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Developmental Biology

在活斑马鱼胚胎成像的亚细胞结构

doi: 10.3791/53456 Published: April 2, 2016

Introduction

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体内成像提供在最生理上下文细胞行为的直接可视化。斑马鱼的胚胎,其快速的外部发展和丰富的允许荧光标记的遗传工具阵列的透明度,都促使越来越多地使用在体内显微镜阐明关键发育事件的动态。在斑马鱼神经系统发育的成像研究,例如大大扩展了我们的神经祖细胞的行为和他们的后代,包括其后续迁移,分化和电路集成1-8命运的知识。

舞台现在设置调查亚细胞动力学这些细胞行为背后。事实上,斑马鱼已经被利用作为用于体内细胞生物学的工具。它现在是可能的可视化线粒体9-11,中心体2,8,12-14,高尔基15中,微管4和肌动蛋白16细胞骨架,内涵体17和顶膜的组件复杂1,18,体内斑马鱼胚胎其他亚细胞结构中。到目前为止,大部分的所谓对这些细胞器的功能来自于培养细胞研究他们的行为。而体外研究已经取得了巨大的洞察细胞生物学,细胞培养并不完全代表的体内情况的复杂性和因此不一定反映功能和体内亚细胞器的动力学。斑马鱼的胚胎提供体内替代一个可行的检查亚动态。

作为脊椎动物,斑马鱼拥有的同源那些在哺乳动物中发现许多器官系统( 例如,视网膜神经)。此外,斑马鱼的胚胎被越来越多地用于人类疾病19,20建模例如,小畸形21和勒伯尔先天性黑蒙22)和线粒体功能( 例如,帕金森氏病23,τ蛋白病10,24和巴特综合征25), 在体内在细胞和亚细胞水平的成像在这些情况下,将允许更好地了解细胞生物学的这些病理状态的根本。

这里描述的方法的总的目标是提供一种全面的指导来调查在使用体内光学显微镜斑马鱼胚胎细胞器和其它亚细胞结构。 参与体内可视化和跟踪亚细胞结构,整个工作流程描述-遗传标记的方法,以产生瞬时表达和稳定的转基因鱼,最后采用宽视场和共聚焦显微镜成像。虽然这些PROC的edures用于由众多斑马鱼实验室,中所述的协议进行了优化和简化调查亚细胞结构的动态。此处所描述的工作的两个特定方面值得提及:首先,使用在多个配置的GAL4-UAS表达系统在特定细胞类型的基因标签的细胞器。第二,宽视场和共聚焦显微镜的体内直接比较对图像亚细胞结构。

目前的策略,以转基因标签的细胞器和其他亚细胞结构的斑马鱼要么利用皑皑的mRNA 1,4,8或基于DNA的结构,其中子元件直接驱动融合蛋白9,14,15。 体外转录加帽的RNA结果的表达快速和广泛的表达,这不是组织特异性但是。此外,表达水平降低随着时间的推移加帽的RNA稀释或退化。因此,使用RNA的基于构造来检查在发育后期阶段的细胞器动力学是有限的(通常为3天受精后)。

这些限制可通过使用DNA构建,其中表达的空间和时间控制由特定的启动子元件决定来克服。当基于DNA构建中,以转基因表达水平的GAL4-UAS系统显著改善的上下文被用于观察26,27。在此二分表达系统,细胞类型特异性启动子元件驱动的转录激活的Gal4的表达,而报道基因被克隆的Gal4的结合上游激活序列(UAS)的下游。由UAS记者用适当的Gal4的驱动相结合,表达可以被限制到特定的细胞类型,绕过需要每一个特定的表达模式所需时间来克隆的报告基因的不同启动子的后面。此外,多个UAS报告基因的表达可以是由一个单一的Gal4的激活驱动。与GAL4-UAS系统,从而为亚细胞标记的一种多功能灵活的遗传方式。

宽视场和共聚焦显微镜是大多数实验室的工作母机。宽视场系统通常使用弧光灯作为光源,并使用被放置在光路的端部的敏感照相机检测所发射的光。此成像模态典型地限制为薄的样品作为失焦光掩盖较厚样品在焦信息。共焦显微镜之处在于它们是建立有利于从焦平面比那些源于失焦( “光学切片”)28日发起信号,宽领域的系统有所不同。以实现光学切片的针孔被放置在发射路径中的共轭位置以所述点光源。激光器被用作光源和信号与光电倍增管(PMT)来检测。实际上,激光束在样品刷卡逐点和在各点(像素)的荧光发射由光电倍增管检测到。

在这里,我们的图像中同时使用宽视场和共聚焦显微镜以提供镜方式的直接比较活的斑马鱼胚胎非常相同的亚细胞结构。提供这种比较的基础的目的是提供选择适合手边的特定问题的最合适的显微技术的指导方针。

使用这里介绍我们证明线粒体和中心体的GAL4-UAS的遗传标记的方法。这些细胞器是使用宽视场和共聚焦显微镜来证明每个成像模态的适用性在不同细胞类型中的肌肉细胞的神经系统和成像。这里描述的方法可以容易地适于在活斑马鱼胚胎调查其他细胞器和亚细胞结构。

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Protocol

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所有的动物实验均按照上巴伐利亚(德国慕尼黑)政府的地方性法规执行。

1.标签细胞器和其他亚细胞结构

注:此处的基因记者构造了荧光标记中心体,线粒体和细胞膜中描述。

  1. 使用传统的克隆方法29来产生荧光标记中心体和线粒体融合蛋白。克隆在帧斑马鱼centrin4(cetn4)的用荧光蛋白2(FP)的编码序列,如黄色荧光蛋白生成cetn4-YFP。克隆框内与FP细胞色素C氧化酶亚基VIII线粒体靶序列,如青色荧光蛋白生成mitoCFP 9-11。
  2. 要限制融合蛋白(cetn4-YFP或mitoCFP)表达对斑马鱼的特异性细胞ISH胚胎( 神经元或肌肉细胞)使用二分GAL4-UAS表达系统26,27。首先生成一个UAS记者结构。使用传统的方法来克隆在UAS表达载体的融合蛋白,所述Gal4的结合UAS盒的下游(变体的范围从1倍至14倍的UAS,见讨论)26,27,30和最小启动子(E1B基本启动子从鲤鱼βactin基因),并产生UAS:cetn4-YFP和UAS:mitoCFP。
    注:要准备UAS记者对稳定转基因株系产生额外的元素需要被克隆的构建(见下文3)
  3. 为了显现,其中中心体或线粒体标记的细胞环境,生成UAS报道构建在哪个小区膜通过的FP标记。克隆斑马鱼GAP43(含有棕榈酰化位点)在帧与FP第一二十种氨基酸来定位FP到细胞膜(memFP)31,32。
  4. ObtaiN驱动构建体或转基因品系中的细胞类型特异性启动子元件驱动的转录活化因子GAL4-VP16 27 Gal4FF 33或KalTA4 30的表达。
  5. 结合UAS记者与相应的驱动程序结构构造限制言论自由为所需的细胞类型的利益( 例如,在神经元和肌肉细胞)。要做到这一点共注入Gal4驱动子和UAS记者在受精卵的单细胞阶段构建(详细说明见下文2),以产生瞬时表达鱼。另外,生成一个UAS记者稳定的转基因线(下面的详细说明,请参阅3)和跨到Gal4驱动子稳定的转基因品系产生的后代轴承两种转基因。
    注意:也可以注入UAS报道构建/秒到从Gal4驱动子稳定的转基因系或Gal4驱动子构造成fertiliz受精卵编鸡蛋从UAS记者稳定的转基因线。
  6. A.多个单独的UAS记者构造( 例如,UAS:mitoCFP和UAS:memYFP合作,共同表达使用GAL4-UAS系统多个不同的融合蛋白,在以下配置之一使用Gal4的驱动程序和UAS记者/秒与Gal4驱动子结构-injected)10,在一个记者B.多UAS磁带( 例如,UAS:cetn4-YFP,UAS:memCerulean)12 C.双向UAS记者( 例如 UAS:memYFP,mitoCFP)2,10,24( 图1)。

图1
图1.策略共表达使用GAL4-UAS系统融合蛋白。
(A)的多个单独的UAS驱动常量:多个融合蛋白的共表达可以通过使用各种配置的UAS记者盒来实现ructs,(B)上的单个构造或(C)在单个构建双向卡带UAS无人机多个磁带。 请点击此处查看该图的放大版本。

2.生成瞬时表达鱼

注:以下是先前公布的协议34,35的适应。一个基本的喷射设置应该包括具有放大倍率范围高达12倍立体显微镜,用微量夹持一个显微和空气压力源。 2.1-2.5准备提前时间:

  1. 以制备蛋显微注射室中,制备的1.5%在水中的溶液(重量/体积)琼脂糖。琼脂糖粉末添加到水中,微波,直至琼脂糖完全溶解。填培养皿(100×15毫米),用该溶液。
    1. 允许琼脂糖溶液冷却到大概oximately 45℃下放置一个塑料注射模具英寸(40毫米X 66毫米,6×50mm长脊该有1.5毫米宽,1mm深和间隔3毫米),将熔融的琼脂糖的表面上,注意不要前在界面引入气泡。
    2. 琼脂糖套后,储存于4°CO / N。小心取出用锅铲模具。同时在摄氏 4 准备多个显微注射室,存储和重复使用在几个星期。
  2. 使用微量拉马产生的玻璃毛细管注射用长柄36。
    注:用来产生喷射毛细管的特定的设置应根据经验确定。注射毛细管可提前被拉动并在使用之前储存。
  3. 测量质粒DNA(Gal4驱动子和UAS报道构建),用于使用根据制造商的手册分光光度计显微注射的浓度。测量60;吸光度在260nm和280nm(A260 / 280)的比值。稀释该DNA至100毫微克/微升的在无核酸酶水的最终浓度。
    注:A260 / 280的比值1.8〜纯标志着DNA。考虑使用商业试剂盒(基于二氧化硅基结合矩阵)纯化以用于注射的质粒DNA。质粒DNA应该是高质量的,以防止毒性。
  4. 通过组合的DNA(0.5〜2.5微升100纳克/微升库存的为5至20毫微克/微升的最终浓度),Danieau的溶液制备10微升注射混合物(0.33微升30倍股票),酚红(0.25微升,可选)和无核酸酶水到10微升总体积。
    注意:根据经验确定产生合适的表达的DNA的浓度。 Gal4驱动子和UAS报道质粒需要进行共注射。当只有Gal4的驱动程序或UAS报告基因质粒注入野生型受精卵没有表情会随之而来。然而,如果ŧ他受精卵是从Gal4驱动子行,然后是一个或几个UAS记者质粒注射足够。相反,如果显微注射到UAS记者线,只Gal4驱动子质粒需要被注入。最后,虽然酚红能够极大地有助于可视注射剂,它也是一种荧光化合物本身。因此,如果成像前24小时,受精后(HPF)计划,因为它可能不被充分地此时稀释含酚红可能掩盖可视化的FP。
  5. 注射前的晚上计划,雄性和雌性斑马鱼进行繁殖的设置几组(一般为5〜10)。使用繁殖罐与含有网格底部和可拆卸的分配器的雌雄鱼分离的插入物。
    注:男,女斑马鱼一般可以通过自己的体形加以区分。男性往往是修长而女性往往表现出腹部凸出的腹部。男性另外倾向于具有泛黄的红色山口O形圈对他们的腹侧腹部。
  6. 紧接之前的DNA注射,取出分隔,以允许雌雄交配。除去除法后大约15至30分钟,检查蛋在​​槽的底部。使用渔网到一个新的养殖池转移成鱼。
  7. 倒入水中,包含新铺的受精卵,进行养殖池的成了筛子( 例如,一个塑料茶过滤器)。在使用含有Danieau的溶液喷雾瓶筛洗蛋。倒置筛上的培养皿,并使用喷射瓶以Danieau的溶液恢复所有鸡蛋(每育种通常为50至200鸡蛋一对成鱼)。
  8. 使用微加载吸管,背面填充拉动注射毛细管与DNA注射混合。挂载注入毛细管导入一个显微的持有人,并修剪尖,体视显微镜的视觉控制下,使用镊子来创建一个微管,可以PEnetrate而被绒毛膜和细胞质能够提供的DNA的合适的体积。
    注:向其中加样毛细管的前端修剪应凭经验确定和注入卵时能最好地判断的程度。
  9. 以确定的DNA注射的体积,放电注射溶液进入矿物油的下降。测量使用校准微米液滴的半径(r),并计算其体积(4/3πR 3)。通过调节喷射压力和/或各喷射脉冲的持续时间调节音量。
  10. 用塑料吸管,转移所有收集到的蛋(通常为50-200,从上面2.7)进入注射室的战壕。下一个立体的视觉控制,使用镊子定向,使得细胞质(透明)和蛋黄(致密,非透明)可容易地确定的蛋。
  11. 在一个立体的视觉控制显微镜,注入DNA导入受精卵的细胞质,小心,以确保注射量(1至2 NL)对应于小区的体积的约10%。
    注:酚红中的DNA溶液助剂中喷射出的体积的可视化。
  12. 注射后,通过用含有Danieau的溶液喷雾瓶冲洗他们松开从注塑模的沟槽的蛋。随后用塑料移液管转移鸡蛋放入一个新的培养皿中,并在28.5 摄氏度孵化器维护。
  13. 保持未注射的鸡蛋作对照,以确定是否注射造成的高死亡率,无论是作为微量渗透或DNA混合物期间遭受物理损伤的结果。
    注意:高死亡率以下注射可能是由于多种因素,其中包括过高DNA浓度或注射体积和/或质粒与contaminaNTS。为了防止从低质量的DNA用制剂毒性,商用试剂盒(基于二氧化硅基结合矩阵)都可以使用。
  14. 在注射之后定期,使用立体显微镜筛选未受精蛋和死或畸形的胚胎和放弃这些。
    注:认为似乎是在受精后的单细胞阶段几个小时,作为未受精的鸡蛋。标识由大体解剖缺陷胚胎畸形,如受损前后体轴。一个绒毛膜内非晶材料表明,胚胎没有通过发育阶段进行而死。要确定是否显微注射胚胎的发展经历一个正常的过程中咨询解剖图谱37。
  15. 传送用塑料移液管将胚胎含有1x 1-苯基10和24 HPF之间-2-硫脲(1xPTU),以防止颜料的形成Danieau的溶液。维持Danieau的解决方案续胚胎癌宁PTU在实验的持续时间。
    注意:除了黑色素细胞,皮肤的表面上的虹色细胞可以是用于成像问题。而PTU不抑制iridophore阵型,存在突变品系用虹色细胞的数目如洛伊奥比森(罗伊)减少并可以使用38。
  16. 胚胎孵化后(通常在第二或第三天受精后,2或3旦),弃去绒毛膜和交换包含PTU的Danieau的溶液。
    注意:这些步骤是重要的,以确保胚胎介质的质量和健康的胚胎的生存能力。

3.生成稳定的转基因品系

注:稳定转基因系可以使用TOL2座子系统有效地产生。与mRNA的编码转座酶到施肥沿着含有感兴趣的转基因的TOL2座子载体是共注射Ð鸡蛋在单细胞阶段。由注入的mRNA衍生的转座蛋白催化从转座子载体及其集成的转基因盒的切除入基因组39。

  1. 克隆转基因记者盒( 例如,UAS:mitoCFP)TOL2之间在当前在斑马鱼社区用作描述40 TOL2向量之一反向末端重复。
    注:含有一个可选择的暗盒TOL2载体,其中启动子元件驱动的无关的感兴趣的区域的器官系统的FP表达( 例如,心脏41或透镜42)是在不存在Gal4的反式激活的筛选UAS记者转基因系是有用的。
  2. 使用商业试剂盒(基于二氧化硅基结合矩阵),纯化后用于注射的质粒DNA。确保该质粒DNA是高质量的,以防止毒性。
  3. 转录使用TOL2转座编码基因合适的转录载体如PCS-TP 43。简单地说,线性PCS-TP和使用商业工具包生成皑皑的mRNA和遵循制造商的协议。注意避免RNA酶的污染( 例如,使用无RNA酶的枪头和管)。分装的RNA,在100毫微克/微升的浓度,为单次使用,并储存于-80℃。
  4. 在注射剂的早晨,解冻转座的mRNA在冰上的等分试样。混合座子DNA载体(2微升100纳克/微升),并以1转座的mRNA(2微升100纳克/微升):1的比例,并加入6微升无RNA酶的水,以使总体积至10μL。
    注:20毫微克的浓度/微升,建议为每个但最佳浓度应根据经验确定。使用无RNA酶的水稀释。使用处理DNA-RNA注射混合时手套,并保持它在冰上注射的整个期间,以防止第m降解RNA。
  5. 在上述第2节使用的详细说明,注入DNA-RNA注射混合入受精卵在单细胞阶段。在一个立体视觉控制目标为在转基因的效率的最高利率单细胞阶段细胞质。保持在28.5 摄氏度注入胚胎,直到准备筛选转基因表达。
    注:PCR可以做检查TOL2转座的效率,如前所述44。
  6. 屏幕的胚胎在培养皿用于使用荧光解剖显微镜的目镜转基因。
    注意:使用适当的过滤器设置显微镜以可视化的可选盒FP表达(即荧光在心脏或镜头)在2或3 DPF。由式(在心脏或镜头)确定潜在的转基因胚胎,并提高这些胚胎到成年(F 0代)采用标准协议45。另外,如在46中所述通过PCR确定潜在的转基因胚胎。
  7. 一旦UAS记者f 0的鱼是2.5 - 3个月的年龄,他们(见2.5了解详细信息)穿越到非转基因野生型鱼收购鸡蛋,建立一个F 1代。另外,交UAS记者f 0的鱼到Gal4驱动子行建立一个F 1代。在后一种情况下,在UAS驱动转基因可以直接在从交叉得到的胚胎监测。
  8. 使用荧光解剖显微镜对显示屏F 1胚胎转基因或可选择的盒的表达。
    注:当表达被确认则转基因可以说是种系传播。转基因是在F 0级非孟德尔。表达转基因胚胎的数目可以从一个小数目变化到绝大多数个体clutche秒。在不同的F 0鱼座子整合可能相差很大,导致不同的表达模式。因此,从不同的F 0的创始人作为单独的分线保持˚F1鱼。在F中1鱼转座子的整合是稳定和孟德尔方式传递到后代。
  9. 保持每个F 0鱼在单独的坦克重新标识转基因携带者。

4.准备胚胎成像的正置显微镜

注:这里所描述的程序已经对具有长工作距离水浸泡锥目标正置显微镜成像优化。

  1. 使用荧光解剖显微镜来筛选胚胎的转基因表达。
    注意:一UAS记者转基因的表达将取决于所用的具体Gal4驱动子线。用于成像实验选择的胚胎的基础上所希望的记录ression格局。
  2. 用塑料吸管含有Danieau的用1×PTU和1x三卡因缓冲的单独培养皿传输所选的胚胎。
    注意:当标签是稀疏的(只有少数细胞在器官系统)安装在琼脂糖胚胎(见4.3 - 4.7以下)和屏幕使用具有高倍率目标的宽视场的显微镜转基因表达(见下面5.1)。三卡因anesthetizes鱼和应在几秒钟内有效。如果鱼不固定的,很可能是,三卡因已经劣化。这种退化的可能原因包括三卡因储存差,这是光敏感47。
  3. 制备琼脂糖用低熔点琼脂糖粉末在Danieau的缓冲至0.7%的终浓度溶解嵌入鱼。等分试样(1ml)中,并保持在热块在40℃,直到准备使用。
    注:更高concentrat琼脂糖的离子(高达1.5%),也可用于嵌入鱼。
  4. 添加20倍股票三卡因的50微升和20微升PTU的50倍原液的至1ml的等分试样的低熔点琼脂糖和轻敲管的侧拌匀。返回管到热块。使用塑料移液管,轻轻吸取几(1-10)麻醉的胚胎放入琼脂糖,尽可能少液体转移,以避免稀释琼脂糖。
  5. 用塑料吸管转移所有的胚胎的玻璃底培养皿少量琼脂糖。
  6. 工作相对较快,使用镊子将胚放置在所需的方向,这取决于结构,以进行成像。
    注:他们一边东方的胚胎,如果视网膜或Rohon胡子(RB)感觉神经元应该进行成像。
  7. 允许琼脂糖巩固至少15分钟。添加含有1xPTU和1xTricaine Danieau的缓冲,以便弥补嵌入琼胶胚胎本身。将包含在孵化器琼脂糖嵌入式胚胎的菜在28.5 摄氏度 ,直到准备图像。

采用宽视场和共聚焦显微镜成像5.细胞和亚细胞结构

注意:宽视场显微镜和点扫描共聚焦显微镜是最广泛使用的方式,以图像的荧光标记的斑马鱼胚胎表1总结的主要优点和两种系统的缺点。对于这两种形式的显微镜,在4以上整个成像实验通过使用加热室在显微镜的阶段所描述,并在28.5℃下保持胚安装在琼脂糖。重要的是,用琼脂糖包埋胚胎盘被允许之前成像开始作为温度波动引起z维度漂移平衡至28.5 摄氏度 。当进行长期成像实验(超过Severa的升小时),放置一个树脂玻璃盖在培养皿上,以减少缓冲的蒸发。

宽视场 点扫描共聚焦
成本 相对便宜昂贵(约5倍以上)
光漂白 高。样品暴露于激光的上方和下方的焦平面。
光毒性 高(见上面的照片漂白)
采集速度 快速
分辨率XY 阿贝定律然而,;阿贝定律(可通过应用程序使用40%,非常小的针孔得到改善。大多数设置这有什么实际应用)
光学切片 较差的是(可通过针孔大小来调整)
组织渗透 限于浅表结构( Rohon胡子细胞或肌纤维) 限于<100mm的胚胎的表面

表1.宽视场和点扫描共聚焦显微镜的一般比较

  1. 宽视野显微镜
    提供了使用一个堂堂正正的宽视场显微镜长工作距离水浸泡锥目标成像的斑马鱼胚胎在这里指南:注意 。该显微镜配备有冷却CCD照相机,以及安装在一个自动滤波轮,用于快速采集的多个通道的过滤器集可视化不同的荧光团。图像采集由μManager,一个开源的显微镜软件48控制。提供了一种用于成像中的RB的感觉神经元线粒体的具体例子。 RB细胞用膜靶向YFP的遗传标记和它们的线粒体是CFP标记(见上文1.1)。
    1. 在低熔点站在他们一边登上胚胎琼脂糖如上述4中所述。
    2. 允许与装鱼菜开始前成像平衡至28.5 摄氏度在显微镜阶段加热室。
    3. 使用低倍率水浸渍锥目标,并期待通过显微镜的目镜来选择胚胎图像的表面上的区域。
      注意:如果稳定的转基因MitoFish记者线,的Tg(UAS-E1B:mYFP,mitoCFP)mde6,被一起使用的驱动器系如于克:Gal4的那么大多数RB神经元被标记,并且显示为致密MES神经突乔木的胚胎的表面上H-工作。如果DNA的显微注射构建体是用来实现稀疏标记( 例如,感官:GAL4-VP16与UAS:mitoCFP和UAS:MA-YFP),屏幕的胚胎,以确定双重标记的细胞。
    4. 打开显微镜软件(μManager1.4)和“光照下的'”配置设置点击“确定正确的过滤器集的利息(YFP或CFP当前为例)的波长,在”相机设置“中输入的曝光时间获得合适的图像所需。
      注:“照明设置”是预先设定由安装软件在用户和打开μManager时被加载。如果软件没有被配置为控制所述滤光轮,手动转台移动至滤光轮到合适的位置。
    5. 更改为长工作距离水浸泡锥目标从40-100x放大。选择具有最高数值孔径(NA),并且色校正目标(复消色差透镜)。
    6. 点击“现场”选择的视场:在RB神经元,图像线粒体转运在杆轴突的情况下,发出从细胞体,或在周边乔木。
      注:RB神经元的胚胎的尾鳍折叠外围乔木提供到图像的理想机会的大视场是平坦的,因此可以用宽视场显微镜单个帧上捕获。它装入胚为平坦地尽可能在其一侧,以便尾鳍褶皱平行于培养皿的底部是很重要的。
    7. 选择的视场后,点击在ImageJ的菜单中的“矩形选区”按钮,定义感兴趣(ROI)的区域,并在μManager窗口点击“投资回报率”。选择用于成像的投资回报率后,单击“停止”和“保存”TA科YFP的频道的图像记录轴突/秒的局部形貌。
    8. 图像线粒体运输点击“多-D ACQ”。按钮。观察一个附加窗口(“多维采集”),并选择的时间点的数量,以及在该窗口上的时间点之间的间隔。使用0.3-1赫兹的帧速率。进行记录,至少10分钟,以收集尽可能多的数据点成为可能。
    9. 在“多维收购”窗口中,单击“通道”,增加和定义成像波长(CFP供在这个例子中线粒体)和曝光时间。不断曝光时间低于400毫秒成像线粒体运输。
    10. 点击选择“保存图像”中的“多维收购”窗口,自动将文件保存在“根目录”所列的特定文件夹。点击“采集”,在右上角展开恬电子推移成像。
    11. 手动调整焦点,而慢速录制,以弥补在z方向的任何漂移。
      注意:使用这些参数中的RB神经元线粒体转运可以成像只要4小时。
  2. 共聚焦显微镜
    提供了以下准则成像直立奥林巴斯FV1000共聚焦显微镜和长工作距离水浸泡锥目标:注意 。该显微镜配备有多个激光线和多个检测器(光电倍增管的常规和更敏感的磷砷化镓检测器),其允许多通道成像。具体提到奥林巴斯Fluoview软件制作。然而,在这里所描述的摄像参数应该很容易移植到其它共焦系统。
    1. 安装的胚胎在低熔点琼脂糖中适合于器官/结构的取向将被成像,如上述4中所述。
    2. 摄氏度在显微镜阶段加热室。
    3. 使用共焦显微镜长工作距离水浸泡锥目标在直立配置。选择具有最高可能的NA目标最大化可收集到的荧光信号的量,并具有最好的分辨率。从多个渠道采集图像选择色校正目标(复消色差透镜)。
    4. 打开显微镜的软件,然后点击“跨灯”或“外延灯”,以使用传输或荧光分别通过显微镜的目镜,以确定感兴趣的区域。
    5. 使用该软件可设置以下参数扫描获取图像堆栈:
      1. 在“获取设置”窗口,确认选择了成像客观的说上落道琼斯指数出现的目标相匹配可用的目标ñ菜单。
        注意:这是为了确保对特定目标的任何预先计算的参数( 例如,横向和轴向分辨率,共焦孔径等的大小)保持真,并且可以可靠地使用。
      2. 选择适当的激光线/秒,激发和发射分色过滤器图像特定荧光蛋白(多个)。通过点击“图像采集控制”窗口中的“染料列表”按钮做到这一点,选择适当的荧光/秒。或者,点击“光通路和染料”按钮来手动设置这些参数。
        注:当选择了“染料列表”按钮选项,该软件自动选择适当的激光线,激发和发射二向色滤光片,并适当地调整共焦孔径的大小。
      3. 在“获取设置”窗口,调整“缩放”因子,“大小ASP等扫描图像的比“( ,512×512,1024×1024等)以获得所需要的像素大小,以最好的解决被成像的结构,设置像素大小成为目标的理论分辨率的一半左右,从而以下奈奎斯特采样准则为了在“图像采集控制”的窗口的信息,符号(“I”)确定的按钮,获取的图像的点击的像素大小。
      4. 在“获取设置”窗口中设置的扫描速度最快的(2微秒/像素)。
      5. 在卡尔曼线平均“图像采集控制”窗口中点击减少noise.A因素的2〜3足够。
      6. 重叠光谱荧光成像时,选择连续扫描模式。要做到这一点,在“图像采集控制”窗口点击“序列”和“线”。
      7. 调整相关激光线/秒的输出功率(典型低于5%)。的具体值需要根据经验确定。
      8. 点击“XY重复”或“焦点X2”或“X4聚焦”按钮,同时调整每个通道的探测器设置连续扫描选定的区域。调整“HV”,“增益”和“偏移”为每个通道以获得具有灰度值的最高动态范围图像。
        注:这些设置的具体值需要根据经验来确定。 “高压”在检测器上调整电压改变其灵敏度,“偏移量”调整该检测器的输出信号和“增益”由一个常数因子乘以检测器的输出信号。
      9. 按Ctrl + H形象化经由下饱和标识查找表(希洛)所获取的图像(显示为蓝色)和过饱和像素(显示为红色),一般应避免这两者。重新评估的相关麟激光的输出功率E / S和检测器设置。
        注:使用高激光功率和高水平探测器的“高压”将导致更多的信号。然而,更高的激光功率将导致增加漂白和光毒性。增加“HV”,将导致更多的噪音。因此,折衷需要设定激光功率和“高压”,以获得具有可接受的噪音水平的影像并防止光损伤而当被发现(也见表1)。
      10. 通过聚焦在感兴趣的区域的上限和下限收集从一个限定的体积图像。在上卷的上限和下限的z栈窗口的“结束集”和“启动集”组按钮“获取设置”窗口点击要成像。选择的步长是为给定的目标的z分辨率的一半( 例如 ,如果Z分辨率为2μm选择1微米)。要确定Z-分辨率objectiv的E单击该按钮,在“图像采集控制”窗口的信息,符号(“I”)。
      11. 设置了时间序列在时间频率是适合的亚细胞结构的动力学被成像收集的z栈。在“TimeScan”子窗口进入其的z栈应该获取(“间隔”')的频率和的图像应该获取(“数”)的次数。
      12. 在“图像采集控制”窗口点击“深度”和“时间”按钮来确认一个Z堆栈和时间序列将被收购。最后点击“XYZT”按钮,开始采集时间推移图像。
      13. 图像采集完成后,观察软件界面上的“完成系列”。点击它并保存图像“OIB”的格式来记录与之相关的图像和元数据。
        对获得的图像:注意宽视场显微镜和共聚焦显微镜可以可视化和使用软件,如斐济,一个免费的公共领域的图像处理程序进行分析。

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Representative Results

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这里使用宽视场和共聚焦显微镜图像线粒体和在活斑马鱼胚胎中心体的直接比较和对比。这取决于细胞器动力学是细胞的位置要被检查和特定的亚细胞事件的固有频率,通常无论是宽视场或共聚焦显微镜是更好的选择。我们在位于胚胎的表面上的RB的神经元和在位于更深的视网膜细胞成像的细胞器。 RB神经元与其二维几何在一起的表观位置使它们的良好候选用于通过两个宽视场和共聚焦显微镜( 2)被成像。使用共聚焦显微镜获取图像然而显著较慢,并可能导致特定的亚细胞事件( 如,线粒体的运动, 2C,D的动力学的低估图3)。

以使细胞器和细胞膜的并发可视我们使用了GAL4-UAS系统在三种不同的配置。首先,UAS MitoFish记者行的Tg(UAS-E1B:mYFP,mitoCFP)用于mde6。在这里,双向UAS允许线粒体靶向CFP和膜针对性YFP伴随表达。在用适当的Gal4驱动子行组合,MitoFish( 3A,B)和CFP和YFPř标记的RB的感觉神经元的线粒体和细胞膜( 2A-C)或视网膜细胞 espectively。第二,两个UA构造(UAS:mitoCFP和UAS:MA-YFP)用Gal4驱动子构建体合并(感官:GAL4-VP16,从胰岛-1基因的感觉神经元特异性增强子元件)在短暂注射7。镶嵌表达式通常导致从这些注射允许各个单元的跟踪过天( 图2E)。第三种方法使用两种UAS盒的使用中,每个驱动不同的融合蛋白的表达,在一个单一的连续结构。这种策略用于生成CentrinFish的Tg(UAS:cetn4-YFP,UAS:MA-蔚蓝)tum1,其中centrin4-YFP融合标签中心体和蔚蓝定位到细胞膜。结合特定Gal4驱动子线组合的中心体和视网膜细胞( 3C,D)或肌纤维 图4)的细胞膜标记。

ENT“FO: - together.within页保留=”1“> 图2
图2: 在胚胎斑马鱼的RB感觉神经元 成像线粒体 体内
在2翅片折叠的尾部的RB的感觉神经元的dpf MitoFish用一个复消色差透镜40倍的水浸渍锥目标具有0.80的NA成像,或者通过宽视场(A)或共焦(B)的显微镜。面板的区域概述。C的宽视场时间推移在RB神经元的2外围乔木DPF MitoFish感兴趣的小区域的图像的右侧显示详细信息。单个线粒体(0箭头'')这一运动的跟踪超过100秒;显示六个时间点。在前面的时间点的线粒体的位置在洋红色概述d。C中的移动线粒体的位置电子共聚焦图像。个别的RB细胞及其线粒体标记物所达到共注射感觉神经元特异性Gal4驱动子具有两个UAS报道构建,UAS一起构造:mitoCFP和UAS:MA-YFP,在单细胞阶段和筛选分离的双标记的细胞。图像对比度反转和个别线粒体示意性地描绘为品红色点。比例尺A,B 20微米,C 2微米,Ë50微米。靶向线粒体CFP(mitoCFP),膜有针对性的YFP(MA-YFP)。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3
图3:宽视场和共聚焦显微镜 胚胎斑马鱼视网膜 对比图像细胞器 体内
OTX2启动子元件驱动在细胞膜(AB)或YFP中在2视网膜的dpf斑马鱼的胚胎细胞膜(CD)中心体和蔚蓝线粒体和YFP CFP的表达。为了实现这个标签模式,OTX2:Gal4的转基因鱼要么越过MitoFish(AB)O- [R CentrinFish(CD)。 40倍的水浸泡锥复消色差透镜的目标(NA 0.80)用于获取使用宽视场(A,C)和共聚焦(B,D)显微镜在每个视网膜上的同一区域的图像。 所述的插图和内核层的区域的B示出详细地,在CD的插图显示在M相的细胞。比例尺为20μm。靶向线粒体CFP(mitoCFP),膜有针对性的YFP(MA-YFP),centrin4-YFP(cetn4-YFP),膜有针对性的蔚蓝(MA-蔚蓝)。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4
图4:宽视场和共聚焦microsc的比较OPY 体内图像中心体
采用宽视场(A)和共聚焦(B)显微镜成像;:用荧光单肌纤维标记的细胞膜和中心体(CentrinFish Gal4的OTX2)。在这两种情况下使用了40倍的水浸泡锥复消色差透镜的目标(NA 0.80)。比例尺为10μm。 Centrin4-YFP(cetn4-YFP),膜有针对性的蔚蓝(MA-蔚蓝) 点击此处查看该图的放大版本。

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Discussion

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在这里,我们证明了GAL4-UAS表达系统的通用性,以荧光标记的线粒体,中心体和体内在斑马鱼胚胎特定细胞类型的细胞膜。该标签其他细胞器或亚细胞结构的许多荧光融合蛋白可以在出版的文献中找到,并且可以从相应的实验室,商业来源或非商业质粒保藏( 例如,Addgene)获得。设计一个新的荧光融合蛋白,几个参数需要考虑,包括FP使用哪个以及是否在感兴趣蛋白质的氨基或羧基末端融合在FP。有关生成荧光融合蛋白进行更彻底的讨论,读者对上述49-51提到有深度的文章。

我们强调三种策略实现使用UAS驱动转基因融合蛋白的共表达。多,分隔符ËUAS记者结构允许组合不同现有报道构建,而不需要额外的克隆。记者的表达水平也可以独立滴定。然而,当使用任一倍数的UAS盒或在单个构建体的双向UAS盒得以实现共表达的水平较高。自的FP被用作标记相对容易验证共表达。应当注意的是,其他方法用于多顺反子表达也是存在的,包括使用内部核糖体进入位点40和病毒2A肽52,53。作为替代基于DNA构建体, 在体外转录加帽的mRNA可以用于表达荧光融合蛋白来标记亚细胞结构1,4,8。这种方法的需要注意的是但是该表达仅限于发展的最初几天,而不是细胞或组织特异性。不管选择了表达的融合蛋白的方法的,重要的是以确保表达水平不会导致非特异性标记和破坏细胞的生理状态。在这方面,在GAL4-UAS系统27固有报告基因表达的扩增可以是有问题的,表现为例如如即使当FP被定位到特定的细胞器胞质标记。当可用时,抗体应当用来验证由融合蛋白获得的表达模式反映了内源的情况。在一些情况下,低(更低)的DNA浓度的注入可以减轻融合蛋白的误定位的问题。可替代地,具有低数目的UAS重复载体可有助于滴定向下转基因表达水平的30。同样,对于活化剂的Gal4-VP16,修改后的版本存在,它被报告给驱动表达比较弱,因此毒性更小30,33。如果融合蛋白的误定位仍然存在尽管努力滴定陶氏Ñ​​转基因表达水平,这可能是必要的,以放弃的GAL4-UAS系统,并通过直接启动子元件驱动表达。

稳定的转基因品系,MitoFish 10CentrinFish 12,我们描述在该原稿用14xUAS盒进行的。我们维持在Gal4驱动子行后台这些线以检测更改在表达几代中,由于具有多个UAS重复记者线已报告容易发生沉默54。我们还没有看到沉默比3我们世世代代传播的CentrinFish的证据。然而,我们已经看到杂色表达MitoFish,因此严格选择具有表达的'全',强烈的层次胚胎后代传播。目前的文献表明,与5xUAS重复表达载体可以产生稳定的转基因株系替代 - 记者是带动足够高的水平30和UAS的相对低一些重复可能使其不容易转基因沉默,但不重复的重复UAS据报道,即使是不太敏感54。

FP的目前可用的标记细胞器或其他亚细胞结构的调色板是非常广泛的55。当选择一个特定的FP作为标记,应考虑以下参数:第一,在FP的激发和发射光谱,以确定特定的激光线,以及作为其可视所需要的激发和发射滤波器。第二,亮度和在FP的光稳定性。第三,速度与在FP成熟以下翻译。第四,无论是在FP具有在融合物聚集的倾向。关于最后一个参数,应谨慎和控制实验,应该做测试每个FP的适用于特定的实验。例如,当重ð的FP mCherry和DsRed的被广泛使用,据说它们形成一定的融合体56聚集体。我们已经发现TagRFP-T 57,TagRFP更光稳定变型中,当靶向线粒体和细胞膜(未发表的观测)表现良好。当多个细胞器需要被伴随地可视化,FP的非重叠光谱应该被使用。我们已经成功地使用青 ​​色FPS(CFP和蔚蓝)和YFP( 2-4)的组合。通过利用从蓝色到近红外的整个光谱范围,可以极大地扩展了可同时可视化2亚细胞结构的数量。除了 ​​常规的FP,光活化的FP是特别有用的探测细胞器动力学, 例如,使用在FP枫的跟踪单个线粒体58的命运。

其中显微技术 - 宽视场或共聚焦 - 最适当成像取决于许多因素,包括细胞的位置进行成像,并且与特定的亚细胞或细胞事件预期发生的速度。宽视野显微镜是肤浅的地点和人烟稀少标记的样品的首选方式。它提供了在高速低光毒性和图像以合理的价格。然而,如果成像需要在斑马鱼的非浅表部位要执行,密集的标记的样品中或获得三维信息,共焦或者光学切片显微镜的另一种形式成为选择的方法。

不论其是被监测细胞或亚结构,经常会有获得最佳的图像和保持样本活着并且在重复时间推移成像良好的生理状态之间的权衡。光毒性可以表现为在细胞器的行为或变化,细胞的异常形态学甚至细胞死亡。键减少光漂白和光毒性为宽视场和共聚焦显微镜是使用光的尽可能低的水平,以获得图像。在这方面,具有最高可能的NA目标的关键是最大限度地提高可收集的荧光信号的量。对于共焦显微镜,一些参数可以调整,以补偿使用较低的激光功率。具有较高的量子效率检测器相对于传统的光电倍增管, 例如,磷砷化镓探测器,可用于确保发射的光子更容易被检测到。或者或另外,更高倍增极电压可以在PMT被应用于提高检测器的灵敏度。共焦孔(针孔)可以被打开以允许更多的荧光信号的采集,尽管轴向分辨率的损失。以暴露样品到尽可能少的光成为可能,扫描应该以高速进行,使得的停留时间每个象素的激光是低的。扫描以较低的空间分辨率也具有增加扫描的速度的效果。成像较少有样品暴露于较少的光的额外的好处,但是,如果它不危及调查过程的全面采样只应被考虑。

作为替代,旋转盘共聚焦显微镜和共焦显微镜,配备一个所谓的“共振”扫描仪提供快速扫描的能力。两种模式的优点在于它们是更快和更光毒性比“古典”,点扫描共聚焦显微镜。然而,旋转盘共焦显微镜在Z轴的分辨率较为有限,不能深深渗透到组织中的点扫描共焦显微镜。同样地,谐振扫描器共焦显微镜中的应用可以被限制为极短的像素停留时间会导致较差的图像质量可能,反过来,排除亚细胞事件( 例如,二进制图像具有减少的信号-噪声)的检测。

最后,虽然宽视场和共焦成像在这里强调,其他形式的光学显微镜如双光子59和光片镜60的可能更适合于特定的问题。双光子显微镜是基于荧光团的两个光子的光谱的红外范围内的同时吸收的激发。在用共聚焦显微镜常见,它使用点扫描来获取从样本图像和已经凭借双光子激发的非线性的光学切片的能力。对于荧光激发使用长波长光的成像允许在深度从表面几百微米。此外激发到一个小的成像体积的限制可以防止光致漂白和光毒性焦平面之外。然而,并非所有的FP■找高多光子吸收横截面,一个问题,即在红色的FP特别普遍。此外,发现单一红外波长来同时激励多个不同的FP是困难的,使得多通道成像繁琐。光片显微镜采用激光光线的薄'片'(通常厚度为2至10微米),以激发样品,并在用一个灵敏的相机以垂直角度检测从这个照射焦平面荧光信号​​。光学切片是通过在一个时刻照亮单一平面来实现的。激发光的这种限制降低了光毒性的发生。由于从整个照亮平面荧光信号​​同时采集,图像采集比点扫描共聚焦和多光子显微镜显著更快。所有这些特点使光表镜特别适合于成像高时空分辨率的动态细胞活动大量的现场样品。事实上,在整个斑马鱼胚胎使用光片显微细胞的命运发展61的前24个小时的过程中进行了全面跟踪。随着持续改进,以更好的成像渗透62,63和空间分辨率64,可以想到的是光片镜将被用来探测动态不仅在细胞,而且在整个斑马鱼胚胎的亚细胞水平。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose (2-hydroxyethylagarose) Sigma-Aldrich A4018-10G Low-gelling temperature Type VII
Block heater Eppendorf Thermomixer compact
Ca(NO3)2 Calcium nitrate hydrate, 99.996%  Aldrich 202967-50g To prepare 30x Danieau's
CCD camera Qimaging Retiga Exi Fast 1394
Ceramic Coated Dumont #5 Forceps Dumont - Fine Science Tools 11252-50 #5 Forceps
Confocal laser-scanning microscope Olympus FV1000 Fluoview
Culture dish heater Warner Instrument Corporation DH-35 Heating ring
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfate salt PharmaQ Tricaine PharmaQ-25g Tricaine (anesthetic)
Fluorescence dissecting microscope Leica M205 FA
GeneClean kit MP Biomedicals 111001200
Glass Bottom Culture Dishes MatTek Corporation P35G-0-14-C 35 mm petri dish, 14 mm microwell, No. 0 coverglass
Glass needles World Precision Instruments Inc.  TW100F-4 For microinjections
HEPES Sigma H3375-250g To prepare 30x Danieau's
High vacuum grease Dow Corning  DCC000001242 150g Silicon dioxide grease
KCl 99% Sigma-Aldrich S7643-5kg To prepare 30x Danieau's
MgSO4.7H2O   Magnesium sulfate heptahydrate 98+% A.C.S reagent Sigma-Aldrich 230291-500g To prepare 30x Danieau's
Microinjector  Eppendorf FemtoJet
Microloader tips Eppendorf 930001007 0.5-20 ul
Micromanipulator Maerzhaeuser Wetzlar MM33 Rechts/00-42-101-0000/M3301R
Micropipette holder Intracel P/N 50-00XX-130-1
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit Ambion AM1340 To transcribe PCS-Transposase
NaCl BioXtra >99.5% Sigma-Aldrich P9541-1kg To prepare 30x Danieau's
Nanophotometer To measure DNA/RNA concentration
Needle puller Sutter Instrument P-1000 Flaming/Brown
NIR Apo 40x/0.80W  Nikon Water-dipping-cone objective
N-Phenylthiourea Grade I, approx. 98% Sigma P7629-10G PTU (prevents pigmentation)
Petri dishes Sarstedt AG  821472 92 x 16mm 
Plastic molds  Adaptive Science Tools TU-1 For microinjections
Plexiglas cover-with a hole Custom-made The hole in the Plexiglas cover should be 3 mm larger than the diameter of the water-dipping-cone objective
Tea-strainer (Plastic) To collect zebrafish eggs
Temperature controller Warner Instrument Corporation TC-344B Dual Automatic Temperature Controller
Transfer pipettes Sarstedt AG  86.1171 3.5mL plastic transfer pipettes
UMPlanFI 100x/1.00W Olympus Water-dipping-cone objective
UMPlanFLN 20x/0.50W  Olympus Water-dipping-cone objective
Widefield microscope Olympus BX51WI
PTU (50x Stock) Dissolve 76 mg PTU in 50 ml distilled water
Stir vigorously at room temperature 
Store at -20 oC in 1 ml aliquots
Use at 1x working solution
Tricaine (20x Stock) Dissolve 200 mg Tricaine in 48 ml distilled water
Add 2 ml 1M Tris base (pH9)
Adjust to pH 7 
Store at -20 oC in 1 ml aliquots
Use at 1x working solution
Danieau's Solution (30x Stock) 1,740 mM  NaCl 
21 mM      KCl 
12 mM      MgSO4.7H2
18 mM      Ca (NO3)2
150 mM    HEPES buffer 
Distilled water upto 1 L 
Store at 4 o
Use at 0.3x working solution

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在活斑马鱼胚胎成像的亚细胞结构
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Engerer, P., Plucinska, G., Thong, R., Trovò, L., Paquet, D., Godinho, L. Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (110), e53456, doi:10.3791/53456 (2016).More

Engerer, P., Plucinska, G., Thong, R., Trovò, L., Paquet, D., Godinho, L. Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (110), e53456, doi:10.3791/53456 (2016).

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