões central e parede permite que a eficiência da coluna para ser optimizado. Os ganhos de eficiência da coluna observada usando colunas AFT não pode ser indicado como um único valor, uma vez que estes ganhos de eficiência são uma função de três factores: (1) a taxa de fluxo, (2) a relação de segmentação, e (3) o factor de retenção de soluto . No entanto, os ganhos de eficiência em comparação com conventional colunas são quase sempre observada, e por vezes, esses ganhos são mais do que 100% do número de pratos teóricos 1,2. A capacidade de ajustar o rácio de segmentação permite que o analista para adaptar efectivamente o diâmetro da coluna "virtual", e este é um factor importante no que diz respeito ao processo de detecção. Por exemplo, uma coluna virtual de 2.1 mm de diâmetro interno (ID) é estabelecida a partir de uma coluna ID de 4.6 mm quando a relação física segmentação é de 21% de fase móvel eluindo a partir do orifício de saída central radial. Sob estas condições, a coluna id Virtual 2.1 mm realiza com uma eficiência que podem ser mais do que 70% maior do que a coluna convencional ID de 2.1 mm, dependendo da taxa de fluxo, e factor de retenção de soluto 10.
O design de coluna PSF corrente que é utilizado para a detecção multiplexado incorpora uma porta de saída de 4-montagem, mas a coluna pode ser equipado com uma porta 2-Também-encaixe final, no entanto, esta limita a detecção tO apenas dois detectores. A operação básica destas colunas é, no entanto, o mesmo, excepto que os quatro detectores podem ser acopladas simultaneamente à saída da coluna PSF 4-porta alargar o âmbito de detecção multiplexado. Além da coluna de tubos conjuntivo pré e pós, os únicos requisitos adicionais para operar uma coluna PSF é tubos que podem ser ligados às portas de saída periférica, e um meio pelo qual a quantidade de fase móvel passa através de cada tubo pode ser medido, costuma ser uma medição de massa ou uma medição volumétrica. Para facilidade de ajuste, o diâmetro interno de toda a tubagem de fluxo de saída deve ser o mesmo. A razão de fluxo entre as aberturas de saída centrais periféricas e radiais é então variado através da utilização de gestão de pressão, simplesmente por alteração do comprimento do tubo localizado na saída periférica encaixe, ou o comprimento de pós tubo detector do orifício de saída central radial.
Detecção multiplexado Usando colunas do PSF
Uma vantagem importante das colunas PSF é que cada uma das aberturas de saída de saída pode ser ligado directamente a uma fonte de detecção, permitindo assim a detecção multiplexado. Em um sistema de detecção bem concebido com uma única análise de detecção multiplexada pode proporcionar informação substancial no que diz respeito à natureza dos componentes no interior da amostra. Importante, ensaios destrutivos e não destrutivos podem ser conduzidas exactamente ao mesmo tempo, sem atraso de detecção. Isto permite a atribuição absoluta de, por exemplo, anti-oxidantes, utilizando DPPH • reagente, com componentes para eluir observado com UV e / ou espectrometria de massa (MS) de detecção de respostas de 7,11. Portanto, quatro detectores independentes pode ser operado simultaneamente com porções adequadas de fluxo dirigido para cada detector através de qualquer uma das quatro portas de saída. Uma vez que o fluxo através destas portas pode ser facilmente ajustado a quantidade de soluto, atingindo qualquer dos detectores pode ser ajustado para se adequara sensibilidade do detector dada fonte. Deve notar-se, no entanto, que a migração de soluto mais eficiente é observado através da porta de saída central radial. Cada uma das portas periféricos oferecem eficiência de separação equivalente, o qual quando ajustado para 25% através de cada porta, é apenas ligeiramente menos eficaz do que uma coluna convencional. Como tal, é importante que o detector quantitativa ser configurado para analisar amostras a partir da porta de saída central radial.
Ao definir-se uma coluna de PSF para a finalidade de detecção de multiplexação há uma série de considerações que necessitam ser feitas para alcançar resultados eficazes e de alta qualidade; que é dimensões de tubos para cada porta, escolha de qual porta para um tipo de detector e de regulação do fluxo.
Dimensões do tubo para cada porta
Na cromatografia a extensão de tubagem pós coluna desempenha um papel crucial na eficiência e o desempenho da separação. Dea Granded-volume como resultado da tubagem ID comprida ou larga de saída da coluna para detector irá resultar numa perda de eficiência, sensibilidade e resolução. Assim, as dimensões tubulação apropriada deve ser utilizado quando a configuração da coluna PSF para atingir o potencial máximo na prestação de separação eficiente e proporcionar os benefícios de multiplexação.
Porto de Detector
A Figura 2 é uma ilustração de uma configuração de detecção exemplo multiplexado (Ultra-Violeta Visível (L-VIS), espectrómetro de massa (MS) e 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH •) de detecção). A ilustração mostra a porta central é ligado ao detector de MS, enquanto que o DPPH • e detectores de UV-vis estão ligados às portas periféricas. Uma vez que a MS é o detector mais sensível dos três, fluir para este detector foi dirigido a partir do orifício de saída central. Como DPPH • detecção é seletiva para o presence de antioxidantes, e a menos sensível e mais tolerante a banda de alargamento, fluir para este detector foi dirigida a partir de uma porta periférica. O UV-Vis era um detector secundário "genérico", por isso fluir para este detector foi dirigida a partir de uma segunda porta periférica.
Ajuste fluxo
Uma vez que a tubagem adequada foi ligada a partir de uma porta de detector, o fluxo de saída de cada um dos detectores pode ser ajustado para a quantidade necessária. Uma maneira simples para medir a quantidade de fluxo de saída a partir de cada detector é para pesar a quantidade de fase móvel que elui através de cada porta ao longo de um determinado período de tempo. A percentagem de fluxo pode assim ser determinada, e as razões de fluxo pode ser ajustado por qualquer encurtar ou alongar o tubo ligado à linha de saída de detectores de acordo com os requisitos que se adequa dos detectores de escolha. Diferentes detectores têm diferentes requisitos de fluxo, por exemplo, a célula de fluxo deum detector de fluorescência (FLD) não está caudal limitado, mas deve ser tomado cuidado para evitar o excesso de pressurização da célula de fluxo. Por isso, o controlo de fluxo através do FCDP é normalmente alcançada ajustando a queda de pressão através dos outros detectores e o resto do fluxo, em seguida, passa através da FLD. Um detector que é sensível à quantidade de fluxo que é emitido é o MS. Geralmente, espectrómetros de massa de alta corrente finais podem processar facilmente a cerca de 1 a 1,5 ml / min de fase móvel aquosa moderadamente. Acima desta velocidade de fluxo, inundação da fonte pode fazer as MS inoperável. No entanto, a sensibilidade de detecção na maioria dos espectrômetros de massa é beneficiado usando taxas de fluxo inferiores; portanto, as capacidades de divisão de fluxo de PSF são extremamente úteis para aplicações que envolvem a detecção de MS. Caudais volumétricos alta coluna pode ser utilizada, mas com cargas baixas volume transportado para o detector de MS. Sintonização do fluxo para o detector de MS, contudo, deve ser feita ajustando a queda de pressão antes daDetector MS, em vez de pós-MS. Aqui, a utilização de tubos de diâmetro estreito (0,1 mm ID) é muito útil, como a pressão pode ser facilmente ajustado sem adicionar inadequado volume morto.
Dependendo do tipo de detector de o ajustamento da relação de segmentação pode ser feito, quer detector de pré ou pós. Se um detector não destrutivo, tal como é utilizado de UV-Vis, da percentagem de fluxo seria medido e ajustado pós detector. Se um único detector destrutivo é utilizado no multiplex configurar a percentagem de fluxo é determinada pelo cálculo para trás em relação a outras percentagens de fluxo de porta. Se um detector baseado reagente é utilizado, como DPPH •, a percentagem de fluxo é medido detector de pós, sem a adição de reagente; e se dois ou mais destrutivas detectores são usados, então a relação de fluxo é medido pré-detector. Sistemas que podem exigir instrumentação adicional, tal DPPH • Detecção, terá a pressão do sistema extra que pode alterar o fluxopercentagem uma vez ligado ao sistema de detecção. Portanto, a consideração cuidadosa deve ser dada a pressão do sistema de um detector destrutiva, ao ajustar percentual fluxo pré-detector. Independentemente da razão de fluxo que está definido através de qualquer uma das portas, informação quantitativa deve ser obtida por meio da padronização adequada. Uma vez que as razões de fluxo são configurados, no entanto, eles são robustos, e não mudam mesmo sob condições de eluição em gradiente 7,
O protocolo de vídeo detalhado que acompanha este manuscrito se destina a mostrar como usar e ajustar o funcionamento da coluna PSF em um modo multiplexado de detecção.
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Protocol
Nota: Este protocolo contém instruções sobre como usar uma coluna de PSF em um sistema de HPLC associada a múltiplos detectores para detecção multiplexada. O protocolo foi escrito assumindo que o leitor tenha conhecimentos básicos e experiência em cromatografia e vários métodos de detecção de HPLC.
Atenção: Por favor, consulte as fichas de dados de segurança de material (MSDS) para todos os materiais e reagentes antes do uso (ou seja, MSDS para metanol). Garantir a utilização de todas as práticas de segurança adequadas ao manusear solventes e High Performance Liquid Chromatography (HPLC) eluente. Assegurar o uso apropriado de controles de engenharia de HPLC, equilíbrio e detector de instrumentação, e assegurar o uso de equipamentos de proteção individual (óculos de segurança, luvas, jaleco, calça de corpo inteiro, e sapatos fechados).
1. Configuração de Instrumento HPLC
- Prepara-se o instrumento de HPLC com água ultrapura (por exemplo, 100% de água Milli-Q) para Line A e 100% de metanol para a linha B como fase móvel e limpar as bombas como por exigência fabricante. Se um dos detectores utilizados é o MS, como é aqui, adicionar ácido fórmico a 0,1% para ambas as fases móveis A e B.
- Defina-se a HPLC componentes instrumentais e detectores, como ilustrado na Figura 2. Isto exige a colocação conveniente dos detectores em relação à coluna de modo a minimizar o volume morto entre o detector e a coluna. A flexibilidade na configuração do sistema de HPLC é desejável.
2. Configuração de UV-Vis e detectores MS
- Definir o detector de UV-Vis ao comprimento de onda desejado depende da amostra de interesse (por exemplo, 280 nm).
- Defina o detector MS no modo positivo para Contagem Total Ion (TIC) a análise utilizando o método de detecção Full Scan. Também ajustar os seguintes parâmetros: temperatura MS consequentemente vaporizador 500 ° C, temperatura de capilar 350 ° C, gás bainha fixada a uma taxa de 60 unidades, o fluxo de gás auxiliar40 e varrer o fluxo de gás em 5 unidades, e tensão de 3,5 kV de pulverização. Essas configurações podem ser ajustadas mais tarde para os requisitos específicos de usuários dependentes da amostra a ser analisada.
3. Preparação de 2,2-difenil-1-picrilhidrazil radical (DPPH •) Reagente de configuração de DPPH • Sistema Detector
- Pesar 25 mg de DPPH • e dissolve-se em 250 ml de metanol num balão volumétrico.
- Adicionar 250 ul de ácido fórmico ao DPPH • reagente. Tapar o frasco em folha para evitar a exposição à luz.
- Sonicar o balão contendo o DPPH • reagente durante 10 min.
- Purga-se o DPPH • bomba com o preparado DPPH • reagente conforme a necessidade do fabricante.
- Configurar o DPPH • sistema de acordo com a Figura 2, anexando a linha da bomba para a entrada de uma peça em T.
- Anexar uma bobina de 100 ul reação ao the de saída da peça em T e prender a outra extremidade da bobina de reacção para o detector.
- Envolvem o bobina de reacção em um aquecedor de coluna e definir a temperatura do aquecedor de coluna a 60 ° C.
- Defina o DPPH • UV-Vis detector para 520 nm.
4. Configuração do PSF Coluna
- Ligue a entrada da coluna de PSF para o instrumento de HPLC.
- Ligue a porta central para o detector de MS, utilizando um comprimento de 15 cm de tubagem de 0,13 mm ID.
- Conectar um porta periférica para o detector de UV-Vis, utilizando um comprimento de 15 cm de tubagem de 0,13 mm ID.
- Conectar uma outra porta periférica para a peça em T do DPPH • sistema de detecção utilizando um comprimento de 15 cm de tubagem de 0,13 mm ID.
- Bloquear a porta periférica livre utilizando uma rolha de coluna.
- Traga a taxa de fluxo da bomba de HPLC de 1 ml min -1 a 100% da linha B - 100% de metanol (ácido fórmico a 0,1%).
- Equilibrar a coluna com metanol a 100% móvel pHase por 20 min para uma coluna de comprimento x 250 mm 4,6 milímetros id. Desta vez é dimensionada de acordo com as dimensões das outras colunas, o utilizador pode empregar.
5. Ajustando o Coluna PSF para detecção multiplexada
- Medir a massa de, pelo menos, dois recipientes de recolha vazios (um para a porta ligada ao detector de UV-Vis e um para o detector de DPPH •) utilizando uma balança analítica.
- Recolha fase móvel a partir do UV-Vis e os DPPH • Portas em dois recipientes separados, pré-pesados de recolha (5.1). Grave o período de tempo para a coleção. Recolher pelo menos 500 mg de solvente em cada navio.
- Pesar os vasos de recolha e determinar a massa da fase móvel. Dada a densidade de 0,791 g de metanol é mL -1, determinar o volume de fase móvel recolhidos a partir de cada porta.
- Por diferença, isto é, taxa de fluxo conjunto bomba nominal menos a taxa de fluxo através do DPPH • e UV-Vis Detectoportas de fluxo r, determinação da velocidade de fluxo para o detector de MS. Expresse cada proporção de fluxo como uma percentagem do fluxo total.
Nota: Idealmente, as percentagens de fluxo são: para a MS é de 18% do caudal total, ao UV-Vis 22%, para o DPPH • detector de 60%. - Se não, ajustar as percentagens de fluxo, alterando a pressão de retorno no detector de UV-Vis. Por exemplo, se o fluxo para o UV-Vis é demasiado alta, diminuir a proporção de adição de adicionar uma secção de 15 cm de tubagem de 0,13 mm id para a saída do detector de UV-Vis. Em seguida, repita os passos 5.1 a 5.5.
6. Condições configuração final
- Definir a taxa de fluxo da bomba de DPPH • reagente para a mesma taxa de fluxo que sai da porta de saída ligada ao DPPH • detector.
Nota: A coluna PSF multiplexado com UV-Vis, DPPH • e MS está pronto para análise.
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Representative Results
Uma análise por HPLC multiplexada foi realizada utilizando uma coluna de TFA no modo de PSF (Figura 1) e configurado como ilustrado na Figura 2. Este tipo de configuração permitiu uma amostra de café para ser analisada simultaneamente usando UV-Vis, de DPPH • e MS No total Contagem Ion modo (TIC). Os compostos da amostra de café que responderam ao DPPH • poderia, então, ser facilmente compensada aos UV-Vis e MS - respostas de TIC com base no alinhamento de tempo de retenção, tal como ilustrado na Figura 3, uma vez que os cromatogramas foram gravados simultaneamente. Quando uma resposta positiva foi observada a partir do detector de MS-TIC, a massa molecular do pico foi registada. A Tabela 1 lista os tempos de retenção dos DPPH • picos, e a resposta de tais picos na região do UV-Vis e / ou o MS detector, o qual, assim, desde que a massa molecular. A facilidade em picos entre diferentes processos de detecção de correspondência permitiu afforma ast e mais eficiente de triagem e caracterização de uma amostra complexa, tal como o café.
Figura 1. Uma imagem da coluna de fluxo Tecnologia activo em comparação com uma coluna convencional. A coluna AFT está equipado com um acessório de saída de quatro portas que abriga a frita anular permitindo pico de amostragem ao longo da secção transversal radial de uma faixa de amostra. Por favor clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 2. Uma ilustração exemplo de um arranjo HPLC multiplexado, utilizando uma coluna de PSF com DPPH •, detectores MS UV-Vis e. Cada Detecto R está ligado a um orifício de saída separada. Neste caso, o MS é usado para a quantificação e está definido para coletar amostra do porto saída central radial. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Os cromatogramas de uma amostra de café analisados por meio de um sistema de HPLC multiplexado, utilizando uma coluna com PSF DPPH •, UV-Vis e detectores MS: (a) DPPH • 520 nm, (b) de UV-Vis a 280 nm, (C ) MS - TIC. Cada traço detector é perfeitamente coincidentes no tempo, por isso não é necessário ajuste compensar, a fim de compensar o tempo morto entre cada detector.arget = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Café DPPH • Peak Response e Massa | |||||
| DPPH • Peak | Tempo de retenção | DPPH • | UV-Vis | MS - TIC Resposta | Massa |
| (min) | Resposta | Resposta | |||
| 1 | 6,74 | sim | sim | sim | 123,84 |
| 2 </ td> | 7,54 | sim | sim | sim | 125,83 |
| 3 | 8,94 | sim | Não | Não | - |
| 4 | 10.05 | sim | Não | sim | 135,83 |
| 5 | 13,15 | sim | Não | Não | - |
| 6 | 16.22 | sim | Não | Não | - |
| 7 | 18.14 | sim | sim | sim | 126,82 |
| 8 | 19,4 | sim | sim | sim | 162,81 |
| 9 | 20.46 | sim | sim | sim | 187,89 |
| 10 | 24.71 | sim | sim | sim | 162,81 |
| 11 | 26.27 | sim | sim | sim | 162,8 |
| 12 | 26.97 | sim | sim | sim | 194,87 |
| 13 | 31.84 | sim | sim | sim | 162,8 |
| 14 | 32.02 | sim | sim | sim | 162,78 | 15 | 32.56 | sim | sim | sim | 176,82 |
| 16 | 33.94 | sim | sim | sim | 176,83 |
| 17 | 41.26 | sim | sim | Não | - |
| 18 | 42,72 | sim | Não | sim | 284,93 |
| 19 | 46.07 | sim | sim | sim | 190,83 |
| 20 | 49.21 | sim | sim | sim | 162,75 |
Tabela 1. Detectado DPPH • picos de resposta à radiação UV-Vis e MS - TIC.
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Discussion
Este estudo envolve a caracterização e definição de perfis de café utilizando HPLC com detecção multiplexada empregando uma coluna paralela fluxo segmentado (PSF). Multiplexada HPLC utilizando colunas PSF permite a caracterização e identificação de entidades químicas chave reduzindo a complexidade de dados da amostra, enquanto a obtenção de um maior grau de informações específicas da molécula dentro de uma fracção do tempo que leva a utilização de processos de detecção de múltiplos convencionais. A coluna PSF não só permite que uma plataforma para a detecção multiplexada, mas também a combinação de ambos os detectores destrutivos e não destrutivos, sem volume morto adicional e tubagem. • DPPH, UV-Vis e MS (TIC) foram multiplexados para a análise de café expresso.
Uma coluna PSF 4-porta foi utilizado para a análise multiplex de café usando os três detectores diferentes. A porta central da saída da coluna FDP foi ligado ao detector de MS e dois dos três ce portas periféricas foram conectado a um sistema de detecção de DPPH • ou um detector UV-Vis. A terceira porta periférica disponíveis não foi utilizado e, por conseguinte, bloqueado com uma rolha de coluna, mas este poderia ter sido utilizado para a recolha de amostra, ou para um outro detector. O processo de ajuste deste conjunto multiplexado up foi específico para o detector, onde a medição do fluxo de segmentação ocorreu pós-detector para DPPH • sistemas de detecção de UV-Vis e. Uma vez que a MS é um detector destrutivo, a percentagem de fluxo foi determinado pela diferença (fluxo nominal total menos o fluxo das outras portas de saída).
Neste estudo, a análise de café com o DPPH • reagente resultou em picos bem resolvidos 20, 13, dos quais também tiveram uma resposta nos detectores de UV-Vis e MS. A Figura 3 compara os cromatogramas obtidos por cada detector. Existem quatro regiões que têm o mesmo perfil cromatográfico em cadacromatograma, indicada pelas caixas vermelhas. Nestas caixas, onde UV-Vis e MS mostrou pouca resposta a estes compostos, houve uma forte resposta do DPPH • detector. Quatro componentes que responderam ao DPPH • reagente não foram detectados quer por os detectores de UV-Vis ou MS e três dos componentes que responderam ao DPPH • reagente deu nenhuma resposta de UV-Vis ou MS de todo. A massa molecular dos componentes que responderam às MS estão registados na Tabela 1. O componente que eluiu aos 10 minutos teve um forte DPPH • resposta, sem resposta do detector de UV-Vis e apenas uma resposta muito pequena a partir do detector de MS .
O acoplamento de uma coluna de AFT em modo PSF deu a oportunidade de executar vários detectores em modo multiplexado, onde todos os detectores, independentemente de requisitos de HPLC-detectores foram executados simultaneamente em uma única injeção e separação do complexo sample. Acabar com o multi-porta projeto de montagem da coluna AFT oferece a vantagem de proporcionar oportunidades para os processos de detecção de multiplexação, produzindo informações de amostra detalhada e confiabilidade absoluta na atribuição de componentes entre cada modo de detecção. Detecção multiplexada com colunas PSF forneceu uma grande quantidade de informações de amostra, três detectores operados simultaneamente dentro do tempo de execução necessário para um único detector. A correspondência exata do tempo de retenção de picos dentro de cada modo de detecção foi possível. Dois dos detectores utilizados foram detectores destrutivas.
As capacidades de multiplexação de uma coluna PSF é, no entanto, limitada pelos componentes instrumentais disponíveis HPLC e instrumentação de detecção. A técnica exige vários métodos de detecção e as necessárias add-ons para cada modalidade específica de detecção, ou seja, bombas, bobinas de reação, aquecedores etc. A principal vantagem da detecção de multiplexação usando uma coluna de PSF é o reduction no tempo de análise por até quatro vezes (4 detectores são se utilizado), o que minimiza a variabilidade da amostra entre as análises para cada modo de detecção único. Além disso, designando as relações de componentes dentro da amostra detectada a partir de um detector para a outra é muito mais simples e menos propenso a erros do que se cada detector foram utilizados separadamente. Isto evita desfasamento em atribuições de componentes, o que é muitas vezes um problema na análise de amostras complexas.
É também importante recordar que a quantificação deve ser feita com base no detector localizado na porta de saída central radial desde a eficiência de separação aqui é o mais alto, por isso, efeitos de rejeito de pico são mínimos e, assim, a quantificação é mais preciso. A segmentação fluxo foi mostrado para ser robusto através de análises, mas, mesmo assim, é uma boa prática de laboratório para manter a padronização regular. Assim, em qualquer trabalho quantitativo é importante para executar padrões, conforme apropriado. Se é usado um detector puroLY como um meio de compreender a complexidade da amostra por meio de representação visual dos constituintes da amostra, a quantificação pode não ser necessária, como é o caso aqui para o protocolo de detecção de resposta antioxidante.
Nós demonstramos aqui um exemplo de detecção triplo, UV, MS e detecção sensível antioxidante. Sistemas de detecção de multiplexados usando colunas AFT pode ser usado em quase qualquer situação onde um analistas requer informações de amostra multidimensional e isso envolve vários protocolos de detecção. Usando colunas AFT irá simplificar e acelerar o processo de caracterização da amostra.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HPLC instrument | Multiple detectors of choice for multiplexed detection. Detectors of choice may require additional instrumentation, e.g., pump. | ||
| Parallel Segmented Flow HPLC column | Thermo Fisher Scientific | Not Defined | Soon to be commercialized |
| Methanol | Any brand | HPLC Grade | |
| PEEK tubing | Any brand | Various lengths and i.d. | |
| Column stoppers | Any brand | For blocking unused peripheral ports. | |
| PEEK tube cutter | Any brand | ||
| Analytical Scale Balance | Any brand | ||
| Stop watch | Any brand | ||
| Eluent collection vessels | Any brand | 1-2 ml sample vials can be used as eluent collection vessels |
References
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