Chemistry

调优并行分段流动列和启用多重检测

Published: December 15, 2015 doi: 10.3791/53448

Sercan Pravadali-Cekic¹, Danijela Kocic¹, Stanley Hua¹, Andrew Jones¹, Gary R. Dennis¹, R. Andrew Shalliker¹

¹School of Science and Health, University of Western Sydney

Introduction

主动流技术专栏

主动流技术（AFT）层析柱最近开发来克服低效率与流量异质^1-6相关联的分离并且还使多重检测。在这个特殊的沟通我们详细介绍了并行的操作过程分段流程（PSF）柱多重检测。 PSF中列的关键的功能的优点是：（1）从柱床的径向中心区域的流动被从流动的周边或壁区域分离，（2）流动相必须由一个检测要处理的体积源被还原，和（3）检测源可以复用，以未经灌输检测延迟在每个检测处理，或随后迫使一个柱后流动流^7,8的分束扩大样品信息。 PSF中柱设计中的关键功能，使一个多重检测的dvantage是小说出口配件和玻璃料组件，图1是在船尾柱的照片比现有柱。重要的是要明白，分裂过程使用并行分段流动列是不一样的柱后流流拆分获得是重要的。在后柱流动流分割整个样本频带从前缘到尾的均等取样的四肢（即，轴向地），从而，每一个流动流等于相对于效率和灵敏度;灵敏度的幅度由此被除以分割数。在PSF，然而，分割处理的样品带径向，轴向未。因此，中央口采样峰顶 - 高峰最集中的地区。因此，这里的灵敏度最高的峰不被漫拖尾区域稀释。将样品从外围端口洗脱是效率不如在CENTRA升区，但是，因为带被径向采样，而不是沿轴向，所述峰的宽度窄于将一个采样过程，其将上述峰在轴向上，也就是 ，一柱后分裂的情况。因此与浓度相关的检测器的灵敏度不会降低。

在PSF列，出口配件包括多个出口端口，并在此端部接头内部有坐落在一个环形的玻璃料。的该环形熔料通道的内部流出通过所述径向中心出口端口之列，而出口料通道的外径向部分经由外围或壁区域出口流动口流出的列。出口玻璃料的内，外部分由不可渗透的阻挡层，防止这些流^区 2之间横向流动分离。作为该设计的结果通过该柱床的中央径向流动物流从壁面区域流动插件分开IDE列。流来自这两个区域的相对部分可通过压力管理，以便优化所述柱技术的各种功能方面，例如分离效率或检测灵敏度变化以几乎任何期望的比例。从本质上说，这种设计有效地较大的格式列一个“虚拟”的列内建立，具有较窄内径，因此，列函数作为一个真正的无壁塔，克服柱床异质和壁效应^9,10。

PSF列的主要好处是提高柱效，尽量减少溶剂处理的检测源（S），使多路检测。然而，一个额外的优点是，由于任何带的拖尾和面向地区被从整体洗脱除去轮廓溶质在洗脱或检测存在于更高浓度比原本为相同的S观察到的olute注射和浓度负载在常规柱，根据所使用的分割比。其结果往往存在观察到的信号强度的增益对PSF列²进行分离。事实上，如果分割比率进行调整，使得从每四个出口的流出口的25％，即使用紫外线（UV）检测中观察到的信号强度几乎示出使用常规的完全相同的信号强度作为表观其中移动相的整个（100％），分析^7列。此外，中央和壁流区域之间的出口比微调允许优化该列的效率。（1）的流量，（2）的分割比率，以及（3）溶质保留因子：在柱效增益使用AFT列不能被说成一个单一的值，因为这些效率增益是三个因素的函数观察。然而，提高效率相比，CONVentional列几乎总是观察到，有时这些收益是在理论塔板^1,2的数量超过了100％。的能力来调整分割比允许分析者有效地定制“虚拟”塔的直径，这是相对于检测处理的一个重要因素。例如，一个虚拟2.1毫米内径（ID）列是从一个物理4.6毫米内径柱成立时的分割比是流动相从径向中央出口洗脱的21％。在这些条件下，虚拟2.1毫米内径柱执行与效率可能比以往的2.1毫米内径柱大于70％以上，这取决于流速，和溶质保留因子^10。

一个用于多路检测的当前的PSF柱设计集成了一个4端口出口配件，但该列可以配备2端口端配合也，然而，这限制了检测吨Ø只有两个探测器。这些列的基本操作是，然而，同样的，所不同的是四个探测器可以同时耦合到4端口出口的PSF列范围扩大为多重检测。除了前和后柱连接管，唯一的附加的要求进行操作PSF中列管可连接到外围出口端口，并通过该通过各管流动相的量可以被测量的装置，通常是一个质量测量或体积测量。为了便于调谐，所有出口流管的内径应该是相同的。圆周和径向中央出口端口之间的流量比，然后通过使用压力管理的变化，简单地通过改变位于所述外围出口配件，或管道交检测器上的径向中央出口孔的长度的管道的长度。

多重检测应用PSF列

PSF列的一个重要优点是，每一个的出口退出端口可直接连接到检测源，从而使多路检测。在设计良好的检测系统具有多路检测的单个分析可以提供在问候样本内的组分的性质基本信息。重要的是，破坏性和非破坏性测试可以精确地在同一时间进行，而不检测延迟。这允许的绝对分配，例如使用^DPPH•试剂，与组件观察以洗脱用UV和/或质谱（MS）检测响应^7,11抗氧化剂。因此，四个独立检测器可同时与水流通过任何四个出口端口引导到每个检测器适当部分进行操作。因为通过这些端口的流动可以容易地调节溶质到达任意检测器中的量可被调节以适合给定的检测器源的灵敏度。应当指出，然而，最有效的溶质迁移通过径向中央出口端口观察。每个外围设备端口提供等同的分离效率，其中当通过每个端口设置为25％，仅比传统柱略有效率较低。因此，重要的是定量检测器被设置为从径向中央出口分析样品。

当设置用于多路复用检测目的一个PSF列有一些需要被制成以实现高效率和高品质的效果方面的考虑;选择哪个端口的一种类型的检测器和流量调节的是管的尺寸为每个端口，。

管外形尺寸为每个端口

在层析柱后的管道长度起着分离的效率和性能至关重要的作用。大DEA的d体积从柱出口到检测器长或宽的id管的结果，将导致效率，分辨率和灵敏度的损失。因此，设置在PSF柱以达到最大的潜力在提供有效的分离，同时提供多路复用的好处时适当管道尺寸必须被利用。

港探测器

图2是多重检测（紫外-可见（U -可见光），质谱（MS）和2,2-二苯基-1-苦基苯肼^{（DPPH•）}检测）的一个例子的设置的图示。该图显示了中央端口附连到质谱仪，而^DPPH•和紫外-可见检测器被附连到外设端口。由于MS是三种最敏感的检测器，流动到该检测器从中央出口端口被指挥。由于^DPPH•检测是选择性的presencË的抗氧化剂，和最不敏感和最耐受谱带增宽，流到这个检测器从一个外围端口被指挥。紫外 - 可见是次要的“通用”探测器，因此流向该探测器从第二外设端口的导演。

流量调节

一旦适当的管道已被附接到从一个端口到检测器，从各检测器的排出流量可调节到所需的量。测量流量从每个检测器排出的量的简单方法是称量流动相的洗脱通过每个端口上的给定时间段的量。的百分比流量因此可确定，并且通流比可通过缩短或延长附着于检测器的出口管线管据此以适合所选择的检测器的要求进行调整。不同的检测器具有流量不同的要求，例如，流动细胞荧光检测器（FLD）不流速的限制，但必须小心以避免过度加压流通池。因此流过FLD的控制通常是通过调整穿过其他检测器的压降和流量的剩余部分然后通过FLD传递实现。的检测器即流被递送的量敏感是MS。一般情况下，目前的高端质谱仪可以很容易地处理大约1〜1.5毫升/中度水流动相分。上述该流速，源的驱可能使该MS无法操作。然而，在大多数质谱仪检测灵敏度受益通过使用较低的流速;因此，PSF分流能力是涉及MS检测应用中非常有用。高柱体积流速可以利用，但随着运送到质谱仪低容量负载。流动到MS检测器的调谐，然而，必须通过调整前向压降制成质谱检测器，而不是后期的MS。这里，使用窄孔管（0.1毫米内径）是非常有用的，因为压力可以在不增加不适当的死体积容易地调节。

取决于检测器的类型的分割比的调整既可以做前或后检测器。如果一个非破坏性的检测器，如紫外可见时，流量百分比将被测量和调整交检测器。如果单个检测器破坏性被用在多重设置的流百分比通过回计算相对于其他端口流动百分比来确定。如果一个试剂基于检测器的使用，例如^DPPH•，流程百分比被测量不加入试剂后检测器;如果两个或更多的破坏性检测器被使用，则流量比被测量预检测器。检测系统可能需要额外的仪器仪表等^DPPH•，将有额外的系统压力可能改变流动百分比一旦附着到检测系统。因此，慎重考虑应支付给破坏性检测系统压力，调节流量百分比时，预先检测。不论是通过任何端口设定的流量比的，定量信息应通过适当的标准化而获得。一旦流量比设置，但是，它们是健壮的，他们甚至不下的梯度洗脱条件⁷改变，

详细的视频协议附带的这篇稿件的目的是展示如何在检测的复用方式，使用和调整PSF列运作。

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Protocol

注：该协议包含有关如何使用PSF列上加上多个探测器多重检测高效液相色谱系统的说明。该协议已被写入假设读者已经在色谱仪及各种HPLC检测方法的基本知识和经验。

注意：请参阅材料安全数据表（MSDS）的所有材料和试剂使用前（即 MSDS甲醇）。确保使用一切适当的安全措施处理溶剂和高效液相色谱法（HPLC）洗脱时。确保适当使用高效液相色谱仪，分析天平和检测仪器仪表工程控制，保证使用个人防护用品（防护眼镜，手套，实验室外套，全长长裤和封闭趾鞋）。

1.设置高效液相色谱仪

准备高效液相色谱仪，用超纯水（例如，100％的Milli-Q水）林Ea和100％甲醇的线B作为流动相和清除泵按照制造商的要求。如果所使用的检测器之一是MS的，因为它是在这里，添加0.1％甲酸两者流动相A和B的
设置HPLC仪器组件和检测器，如图2。这需要相对于所述柱的探测器方便放置以便最小化检测器和塔之间的死体积。灵活性在HPLC系统配置是可取的。

2.设置的UV-Vis和MS检测器

设定UV-Vis检测到所需的波长依赖于感兴趣的样品（例如，280纳米）。
坐落在积极模式总离子计数（TIC）分析，采用全扫描检测方法的质谱检测器。还可以调整以下的MS参数，因此：蒸发器温度500℃，毛细管温度350℃，鞘气设定的速度为60台，辅助气流40扫了5台气流和喷雾电压3.5千伏。这些设置可以在以后的特定的用户要求依赖于被分析的样本进行调节。

3.制备2,2-二苯基- 1 -苦味自由基^{（DPPH•）}试剂^DPPH•系统检测器的设置

权衡的^DPPH•25毫克，溶解在250ml甲醇中在容量瓶中。
加入250微升甲酸的^DPPH•试剂。盖上烧瓶中箔，以防止暴露在光线下。
超声处理含有^DPPH•试剂进行10分钟的烧瓶中。
清除^DPPH•泵的准备^DPPH•试剂根据制造商的要求。
根据图2通过将泵线到一个T形件的入口设置的^DPPH•系统。
附加100微升反应管为thT型件电子出口并附加反应线圈到检测器的另一端。
包住反应线圈在柱加热器和设置列加热器温度到60℃。
设置^{DPPH•UV-Vis}检测到520纳米。

4.设置PSF柱

涤纶短纤柱的入口连接到高效液相色谱仪。
中央端口连接到质谱仪，使用0.13毫米内径的管道有15厘米长。
一个外围端口连接到使用的0.13毫米ID管15厘米长的UV-Vis检测。
连接其他外设端口连接到T型件使用0.13毫米内径的管道有15厘米长的^DPPH•检测系统。
使用柱塞阻止未使用的外设端口。
带来的HPLC泵的流速到1ml分钟^-1，在100％的线B - 100％甲醇（0.1％甲酸）。
平衡与100％甲醇的移动ph值列ASE 20分钟为4.6毫米内径×250毫米长度列。根据其他列的用户可以采用的尺寸此时间缩放。

5.调优PSF列的多重检测

测量的至少两个空收集容器（一个用于连接到UV-Vis检测器，一个用于^DPPH•检测器的端口）使用分析天平的质量。
收集紫外可见的^DPPH•端口流动相为两个单独的，预先称重的收集容器（5.1）。记录的时间段为集合。收集至少500毫克的溶剂中，在每一个容器中。
称量收集容器并确定流动相的质量。定甲醇的密度0.791克毫升^-1，确定从每个端口收集流动相的体积。
通过差，即，标称泵设定流率减去通过^DPPH•流速和紫外可见DETECTOř流动口，确定流率到MS检测器。表示每个流动比例为总流量的百分比。
注意：在理想情况下，则流程百分比均为：向MS是总流量的18％，到紫外可见22％，到^DPPH•探测器60％。
如果不是这样，通过改变紫外 - 可见检测器上的背压调节流量的百分比。例如，如果流至紫外可见太高，通过添加加0.13毫米ID管15厘米部分到UV-Vis检测器的出口降低的比例。然后重复步骤5.1至5.5。

6.最终设置条件

设置^DPPH•试剂泵到相同的流速流出连接到^DPPH•检测器的出口的流速。
注：复用紫外-可见分光光度计的PSF列^，DPPH•和MS现在可以进行分析。

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Representative Results

一个复用HPLC分析进行了使用PSF模式（ 图1）的后列，并设置为如图 2所示。这种类型的设置允许的咖啡样品同时通过^{UV-Vis，DPPH•}和MS的总分析离子计数（TIC）模式。咖啡样品作出答复^DPPH•的化合物然后可以很容易地匹配到紫外可见和MS -基于保留时间对准的TIC响应，如图3中，由于同时记录色谱图。其中正响应来自MS-TIC检测器看到的那样，被记录的峰的分子量。 表1列出的^DPPH•峰的保留时间，并且这样的峰在UV-Vis和/或MS的响应检测器上，从而提供的分子量。该易于匹配不同的检测过程之间的峰值允许自动对焦筛选和表征AST和更有效的形式为一个复杂的样品，如咖啡。

图1.主动流动技术柱相比传统的列的图像。在船尾柱安装有一个四口口接头，里面的环形烧结使峰值采样跨样品带的径向截面。请点击这里查看一个更大的版本这个数字。

图2的多路复用的HPLC装置的一个例子说明，使用PSF柱上用^DPPH•，紫外-可见和MS检测器。每个DETECTO r被连接到一个单独的出口端口。在这种情况下，MS用于定量分析，并设置为收集来自径向中央出口样品。请点击此处查看该图的放大版本。

图3.通过多路复用HPLC系统进行分析咖啡样品的色谱图，使用PSF柱上用^DPPH•，紫外-可见和MS检测器^{：（1）DPPH•520}纳米，（二）紫外可见280nm处，（三）MS - TIC。每个检测器的跟踪是在时间上完全重合，因此没有偏移调整是必需的，以补偿每个探测器之间的死区时间。ARGET =“_空白”>点击此处查看该图的放大版本。

“>

咖啡^DPPH•峰响应和质量
^DPPH•峰	保留时间	^DPPH•	紫外-可见	MS - TIC响应	质量
^DPPH•峰	（分钟）	响应	响应	MS - TIC响应	质量
1	6.74	是	是	是	123.84
2 </ TD>	7.54	是	是	是	125.83
3	8.94	是	没有	没有	-
4	10.05	是	没有	是	135.83
五	13.15	是	没有	没有	-
6	16.22	是	没有	没有	-
7	18.14	是	是	是	126.82
8	19.4	是	是	是	162.81
9	20.46	是	是	是	187.89
10	24.71	是	是	是	162.81
11	26.27	是	是	是	162.8
12	26.97	是	是	是	194.87
13	31.84	是	是	是	162.8
14	32.02	是	是	是	162.78
15	32.56	是	是	是	176.82
16	33.94	是	是	是	176.83
17	41.26	是	是	没有	-
18	42.72	是	没有	是	284.93
19	46.07	是	是	是	190.83
20	49.21	是	是	是	162.75

表格1。 >检测^DPPH•峰响应UV-Vis和MS - TIC。

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Discussion

这项研究涉及的表征和使用高效液相色谱多重检测采用平行分段流动（PSF）列咖啡剖析。复使用的HPLC柱的PSF使关键化学实体的表征和鉴定通过减少而它需要使用常规的多检测处理的一小部分时间内获得更大程度的分子的特定信息的样品的数据的复杂性。该PSF列不仅可为多重检测平台，同时还兼具破坏性和非破坏性检测相结合，无需额外的死体积和管道。 ^{DPPH•，UV-Vis}和MS（TIC）进行多路复用的意式浓缩咖啡的分析。

一个4口PSF柱用于咖啡使用三种不同的检测器复用的分析。 PSF中柱出口的中央端口被连接到THRE的质谱仪和两个Ë外围端口被连接到任何一个^DPPH•检测系统或UV-Vis检测器。第三可用外设端口不使用，因此，阻止了柱塞，但是这可能已被用于样品的集合，或为另一个检测器。这一复用组向上调整过程是特异性的检测器，其中，分割流量测量发生后检测器，用于紫外-可见和^DPPH•检测系统。由于MS是一种破坏性检测器，流量百分比是由差（总标称流量减去向其他出口端口的流）确定。

在这项研究中，咖啡分析与^DPPH•试剂导致20良好分辨的峰，其中13也显示在UV-Vis和MS检测的响应，图3比较由每个检测器获得的色谱图。它有在每个相同的色谱轮廓四个区域色谱，用红色方框表示。在这些框，其中UV-Vis和MS表明这些化合物一点反应，有来自^DPPH•检测了强烈的反响。未检出四个组件回应了^DPPH•试剂或者通过紫外可见或质谱检测器和三个一项能满足^DPPH•试剂的组件没有给出紫外-可见光或MS反应都没有。作出答复给MS的组分的分子量记录在表1中。以10分钟时洗脱的组分产生了强烈的^DPPH•响应，没有从UV-Vis检测器的响应和来自MS检测器只有一个非常小的反应。

在PSF模式船尾柱的连接给了机会运行在复用模式下，所有的探测器，无论HPLC检测器要求在单次注射这种复杂的SAMP和分离被同时运行多个探测器勒。多端口端部接头设计的AFT列提供提供机会，用于多路复用检测处理，得到详细样本信息和绝对的可靠性在每个检测模式之间分量的分配的的额外好处。多重检测与PSF列提供了大量的样品的信息，需要一个单一的检测器的运行时间内同时操作三个探测器。的各检测模式中的峰的保留时间的完全匹配是可能的。两个所使用的检测器是破坏性的检测器。

一个PSF列的复用功能，但是通过现有的高效液相色谱仪器部件和检测仪器仪表有限。该技术需要多种检测方法和必要的插件用于检测每个特定模式，即，泵，反应线圈，加热器等使用PSF列多路复用检测的主要好处是反证法N的分析时间最多四折（如果4个探测器使用），它的分析检测的每个单模减少样品的可变性。此外，分配从一个检测到另一个检测样品中的成分的关系就简单得多，而且容易比，如果每个探测器分别采用错误更少。这避免了不匹配组件分配，这往往是在复杂样品的分析的问题。

它重申，量化应基于位于径向中央出口端口的检测器上进行，因为这里的分离效率是最高的，因此，拖尾影响是很小的，定量，因此是最精确的是重要的。流程细分已被证明是通过分析强劲，但即便如此，这是良好实验室规范保持经常性的标准化。因此，在任何定量工作运行标准酌情是很重要的。如果探测器使用纯LY作为理解通过样品成分视觉描绘的样品的复杂性的一种手段，量化可以不需要，因为是在这里的抗氧化反应的检测协议的情况。

我们已经证明了这里三重检测，UV，MS和抗氧化响应检测的一个例子。使用AFT列多重检测系统可以在一个分析师，需要多层面的样本信息几乎所有情况下使用，这涉及到多个检测协议。使用AFT列将大大简化和加快样本表征的过程。

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Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HPLC instrument			Multiple detectors of choice for multiplexed detection. Detectors of choice may require additional instrumentation, e.g., pump.
Parallel Segmented Flow HPLC column	Thermo Fisher Scientific	Not Defined	Soon to be commercialized
Methanol	Any brand		HPLC Grade
PEEK tubing	Any brand		Various lengths and i.d.
Column stoppers	Any brand		For blocking unused peripheral ports.
PEEK tube cutter	Any brand
Analytical Scale Balance	Any brand
Stop watch	Any brand
Eluent collection vessels	Any brand		1-2 ml sample vials can be used as eluent collection vessels