Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

التصوير الهياكل التحت خلوية في الأجنة الحية اسماك الزرد

doi: 10.3791/53456 Published: April 2, 2016

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

في مجال التصوير فيفو يوفر رؤية مباشرة من السلوكيات الخلوية في سياق أكثر الفسيولوجية. الشفافية في الأجنة الزرد وتطورها السريع والخارجية ومجموعة غنية من الأدوات الوراثية التي تسمح وضع العلامات الفلورية التي ساهمت في تزايد استخدام في الجسم الحي المجهري لتوضيح ديناميات الأحداث التنموية الرئيسية. دراسات التصوير تطوير النظام العصبي في الزرد لها على سبيل المثال توسع كبير معرفتنا سلوك الخلايا الاولية العصبية ومصير أولادهم بما في ذلك على الهجرة لاحقة، والتمايز والتكامل الدائرة 1-8.

يتم الآن تعيين المرحلة للتحقيق في ديناميات التحت خلوية الكامنة وراء هذه السلوكيات الخلوية. في الواقع، يجري بالفعل استغلال الزرد كأدوات للفي الجسم الحي بيولوجيا الخلية. أصبح من الممكن الآن لتصور الميتوكوندريا 11/09، جسيم مركزي 2،8،12-14، جولجي 15وأنيبيب 4 و الأكتين 16 الهيكل الخلوي، الإندوسومات 17 ومكونات غشاء قمي مجمع 1،18، بين الهياكل التحت خلوية أخرى في الأجنة الزرد في الجسم الحي. وحتى الآن، معظم ما هو معروف عن وظيفة هذه العضيات يأتي من دراسة سلوكهم في الخلايا المستزرعة. بينما في المختبر اعطت الدراسات البصيرة هائلة في بيولوجيا الخلايا، والخلايا في الثقافة لا تمثل تماما تعقيد الوضع في الجسم الحي، وبالتالي لا تعبر بالضرورة عن وظيفة وديناميات العضيات التحت خلوية في الجسم الحي. الأجنة الزرد تقدم قابلة للحياة في بديل الجسم الحي لدراسة ديناميات التحت خلوية.

كما الفقاريات، الزرد تمتلك العديد من أجهزة الجسم (على سبيل المثال، الشبكية العصبية) التي هي مثلي لتلك الموجودة في أنواع الثدييات. بالإضافة إلى ذلك، يتزايد استخدام الأجنة الزرد لنموذج الأمراض التي تصيب الإنسان 19،20 سبيل المثال، صغر الرأس 21 والخلقية بعمى جزئي 22 ليبر) وظيفة الميتوكوندريا (على سبيل المثال، مرض باركنسون 23، tauopathies 10،24 ومتلازمة بارث 25). وفي الجسم الحي التصوير على المستوى الخلوي والتحت خلوية في هذه الحالات سوف تسمح لفهم أفضل للبيولوجيا الخلايا الكامنة وراء هذه الحالات المرضية.

ويتمثل الهدف العام من الأساليب المذكورة هنا هو توفير دليل شامل للتحقيق في العضيات والهياكل التحت خلوية أخرى في الأجنة الزرد استخدام في ضوء الجسم الحي المجهري. يتم وصف كامل تدفق العمل المشاركة في تصور وتتبع الهياكل التحت خلوية في الجسم الحي - من نهج وضع العلامات الوراثية، لتوليد عابر التعبير والأسماك المعدلة وراثيا مستقرة، وأخيرا إلى التصوير باستخدام واسعة المجال والفحص المجهري متحد البؤر. في حين أن كل من هذه بروكيستخدم edures من قبل العديد من المختبرات الزرد، والأمثل البروتوكولات المذكورة ومبسطة للتحقيق في ديناميات الهياكل التحت خلوية. اثنان جوانب محددة من العمل الموصوف هنا تستدعي ذكر: أولا، استخدام نظام التعبير GAL4-UAS في تشكيلات متعددة لوراثيا العضيات التسمية في الخلية أنواع معينة. ثانيا، مقارنة مباشرة من الميدان واسعة والفحص المجهري متحد البؤر الهياكل التحت خلوية الصورة في الجسم الحي.

الاستراتيجيات الحالية لوراثيا العضيات التسمية والهياكل التحت خلوية أخرى في الزرد إما الاستفادة من توج مرنا 1،4،8 أو يبني الحمض النووي إلى حيث العناصر المروج تدفع مباشرة للتعبير عن البروتينات الانصهار 9،14،15. كتب في المختبر توج نتائج الحمض النووي الريبي في السريع والتعبير واسع، وهذا ليس أنسجة محددة ولكن. بالإضافة إلى ذلك، مستويات التعبير يقلل بمرور الوقت يتم تخفيف الحمض النووي الريبي توج أو تدهور. وبالتالي استخدام الحمض النووي الريبي مقرهايبني لدراسة ديناميات عضية في مراحل لاحقة في التنمية محدودة (عادة ما يصل إلى 3 أيام بعد الإخصاب).

هذه القيود يمكن التغلب عليها باستخدام البنى الحمض النووي، حيث يتم تحديد السيطرة المكانية والزمانية التعبير من قبل عناصر المروج محددة. عندما تستخدم يبني الحمض النووي مقرها في سياق التحسينات نظام GAL4-UAS كبيرة في مستويات التعبير التحوير لوحظ 26،27. في هذا النظام التعبير الثنائي، من نوع الخلية عناصر المروج محددة بالسيارة التعبير عن منشط GAL4 النسخي، في حين يتم استنساخ الجينات مراسل المصب من تسلسل تفعيل المنبع ملزم GAL4 (UAS). من خلال الجمع بين UAS صحفيين مع السائقين GAL4 المناسبة والتعبير يمكن أن يقتصر على خلية أنواع معينة، التحايل على الحاجة إلى استنساخ الجينات مراسل وراء المروجين مختلفة في كل مرة هو المطلوب نمط التعبير محددة. وعلاوة على ذلك، والتعبير عن الجينات مراسل UAS متعددة يمكن أن يكونمدفوعا منشط GAL4 واحد. وبالتالي يوفر نظام GAL4-UAS نهجا وراثية متعددة ومرنة لوضع العلامات التحت خلوية.

واسع المجال، والمجاهر مبائر هي حقوله المنتجة من معظم المختبرات. أنظمة واسعة المجال وعادة ما تستخدم مصباح قوس كمصدر الضوء وكشف عن الضوء المنبعث مع كاميرا الحساسة التي يتم وضعها في نهاية مسار الضوء. ويقتصر هذا طريقة التصوير عادة لعينات رقيقة مثل الخروج من ضوء التركيز يحجب المعلومات في التركيز في عينات سمكا. المجهر متحد البؤر تختلف عن أنظمة واسعة المجال في أن يتم بناؤها لصالح الإشارات التي تنشأ من طائرة الوصل على تلك التي تنشأ من التركيز (أي، "باجتزاء البصري") 28. لتحقيق باجتزاء البصرية يتم وضع الثقب في مسار الانبعاثات في موقف المترافقة إلى مصدر الضوء نقطة. وتستخدم أشعة الليزر ومصادر الضوء ويتم اكتشاف الإشارات مع أنابيب مضخم (هذه الفرق). عمليا، ليزروتمريرها شعاع على عينة تم الكشف من قبل PMT نقطة بنقطة وانبعاث مضان في كل بقعة (بكسل).

نحن هنا صورة نفس الهياكل التحت خلوية في العيش الأجنة الزرد باستخدام كل واسعة المجال والفحص المجهري متحد البؤر لتوفير المقارنة المباشرة الطريقتين المجهر. والهدف الأساسي من تقديم مثل هذه المقارنات هو تقديم المبادئ التوجيهية لاختيار تقنية المجهر الأنسب للسؤال محدد في متناول اليد.

باستخدام النهج الموصوفة هنا علينا أن نبرهن GAL4-UAS وضع العلامات الوراثية على أساس من الميتوكوندريا وجسيم مركزي. يتم تصوير هذه العضيات في مختلف خلية أنواع من الجهاز العصبي وخلايا العضلات باستخدام واسعة المجال، والفحص المجهري متحد البؤر لإثبات مدى ملاءمة كل طريقة التصوير. يمكن بسهولة الأساليب المذكورة هنا يمكن تكييفها للتحقيق في العضيات الأخرى والهياكل التحت خلوية في الجنين الزرد الحية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وأجريت التجارب على الحيوانات فقط وفقا للوائح المحلية للحكومة بافاريا العليا (ميونيخ، ألمانيا).

1. التعريف العضيات والهياكل التحت خلوية أخرى

ملاحظة: هنا يبني مراسل الوراثية التي وصفها fluorescently العلامة جسيم مركزي، الميتوكوندريا وأغشية الخلية.

  1. استخدام أساليب الاستنساخ التقليدية 29 لتوليد البروتينات الانصهار أن تسمية fluorescently جسيم مركزي والميتوكوندريا. استنساخ تسلسل ترميز centrin4 الزرد (cetn4) في الإطار مع بروتين فلوري 2 (FP) مثل البروتين الفلوري الأصفر لتوليد cetn4-YFP. استنساخ تسلسل استهداف الميتوكوندريا من فرعية الثامن من السيتوكروم أوكسيديز في الإطار مع FP مثل البروتين الفلوري سماوي لتوليد mitoCFP 9-11.
  2. لتقييد حرية التعبير من البروتينات الانصهار (cetn4-YFP أو mitoCFP) إلى خلايا معينة من zebrafالعش الجنين (مثل الخلايا العصبية أو خلايا العضلات) استخدام ثنائي GAL4-UAS نظام التعبير 26،27. أولا إنشاء مراسل بناء UAS. استخدام الطرق التقليدية لاستنساخ البروتين الانصهار في ناقلات التعبير UAS، المصب من كاسيت UAS ملزم GAL4 (تتراوح المتغيرات من 1x إلى 14X UAS، انظر مناقشة) 26،27،30 والمروج الحد الأدنى (E1B المروج القاعدية من الكارب βactin الجينات)، وتوليد UAS: cetn4-YFP وUAS: mitoCFP.
    ملاحظة: لإعداد مراسل UAS يبني لمستقر الجيل خط المعدلة وراثيا تحتاج إلى استنساخ عناصر إضافية (انظر 3 أدناه)
  3. لتصور سياق الخلوي الذي جسيم مركزي أو وصفت الميتوكوندريا، توليد مراسل UAS يبني التي وصفت أغشية الخلايا من قبل ضباط الإتصال. استنساخ أول الأحماض الأمينية العشرين من الزرد Gap43 (التي تحتوي على مواقع palmitoylation) في الإطار مع FP لاستهداف هذا FP إلى غشاء الخلية (memFP) 31،32.
  4. Obtaiن يبني سائق أو خطوط المعدلة وراثيا في أي خلية من نوع العناصر المروج محددة بالسيارة التعبير عن المنشط النسخي GAL4-VP16 27، Gal4FF 33 أو KalTA4 30.
  5. الجمع بين مراسل UAS يبني مع بناء التشغيل المناسب لتقييد حرية التعبير على المطلوب خلية نوع من الفائدة (على سبيل المثال، في العصبونات أو الخلايا العضلية). للقيام بذلك شارك في حقن السائق GAL4 ومراسل UAS يبني في مرحلة خلية واحدة من البويضات المخصبة (للحصول على تعليمات مفصلة الاطلاع على 2 أدناه) لتوليد عابر معربا عن الأسماك. بدلا من ذلك، تولد مراسل UAS خط المعدلة وراثيا مستقر (للحصول على تعليمات مفصلة الاطلاع على 3 أدناه) والعبور إلى سائق GAL4 خط المعدلة وراثيا مستقر لتوليد ذرية تحمل كل من الجينات المحورة.
    ملاحظة: من الممكن أيضا لحقن UAS مراسل بناء / ث إلى البويضات المخصبة من سائق GAL4 خط المعدلة وراثيا مستقر أو السائق GAL4 بناء في الاسمدةالبيض إد من مراسل UAS خط المعدلة وراثيا مستقر.
  6. للمشاركة في التعبير عن عدة بروتينات اندماج متميزة باستخدام نظام GAL4-UAS، استخدام برنامج تشغيل GAL4 وUAS مراسل / ثانية في واحد من التكوينات التالية: أ متعددة، منفصلة يبني مراسل UAS (على سبيل المثال، UAS: mitoCFP وUAS: memYFP التعاون -injected مع سائق بناء GAL4) 10، B. أشرطة UAS متعددة على مراسل واحد (على سبيل المثال، UAS: cetn4-YFP، UAS: memCerulean) 12 C. ثنائية الاتجاه مراسل UAS (على سبيل المثال UAS: memYFP، mitoCFP) 2،10،24 (الشكل 1).

الشكل 1
الشكل 1. استراتيجيات للمشاركة في التعبير عن البروتينات الانصهار باستخدام نظام GAL4-UAS.
شارك في التعبير عن البروتينات الانصهار متعددة يمكن تحقيقه باستخدام UAS أشرطة مراسل في تشكيلات مختلفة: (أ) متعددة، منفصل CONST يحركها UASructs، (ب) عدة أشرطة UAS على بناء واحد أو (C) في UAS كاسيت ثنائي الاتجاه على بناء واحد. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. توليد عابر التعبير عن السمك

ملاحظة: فيما يلي التكيف من البروتوكولات التي تم نشرها مسبقا 34،35. وينبغي أن تشمل الإعداد حقن الأساسي لمجهر تشريحي مع التكبير مداه يصل إلى 12X، وmicromanipulator مع حامل micropipette ومصدرا للضغط الهواء. إعداد قبل 2.1-2.5 من الزمن:

  1. لإعداد غرف حقن مكروي البيض، وإعداد محلول 1.5٪ (ث / ت) الاغاروز في الماء. إضافة مسحوق الاغاروز في الماء والميكروويف حتى يذوب تماما agarose. ملء طبق بتري (100 × 15 ملم) مع هذا الحل.
    1. تسمح الحل الاغاروز لتبريد لapproximately 45 درجة مئوية قبل وضع قالب حقن مكروي البلاستيك (40 ملم × 66 ملم، مع 6X 50 ملم التلال الطويلة التي هي 1.5 ملم واسعة، 1 مم عميقة ومتباعدة 3 ملم بعيدا) على سطح الاغاروز المصهور، مع الحرص على عدم إدخال فقاعات في واجهة.
    2. بعد غروب الاغاروز، مخزن في 4 درجة CO / N. بعناية إزالة العفن باستخدام ملعقة. إعداد غرف حقن مكروي متعددة في وقت واحد، مخزن في 4 درجة مئوية واستخدامها مرارا وتكرارا على مدى عدة أسابيع.
  2. استخدام مجتذب micropipette لتوليد الشعيرات الدموية حقن الزجاج مع عرقوب طويل 36.
    ملاحظة: إعدادات محددة تستخدم لتوليد الشعيرات الدموية حقن ينبغي أن تحدد تجريبيا. يمكن سحب الشعيرات الدموية حقن في وقت مبكر وتخزينها قبل استخدامها.
  3. قياس تركيز الحمض النووي البلازميد (سائق GAL4 وUAS يبني مراسل) ل microinjection باستخدام مقياس الطيف الضوئي وفقا لدليل الشركة المصنعة. قياس60، ونسبة الامتصاصية في 260 نانومتر و 280 نانومتر (A260 / 280). تمييع DNA إلى تركيز النهائي من 100 نانوغرام / ميكرولتر في nuclease خالية من المياه.
    ملاحظة: A260 280 / نسبة من ~ 1.8 يدل على الحمض النووي محض. النظر في استخدام عدة التجارية (على أساس مصفوفة السيليكا المستندة ملزمة) لتنقية DNA البلازميد لاستخدامها في الحقن. يجب أن يكون DNA البلازميد ذات جودة عالية لمنع التسمم.
  4. إعداد 10 ميكرولتر حقن مزيج من خلال الجمع بين الحمض النووي (0.5 إلى 2.5 ميكرولتر من 100 نانوغرام / الأسهم ميكرولتر لتركيز النهائي من 5 إلى 20 نانوغرام / ميكرولتر)، حل Danieau ل(0.33 ميكرولتر من 30X الأسهم)، الفينول الأحمر (0.25 ميكرولتر، اختياري) وnuclease خالية من المياه لاجمالى حجم 10 ميكرولتر.
    ملاحظة: تحديد تجريبيا تركيز الحمض النووي يمكن أن ينتج التعبير مناسبة. GAL4 السائق وUAS البلازميدات مراسل بحاجة إلى أن يشترك حقنه. لن التعبير تترتب على ذلك عندما يتم حقن سوى السائق GAL4 أو UAS مراسل البلازميد إلى البرية من نوع البويضات المخصبة. ولكن إذا رانه المخصبة البيض من خط السائق GAL4 ثم حقن واحد أو عدة البلازميدات مراسل UAS يكفي. على العكس من ذلك، إذا microinjecting إلى خط مراسل UAS، إلا أن سائق البلازميد GAL4 يحتاج ليتم حقنه. وأخيرا، في حين يمكن الفينول الأحمر يساعد كثيرا في تصور الحقن، وإنما هو أيضا مركب الفلورسنت نفسها. لذلك، يمكن أن الفينول الأحمر طمس ضباط الإتصال تصور إذا تم التخطيط التصوير قبل 24 ساعة آخر الإخصاب (HPF) كما لا يجوز تخفيفه بما فيه الكفاية قبل هذا الوقت.
  5. ومن المقرر المساء قبل الحقن، وإنشاء عدة أزواج (عادة 5-10) من الذكور والإناث الزرد لتربية. استخدام الدبابات تربية مع إدراج تحتوي على قاع الشبكية ومقسم القابلة للإزالة لفصل الاناث والذكور.
    ملاحظة: الذكور والإناث الزرد عموما يمكن تمييزها عن طريق شكل الجسم. الذكور تميل إلى أن تكون نحيلة بينما تميل الإناث لعرض البطن جاحظ من الناحية البطنية. الذكور تميل بالإضافة إلى أن يكون لها عمود مصفر الحمراءأورينج في منطقة البطن بطني بهم.
  6. مباشرة قبل حقن الحمض النووي، وإزالة فواصل للسماح للذكور والإناث للتزاوج. ما يقرب من 15 إلى 30 دقيقة بعد إزالة المفرق، تحقق من وجود البيض في قاع الخزان. نقل الأسماك البالغة باستخدام صيد الأسماك في الشباك لأحواض التفريخ الجديد.
  7. صب الماء، التي تحتوي على البيض المخصب وضعت حديثا، من أحواض التفريخ إلى غربال (على سبيل المثال، وهو البلاستيكية الشاي مصفاة). غسل البيض في غربال باستخدام زجاجة رذاذ يحتوي على حل Danieau ل. عكس غربال على طبق بتري واستخدام زجاجة رذاذ مع حل Danieau لاستعادة كل البيض (عادة 50 إلى 200 بيضة في تربية زوج من الأسماك البالغة).
  8. باستخدام ماصة microloader، والعودة ملء الشعرية حقن سحبت مع الحمض النووي حقن المزيج. جبل الشعرية الحقن في حامل micromanipulator وتقليم الطرف، تحت المراقبة البصرية لمجهر تشريحي، وذلك باستخدام ملقط لإنشاء micropipette التي يمكن المؤسسة العامةnetrate المشيماء والسيتوبلازم الخلية في حين أن تكون قادرة على تقديم حجم مناسب من الحمض النووي.
    ملاحظة: إلى أي مدى يتم قطع غيض من الشعرية حقن ينبغي أن تحدد تجريبيا ويمكن أن يكون أفضل الحكم عند حقن البيض.
  9. لتحديد حجم الحمض النووي للحقن، وتفريغ قطرة من محلول الحقن في الزيوت المعدنية. قياس نصف قطر (ص) من الهبوط باستخدام ميكرومتر المعايرة وحساب حجمه (4/3 π ص 3). تعدل حجم عن طريق ضبط ضغط الحقن و / أو مدة كل نبضة الحقن.
  10. باستخدام ماصة بلاستيكية، ونقل كل البيض جمعها (عادة 50-200، من 2.7 أعلاه) في خنادق غرفة حقن مكروي. تحت المراقبة البصرية لمجهر تشريحي، استخدام ملقط لتوجيه البيض بحيث السيتوبلازم الخلية (شفافة) وصفار (كثيفة وغير شفاف) ويمكن تحديد بسهولة.
  11. تحت المراقبة البصرية لجهاز ستيريوالمجهر، حقن الحمض النووي في سيتوبلازم الخلية البويضة المخصبة، مع الحرص على التأكد من أن حجم حقن (1-2 NL) يتوافق مع ما يقرب من 10٪ من حجم الخلية.
    ملاحظة: الفينول الأحمر في المساعدات محلول الحمض النووي في تصور حجم حقن.
  12. بعد الحقن، وتخفيف البيض من خنادق القالب حقن عن طريق تنظيف لهم زجاجة رذاذ يحتوي على حل Danieau ل. وفي وقت لاحق نقل البيض في طبق بتري جديدة باستخدام ماصة نقل البلاستيكية والحفاظ في 28.5 درجة مئوية الحاضنة.
  13. الحفاظ على البيض حقن الامم المتحدة والضوابط لتحديد ما إذا كان حقن تسهم في ارتفاع معدلات الوفيات، إما نتيجة للأضرار مادية لحقت به خلال اختراق micropipette أو مزيج الحمض النووي.
    يمكن أن تكون معدلات وفيات عالية عقب الحقن بسبب العديد من العوامل، بما في ذلك الاعتقال أو حقن كميات عالية بشكل مفرط الحمض النووي و / أو البلازميدات مع contamina ملاحظة:اليلة. لمنع التسمم من محضرات الحمض النووي جودة منخفضة، ومجموعات تجارية (على أساس مصفوفة السيليكا المستندة ملزمة) يمكن استخدامها.
  14. على فترات منتظمة بعد الحقن، واستخدام مجهر تشريحي للكشف عن بويضة غير مخصبة والأجنة الميتة أو التالفة والتخلص منها.
    ملاحظة: ترى البيض التي تبدو وكأنها في مرحلة خلية واحدة عدة ساعات بعد الإخصاب، وغير مخصبة. تحديد الأجنة المشوهة عن عيوب تشريحية الجسيمة مثل يتورط في محاور الجسم الأمامي الخلفي. المواد غير متبلور داخل المشيمه تشير إلى أن الجنين لم ينفذ من خلال مراحل النمو ومات. للتأكد مما إذا الأجنة التي تم microinjected الخضوع لالاعتيادي للتنمية استشارة الأطالس التشريحية 37.
  15. نقل الأجنة باستخدام ماصة نقل البلاستيك إلى حل Danieau التي تحتوي على 1X 1-فينيل 2-ثيوريا (1xPTU) ما بين 10 و 24 HPF لمنع تشكيل الصباغ. الحفاظ على الأجنة في حل تابع Danieau لaining PTU لمدة التجربة.
    ملاحظة: بالإضافة إلى melanophores، يمكن iridophores على سطح الجلد يكون إشكاليا للتصوير. في حين PTU لا تمنع تشكيل iridophore، خطوط متحولة مع تناقص أعداد iridophores مثل روي أربيسن (روي) موجودة، ويمكن استخدامها 38.
  16. بعد فتحة الأجنة (عادة في اليوم الثاني أو الثالث بعد الإخصاب، 2 أو 3 DPF)، تجاهل chorions وتبادل الحل Danieau التي تحتوي على PTU.
    ملاحظة: هذه الخطوات مهمة لضمان جودة متوسطة الجنين وسلامة الأجنة السليمة.

3. إنشاء خطوط المعدلة وراثيا مستقرة

ملاحظة: مستقرة خطوط المعدلة وراثيا يمكن أن تتولد بكفاءة استخدام نظام ينقول Tol2. وناقلات ينقول Tol2 تحتوي على التحوير من الفائدة شارك حقن جنبا إلى جنب مع مرنا ترميز الانزيم ترانسبوزاز إلى إخصابالبيض د في مرحلة خلية واحدة. البروتين ترانسبوزاز المستمدة من مرنا حقن يحفز استئصال الكاسيت التحوير من ناقلات ينقول واندماجها في جينوم 39.

  1. استنساخ التحوير مراسل كاسيت (على سبيل المثال، UAS: mitoCFP) بين Tol2 مقلوب تكرار محطة في واحدة من ناقلات Tol2 المستخدمة حاليا في المجتمع الزرد كما هو موضح 40.
    ملاحظة: ناقلات Tol2 تحتوي على شريط كاسيت للاختيار فيها عناصر المروج بالسيارة التعبير FP في أجهزة الجسم لا علاقة لها مجال الاهتمام (على سبيل المثال، القلب 41 أو عدسة 42) مفيدة لفحص خطوط المعدلة وراثيا مراسل UAS في غياب GAL4 transactivation.
  2. استخدام عدة التجارية (على أساس مصفوفة السيليكا المستندة ملزمة)، وتنقية DNA البلازميد لاستخدامها في الحقن. تأكد من أن البلازميد هو من نوعية عالية لمنع التسمم.
  3. نسخ Tol2 مرنا ترميز ترانسبوزاز باستخدامناقلات النسخ المناسبة مثل PCS-TP 43. لفترة وجيزة، خطي PCS-TP واستخدام مجموعة تجارية لتوليد توج مرنا واتبع بروتوكول الشركة المصنعة. الحرص على تجنب تلوث مع RNases (على سبيل المثال، استخدام ريبونوكلياز خالية من نصائح ماصة وأنابيب). قسامة الحمض النووي الريبي، في تركيز 100 نانوغرام / ميكرولتر، لاستخدام واحد ومخزن في -80 درجة مئوية.
  4. في صباح يوم من الحقن، وذوبان الجليد قسامة من مرنا ترانسبوزاز على الجليد. مزيج من ناقلات ينقول الحمض النووي (2 ميكرولتر من 100 نانوغرام / ميكرولتر) وترانسبوزاز مرنا (2 ميكرولتر من 100 نانوغرام / ميكرولتر) في نسبة 1: 1، وإضافة 6 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية من المياه لتبرزي حجم الكلي ل10μl.
    ملاحظة: هناك تركيز من 20 نانوغرام / ميكرولتر يوصى لكل لكن ينبغي تحديد تركيز الأمثل تجريبيا. استخدام مياه خالية من ريبونوكلياز للتخفيف. استخدام قفازات عند التعامل مع مزيج حقن الحمض النووي RNA وابقائه على الجليد لكامل الفترة من الحقن لمنع تدهور مالحمض النووي الريبي.
  5. باستخدام الإرشادات التفصيلية في القسم 2 أعلاه، وضخ مزيج حقن الحمض النووي RNA إلى البويضات المخصبة في مرحلة خلية واحدة. تحت المراقبة البصرية لمجهر تشريحي استهداف السيتوبلازم الخلية في مرحلة خلية واحدة لأعلى معدلات الكفاءة transgenesis. الحفاظ على الأجنة المحقونة في 28.5 درجة مئوية حتى على استعداد للكشف عن التعبير التحوير.
    ملاحظة: PCR يمكن القيام به للتحقق من كفاءة ترانسبوزاز Tol2 كما هو موضح سابقا 44.
  6. الأجنة الشاشة في طبق بتري لtransgenesis باستخدام oculars المجهر مضان تشريح.
    ملاحظة: استخدام مجموعات مرشح المناسبة للمجهر لتصور FP تعبير عن كاسيت اختيار (أي مضان في القلب أو العدسة) في 2 أو 3 DPF. تحديد الأجنة وراثيا المحتملة التي كتبها التعبير (في القلب أو العدسة) ورفع هذه الأجنة إلى مرحلة البلوغ (F 0 جيل) باستخدام معيارالبروتوكولات 45. بدلا من ذلك، وتحديد الأجنة وراثيا محتملة من قبل PCR كما هو موضح في 46.
  7. مرة واحدة مراسل F UAS 0 الأسماك 2،5-3 أشهر من العمر، عبر لهم (انظر 2.5 لمزيد من التفاصيل) إلى غير المعدلة وراثيا من نوع البرية الأسماك للحصول على البيض لإنشاء جيل F 1. بدلا من ذلك، عبر مراسل UAS F 0 الأسماك إلى خط السائق GAL4 لإنشاء جيل F 1. في الحالة الأخيرة، والتحوير يحركها UAS يمكن رصدها مباشرة في الأجنة التي تم الحصول عليها من الصليب.
  8. استخدام مضان تشريح المجهر للكشف F 1 الأجنة للتعبير عن التحوير أو كاسيت اختيار.
    ملاحظة: عندما يتم تأكيد التعبير ثم التحوير يمكن القول أن سلالة الجرثومية إرسالها. Transgenesis هو غير مندلية في مرحلة F 0. قد تختلف عدد الأجنة معربا عن التحوير من عدد صغير للغالبية العظمى في clutche الفرديةالصورة. التكامل ينقول في مختلف F 0 الأسماك قد تختلف إلى حد كبير، مما أدى إلى أنماط التعبير المختلفة. وبالتالي الحفاظ على F 1 الأسماك من مختلف F 0 مؤسسي كخطوط فرعية منفصلة. التكامل ينقول في F 1 الأسماك مستقرة ومرت على الأجيال اللاحقة بطريقة مندلية.
  9. الحفاظ على كل F 0 الأسماك في خزانات منفصلة لإعادة تحديد حاملات التحوير.

4. إعداد الأجنة للتصوير على مجهر تستقيم

ملاحظة: الإجراءات الموضحة هنا وقد تم تحسين للتصوير على المجاهر تستقيم مع أهداف مسافة المياه غمس مخروط العمل الطويلة.

  1. استخدام مضان تشريح المجهر لفحص الأجنة للتعبير عن التحوير.
    ملاحظة: سوف التعبير مراسل التحوير UAS تعتمد على خط السائق GAL4 المحددة المستخدمة. حدد الأجنة لتجارب التصوير على أساس عملي المطلوبنمط ression.
  2. نقل الأجنة المحدد باستخدام ماصة بلاستيكية لطبق بتري منفصلة تحتوي عازلة Danieau مع 1X PTU و1X تريكين.
    ملاحظة: عند وضع العلامات متناثر (سوى عدد قليل من الخلايا في نظام الجهاز) جبل الأجنة في الاغاروز (انظر 4،3-4،7 أدناه)، وشاشة للتعبير عن التحوير باستخدام المجهر واسعة المجال مع أهداف التكبير عالية (انظر 5.1 أدناه). تريكين يخدر الأسماك وينبغي أن تكون فعالة في غضون ثوان. إذا لم يتم يجمد الأسماك فمن المرجح أن تريكين قد تدهورت. وتشمل الأسباب المحتملة لهذا التدهور سوء التخزين من تريكين، وهي حساسة للضوء 47.
  3. إعداد الاغاروز لتضمين الأسماك عن طريق إذابة مسحوق الاغاروز ذوبان منخفضة في المخزن Danieau لتركيز النهائي من 0.7٪. قسامة (1 مل)، ونضع في حرارة كتلة عند 40 درجة مئوية لتصبح جاهزة للاستخدام.
    ملاحظة: ويركز العاليأيونات الاغاروز (حتى 1.5٪) ويمكن أن تستخدم أيضا لتضمين الأسماك.
  4. إضافة 50 ميكرولتر من الأسهم 20x ومن تريكين و 20 ميكرولتر من محلول 50X الأسهم من PTU إلى قسامة 1 مل من الاسعار المنخفضة ذوبان الاغاروز وتخلط جيدا من خلال الاستفادة من الجانب من الأنبوب. إعادة أنبوب للحرارة كتلة. باستخدام ماصة نقل البلاستيكية، ماصة بلطف عدد قليل من (1-10) الأجنة تخدير في الاغاروز، ونقل السائل أقل قدر ممكن لتجنب تمييع الاغاروز.
  5. باستخدام ماصة نقل البلاستيك جميع الأجنة مع كمية صغيرة من الاغاروز إلى الزجاج طبق بتري السفلي.
  6. العمل بسرعة نسبيا، واستخدام الملقط لوضع الأجنة في الاتجاه المطلوب، اعتمادا على هيكل للتصوير.
    ملاحظة: الأجنة المشرق إلى جانبهم إذا كان ينبغي تصوير شبكية العين أو روهون اللحية (RB) الخلايا العصبية الحسية.
  7. السماح للالاغاروز ليصلب لمدة 15 دقيقة على الأقل. إضافة العازلة Danieau التي تحتوي على 1xPTU و1xTricaine لتغطية الأجنة جزءا لا يتجزأ من agaroحد ذاتها. ضع صحن يحتوي الأجنة agarose جزءا لا يتجزأ في حاضنة عند 28.5 درجة مئوية حتى جاهزة للصورة.

5. التصوير الخلوية والتحت خلوية الهياكل باستخدام اسعة حقل أو متحد البؤر المجهري

ملاحظة: عريض الحقل المجهري ونقاط المسح المجهري متحد البؤر هي الأكثر استخداما على نطاق واسع طرائق صورة الأجنة الزرد fluorescently المسمى ويلخص الجدول 1 المزايا الرئيسية وعيوب كلا النظامين. لكل أشكال المجهر، هي التي شنت الأجنة في الاغاروز كما هو موضح في 4 أعلاه، وحافظت على 28.5 درجة مئوية في جميع أنحاء تجربة التصوير باستخدام غرفة التدفئة على مسرح المجهر. الأهم من ذلك، يسمح الطبق مع الأجنة agarose جزءا لا يتجزأ لكي تتوازن إلى 28.5 درجة مئوية، قبل أن يبدأ التصوير كما تسبب التقلبات في درجات الحرارة الانجراف في Z-البعد. عند إجراء تجارب التصوير على المدى الطويل (أكثر من سيفيراساعات ل)، ووضع غطاء زجاجي على طبق بتري للحد من تبخر المخزن المؤقت.

واسع المجال نقطة مسح متحد البؤر
كلفة رخيص نسبيا غالية (تقريبا. 5X أكثر)
الصورة تبيض منخفض عالي. تتعرض العينة للضوء ليزر فوق وتحت البؤري.
صور سمية منخفض عالية (انظر الصورة تبيض أعلاه)
سرعة اكتساب بسرعة بطيء
قرار في س ص القانون آبه (يمكن تحسين القانون آبي من خلال التطبيق 40٪ باستخدام الثقب صغير جدا، و. ومع ذلك، فيمعظم إعدادات هذا له التطبيق العملي قليلا)
باجتزاء البصري فقير نعم (يمكن تعديلها حسب حجم الثقب)
اختراق الأنسجة تقتصر على هياكل سطحية (على سبيل المثال، روهون اللحية الخلايا أو الألياف العضلية) تقتصر على <100 مم من سطح الجنين

الجدول 1. مقارنة العامة للواسعة المجال ونقاط المسح المجهري متحد البؤر

  1. المجهر واسعة المجال
    وتقدم إليك بعض الإرشادات لتصوير الأجنة الزرد باستخدام تستقيم المجهر واسعة المجال مع أهداف مسافة المياه غمس مخروط العمل الطويلة: ملاحظة. وقد تم تجهيز المجهر مع كاميرا CCD المبردة، وشنت مجموعات مرشح لتصور fluorophores مختلفة على عجلة تصفية الآلي لاقتناء السريع للقنوات متعددة.يتم التحكم الحصول على الصور من قبل μManager، حزمة البرمجيات مفتوحة المصدر المجهري 48. ويرد مثال محدد لتصوير الميتوكوندريا في الخلايا العصبية الحسية الميزانيه العاديه. وصفت الخلايا الميزانيه العاديه وراثيا باستخدام غشاء المستهدفة YFP والميتوكوندريا هم CFP الموسومة (انظر 1.1 أعلاه).
    1. جبل الأجنة إلى جانبهم في انخفاض ذوبان الاغاروز كما هو موضح في 4 أعلاه.
    2. السماح الطبق مع السمك شنت لكي تتوازن إلى 28.5 درجة مئوية في غرفة التدفئة على مسرح المجهر قبل بدء التصوير.
    3. استخدام الهدف المياه غمس مخروط منخفضة التكبير وننظر من خلال oculars المجهر لاختيار منطقة على سطح الجنين إلى صورة.
      ملاحظة: إذا كان مستقرا المعدلة وراثيا خط مراسل MitoFish، تيراغرام (UAS-E1B: mYFP، mitoCFP) mde6، ويستخدم جنبا إلى جنب مع خط سائق مثل HUC: GAL4 ثم وصفت الخلايا العصبية أكثر RB، وتبدو وكأنها زارة التربية والعلم كثيفةح-العمل العرش محوار على سطح الجنين. إذا تم استخدام Microinjection من الحمض النووي يبني لتحقيق وضع العلامات متفرق (على سبيل المثال، الحسي: GAL4-VP16 مع UAS: mitoCFP وUAS: MA-YFP) والأجنة الشاشة لتحديد الخلايا المسمى المزدوج.
    4. فتح البرنامج المجهر (μManager 1.4) وانقر على "الإضاءة" "تحت عنوان" ضبط التهيئة "لتحديد مجموعات مرشح الصحيحة للالطول الموجي للاهتمام (YFP أو CFP للمثال الحالي) وتحت" إعدادات الكاميرا "دخول وقت التعرض مطلوب للحصول على صورة مناسبة.
      ملاحظة: "إعدادات الإضاءة" هي من قبل المستخدم عند تثبيت البرنامج قبل مجموعة ويتم تحميل عند فتح μManager. إذا لم يتم تكوين برنامج للتحكم في عجلة تصفية يدويا تحريك عجلة تصفية في البرج إلى الموقف المناسب.
    5. التغيير إلى الهدف المياه غمس مخروط المسافة العمل منذ فترة طويلة تتراوح بين 40-100x التكبير. اختارالهدف الذي يحتوي على أعلى الفتحة العددية (NA) ويتم تصحيح لونيا (امزيغ).
    6. انقر على "لايف" لاختيار مجال الرؤية: في حالة الخلايا العصبية RB، صورة النقل الميتوكوندريا في محور عصبي الجذعية، المنبثقة عن جسم الخلية، أو في الشجرة الطرفية.
      ملاحظة: العرش الطرفية للخلايا العصبية الميزانيه العاديه في حظيرة الزعنفة الذيلية للجنين توفر فرصة مثالية للصورة حقل كبير من الرأي القائل بأن شقة، وبالتالي يمكن الحصول عليها في إطار واحد مع المجهر واسعة المجال. ولذلك فمن المهم لتحميل الجنين كما رفضا قاطعا ممكن على جانبها، بحيث أضعاف الزعنفة الذيلية موازية للأسفل طبق بتري.
    7. بعد اختيار مجال الرؤية، انقر على زر "اختيار مستطيلة" في القائمة يماغيج، وتحديد المنطقة ذات الاهتمام (ROI) وانقر على "العائد على الاستثمار" في إطار μManager. بعد تحديد العائد على الاستثمار للتصوير، انقر فوق "إيقاف" و "حفظ" لتاكه صورة للقناة YFP لتسجيل مورفولوجيا المحلي للمحوار / ثانية.
    8. إلى صورة النقل الميتوكوندريا انقر على "متعدد الأبعاد ACQ." زر. مراقبة نافذة إضافية ( "متعدد الأبعاد اقتناء") وحدد عدد مرات نقاط وكذلك الفترة الزمنية الفاصلة بين الوقت نقطة في هذا الإطار. استخدام معدلات الإطار من 0،3-1 هرتز. تنفيذ تسجيلات لمدة 10 دقيقة على الأقل لجمع أكبر عدد ممكن البيانات نقاط ممكن.
    9. في إطار "متعدد الأبعاد اقتناء"، انقر على "قنوات"، إضافة وتحديد الطول الموجي للتصوير (CFP للالميتوكوندريا في هذا المثال) ووقت التعرض. الحفاظ مرات التعرض إلى أقل من 400 ميللي ثانية لتصوير النقل الميتوكوندريا.
    10. انقر على خيار "حفظ الصور" في إطار "المتعددة الأبعاد اقتناء"، لحفظ الملفات تلقائيا في مجلد معين الواردة في "دليل الجذر". انقر على "اكتساب" في الزاوية اليمنى العليا لبدء تيمتصوير الفاصل بين ه.
    11. إعادة ضبط يدويا التركيز أثناء تسجيل مرور الزمن لتعويض أي انحراف في البعد ض.
      ملاحظة: استخدام هذه المعلمات النقل الميتوكوندريا في الخلايا العصبية RB يمكن تصوير لطالما 4 ساعة.
  2. المجهر متحد البؤر
    وتقدم هنا المبادئ التوجيهية للتصوير مع أوليمبوس FV1000 المجهر متحد البؤر تستقيم والأهداف المياه غمس مخروط مسافة طويلة في العمل: ملاحظة. وقد تم تجهيز المجهر مع خطوط متعددة الليزر والعديد من أجهزة الكشف عن (هذه الفرق التقليدية وأكثر حساسية للكشف عن زرنيخيد فوسفيد) التي تسمح للتصوير الأقنية. يشار محددة لبرنامج أوليمبوس Fluoview. ومع ذلك، يجب أن تكون المعلمات التصوير وصفها هنا للتحويل بسهولة إلى أنظمة متحد البؤر الأخرى.
    1. جبل الأجنة في انخفاض ذوبان الاغاروز في التوجه المناسب للجهاز / هيكل إلى أن تصوير، كما هو موضح في 4 أعلاه.
    2. درجة مئوية في غرفة التدفئة على مسرح المجهر قبل بدء التصوير.
    3. استخدام مسافة الأهداف المياه غمس مخروط العمل الطويلة لالمجاهر مبائر في تكوين تستقيم. اختيار الأهداف مع أعلى مستوى ممكن NA لتحقيق أقصى قدر من إشارات الفلورسنت التي يمكن جمعها والحصول على أفضل حل السلطة. عندما جمع الصور من قنوات متعددة اختيار الأهداف تصحيح لونيا (امزيغ).
    4. فتح البرنامج المجهر وانقر على "ترانس مصباح" أو "برنامج التحصين الموسع مصباح" لاستخدام إما المرسلة أو مضان ضوء على التوالي لتحديد المنطقة ذات الاهتمام عبر oculars المجهر.
    5. استخدام البرنامج لإعداد المعلمات المسح التالية للحصول على مداخن صورة:
      1. في إطار "إعداد اقتناء" تحقق الهدف الذي تم اختياره لتصوير يطابق الهدف الذي يظهر على انخفاض مؤشر داو جونزالقائمة ن الأهداف المتاحة.
        ملاحظة: هذا هو التأكد من أن أية معلمات محسوبة مسبقا لهدف معين (على سبيل المثال، الأفقي وقرار محوري، حجم الفتحة متحد البؤر الخ) يكون صحيحا، ويمكن استخدامها بشكل موثوق.
      2. حدد خط ليزر / ثانية، والإثارة ومزدوج اللون الانبعاثات مرشحات مناسبة لصورة ببروتين معين (ق). القيام بذلك عن طريق النقر على زر "قائمة صبغ" في إطار "صورة تحكم اقتناء" واختيار fluorophore المناسب / ثانية. بدلا من ذلك، انقر على زر "مسار الضوء والأصباغ" لتعيين هذه المعلمات يدويا.
        ملاحظة: عندما يتم اختيار الخيار زر "قائمة صبغ"، البرنامج تلقائيا بتحديد خطوط الليزر، والإثارة وانبعاث مرشحات مزدوج اللون المناسبة وضبط حجم الفتحة مبائر بشكل مناسب.
      3. في إطار "اكتساب إعداد"، وضبط "تكبير" عامل و "الحجم آسيا والمحيط الهادئنسبة إلخ "(أي، 512x512، 1024x1024 الخ) من الصورة الممسوحة ضوئيا إلى الحصول على حجم بكسل من الضروري حل أفضل الهياكل التي يجري تصويرها. اضبط حجم بكسل أن يكون حوالي نصف القرار النظري لهذا الهدف، وبالتالي المعايير التالية أخذ العينات نيكويست . لتحديد حجم بكسل من الصورة نقرة حصلت على الزر الذي يحمل رمز للعلم ( "أنا") في إطار "صورة تحكم اقتناء".
      4. ضبط سرعة المسح الضوئي لأسرع ممكن (2 ميكرو ثانية / بكسل) في إطار "إعداد اقتناء".
      5. في "صورة تحكم اكتساب" نافذة انقر على كالمان خط المتوسط ​​للحد من عامل noise.A من 2-3 يكفي عادة.
      6. اختر وضع المسح المتتابع عند تصوير fluorophores مع تداخل الأطياف. للقيام بذلك، انقر على "متسلسل" و "لاين" في إطار "صورة تحكم اقتناء".
      7. ضبط انتاج الطاقة من خط ليزر / الصورة ذات الصلة (عادةأقل من 5٪). تحتاج إلى أن تحدد تجريبيا قيم معينة.
      8. انقر على زر "XY كرر" أو "X2 التركيز" أو "التركيز X4" لمسح مستمر المنطقة المحددة أثناء ضبط إعدادات كاشف لكل قناة. ضبط "HV"، "الربح" و "الأوفست" لكل قناة للحصول على الصور التي لديها أعلى النطاق الديناميكي القيم الرمادية.
        ملاحظة: القيم المحددة لهذه الإعدادات تحتاج إلى أن تحدد تجريبيا. "HV" يضبط الجهد على كاشف لتغيير حساسيتها، "الأوفست" ضبط إشارة خرج الكاشف و "كسب" يضاعف إشارة خرج للكشف من قبل عاملا ثابتا.
      9. اضغط Ctrl + H لتصور الصور المكتسبة من خلال نظرة متابعة الجدول (حلو) أن يحدد تحت المشبعة (تظهر باللون الأزرق) ومشبعة أكثر بكسل (تظهر باللون الأحمر)، وكلاهما يجب عموما تجنبها. إعادة تقييم انتاج الطاقة من الليزر ذات الصلة لينه / ق وإعدادات كاشف.
        ملاحظة: استخدام القوة ليزر عالية ومستويات عالية من "HV" للكشف سيؤدي إلى المزيد من الإشارات. ولكن سوف قوة الليزر العالي يؤدي إلى زيادة التبييض والصور سمية. وزيادة "HV" يؤدي إلى زيادة الضوضاء. ولذلك، يحتاج حلا وسطا التي يمكن العثور عليها عند وضع قوة الليزر و"HV" للحصول على الصور مع مستويات مقبولة من الضوضاء في حين منع الصور الضرر (انظر أيضا الجدول 1).
      10. جمع الصور من حجم محدد من خلال التركيز على الحدود العليا والدنيا للمنطقة من الفائدة. في "إعداد اقتناء" نافذة انقر على أزرار "وضع حد للمجموعة" و "البداية مجموعة" مجموعة من النافذة ض المكدس في الحدود العليا والدنيا من حجم للتصوير. حدد حجم الخطوة التي هي نصف للقرار ض لهدف معين (على سبيل المثال، إذا ض القرار هو 2 ميكرون اختر 1 ميكرون). لتحديد الدقة ض من الاهدافه انقر على زر مع رمز للعلم ( "أنا") في إطار "صورة تحكم اقتناء".
      11. إعداد سلسلة زمنية لجمع مداخن ض في التواتر الزمني الذي يتناسب مع ديناميات هيكل التحت خلوية يجري تصويره. في "TimeScan" نافذة فرعية إدخال التردد الذي ينبغي الحصول عليها ض مداخن ( "الفاصل الزمني" ') وعدد المرات التي ينبغي الحصول عليها من صور ( "ارقام").
      12. انقر على "عمق" وأزرار "تايم" في إطار "صورة تحكم اقتناء" للتأكد من أن ض المكدس والسلاسل الزمنية سيتم الحصول عليها. وأخيرا انقر على زر "XYZT" لبدء الحصول على الصور مرور الزمن.
      13. بعد الانتهاء من الحصول على الصور، ومراقبة "سلسلة تم" على واجهة البرنامج. اضغط عليها وحفظ الصور في شكل "بنك عمان الدولي" لتسجيل الصور والبيانات الوصفية المرتبطة بها.
        ملاحظة: الصور التي تم الحصول عليها علىالمجهر واسعة المجال والمجهر متحد البؤر يمكن تصور وتحليلها باستخدام برامج مثل فيجي، ضمن الملكية العامة، برنامج معالجة الصور مجانا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

هنا تتم مقارنة مباشرة استخدام واسعة المجال والفحص المجهري متحد البؤر الميتوكوندريا صورة وجسيم مركزي في العيش الأجنة الزرد ويتناقض. اعتمادا على مكان وجود الخلايا التي ديناميات عضية وستبحث وتردد الملازمة للأحداث التحت خلوية محددة، عادة إما واسعة حقل أو متحد البؤر المجهري هو الخيار الأفضل. نحن تصوير العضيات في الخلايا العصبية الميزانيه العاديه تقع على سطح الجنين وفي خلايا الشبكية تقع أعمق. موقع سطحية من الخلايا العصبية RB جنبا إلى جنب مع هندسة الأبعاد مباراتين جعلها مرشحة جيدة ليجري تصويره من قبل كل من حقل واسع والفحص المجهري متحد البؤر (الشكل 2). الحصول على الصور باستخدام المجهر مبائر هي إلا أبطأ بكثير ويمكن أن يؤدي إلى التقليل من ديناميات الأحداث التحت خلوية محددة (على سبيل المثال، حركة الميتوكوندريا، الشكل 2C، D (الشكل 3).

لتمكين التصور المتزامن لعضيات والأغشية الخلوية استخدمنا نظام GAL4-UAS في ثلاثة أشكال مختلفة. أولا، خط مراسل UAS MitoFish تيراغرام (UAS-E1B: mYFP، mitoCFP) تم استخدام mde6. هنا، يسمح للUAS ثنائي الاتجاه التعبير يصاحب ذلك من CFP المستهدفة mitochondrially وغشاء المستهدفة YFP. في تركيبة مع خطوط السائق GAL4 المناسبة، MitoFish تسمية الميتوكوندريا والخلية أغشية الخلايا العصبية الحسية RB (الجناح الشكل 2A-C) أو خلايا الشبكية (الشكل 3A، B) مع CFP و YFP ص espectively. الثانية، وهما UAS يبني (UAS: mitoCFP وUAS: MA-YFP) كانت مجتمعة مع سائق بناء GAL4 (الحسية: GAL4-VP16، الخلايا العصبية المحددة عناصر محسن الحسية من الجين جزيرة-1) 7 في الحقن عابرة. التعبير الفسيفساء التي تنتج عادة من هذه الحقن يسمح تتبع الخلايا الفردية خلال أيام (الشكل 2E). توظيف وثمة نهج ثالث استخدام اثنين من أشرطة UAS، يقود كل تعبير عن انصهار بروتين مختلف، على بناء متجاورة واحد. وقد استخدمت هذه الاستراتيجية لتوليد CentrinFish تيراغرام (UAS: cetn4-YFP، UAS: MA-فندق Cerulean) tum1، التي التحام centrin4-YFP تسميات جسيم مركزي واستهدف فندق Cerulean لأغشية الخلايا. في تركيبة مع خطوط محددة سائق GAL4 وصفت وجسيم مركزي وأغشية الخلايا من خلايا الشبكية (الشكل 3C، D) أو الألياف العضلية (الشكل 4).

والأنف والحنجرة "FO: المحافظة على together.within الصفحات =" 1 "> الشكل 2
الشكل 2: التصوير الميتوكوندريا في الجسم الحي في الخلايا العصبية الحسية الميزانيه العاديه من الزرد الجنينية.
الخلايا العصبية الحسية الميزانيه العاديه في الجزء الذيلية من حظيرة زعنفة من 2 DPF MitoFish تم تصوير باستخدام امزيغ الهدف 40X المياه غمس مخروط مع NA 0.80، إما عن طريق حقل واسع (A) أو متحد البؤر (ب) المجهري. لوحات لحق عرض التفاصيل موضحة. C-حقل واسع الوقت الفاصل بين الصور من منطقة صغيرة من الاهتمام في الشجرة الطرفية خلية عصبية RB في 2 DPF MitoFish المنطقة. وتابع حركة من الحبيبات الخيطية واحدة (السهم في 0 '') أكثر من 100 ثانية؛ يتم عرض ست نقاط الوقت. ويرد موقف الحبيبات الخيطية في الوقت نقطة سابقة في أرجواني. D موقف الحبيبات الخيطية تتحرك في C E متحد البؤر من الخلايا العصبية الحسية الميزانيه العاديه في 2 و 3 DPF. وقد تحقق وضع العلامات الخلايا RB الفردي والميتوكوندريا من قبل المشارك حقن السائق GAL4 الحسية العصبية محددة بناء جنبا إلى جنب مع اثنين من بنيات مراسل UAS، UAS: mitoCFP وUAS: MA-YFP، في مرحلة خلية واحدة والكشف عن معزولة مزدوجة خلايا -labeled. الصورة هي درجة تباين مقلوب ووصفت الميتوكوندريا الفردية تخطيطي كنقاط أرجواني. مقياس شريط B 20 ميكرون، C 2 ميكرون،E 50 ميكرون. Mitochondrially المستهدفة CFP (mitoCFP)، غشاء المستهدفة YFP (MA-YFP). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3): مقارنة واسعة المجال والفحص المجهري متحد البؤر لعضيات الصورة في الجسم الحي في شبكية العين الزرد الجنينية.
Otx2 عناصر المروج بالسيارة تعبير عن CFP في الميتوكوندريا وYFP في أغشية الخلايا (A و B) أو YFP في جسيم مركزي وفندق Cerulean في أغشية الخلايا (C و D) في شبكية العين من 2 DPF الأجنة الزرد. لتحقيق هذا النمط وضع العلامات، Otx2: تم الأسماك المعدلة وراثيا GAL4 إما عبروا إلى MitoFish (A و B) سص CentrinFish (C و D). تم استخدام الهدف امزيغ 40X المياه غمس مخروط (NA 0.80) للحصول على الصور من نفس المنطقة في كل شبكية العين باستخدام واسع المجال (A، C) ومتحد البؤر (B، D) المجهر. تظهر الأشكال في ألف وعرض B التفاصيل من منطقة الطبقة النووية الداخلية إدراجات في C و D خلية في M-المرحلة. مقياس شريط 20 ميكرون. استهدفت Mitochondrially CFP (mitoCFP)، غشاء المستهدفة YFP (MA-YFP)، centrin4-YFP (cetn4-YFP)، غشاء استهدفت فندق Cerulean (MA-فندق Cerulean). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4: مقارنة واسعة المجال وmicrosc مبائرسخ إلى جسيم مركزي الصورة في الجسم الحي.
والألياف العضلية واحد مع الموسومة fluorescently أغشية الخلايا وجسيم مركزي (Otx2: GAL4، CentrinFish) تم تصويرها باستخدام واسع المجال (A) ومتحد البؤر (ب) المجهري. في كلتا الحالتين تم استخدام الهدف امزيغ 40X المياه غمس مخروط (NA 0.80). مقياس شريط 10 ميكرون. Centrin4-YFP (cetn4-YFP)، استهدفت غشاء فندق Cerulean (MA-فندق Cerulean) الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

هنا، علينا أن نظهر براعة النظام التعبير GAL4-UAS إلى الميتوكوندريا العلامة fluorescently، جسيم مركزي والأغشية الخلوية من خلية أنواع محددة في الجسم الحي في الأجنة الزرد. العديد من البروتينات الانصهار فلوري أن تسمية العضيات الأخرى أو الهياكل التحت خلوية يمكن العثور عليها في الأدبيات المنشورة ويمكن الحصول عليها من معمل منها، مصادر تجارية أو مستودعات البلازميد غير تجارية (على سبيل المثال، Addgene). لتصميم انصهار بروتين فلوري جديد، تحتاج إلى النظر فيها، بما في ذلك التي FP لاستخدام وعما إذا كان لصهر FP في الأمينية أو كربوكسي محطة من البروتين من الفائدة العديد من المعلمات. للنقاش حول حول توليد البروتينات الانصهار فلوري، ويشار إلى القراء على مقالات متعمقة حول هذا الموضوع 49-51.

نسلط الضوء ثلاث استراتيجيات لتحقيق التعاون في التعبير عن البروتينات الانصهار باستخدام الجينات المحورة مدفوعة UAS. متعددة، separatالبريد UAS يبني مراسل تسمح للجمع بين مختلف مراسل الموجودة يبني دون الحاجة إلى استنساخ إضافي. ويمكن أيضا أن مستويات التعبير مراسل تكون معاير بشكل مستقل. ومع ذلك، يتم تحقيق مستويات أعلى من شارك في التعبير عندما تستخدم إما متعددة أشرطة UAS أو شريط كاسيت UAS ثنائي الاتجاه على بناء واحد. حيث يتم استخدام ضباط الإتصال من العلامات فمن السهل نسبيا للتحقق من شارك في التعبير. وتجدر الإشارة إلى أن وسائل أخرى للتعبير متعددة cistronic موجودة أيضا، بما في ذلك استخدام مواقع دخول الريباسي الداخلية 40 والببتيدات 2A الفيروسية 52،53. كبديل ليبني الحمض النووي القائم، كتب في المختبر توج يمكن استخدامها مرنا للتعبير عن البروتينات الانصهار فلوري لتسمية البنى التحت خلوية 1،4،8. التحذير من هذا النهج ولكن هذا التعبير يقتصر على الأيام القليلة الأولى من التنمية وليس الخلايا او الانسجة محددة. بغض النظر عن الطريقة التي يختارها للتعبير عن البروتينات الانصهار، فمن الأهمية بمكانللتأكد من أن مستويات التعبير لا تؤدي إلى وضع العلامات غير محددة وتسوية الحالة الفسيولوجية للخلايا. في هذا الصدد، والتضخيم من التعبير الجيني مراسل المتأصل في النظام GAL4-UAS 27 يمكن أن يكون مشكلة، ويظهر على سبيل المثال وضع العلامات عصاري خلوي حتى عندما يتم استهداف FP لعضية محددة. عندما تكون متاحة، يجب استخدام الأجسام المضادة للتحقق من أن أنماط التعبير التي حصلت عليها البروتينات الانصهار تعكس الحالة الذاتية. في بعض الحالات، يمكن حقن تركيزات منخفضة (إيه) DNA التخفيف من مشكلة سوء توطين انصهار بروتين. بدلا من ذلك، يمكن أن ناقلات مع عدد قليل من تكرار UAS يساعد على يعاير خفض مستويات التعبير التحوير 30. وبالمثل، على المنشط GAL4-VP16، نسخ معدلة موجودة، والتي تشير التقارير إلى قيادة التعبير نسبيا ضعيفة، وبالتالي فهي أقل سمية 30،33. إذا سوء توطين انصهار بروتين مستمر رغم الجهود المبذولة ليعاير داون مستويات التعبير التحوير، قد يكون من الضروري للتخلي عن نظام GAL4-UAS ودفع التعبير من قبل عناصر المروج مباشرة.

خطوط المعدلة وراثيا مستقرة، MitoFish 10 و CentrinFish 12، وصفنا في هذه المخطوطة تم إجراؤها باستخدام أشرطة 14xUAS. نحافظ على هذه الخطوط في الخلفية من خطوط السائق GAL4 للكشف عن تغيرات في التعبير على مدى أجيال، منذ خطوط مراسل يكرر UAS متعددة تم الإبلاغ عن أن تكون عرضة لإسكات 54. لم نر دليلا على إسكات عبر 3 أجيال قمنا نشر في CentrinFish. ومع ذلك شهدنا التعبير التلون في MitoFish وبالتالي صارم اختيار الأجنة مع مستويات قوية "كاملة"، التعبير لنشر للأجيال القادمة. وتشير الدراسات الحالية أن ناقلات التعبير مع تكرار 5xUAS يمكن أن يكون بديلا لتوليد خطوط المعدلة وراثيا مستقرة - مراسل هومدفوعا إلى مستويات عالية بما فيه الكفاية (30) وعدد قليل نسبيا من UAS يكرر قد جعلها أقل عرضة لإسكات التحوير، على الرغم من أن يكرر UAS غير المتكررة ويقال حتى أقل عرضة 54.

لوحة من ضباط الإتصال المتاحة حاليا لعضيات العلامة أو الهياكل التحت خلوية أخرى واسع جدا 55. عند اختيار FP معين كبصمة، ينبغي النظر إلى المعايير التالية: أولا، إن الإثارة وانبعاث أطياف FP لتحديد خط ليزر معين فضلا عن الإثارة وانبعاث المرشحات المطلوبة لتصور لها. ثانيا، السطوع والصور استقرار FP. ثالثا، السرعة التي FP ينضج الترجمة التالية. رابعا، إذا كانت FP لديه ميل إلى تجميع في اندماج. وفيما يتعلق المعلمة الأخيرة، يجب أن تمارس الرعاية وينبغي أن يتم ذلك تجارب السيطرة لاختبار مدى ملاءمة كل FP للتجارب محددة. على سبيل المثال، في حين أن إعادةوتستخدم د ضباط الإتصال mCherry وعن dsRed على نطاق واسع، يقال أنها تشكل الحصى في بعض اندماج 56. لقد وجدنا TagRFP-T 57، وأكثر من ذلك لصورة مستقرة البديل من TagRFP، لأداء جيدا عندما تستهدف الميتوكوندريا والأغشية الخلوية (الملاحظات غير منشورة). عندما تحتاج إلى تصور بصورة متزامنة، إطارا في الثانية مع أطياف غير متداخلة العضيات متعددة ينبغي استخدامها. وقد استخدمنا بنجاح مجموعات من ضباط الإتصال سماوي (CFP وفندق Cerulean) وYFP (الشكلان 2-4). من خلال استغلال النطاق الطيفي كامل من اللون الأزرق إلى الأحمر القريب، يمكن للمرء أن زيادة كبيرة في عدد من الهياكل التحت خلوية يمكن تصور في وقت واحد 2. بالإضافة إلى ضباط الإتصال التقليدية،-صور activatable ضباط الإتصال مفيدة بشكل خاص للتحقيق في ديناميات عضية، على سبيل المثال، استخدام FP Kaede الذي لتتبع مصير الميتوكوندريا الفردي 58.

الذي المجهري تقنية - واسعة المجال أو متحد البؤر - هو الأكثرمناسب للتصوير يعتمد على عدد من العوامل، بما في ذلك موقع الخلايا للتصوير والسرعة التي من المتوقع أن تحدث أحداث التحت خلوية أو خلوية معينة. المجهر واسعة المجال هو الطريقة المفضلة في مواقع سطحية والعينات وصفت قليلة. ويقدم المنخفضة الصور سمية والتصوير بسرعة عالية بسعر معقول. ومع ذلك، إذا التصوير يحتاج إلى أن يقوم في الأجزاء غير سطحية من الزرد، في عينات المسمى كثيفة أو للحصول على معلومات ثلاثية الأبعاد، متحد أو أي شكل آخر من المجهر الضوئي باجتزاء يصبح الأسلوب المفضل.

بغض النظر عن الذي تتم مراقبته البنية الخلوية أو التحت خلوية، غالبا ما يكون هناك مفاضلة بين الحصول على أفضل صورة ممكنة والحفاظ على عينة حية وفي حالة فسيولوجية جيدة لتكرار الوقت الفاصل بين التصوير. صور سمية يمكن أن يعبر عن التغيرات في سلوك العضيات، مورفولوجيا شاذة من خلايا أو حتى الخليةالموت. المفتاح للحد من الصور وتبييض والصور سمية على حد سواء واسعة المجال والفحص المجهري متحد البؤر هو استخدام أدنى المستويات الممكنة من الضوء للحصول على الصور. في هذا الصدد، والأهداف مع أعلى ممكن NA هي المفتاح لتحقيق أقصى قدر من إشارة الفلورسنت التي يمكن جمعها. للفحص المجهري متحد البؤر، وعدد من المعلمات ويمكن تعديلها لتعويض استخدام أقل قوة الليزر. كاشفات مع كفاءة الكم أعلى مقارنة هذه الفرق التقليدية، على سبيل المثال، للكشف عن فوسفيد زرنيخيد، ويمكن استخدامها لضمان هم أكثر عرضة ليتم الكشف عن أن الفوتونات المنبعثة. بدلا من ذلك أو بالإضافة إلى ذلك، يمكن تطبيق أعلى الفولتية dynode في PMT لزيادة حساسية للكشف. الفتحة مبائر (الثقب) يمكن فتحها للسماح لجمع المزيد من إشارة الفلورسنت، وإن كان ذلك مع فقدان القرار المحوري. لفضح عينات لضوء أقل قدر ممكن، وينبغي أن يتم المسح بسرعات عالية مثل أن مدة انتظارليزر لكل بكسل منخفضة. المسح على القرار المكانية انخفاض له أيضا تأثير زيادة سرعة المسح الضوئي. التصوير أقل كثيرا له فائدة إضافية تتمثل في تعريض العينة إلى ضوء أقل، ولكن ينبغي النظر إلا إذا كان لا يضر أخذ عينات شاملة للعمليات التحقيق.

وكبديل لذلك، القرص الغزل المجاهر مبائر والمجهر متحد البؤر التي تكون مجهزة مع ما يسمى الماسح الضوئي "مدوية" توفر القدرة على مسح سريع. الطريقتين لديها ميزة أنها أسرع وأقل المجاهر مبائر "الكلاسيكية"، نقطة المسح الضوئي للصور سمية من. ومع ذلك، القرص الغزل المجاهر مبائر محدودة أكثر في زي قرار، ولا يمكن تخترق بعمق في النسيج كما المجاهر نقطة مسح متحد البؤر. وبالمثل، فإن تطبيق المجاهر مبائر الرنانة الماسح الضوئي يمكن أن تكون محدودة كما بكسل مدة بقاء قصيرة جدا من شأنها أن تؤدي إلى أقل جودة الصورة التي يمكن،بدوره، يحول دون الكشف عن الأحداث الفرعية الخلوية (على سبيل المثال، صور ثنائية مع انخفاض إشارة إلى الضوضاء).

وأخيرا، في حين يتم تسليط الضوء واسعة المجال والتصوير متحد البؤر هنا، أشكال أخرى من المجهر الضوئي مثل ثنائي الفوتون 59 والخفيفة ورقة الفحص المجهري 60 قد يكون أكثر ملاءمة لأسئلة محددة. ويستند المجهر ثنائي الفوتون على الإثارة من fluorophore من امتصاص وقت واحد من اثنين من الفوتونات في نطاق الأشعة تحت الحمراء من الطيف الضوئي. من القواسم المشتركة مع المجهر متحد البؤر، ويستخدم المسح أشر إلى الحصول على صور من العينة ولديها قدرات باجتزاء البصرية بحكم غير الخطي من الإثارة ثنائي الفوتون. استخدام ضوء الطول الموجي الطويل لإثارة fluorophore يسمح التصوير في أعماق عدة مئات من ميكرون من السطح. وعلاوة على ذلك تقييد الإثارة إلى وحدة تخزين صغيرة التصوير يمنع الصور وتبييض والصور سمية خارج البؤري. ومع ذلك، ليس كل FPالصورة لديهم ارتفاع في امتصاص multiphoton المقاطع العرضية، وهي المشكلة التي هي سائدة بشكل خاص في الحمراء الثانية. وعلاوة على ذلك، العثور على الطول الموجي الأشعة تحت الحمراء واحد لتثير في وقت واحد ضباط الإتصال متميزة متعددة من الصعب، مما يجعل متعدد القنوات التصوير مرهقة. يستخدم ورقة الخفيفة المجهري لصحيفة '' رقيقة (عادة سماكة تتراوح 2-10 ميكرون) من ضوء الليزر لإثارة العينة، وبالكشف عن إشارات مضان من هذا المستوى البؤري مضيئة في زاوية عمودية باستخدام كاميرا حساسة. ويتحقق باجتزاء البصري إلقاء الضوء على طائرة واحدة في وقت واحد. هذا التقييد من ضوء الإثارة يقلل من حدوث الصور سمية. منذ يتم جمع إشارات مضان من الطائرة مضاءة كلها في وقت واحد، الحصول على الصور هو أسرع بكثير من نقطة متحد البؤر المسح الضوئي والمجهر multiphoton. كل هذه الخصائص تجعل ورقة ضوء المجهر مناسبة بشكل خاص لتصوير الأحداث الخلوية الحيوية لقرار الزمانية المكانية العالية فيكميات كبيرة من العينات الحية. في الواقع، كانت تتبع باستخدام ورقة ضوء مصير الخلايا المجهري في الجنين الزرد كامل شامل خلال 24 ساعة الأولى من تطوير 61. مع التحسينات المستمرة لأفضل 62،63 اختراق التصوير والتحليل المكاني 64، فمن المتصور أن الخفيفة ورقة المجهر وسوف تستخدم لتحقيق دينامية ليس فقط في قطاع الخليوي ولكن أيضا على المستوى التحت خلوية في الأجنة الزرد بأكملها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose (2-hydroxyethylagarose) Sigma-Aldrich A4018-10G Low-gelling temperature Type VII
Block heater Eppendorf Thermomixer compact
Ca(NO3)2 Calcium nitrate hydrate, 99.996%  Aldrich 202967-50g To prepare 30x Danieau's
CCD camera Qimaging Retiga Exi Fast 1394
Ceramic Coated Dumont #5 Forceps Dumont - Fine Science Tools 11252-50 #5 Forceps
Confocal laser-scanning microscope Olympus FV1000 Fluoview
Culture dish heater Warner Instrument Corporation DH-35 Heating ring
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfate salt PharmaQ Tricaine PharmaQ-25g Tricaine (anesthetic)
Fluorescence dissecting microscope Leica M205 FA
GeneClean kit MP Biomedicals 111001200
Glass Bottom Culture Dishes MatTek Corporation P35G-0-14-C 35 mm petri dish, 14 mm microwell, No. 0 coverglass
Glass needles World Precision Instruments Inc.  TW100F-4 For microinjections
HEPES Sigma H3375-250g To prepare 30x Danieau's
High vacuum grease Dow Corning  DCC000001242 150g Silicon dioxide grease
KCl 99% Sigma-Aldrich S7643-5kg To prepare 30x Danieau's
MgSO4.7H2O   Magnesium sulfate heptahydrate 98+% A.C.S reagent Sigma-Aldrich 230291-500g To prepare 30x Danieau's
Microinjector  Eppendorf FemtoJet
Microloader tips Eppendorf 930001007 0.5-20 ul
Micromanipulator Maerzhaeuser Wetzlar MM33 Rechts/00-42-101-0000/M3301R
Micropipette holder Intracel P/N 50-00XX-130-1
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit Ambion AM1340 To transcribe PCS-Transposase
NaCl BioXtra >99.5% Sigma-Aldrich P9541-1kg To prepare 30x Danieau's
Nanophotometer To measure DNA/RNA concentration
Needle puller Sutter Instrument P-1000 Flaming/Brown
NIR Apo 40x/0.80W  Nikon Water-dipping-cone objective
N-Phenylthiourea Grade I, approx. 98% Sigma P7629-10G PTU (prevents pigmentation)
Petri dishes Sarstedt AG  821472 92 x 16mm 
Plastic molds  Adaptive Science Tools TU-1 For microinjections
Plexiglas cover-with a hole Custom-made The hole in the Plexiglas cover should be 3 mm larger than the diameter of the water-dipping-cone objective
Tea-strainer (Plastic) To collect zebrafish eggs
Temperature controller Warner Instrument Corporation TC-344B Dual Automatic Temperature Controller
Transfer pipettes Sarstedt AG  86.1171 3.5mL plastic transfer pipettes
UMPlanFI 100x/1.00W Olympus Water-dipping-cone objective
UMPlanFLN 20x/0.50W  Olympus Water-dipping-cone objective
Widefield microscope Olympus BX51WI
PTU (50x Stock) Dissolve 76 mg PTU in 50 ml distilled water
Stir vigorously at room temperature 
Store at -20 oC in 1 ml aliquots
Use at 1x working solution
Tricaine (20x Stock) Dissolve 200 mg Tricaine in 48 ml distilled water
Add 2 ml 1M Tris base (pH9)
Adjust to pH 7 
Store at -20 oC in 1 ml aliquots
Use at 1x working solution
Danieau's Solution (30x Stock) 1,740 mM  NaCl 
21 mM      KCl 
12 mM      MgSO4.7H2
18 mM      Ca (NO3)2
150 mM    HEPES buffer 
Distilled water upto 1 L 
Store at 4 o
Use at 0.3x working solution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alexandre, P., Reugels, A. M., Barker, D., Blanc, E., Clarke, J. D. Neurons derive from the more apical daughter in asymmetric divisions in the zebrafish neural tube. Nat Neurosci. 13, (6), 673-679 (2010).
  2. Distel, M., Hocking, J. C., Volkmann, K., Koster, R. W. The centrosome neither persistently leads migration nor determines the site of axonogenesis in migrating neurons in vivo. J Cell Biol. 191, (4), 875-890 (2010).
  3. Godinho, L., et al. Nonapical symmetric divisions underlie horizontal cell layer formation in the developing retina in vivo. Neuron. 56, (4), 597-603 (2007).
  4. Norden, C., Young, S., Link, B. A., Harris, W. A. Actomyosin is the main driver of interkinetic nuclear migration in the retina. Cell. 138, (6), 1195-1208 (2009).
  5. Godinho, L., et al. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. 132, (22), 5069-5079 (2005).
  6. Mumm, J. S., et al. In vivo imaging reveals dendritic targeting of laminated afferents by zebrafish retinal ganglion cells. Neuron. 52, (4), 609-621 (2006).
  7. Sagasti, A., Guido, M. R., Raible, D. W., Schier, A. F. Repulsive interactions shape the morphologies and functional arrangement of zebrafish peripheral sensory arbors. Current biology : CB. 15, (9), 804-814 (2005).
  8. Zolessi, F. R., Poggi, L., Wilkinson, C. J., Chien, C. B., Harris, W. A. Polarization and orientation of retinal ganglion cells in vivo. Neural Dev. 1, 2 (2006).
  9. Kim, M. J., Kang, K. H., Kim, C. H., Choi, S. Y. Real-time imaging of mitochondria in transgenic zebrafish expressing mitochondrially targeted GFP. Biotechniques. 45, (3), 331-334 (2008).
  10. Plucinska, G., et al. In vivo imaging of disease-related mitochondrial dynamics in a vertebrate model system. J Neurosci. 32, (46), 16203-16212 (2012).
  11. O'Donnell, K. C., Vargas, M. E., Sagasti, A. WldS and PGC-1alpha regulate mitochondrial transport and oxidation state after axonal injury. J Neurosci. 33, (37), 14778-14790 (2013).
  12. Engerer, P., Yoshimatsu, T., Suzuki, S. C., Godinho, L. CentrinFish permit the visualization of centrosome dynamics in a cellular context in vivo. Zebrafish. 11, (6), 586-587 (2014).
  13. Wang, K., et al. Rapid adaptive optical recovery of optimal resolution over large volumes. Nat Methods. 11, (6), 625-628 (2014).
  14. Randlett, O., Poggi, L., Zolessi, F. R., Harris, W. A. The oriented emergence of axons from retinal ganglion cells is directed by laminin contact in vivo. Neuron. 70, (2), 266-280 (2011).
  15. Tanabe, K., et al. Atypical protein kinase C regulates primary dendrite specification of cerebellar Purkinje cells by localizing Golgi apparatus. J Neurosci. 30, (50), 16983-16992 (2010).
  16. Hocking, J. C., Distel, M., Koster, R. W. Studying cellular and subcellular dynamics in the developing zebrafish nervous system. Exp Neurol. 242, 1-10 (2013).
  17. Clark, B. S., Winter, M., Cohen, A. R., Link, B. A. Generation of Rab-based transgenic lines for in vivo studies of endosome biology in zebrafish. Dev Dyn. 240, (11), 2452-2465 (2011).
  18. Paolini, A., et al. Asymmetric inheritance of the apical domain and self-renewal of retinal ganglion cell progenitors depend on Anillin function. Development. 142, (5), 832-839 (2015).
  19. Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. The Journal of clinical investigation. 122, (7), 2337-2343 (2012).
  20. Steele, S. L., Prykhozhij, S. V., Berman, J. N. Zebrafish as a model system for mitochondrial biology and diseases. Translational research : the journal of laboratory and clinical medicine. 163, (2), 79-98 (2014).
  21. Novorol, C., et al. Microcephaly models in the developing zebrafish retinal neuroepithelium point to an underlying defect in metaphase progression. Open biology. 3, (10), 130065 (2013).
  22. Baye, L. M., et al. The N-terminal region of centrosomal protein 290 (CEP290) restores vision in a zebrafish model of human blindness. Human molecular genetics. 20, (8), 1467-1477 (2011).
  23. Flinn, L. J., et al. TigarB causes mitochondrial dysfunction and neuronal loss in PINK1 deficiency. Annals of neurology. 74, (6), 837-847 (2013).
  24. Paquet, D., et al. A zebrafish model of tauopathy allows in vivo imaging of neuronal cell death and drug evaluation. The Journal of clinical investigation. 119, (5), 1382-1395 (2009).
  25. Khuchua, Z., Yue, Z., Batts, L., Strauss, A. W. A zebrafish model of human Barth syndrome reveals the essential role of tafazzin in cardiac development and function. Circulation research. 99, (2), 201-208 (2006).
  26. Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of development. 80, (2), 153-158 (1999).
  27. Koster, R. W., Fraser, S. E. Tracing transgene expression in living zebrafish embryos. Dev Biol. 233, (2), 329-346 (2001).
  28. Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nat Methods. 2, (12), 920-931 (2005).
  29. Sambrook, J., Russell, D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  30. Distel, M., Wullimann, M. F., Koster, R. W. Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (32), 13365-13370 (2009).
  31. Skene, J. H., Virag, I. Posttranslational membrane attachment and dynamic fatty acylation of a neuronal growth cone protein, GAP-43. J Cell Biol. 108, (2), 613-624 (1989).
  32. Zuber, M. X., Strittmatter, S. M., Fishman, M. C. A membrane-targeting signal in the amino terminus of the neuronal protein GAP-43. Nature. 341, (6240), 345-348 (1989).
  33. Asakawa, K., et al. Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (4), 1255-1260 (2008).
  34. Godinho, L. Injecting zebrafish with DNA or RNA constructs encoding fluorescent protein reporters. Cold Spring Harb Protoc. 2011, (7), 871-874 (2011).
  35. Palanca, A. M., Sagasti, A. Optogenetic activation of zebrafish somatosensory neurons using ChEF-tdTomato. J Vis Exp. (71), e50184 (2013).
  36. Dean, D. A., Gasiorowski, J. Z. Preparing injection pipettes on a flaming/brown pipette puller. Cold Spring Harb Protoc. 2011, (3), prot5586 (2011).
  37. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, (3), 253-310 (1995).
  38. Ren, J. Q., McCarthy, W. R., Zhang, H. W., Adolph, A. R., Li, L. Behavioral visual responses of wild-type and hypopigmented zebrafish. Vision Research. 42, (3), 293-299 (2002).
  39. Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, Suppl 1. S7 (2007).
  40. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev Dyn. 236, (11), 3088-3099 (2007).
  41. Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Dev Dyn. 228, (1), 30-40 (2003).
  42. Davidson, A. E., et al. Efficient gene delivery and gene expression in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon. Dev Biol. 263, (2), 191-202 (2003).
  43. Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Dev Cell. 7, (1), 133-144 (2004).
  44. Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. Efficient transposition of the Tol2 transposable element from a single-copy donor in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (50), 19827-19832 (2008).
  45. Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th ed, University of Oregon Press. (2007).
  46. Wilkinson, R. N., Elworthy, S., Ingham, P. W., van Eeden, F. J. A method for high-throughput PCR-based genotyping of larval zebrafish tail biopsies. Biotechniques. 55, (6), 314-316 (2013).
  47. Carter, K. M., Woodley, C. M., Brown, R. S. A review of tricaine methanesulfonate for anesthesia of fish. Rev Fish Biol Fisher. 21, (1), 51-59 (2011).
  48. Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using microManager. Curr Protoc Mol Biol. 14.20 (2010).
  49. Snapp, E. L. Design and Use of Fluorescent Fusion Proteins in Cell Biology. Curr Protoc Cell Biol. 21.4 (2005).
  50. Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends in cell biology. 19, (11), 649-655 (2009).
  51. Costantini, L. M., Snapp, E. L. Fluorescent proteins in cellular organelles: serious pitfalls and some solutions. DNA and cell biology. 32, (11), 622-627 (2013).
  52. Provost, E., Rhee, J., Leach, S. D. Viral 2A peptides allow expression of multiple proteins from a single ORF in transgenic zebrafish embryos. Genesis. 45, (10), 625-629 (2007).
  53. Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLoS One. 6, (4), e18556 (2011).
  54. Akitake, C. M., Macurak, M., Halpern, M. E., Goll, M. G. Transgenerational analysis of transcriptional silencing in zebrafish. Dev Biol. 352, (2), 191-201 (2011).
  55. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2, (12), 905-909 (2005).
  56. Katayama, H., Yamamoto, A., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. GFP-like proteins stably accumulate in lysosomes. Cell Struct Funct. 33, (1), 1-12 (2008).
  57. Shaner, N. C., et al. Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins. Nat Methods. 5, (6), 545-551 (2008).
  58. Marinkovic, P., et al. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (11), 4296-4301 (2012).
  59. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2, (12), 932-940 (2005).
  60. Keller, P. J., Ahrens, M. B. Visualizing Whole-Brain Activity and Development at the Single-Cell Level Using Light-Sheet Microscopy. Neuron. 85, (3), 462-483 (2015).
  61. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, (5904), 1065-1069 (2008).
  62. Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nat Methods. 8, (9), 757-760 (2011).
  63. Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy. Nat Methods. 9, (7), 755-763 (2012).
  64. Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346, (6208), 1257998 (2014).
التصوير الهياكل التحت خلوية في الأجنة الحية اسماك الزرد
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Engerer, P., Plucinska, G., Thong, R., Trovò, L., Paquet, D., Godinho, L. Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (110), e53456, doi:10.3791/53456 (2016).More

Engerer, P., Plucinska, G., Thong, R., Trovò, L., Paquet, D., Godinho, L. Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (110), e53456, doi:10.3791/53456 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter