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Developmental Biology

लिविंग zebrafish भ्रूण में subcellular संरचनाओं इमेजिंग

doi: 10.3791/53456 Published: April 2, 2016

Introduction

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Vivo इमेजिंग में सबसे अधिक शारीरिक संदर्भ में सेलुलर व्यवहार के प्रत्यक्ष दृश्य प्रदान करता है। Zebrafish भ्रूण, उनके तेजी से और बाह्य विकास और आनुवंशिक उपकरण है कि फ्लोरोसेंट लेबलिंग की अनुमति के एक अमीर सरणी की पारदर्शिता सभी विवो माइक्रोस्कोपी के बढ़ते उपयोग महत्वपूर्ण विकासात्मक घटनाओं की गतिशीलता को स्पष्ट करने के लिए योगदान दिया है। Zebrafish में तंत्रिका तंत्र के विकास की इमेजिंग अध्ययन उदाहरण के लिए बहुत तंत्रिका पूर्वज कोशिकाओं के व्यवहार और उनके बाद प्रवास, भेदभाव और सर्किट एकीकरण 1-8 सहित उनके संतान के भाग्य के हमारे ज्ञान का विस्तार किया है।

मंच अब इन सेलुलर व्यवहार अंतर्निहित subcellular गतिशीलता की जांच को तैयार है। दरअसल, zebrafish पहले से ही इन विवो कोशिका जीव विज्ञान के लिए उपकरण के रूप में शोषण किया जा रहा है। यह Golgi 15 माइटोकॉन्ड्रिया 9-11 कल्पना करने के लिए अब संभव है, 2,8,12-14 centrosomes,, Microtubule 4 और actin 16 cytoskeleton, 17 endosomes और शिखर झिल्ली के घटक जटिल 1,18, विवो में zebrafish भ्रूण में अन्य subcellular संरचनाओं के बीच में। अब तक, क्या इन अंगों के समारोह के बारे में जाना जाता है के ज्यादा संवर्धित कोशिकाओं में उनके व्यवहार का अध्ययन से आता है। इन विट्रो अध्ययन कोशिका जीव विज्ञान में जबरदस्त अंतर्दृष्टि सामने आए हैं, वहीं संस्कृति में कोशिकाओं को पूरी तरह से इन विवो स्थिति की जटिलता का प्रतिनिधित्व नहीं करते और इसलिए जरूरी समारोह और इन विवो में subcellular अंगों की गतिशीलता को प्रतिबिंबित नहीं करते। Zebrafish भ्रूण subcellular गतिशीलता की जांच करने के लिए विवो विकल्प में एक व्यवहार्य प्रदान करते हैं।

रीढ़ के रूप में, zebrafish कई अंग प्रणालियों (जैसे, तंत्रिका रेटिना) कि स्तनधारी प्रजातियों में पाए जाने वाले के मुताबिक़ के अधिकारी हैं। इसके अतिरिक्त, zebrafish भ्रूण तेजी से मानव रोगों 19,20 मॉडल करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है (जैसे, microcephaly 21 और लेबर की जन्मजात अंधता 22) और mitochondrial समारोह (जैसे, पार्किंसंस रोग 23, 10,24 और tauopathies बार्थ सिंड्रोम 25) से संबंधित उन सहित। सेलुलर और subcellular स्तर पर vivo इमेजिंग इन मामलों में कोशिका जीव विज्ञान ये रोग राज्यों अंतर्निहित का एक बेहतर समझ की अनुमति होगी।

यहाँ वर्णित विधि के समग्र लक्ष्य विवो प्रकाश माइक्रोस्कोपी में उपयोग कर zebrafish भ्रूण में अंगों और अन्य subcellular संरचनाओं की जांच करने के लिए एक व्यापक मार्गदर्शन प्रदान करने के लिए है। पूरे काम के प्रवाह विवो में visualizing और subcellular संरचनाओं पर नज़र रखने में शामिल वर्णित है - आनुवंशिक लेबलिंग दृष्टिकोण से, क्षणिक पैदा व्यक्त करने और स्थिर ट्रांसजेनिक मछली, और अंत में व्यापक क्षेत्र और confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग इमेजिंग के लिए करने के लिए। इन proc के प्रत्येक जबकिedures कई zebrafish प्रयोगशालाओं द्वारा इस्तेमाल किया जाता है, प्रोटोकॉल वर्णित अनुकूलित और subcellular संरचनाओं की गतिशीलता की जांच के लिए चुस्त कर रहे हैं। काम यहाँ वर्णित के दो विशिष्ट पहलुओं वारंट उल्लेख: सबसे पहले, विशेष सेल-प्रकार में आनुवंशिक रूप से लेबल अंगों के लिए कई विन्यास में Gal4 यूएएस अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग करें। दूसरा, एक प्रत्यक्ष विवो में छवि subcellular संरचनाओं के लिए व्यापक क्षेत्र और confocal माइक्रोस्कोपी की तुलना।

आनुवंशिक रूप से लेबल organelles और zebrafish में अन्य subcellular संरचनाओं के लिए वर्तमान रणनीतियों या तो छाया हुआ mRNA 1,4,8 या डीएनए आधारित निर्माणों का उपयोग जहां प्रमोटर तत्वों सीधे संलयन प्रोटीन में 9,14,15। इन विट्रो लिखित छाया शाही सेना परिणामों की अभिव्यक्ति ड्राइव तेजी से और व्यापक अभिव्यक्ति, कि हालांकि ऊतक विशेष नहीं है। इसके अतिरिक्त, अभिव्यक्ति के स्तर समय के साथ कम के रूप में छाया शाही सेना पतला या अपमानित किया जाता है। इस प्रकार शाही सेना के इस्तेमाल के आधार पर(आमतौर पर 3 दिनों के बाद निषेचन) के विकास में बाद के चरणों में organelle गतिशीलता सीमित है जांच करने के लिए निर्माण करती है।

इन सीमाओं डीएनए निर्माणों, जहां अभिव्यक्ति के स्थानिक और लौकिक नियंत्रण विशिष्ट प्रमोटर तत्वों द्वारा निर्धारित किया जाता है का उपयोग करके दूर किया जा सकता है। डीएनए आधारित निर्माणों transgene अभिव्यक्ति के स्तर को Gal4 यूएएस प्रणाली महत्वपूर्ण सुधार के संदर्भ में इस्तेमाल किया जाता है जब 26,27 मनाया जाता है। इस द्विपक्षीय अभिव्यक्ति प्रणाली में, सेल प्रकार विशिष्ट प्रमोटर तत्वों, एक transcriptional उत्प्रेरक Gal4 की अभिव्यक्ति ड्राइव, जबकि रिपोर्टर जीन Gal4 बाध्यकारी नदी के ऊपर सक्रिय अनुक्रम (यूएएस) के बहाव के क्लोन कर रहे हैं। उचित Gal4 चालकों के साथ यूएएस संवाददाताओं के संयोजन से, अभिव्यक्ति, विशिष्ट सेल प्रकार के लिए प्रतिबंधित किया जा सकता है विभिन्न प्रमोटरों के पीछे हर बार एक विशिष्ट अभिव्यक्ति पैटर्न वांछित है रिपोर्टर जीन क्लोन करने की जरूरत circumventing। इसके अलावा, कई यूएएस रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति हो सकती हैएक भी Gal4 उत्प्रेरक द्वारा संचालित। Gal4 यूएएस प्रणाली इस प्रकार subcellular लेबलिंग के लिए एक बहुमुखी और लचीला आनुवंशिक दृष्टिकोण प्रदान करता है।

वाइड-फील्ड और confocal सूक्ष्मदर्शी सबसे प्रयोगशालाओं के workhorses हैं। वाइड-फील्ड प्रणाली आम तौर पर एक प्रकाश स्रोत के रूप में एक चाप दीपक का उपयोग करें और एक संवेदनशील कैमरा है कि प्रकाश पथ के अंत में रखा जाता है के साथ उत्सर्जित प्रकाश का पता लगाने। इस इमेजिंग साधन आम तौर पर पतली नमूने के लिए प्रतिबंधित कर के रूप में बाहर का ध्यान केंद्रित प्रकाश को धुंधला कर मोटा नमूनों में में फोकस जानकारी है। Confocal सूक्ष्मदर्शी व्यापक क्षेत्र है कि सिस्टम में वे संकेत है कि उन है कि फोकस (यानी, "ऑप्टिकल सेक्शनिंग"), 28 से बाहर उत्पन्न खत्म फोकल हवाई जहाज़ से उत्पन्न पक्ष में करने के लिए बनाया जाता है से भिन्न होते हैं। ऑप्टिकल सेक्शनिंग प्राप्त करने के लिए एक पिनहोल बिन्दु प्रकाश स्रोत के लिए एक साधना स्थिति में उत्सर्जन पथ में रखा गया है। लेजर प्रकाश स्रोत के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं और संकेत photomultiplier ट्यूब (PMTs) के साथ पाया जाता है। व्यावहारिक रूप से, एक लेजरकिरण बिंदु से बिंदु और प्रत्येक स्थान (पिक्सेल) में प्रतिदीप्ति उत्सर्जन पीएमटी से पता चला है नमूना भर swiped है।

यहाँ हम दोनों की छवि माइक्रोस्कोपी के तौर तरीकों की एक प्रत्यक्ष तुलना प्रदान करने के लिए दोनों व्यापक क्षेत्र और confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग zebrafish भ्रूण जीने में बहुत ही subcellular संरचनाओं। इस तरह की तुलना को उपलब्ध कराने के मूल उद्देश्य के हाथ में विशिष्ट प्रश्न के लिए सबसे उपयुक्त माइक्रोस्कोपी तकनीक को चुनने के लिए दिशा निर्देश प्रदान करने के लिए है।

दृष्टिकोण यहाँ वर्णित हम माइटोकॉन्ड्रिया और centrosomes की Gal4 यूएएस आधारित आनुवंशिक लेबलिंग प्रदर्शित का उपयोग करना। इन अंगों प्रत्येक इमेजिंग साधन की उपयुक्तता प्रदर्शित करने के लिए व्यापक क्षेत्र और confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग तंत्रिका तंत्र की और मांसपेशियों की कोशिकाओं में अलग सेल-प्रकार में imaged हैं। यहाँ वर्णित विधि आसानी से रहने वाले zebrafish भ्रूण में अन्य अंगों और subcellular संरचनाओं की जांच के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

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Protocol

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सभी पशु प्रयोगों अपर बावरिया (म्यूनिख, जर्मनी) सरकार के स्थानीय नियमों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया।

1. लेबल organelles और अन्य subcellular संरचनाओं

नोट: यहाँ आनुवंशिक संवाददाता constructs कि fluorescently टैग centrosomes, माइटोकॉन्ड्रिया और कोशिका झिल्लियों वर्णित हैं।

  1. पारंपरिक क्लोनिंग तरीकों का प्रयोग 29 संलयन प्रोटीन है कि fluorescently centrosomes और माइटोकॉन्ड्रिया लेबल उत्पन्न करते हैं। इस तरह के पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन cetn4-YFP उत्पन्न करने के लिए के रूप में एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन 2 (एफपी) के साथ में फ्रेम zebrafish centrin4 (cetn4) की कोडिंग अनुक्रम क्लोन। इस तरह के सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन mitoCFP 9-11 उत्पन्न करने के लिए के रूप में फ्रेम एक एफपी साथ साइटोक्रोम ग oxidase की सबयूनिट आठवीं के mitochondrial लक्ष्यीकरण अनुक्रम क्लोन।
  2. zebraf की विशेष कोशिकाओं को (cetn4-YFP या mitoCFP) संलयन प्रोटीन की अभिव्यक्ति को प्रतिबंधित करने के लिएish भ्रूण (जैसे न्यूरॉन्स या मांसपेशियों की कोशिकाओं) द्विपक्षीय Gal4 यूएएस अभिव्यक्ति प्रणाली 26,27 का उपयोग करें। सबसे पहले एक यूएएस संवाददाता का निर्माण उत्पन्न करते हैं। पारंपरिक तरीकों का प्रयोग एक यूएएस अभिव्यक्ति वेक्टर में संलयन प्रोटीन, Gal4 बाध्यकारी यूएएस कैसेट के बहाव के क्लोन करने कार्प से 26,27,30 और एक न्यूनतम प्रमोटर (E1B बेसल प्रमोटर (वेरिएंट 14x यूएएस के लिए 1x से लेकर, चर्चा देखें) cetn4-YFP और यूएएस: जीन βactin), और यूएएस उत्पन्न mitoCFP।
    नोट: यूएएस संवाददाता तैयार करने के लिए स्थिर ट्रांसजेनिक लाइन पीढ़ी अतिरिक्त तत्वों क्लोन करने की आवश्यकता के लिए constructs (देखें नीचे 3)
  3. सेलुलर जिस संदर्भ में centrosomes या माइटोकांड्रिया चिह्नित कर रहे हैं कल्पना, उत्पन्न यूएएस संवाददाता constructs जिसमें कोशिका झिल्ली एफपीएस द्वारा चिह्नित कर रहे हैं। लक्ष्य के लिए पहली बीस अमीनो एसिड zebrafish Gap43 में फ्रेम एक एफपी के साथ (palmitoylation साइटों से युक्त) क्लोन है कि एफपी कोशिका झिल्ली (memFP) 31,32 करने के लिए।
  4. obtain चालक निर्माणों या ट्रांसजेनिक लाइनों, जिसमें सेल प्रकार विशिष्ट प्रमोटर तत्वों transcriptional उत्प्रेरक Gal4-VP16 27, 33 या Gal4FF KalTA4 30 की अभिव्यक्ति ड्राइव।
  5. गठबंधन यूएएस रिपोर्टर एक उपयुक्त ड्राइवर निर्माण के साथ constructs (न्यूरॉन्स या मांसपेशियों की कोशिकाओं में, उदाहरण के लिए) ब्याज के वांछित सेल प्रकार के लिए अभिव्यक्ति को सीमित करने के लिए। ऐसा करने के लिए सह-इंजेक्षन Gal4 ड्राइवर और यूएएस संवाददाता निषेचित अंडे में से एक सेल मंच पर constructs (के लिए विस्तृत निर्देश नीचे 2 देखें) क्षणिक मछली व्यक्त उत्पन्न करते हैं। (3 के लिए विस्तृत निर्देश नीचे देखें) वैकल्पिक रूप से, एक यूएएस संवाददाता स्थिर ट्रांसजेनिक लाइन पैदा करते हैं और एक Gal4 चालक स्थिर ट्रांसजेनिक लाइन को पार वंश दोनों transgenes असर उत्पन्न करते हैं।
    नोट: यह भी एक Gal4 चालक स्थिर ट्रांसजेनिक लाइन या एक Gal4 चालक fertiliz में निर्माण से निषेचित अंडे में इंजेक्षन करने के लिए यूएएस संवाददाता का निर्माण / एस संभव हैएक यूएएस संवाददाता स्थिर ट्रांसजेनिक लाइन से एड अंडे।
  6. ए कई अलग यूएएस संवाददाता निर्माणों (जैसे, यूएएस: mitoCFP और यूएएस: memYFP सह Gal4 यूएएस प्रणाली का उपयोग कर एकाधिक भिन्न संलयन प्रोटीन सह-अभिव्यक्त करने के लिए निम्न विन्यास में से एक में एक Gal4 ड्राइवर और यूएएस संवाददाता / s का उपयोग एक Gal4 चालक निर्माण के साथ -injected) 10, एक भी रिपोर्टर पर बी एकाधिक यूएएस कैसेट (जैसे, यूएएस: cetn4-YFP, यूएएस: memCerulean) 12 सी द्विपक्षीय दिशात्मक यूएएस रिपोर्टर (जैसे यूएएस: memYFP, mitoCFP) 2,10,24 (चित्रा 1)।

आकृति 1
चित्रा 1. रणनीतियाँ सह-एक्सप्रेस को Gal4 यूएएस प्रणाली का उपयोग संलयन प्रोटीन।
(ए) कई अलग यूएएस संचालित const: कई संलयन प्रोटीन की सह अभिव्यक्ति विभिन्न विन्यास में यूएएस संवाददाता कैसेट का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकताructs, (बी) के एक भी निर्माण या (सी) के लिए एक एकल निर्माण पर एक द्विदिश यूएएस कैसेट पर कई यूएएस कैसेट। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

2. मछली जताते क्षणिक उत्पन्न

नोट: निम्न पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल 34,35 का रूपांतरण है। एक बुनियादी इंजेक्शन सेटअप 12x करने के लिए एक बढ़ाई रेंज के साथ एक stereomicroscope, एक micropipette धारक के साथ एक micromanipulator और हवा के दबाव का एक स्रोत शामिल करना चाहिए। समय की 2.1-2.5 आगे तैयार:

  1. अंडा microinjection कक्षों तैयार करने के लिए, पानी में 1.5% की एक समाधान (w / v) agarose तैयार करते हैं। पानी और माइक्रोवेव के लिए agarose पाउडर जोड़ें जब तक agarose पूरी तरह भंग है। इस समाधान के साथ एक पेट्री डिश (100 x 15 मिमी) भरें।
    1. agarose समाधान APPR को शांत करने की अनुमतिoximately 45 सी पिघला हुआ agarose की सतह पर (6x 50 मिमी लंबे लकीरें कि 1.5 मिमी चौड़ा, 1 मिमी गहरी हैं और 3 मिमी के अलावा दूरी के साथ 40 मिमी x 66 मिमी,) एक प्लास्टिक मोल्ड microinjection रखने, देखभाल नहीं करने के लिए लेने से पहले इंटरफेस में बुलबुले परिचय।
    2. Agarose सेट करने के बाद, 4 हे सीओ / एन पर दुकान। सावधानी मोल्ड एक रंग का उपयोग कर हटा दें। कई microinjection कक्षों, दुकान 4 सी पर एक समय में तैयार है और कई हफ्तों से अधिक बार बार का उपयोग करें।
  2. एक micropipette खींचने का प्रयोग एक लंबी टांग 36 के साथ कांच इंजेक्शन केशिकाओं उत्पन्न करते हैं।
    नोट: विशिष्ट इंजेक्शन केशिकाओं उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया सेटिंग्स अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए। इंजेक्शन केशिकाओं समय से आगे खींच लिया और उपयोग करने से पहले संग्रहित किया जा सकता है।
  3. निर्माता की पुस्तिका के अनुसार एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग microinjection के लिए प्लास्मिड डीएनए (Gal4 ड्राइवर और यूएएस संवाददाता निर्माणों) की एकाग्रता को मापने। उपाय60, 260 एनएम और 280 एनएम (A260 / 280) पर absorbance के अनुपात। nuclease मुक्त पानी में 100 एनजी / μl के अंतिम एकाग्रता के लिए डीएनए पतला।
    नोट: एक A260 / 280 ~ 1.8 के अनुपात शुद्ध डीएनए का प्रतीक है। प्लास्मिड डीएनए इंजेक्शन के लिए प्रयोग की जाने वाली शुद्ध करने के लिए एक वाणिज्यिक किट (सिलिका आधारित बाध्यकारी मैट्रिक्स के आधार पर) का उपयोग पर विचार करें। प्लास्मिड डीएनए विषाक्तता को रोकने के लिए उच्च गुणवत्ता का होना चाहिए।
  4. 10 μl इंजेक्शन मिश्रण (30x शेयर की 0.33 μl), फिनोल लाल (0.25 μl, Danieau का समाधान (5 से 20 एनजी / μl के अंतिम एकाग्रता के लिए 0.5 से 2.5 के लिए एक 100 एनजी / μl शेयर की μl) डीएनए के संयोजन से तैयार करें एक 10 μl कुल मात्रा के लिए वैकल्पिक) और nuclease मुक्त पानी।
    नोट: अनुभव से डीएनए की एकाग्रता है कि उपयुक्त अभिव्यक्ति पैदावार का निर्धारण। Gal4 ड्राइवर और यूएएस संवाददाता plasmids सह इंजेक्शन की जरूरत है। जब केवल Gal4 ड्राइवर या यूएएस संवाददाता प्लाज्मिड जंगली प्रकार निषेचित अंडे में इंजेक्ट किया जाता है कोई अभिव्यक्ति पीछा करना होगा। यदि फिर भी टीवह निषेचित अंडे एक Gal4 चालक लाइन तो एक या कई यूएएस संवाददाता plasmids suffices इंजेक्शन से हैं। इसके विपरीत, यदि एक यूएएस संवाददाता लाइन में microinjecting, केवल Gal4 चालक प्लाज्मिड इंजेक्शन की जरूरत है। अंत में, जबकि फिनोल लाल बहुत इंजेक्शन कल्पना करने में मदद कर सकते हैं, यह भी एक फ्लोरोसेंट परिसर में ही है। इसलिए, फिनोल लाल visualizing एफपीएस अस्पष्ट यदि इमेजिंग के रूप में यह पर्याप्त रूप से इस समय तक पतला नहीं किया जा सकता से पहले 24 घंटे बाद निषेचन (HPF) की योजना बनाई है हो सकता है।
  5. शाम इंजेक्शन से पहले, की योजना बनाई है अप पुरुष और महिला प्रजनन के लिए zebrafish की (आम तौर पर 5 से 10) कई जोड़े की स्थापना की। एक gridded नीचे और एक हटाने योग्य विभक्त नर और मादा मछली को अलग करने वाले एक डालने के साथ प्रजनन टैंक का प्रयोग करें।
    नोट: पुरुष और महिला zebrafish आम तौर पर उनके शरीर के आकार से प्रतिष्ठित किया जा सकता है। नर जबकि महिलाओं के लिए एक पेट के बल फैला हुआ पेट प्रदर्शित करते हैं पतला हो जाते हैं। नर इसके अतिरिक्त एक पीले-लाल कर्नल हो जाते हैंउनकी उदर पेट क्षेत्र पर oring।
  6. इसके तत्काल बाद डीएनए इंजेक्शन के लिए पहले, पुरुष और महिला दोस्त के लिए अनुमति देने के लिए डिवाइडर को हटा दें। लगभग 15 से 30 मिनट के लिए विभक्त हटाने के बाद, टैंक के तल पर अंडे के लिए जाँच करें। एक नए प्रजनन टैंक के लिए एक मछली पकड़ने के जाल का उपयोग कर वयस्क मछली स्थानांतरण।
  7. पानी डालो, एक चलनी (जैसे, एक प्लास्टिक चाय-झरनी) में प्रजनन टैंक से बाहर नव रखी निषेचित अंडे, युक्त। चलनी Danieau समाधान युक्त एक स्प्रे बोतल का उपयोग करने में अंडे धो लें। एक पेट्री डिश पर चलनी पलटना और सभी अंडे (वयस्क मछली की जोड़ी प्रति प्रजनन आम तौर पर 50 से 200 अंडे) ठीक करने के लिए Danieau के समाधान के साथ एक स्प्रे बोतल का उपयोग करें।
  8. एक microloader विंदुक का प्रयोग, डीएनए इंजेक्शन मिश्रण के साथ एक खींच लिया इंजेक्शन केशिका वापस भरण। एक micromanipulator के धारक में इंजेक्शन केशिका माउंट और टिप ट्रिम, एक stereomicroscope का दृश्य नियंत्रण के तहत, एक micropipette कि लोगों को खरीदना कर सकते हैं बनाने के लिए संदंश का उपयोगnetrate जरायु और सेल कोशिका द्रव्य जबकि डीएनए का एक उपयुक्त मात्रा देने के लिए कर रहा है।
    नोट: डिग्री इंजेक्शन केशिका की नोक छंटनी की है अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए और सबसे अच्छा है जब अंडे इंजेक्शन लगाने न्याय किया जा सकता है, जो करने के लिए।
  9. इंजेक्शन के लिए डीएनए की मात्रा का निर्धारण करने के लिए, खनिज तेल में इंजेक्शन के समाधान की एक बूंद का निर्वहन। ड्रॉप एक अंशांकन माइक्रोमीटर का उपयोग करने की त्रिज्या (R) उपाय और इसकी मात्रा (4/3 π आर 3) की गणना। इंजेक्शन के दबाव और / या प्रत्येक इंजेक्शन नाड़ी की अवधि का समायोजन करके मात्रा व्यवस्थित करना।
  10. एक प्लास्टिक पिपेट का उपयोग करना, एक microinjection कक्ष की खाइयों में सभी एकत्र अंडे (आम तौर पर 50-200, ऊपर 2.7 से) हस्तांतरण। एक stereomicroscope का दृश्य नियंत्रण के तहत, अंडे इतना है कि सेल कोशिका द्रव्य (पारदर्शी) और जर्दी (घने, गैर पारदर्शी) आसानी से पहचाना जा सकता है उन्मुख करने के लिए संदंश का उपयोग करें।
  11. एक स्टीरियो का दृश्य नियंत्रण के तहतमाइक्रोस्कोप, निषेचित अंडे की कोशिका कोशिका द्रव्य में डीएनए इंजेक्षन, देखभाल करने के लिए सुनिश्चित करें कि इंजेक्शन की मात्रा (1 से 2 nl करने के लिए) सेल की मात्रा का लगभग 10% से मेल खाती है।
    नोट: फिनोल मात्रा इंजेक्शन के दृश्य में डीएनए समाधान एड्स में लाल।
  12. इंजेक्शन के बाद, उन्हें Danieau समाधान युक्त एक स्प्रे बोतल के साथ निस्तब्धता द्वारा इंजेक्शन मोल्ड की खाइयों से अंडे ढीला। इसके बाद एक प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग कर एक ताजा पेट्री डिश में अंडे हस्तांतरण और एक 28.5 सेल्सियस इनक्यूबेटर में बनाए रखें।
  13. पता लगाएँ कि क्या इंजेक्शन, उच्च मृत्यु दर के लिए योगदान कर सकते हैं या तो micropipette पैठ या डीएनए मिश्रण के दौरान निरंतर शारीरिक नुकसान का एक परिणाम के रूप में नियंत्रण के रूप में संयुक्त राष्ट्र के इंजेक्शन अंडे बनाए रखें।
    नोट: उच्च मृत्यु दर निम्न इंजेक्शन जरूरत से ज्यादा उच्च डीएनए एकाग्रता या इंजेक्शन की मात्रा और / या contamina साथ plasmids सहित कई कारकों के कारण हो सकता हैएनटीएस। कम गुणवत्ता डीएनए preps से विषाक्तता को रोकने के लिए, वाणिज्यिक किट (सिलिका आधारित बाध्यकारी मैट्रिक्स के आधार पर) का इस्तेमाल किया जा सकता है।
  14. इंजेक्शन के बाद नियमित अंतराल पर, unfertilized अंडे और मृत या विकृत भ्रूण के लिए स्क्रीन और इन त्यागने के लिए एक stereomicroscope का उपयोग करें।
    नोट: अंडे कि, निषेचन के बाद एक सेल मंच पर कई घंटे हो दिखाई देते हैं unfertilized के रूप में समझे। इस तरह के एक समझौता पूर्वकाल पीछे शरीर कुल्हाड़ियों के रूप में सकल संरचनात्मक दोषों से विकृत भ्रूण को पहचानें। एक जरायु भीतर अनाकार सामग्री चलता है कि भ्रूण विकास के चरणों के माध्यम से आगे बढ़ना नहीं था और मर गया। अगर भ्रूण कि microinjected थे विकास का एक सामान्य कोर्स शारीरिक एटलस 37 से परामर्श गुजरना पता लगाने के लिए।
  15. युक्त 1x 1-फिनाइल 10 और 24 HPF के बीच 2-Thiourea (1xPTU) वर्णक गठन को रोकने के Danieau के समाधान के लिए एक प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग भ्रूण स्थानांतरण। Danieau के समाधान के शेष भाग में भ्रूण बनाए रखेंप्रयोग की अवधि के लिए पीटीयू aining।
    नोट: melanophores के अलावा, त्वचा की सतह पर iridophores इमेजिंग के लिए समस्याग्रस्त किया जा सकता है। पीटीयू iridophore गठन को बाधित नहीं करता है, ऐसे रॉय (रॉय) के रूप में iridophores की कम संख्या के साथ उत्परिवर्ती लाइनों मौजूद हैं और 38 का इस्तेमाल किया जा सकता है।
  16. भ्रूण हैच के बाद, chorions त्यागने और पीटीयू युक्त Danieau समाधान एक्सचेंज (आमतौर पर दूसरे या तीसरे दिन बाद निषेचन, 2 या 3 DPF पर)।
    नोट: ये कदम भ्रूण माध्यम की गुणवत्ता और स्वस्थ भ्रूण की व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं।

3. स्थिर ट्रांसजेनिक लाइनों उत्पन्न

नोट: स्थिर ट्रांसजेनिक लाइनों कुशलता Tol2 transposon प्रणाली का उपयोग कर उत्पन्न किया जा सकता है। एक Tol2 transposon ब्याज की transgene युक्त वेक्टर है mRNA खाद में Transposase एंजाइम एन्कोडिंग के साथ साथ सह इंजेक्शनएक सेल मंच पर अंडे घ। Transposase प्रोटीन इंजेक्शन mRNA से निकाली गई जीनोम 39 में transposon वेक्टर और उसके एकीकरण से ट्रांस्जीन कैसेट के छांटना उत्प्रेरित।

  1. ट्रांस्जीन संवाददाता कैसेट क्लोन (जैसे, यूएएस: mitoCFP) Tol2 के बीच टर्मिनल दोहराता Tol2 वैक्टर वर्तमान zebrafish समुदाय में इस्तेमाल के रूप में 40 में वर्णित में से एक में उलटा।
    नोट: जिसमें प्रमोटर तत्वों हित के क्षेत्र के लिए असंबंधित अंग प्रणालियों में एफपी अभिव्यक्ति ड्राइव एक चयन कैसेट युक्त Tol2 वैक्टर (जैसे, दिल 41 या लेंस 42) Gal4 transactivation के अभाव में यूएएस रिपोर्टर ट्रांसजेनिक लाइनों स्क्रीनिंग के लिए उपयोगी होते हैं।
  2. एक वाणिज्यिक किट (सिलिका आधारित बाध्यकारी मैट्रिक्स के आधार पर) का उपयोग करना, प्लास्मिड डीएनए इंजेक्शन के लिए प्रयोग की जाने वाली शुद्ध। सुनिश्चित करें कि डीएनए विषाक्तता को रोकने के लिए उच्च गुणवत्ता की है।
  3. टाइप एक का उपयोग कर Tol2 Transposase एन्कोडिंग mRNAऐसे पीसीएस-टी.पी. 43 के रूप में उपयुक्त प्रतिलेखन वेक्टर। संक्षेप में, linearize पीसीएस-टी.पी. और एक वाणिज्यिक किट का उपयोग छाया हुआ mRNA पैदा करते हैं और निर्माता प्रोटोकॉल का पालन करें। RNases के साथ संक्रमण से बचने के लिए ध्यान रखना (जैसे, RNase मुक्त पिपेट सुझावों और ट्यूबों का उपयोग करें)। आरएनए विभाज्य, 100 एनजी / μl की एकाग्रता में, सी -80 में एकल उपयोग और दुकान के लिए
  4. इंजेक्शन की सुबह बर्फ पर Transposase mRNA की एक विभाज्य पिघलना। transposon डीएनए वेक्टर (100 एनजी / μl के 2 μl) मिक्स और एक 1 में mRNA (100 एनजी / μl के 2 μl) Transposase: 1 के अनुपात, और कुल मात्रा 10μl करने के लिए लाने के लिए RNase मुक्त पानी के 6 μl जोड़ें।
    नोट: 20 एनजी के एक एकाग्रता / μl प्रत्येक के लिए सिफारिश की है, लेकिन इष्टतम एकाग्रता अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए। कमजोर पड़ने के लिए RNase मुक्त पानी का प्रयोग करें। दस्ताने जब डीएनए आरएनए इंजेक्शन मिश्रण से निपटने का प्रयोग करें और इंजेक्शन की पूरी अवधि के मीटर की गिरावट को रोकने के लिए बर्फ पर रखआरएनए।
  5. ऊपर धारा 2 में विस्तृत निर्देश का प्रयोग, एक सेल मंच पर निषेचित अंडे में डीएनए शाही सेना इंजेक्शन मिश्रण इंजेक्षन। एक stereomicroscope का दृश्य नियंत्रण के तहत transgenesis दक्षता की दर सबसे अधिक के लिए एक सेल मंच पर सेल कोशिका द्रव्य लक्ष्य। Transgene अभिव्यक्ति के लिए स्क्रीन करने के लिए तैयार है जब तक 28.5 सी में इंजेक्शन भ्रूण बनाए रखें।
    नोट: पीसीआर के रूप में पहले से वर्णित 44 Tol2 Transposase की कुशलता के लिए जाँच करने के लिए किया जा सकता है।
  6. एक प्रतिदीप्ति विदारक माइक्रोस्कोप के oculars का उपयोग कर transgenesis के लिए एक पेट्री डिश में स्क्रीन भ्रूण।
    नोट: चयन कैसेट की एफपी अभिव्यक्ति कल्पना करने के लिए माइक्रोस्कोप की उचित फिल्टर सेट का उपयोग करें (यानी, दिल या लेंस में प्रतिदीप्ति) में 2 या 3 DPF। अभिव्यक्ति (दिल या लेंस में) द्वारा संभावित ट्रांसजेनिक भ्रूण को पहचानें और वयस्कता के लिए इन भ्रूण जुटाने (एफ 0 पीढ़ी) मानक का उपयोगप्रोटोकॉल 45। वैकल्पिक रूप से, 46 में वर्णित के रूप में पीसीआर द्वारा संभावित ट्रांसजेनिक भ्रूण की पहचान।
  7. एक बार जब यूएएस संवाददाता एफ 0 मछली 2.5 रहे हैं - उम्र के 3 महीने, एक एफ 1 पीढ़ी की स्थापना के लिए अंडे प्राप्त करने के लिए गैर ट्रांसजेनिक जंगली प्रकार मछली के लिए उन्हें (विवरण के लिए 2.5) को पार। वैकल्पिक रूप से, एक एफ 1 पीढ़ी की स्थापना के लिए एक Gal4 चालक लाइन को पार यूएएस संवाददाता एफ 0 मछली। उत्तरार्द्ध मामले में, यूएएस संचालित ट्रांस्जीन सीधे पार से प्राप्त भ्रूण में नजर रखी जा सकती है।
  8. ट्रांस्जीन या चयन कैसेट की अभिव्यक्ति के लिए एफ स्क्रीन करने के लिए 1 भ्रूण एक प्रतिदीप्ति विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
    नोट: जब अभिव्यक्ति तो पुष्टि की है ट्रांस्जीन germline प्रेषित किया जा करने के लिए कहा जा सकता है। Transgenesis पर एफ 0 चरण गैर मेंडेलियाई है। transgene व्यक्त भ्रूण की संख्या अलग-अलग clutche में विशाल बहुमत के लिए एक छोटी संख्या से भिन्न हो सकते हैंएस। में विभिन्न एफ 0 मछली transposon एकीकरण बहुत अलग अभिव्यक्ति पैटर्न में जिसके परिणामस्वरूप भिन्न हो सकते हैं। इसलिए अलग उप लाइनों के रूप में विभिन्न एफ 0 संस्थापकों में से एफ 1 मछली बनाए रखें। एफ 1 मछली में transposon एकीकरण स्थिर रहे हैं और एक मेंडेलियाई फैशन में बाद की पीढ़ियों पर पारित कर रहे हैं।
  9. अलग टैंक में प्रत्येक एफ 0 मछली बनाए रखें ट्रांस्जीन वाहक फिर से पहचान के लिए।

4. एक ईमानदार माइक्रोस्कोप पर इमेजिंग के लिए भ्रूण तैयार

नोट: यहाँ वर्णित प्रक्रियाओं लंबी दूरी काम पानी की सूई-कोन उद्देश्यों के साथ ईमानदार माइक्रोस्कोप पर इमेजिंग के लिए अनुकूलित किया गया है।

  1. transgene अभिव्यक्ति के लिए भ्रूण स्क्रीन करने के लिए एक प्रतिदीप्ति विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
    नोट: एक यूएएस संवाददाता transgene की अभिव्यक्ति का इस्तेमाल विशिष्ट Gal4 चालक लाइन पर निर्भर करेगा। इमेजिंग प्रयोगों के लिए भ्रूण का चयन वांछित EXP पर आधारितression पैटर्न।
  2. 1x पीटीयू और 1x Tricaine साथ Danieau के बफर युक्त एक अलग पेट्री डिश के लिए एक प्लास्टिक पिपेट का उपयोग कर चुना भ्रूण स्थानांतरण।
    नोट: जब लेबलिंग विरल है (केवल एक अंग प्रणाली में कुछ कोशिकाओं) agarose में भ्रूण माउंट (4.3 देख - 4.7 से नीचे) और स्क्रीन उच्च वृद्धि के उद्देश्यों के साथ एक व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोप का उपयोग transgene अभिव्यक्ति के लिए (नीचे 5.1 देखें)। Tricaine मछली anesthetizes और सेकंड के भीतर प्रभावी होना चाहिए। मछली स्थिर नहीं कर रहे हैं यह है कि Tricaine अपमानित किया है की संभावना है। इस गिरावट के लिए संभावित कारण जो प्रकाश के प्रति संवेदनशील है 47 Tricaine के खराब भंडारण, शामिल हैं।
  3. 0.7% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए Danieau के बफर में कम पिघलने agarose पाउडर भंग द्वारा मछली एम्बेड करने के लिए agarose तैयार करें। विभाज्य (1 मिलीलीटर) और उपयोग के लिए तैयार है जब तक 40 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्मी-ब्लॉक में रहते हैं।
    नोट: माध्यमिक concentratagarose की आयनों (1.5% तक) भी मछली एम्बेड करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  4. के 1 मिलीलीटर विभाज्य Tricaine की एक 20x शेयर के 50 μl और पीटीयू के एक 50x शेयर समाधान के 20 μl जोड़े कम पिघलने agarose और ट्यूब के पक्ष दोहन से अच्छी तरह मिला लें। गर्मी-ब्लॉक करने के लिए ट्यूब लौटें। एक प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट का प्रयोग, धीरे agarose में कुछ (1-10) anesthetized भ्रूण पिपेट, जितना संभव हो कम तरल स्थानांतरित agarose गिराए से बचने के लिए।
  5. एक प्लास्टिक पिपेट हस्तांतरण एक गिलास नीचे पेट्री डिश के लिए agarose की एक छोटी राशि के साथ सभी भ्रूण का उपयोग करना।
  6. अपेक्षाकृत तेजी से कार्य करना, वांछित अभिविन्यास में भ्रूण की स्थिति के लिए, संरचना के आधार पर imaged किया जा संदंश का उपयोग करें।
    नोट: उनके पक्ष में ओरिएंट भ्रूण यदि रेटिना या Rohon-दाढ़ी (आरबी) संवेदी न्यूरॉन्स imaged किया जाना चाहिए।
  7. agarose कम से कम 15 मिनट के लिए जमना करने की अनुमति दें। 1xPTU और 1xTricaine युक्त Danieau के बफर भ्रूण agaro में एम्बेडेड कवर करने के लिए जोड़ेएसई। छवि के लिए तैयार है जब तक 28.5 सी में एक मशीन में agarose एम्बेडेड भ्रूण युक्त पकवान रखें।

5. इमेजिंग सेलुलर और subcellular संरचनाओं वाइड-फील्ड या confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग

नोट: व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोपी और बिंदु स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोपी छवि fluorescently लेबल zebrafish भ्रूण के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल के तौर तरीकों हैं 1 टेबल मुख्य फायदे और दोनों प्रणालियों के नुकसान का सार।। माइक्रोस्कोपी के दोनों रूपों के लिए, भ्रूण खुर्दबीन के मंच पर एक हीटिंग कक्ष का उपयोग करके इमेजिंग प्रयोग के दौरान ऊपर 4 में वर्णित है, और बनाए रखा के रूप में 28.5 सी में agarose में बढ़ रहे हैं। महत्वपूर्ण बात है, agarose एम्बेडेड भ्रूण के साथ पकवान 28.5 सी को संतुलित करने से पहले इमेजिंग शुरू के रूप में तापमान के उतार चढ़ाव जेड आयाम में बहाव के कारण अनुमति दी है। जब लंबे समय तक इमेजिंग प्रयोगों का आयोजन (severa खत्मएल घंटे), पेट्री डिश पर एक Plexiglas कवर जगह बफर के वाष्पीकरण को कम करने के लिए।

विस्तृत क्षेत्र प्वाइंट स्कैनिंग confocal
लागत अपेक्षाकृत सस्ता महंगा (लगभग। 5x अधिक)
तस्वीर विरंजन कम उच्च। नमूना के ऊपर और नीचे फोकल हवाई जहाज़ लेजर प्रकाश के संपर्क में है।
फोटो-विषाक्तता कम उच्च (ऊपर देखें तस्वीर विरंजन)
अधिग्रहण की गति उपवास धीरे
XY में संकल्प अब्बे के नियम अब्बे के कानून (एपीपी द्वारा सुधार किया जा सकता है 40% एक बहुत छोटे पिनहोल का उपयोग;। हालांकि,सबसे सेटिंग्स इस थोड़ा व्यावहारिक आवेदन किया है)
ऑप्टिकल सेक्शनिंग गरीब हाँ (पिनहोल आकार से समायोजित किया जा सकता है)
ऊतक प्रवेश सतही संरचनाओं तक सीमित (जैसे, Rohon-दाढ़ी कोशिकाओं या मांसपेशी फाइबर) भ्रूण की सतह से 100 मिमी के लिए <Limited

तालिका 1. व्यापक क्षेत्र और बिंदु स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोपी के जनरल तुलना

  1. व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोपी
    नोट: यहाँ दिशा निर्देशों zebrafish भ्रूण इमेजिंग लंबी दूरी काम पानी की सूई-कोन उद्देश्यों के साथ एक ईमानदार व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोप का उपयोग के लिए प्रदान की जाती हैं। माइक्रोस्कोप एक ठंडा सीसीडी कैमरा से लैस है, और विभिन्न fluorophores visualizing के लिए फिल्टर सेट कई चैनलों के तेजी से अधिग्रहण के लिए एक स्वचालित फिल्टर पहिया पर मुहिम शुरू की।छवि अधिग्रहण μManager, एक खुला स्रोत सॉफ्टवेयर पैकेज माइक्रोस्कोपी 48 द्वारा नियंत्रित किया जाता है। इमेजिंग आरबी संवेदी न्यूरॉन्स में माइटोकॉन्ड्रिया के लिए एक विशिष्ट उदाहरण प्रदान की जाती है। आरबी कोशिकाओं आनुवंशिक रूप से लक्षित YFP झिल्ली का उपयोग कर चिह्नित कर रहे हैं और उनके माइटोकॉन्ड्रिया सीएफपी टैग (ऊपर 1.1 देखें) कर रहे हैं।
    1. कम पिघलने में उनके पक्ष में माउंट भ्रूण agarose ऊपर 4 में वर्णित है।
    2. घुड़सवार मछली के साथ पकवान इमेजिंग शुरू होने से पहले खुर्दबीन के मंच पर एक हीटिंग चैम्बर में 28.5 सी को संतुलित करने की अनुमति दें।
    3. एक कम बढ़ाई पानी की सूई-कोन उद्देश्य का उपयोग करें और माइक्रोस्कोप के oculars के माध्यम से देखने की छवि के लिए भ्रूण की सतह पर एक क्षेत्र का चयन करें।
      नोट: स्थिर ट्रांसजेनिक MitoFish संवाददाता लाइन, टीजी (यूएएस E1B: mYFP, mitoCFP) यदि mde6, इस तरह के Huc के रूप में एक चालक की लाइन के साथ संयोजन के रूप में प्रयोग किया जाता है: Gal4 तो सबसे आरबी न्यूरॉन्स चिह्नित कर रहे हैं, और एक घने एमईएस के रूप में प्रकटभ्रूण की सतह पर neurite arbors के एच काम करते हैं। डीएनए के microinjection constructs विरल लेबलिंग प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है (उदाहरण के लिए, संवेदी: mitoCFP और यूएएस: यूएएस साथ Gal4-VP16 एमए-YFP), स्क्रीन भ्रूण डबल लेबल कोशिकाओं की पहचान करने के लिए।
    4. माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर (μManager 1.4) खोलें और विन्यास सेटिंग्स "के तहत रोशनी ''" पर क्लिक करें "ब्याज (YFP या वर्तमान उदाहरण के लिए सीएफपी) की तरंग दैर्ध्य के लिए सही फिल्टर सेट को परिभाषित करने के लिए।" के अंतर्गत कैमरा सेटिंग्स "जोखिम समय दर्ज एक उपयुक्त छवि का अधिग्रहण करने की आवश्यकता है।
      नोट: "रोशनी सेटिंग्स" पूर्व निर्धारित सॉफ्टवेयर की स्थापना पर उपयोगकर्ता द्वारा होता है और जब μManager खोलने भरी हुई है। सॉफ्टवेयर फिल्टर पहिया नियंत्रित करने के लिए कॉन्फ़िगर नहीं है, तो मैन्युअल उचित स्थिति के लिए बुर्ज में फिल्टर पहिया चले जाते हैं।
    5. एक लंबे समय से काम दूरी पानी की सूई-कोन 40-100x बढ़ाई से लेकर उद्देश्य के लिए परिवर्तित करें। चुनेंउद्देश्य उच्चतम संख्यात्मक एपर्चर (एनए) है और वार्णिक सही है कि (Apochromat)।
    6. देखने के क्षेत्र का चयन करने के लिए "लाइव" पर क्लिक करें: आरबी न्यूरॉन, स्टेम अक्षतंतु पर छवि mitochondrial परिवहन के मामले में चलाई सेल शरीर से, या परिधीय कुंज में।
      नोट: भ्रूण की दुम फिन गुना में आरबी न्यूरॉन्स की परिधीय arbors देखने के एक बड़े क्षेत्र है कि फ्लैट है और इसलिए एक व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोप के साथ एक ही फ्रेम पर कब्जा किया जा सकता छवि के लिए एक आदर्श अवसर प्रदान करते हैं। यह साफ अपने पक्ष पर संभव के रूप में भ्रूण माउंट करने के लिए इतना है कि दुम फिन गुना पेट्री डिश के तल के समानांतर है इसलिए महत्वपूर्ण है।
    7. देखने के एक क्षेत्र को चुनने के बाद, ImageJ मेनू में "आयताकार चयन" बटन पर क्लिक करें ब्याज (आरओआई) के एक क्षेत्र को परिभाषित करने और μManager विंडो में "रॉय" पर क्लिक करें। इमेजिंग के लिए रॉय चयन करने के बाद, "बंद करो" क्लिक करें और टा करने के लिए "सहेजें"Ke YFP चैनल की एक छवि neurite / एस के स्थानीय आकृति विज्ञान रिकॉर्ड करने के लिए।
    8. छवि की mitochondrial परिवहन पर क्लिक करें "मल्टी-डी ACQ।" बटन। एक अतिरिक्त खिड़की ( "बहु-आयामी अधिग्रहण") का निरीक्षण करें और समय-अंकों की संख्या के साथ ही इस खिड़की पर समय अंक के बीच के अंतराल का चयन करें। 0.3-1 हर्ट्ज के फ्रेम दर का प्रयोग करें। कम से कम 10 मिनट के लिए रिकॉर्डिंग बाहर ले जाने के रूप में कई संभव के रूप में डेटा अंक एकत्र करने के लिए।
    9. "बहु-आयामी अधिग्रहण" विंडो में, "चैनल" पर, और जोखिम के समय (इस उदाहरण में माइटोकॉन्ड्रिया के लिए सीएफपी) पर क्लिक करें जोड़ने के लिए और इमेजिंग के लिए तरंग दैर्ध्य को परिभाषित। mitochondrial परिवहन इमेजिंग के लिए 400 मिसे नीचे करने के लिए जोखिम बार रखें।
    10. विकल्प "छवियाँ सहेजें" "बहु-आयामी अधिग्रहण" विंडो में पर क्लिक करें, स्वचालित रूप से 'निर्देशिका जड़' में उल्लिखित एक विशिष्ट फ़ोल्डर में फ़ाइलों को बचाने के लिए। ऊपरी दाहिने कोने पर "अधिग्रहण" पर क्लिक करें टिम शुरू करने के लिएई-चूक इमेजिंग।
    11. जबकि समय चूक रिकॉर्डिंग Z आयाम में किसी भी बहाव के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए मैन्युअल फोकस बदल डालना।
      नोट: इन मानकों आरबी न्यूरॉन्स में mitochondrial परिवहन के रूप में लंबे समय के रूप में 4 घंटे के लिए imaged किया जा सकता का उपयोग करना।
  2. संनाभि माइक्रोस्कोपी
    नोट: यहाँ दिशा निर्देशों का एक ईमानदार ओलिंप FV1000 confocal खुर्दबीन और लंबे समय तक काम दूरी पानी की सूई-कोन उद्देश्यों के साथ इमेजिंग के लिए प्रदान की जाती हैं। माइक्रोस्कोप कई लेजर लाइनों और कई डिटेक्टरों (पारंपरिक PMTs और अधिक संवेदनशील गैलियम आर्सेनाइड फास्फाइड डिटेक्टरों) कि मल्टीचैनल इमेजिंग के लिए अनुमति देने के साथ सुसज्जित है। विशिष्ट संदर्भ ओलिंप FluoView सॉफ्टवेयर करने के लिए बनाया गया है। हालांकि, यहां वर्णित इमेजिंग मानकों को आसानी से अन्य confocal सिस्टम को संक्रमणीय होना चाहिए।
    1. कम पिघलने एक अभिविन्यास अंग / संरचना के लिए उपयुक्त में agarose में माउंट भ्रूण, imaged किया जा ऊपर 4 में वर्णित है।
    2. ओ सी को संतुलित करने की अनुमति दें।
    3. एक ईमानदार विन्यास में confocal सूक्ष्मदर्शी के लिए लंबे समय तक काम दूरी पानी की सूई-कोन उद्देश्यों का प्रयोग करें। फ्लोरोसेंट संकेतों की राशि एकत्र किया जा सकता है कि अधिकतम और सबसे अच्छा हल करने की शक्ति है के लिए उच्चतम संभव एनए के साथ उद्देश्यों को चुनें। कई चैनलों से एकत्रित छवियों वार्णिक को सही उद्देश्यों (Apochromat) चुनते हैं।
    4. माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर खोलें और माइक्रोस्कोप के oculars के माध्यम से ब्याज के क्षेत्र की पहचान करने के लिए क्रमश: या तो प्रेषित या प्रतिदीप्ति प्रकाश का उपयोग करने पर "ट्रांस दीपक" या "महामारी दीपक" पर क्लिक करें।
    5. छवि के ढेर के अधिग्रहण के लिए निम्न स्कैनिंग मानकों को स्थापित करने के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग करें:
      1. "अधिग्रहण सेटिंग" विंडो में सत्यापित करें कि उद्देश्य इमेजिंग के लिए चुना उद्देश्य यह है कि बूंद-डो पर दिखाई देता है मैचउपलब्ध उद्देश्यों के एन मेनू।
        नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए एक विशेष उद्देश्य के लिए किसी भी पूर्व की गणना मानकों (जैसे, पार्श्व और अक्षीय संकल्प, confocal एपर्चर आदि के आकार के) सही पकड़ और मज़बूती से इस्तेमाल किया जा सकता है।
      2. छवि के विशिष्ट फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एस) के उचित लेजर लाइन / एस, और उत्तेजना और उत्सर्जन dichroic फिल्टर का चयन करें। "छवि अधिग्रहण नियंत्रण" विंडो में "डाई सूची" बटन पर क्लिक करके इस करते हैं और उचित fluorophore / एस चुनें। वैकल्पिक रूप से, स्वयं इन मानकों को स्थापित करने के लिए "प्रकाश पथ और रंजक" बटन पर क्लिक करें।
        नोट: जब "डाई सूची" बटन का विकल्प चुना जाता है, सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से उपयुक्त लेजर लाइनों, उत्तेजना और उत्सर्जन dichroic फिल्टर का चयन करता है और उचित रूप से confocal एपर्चर के आकार समायोजित कर देता है।
      3. "अधिग्रहण सेटिंग" विंडो में, "ज़ूम" कारक और "आकार को समायोजित एएसपीect स्कैन की गई छवि के अनुपात "(यानी, 512x512, 1024x1024 आदि) पिक्सेल आकार आवश्यक प्राप्त करने के लिए सबसे अच्छा संरचनाओं imaged किया जा रहा हल करने के लिए। पिक्सेल आकार सेट जिससे Nyquist नमूना मानदंड निम्नलिखित के बारे में आधे उद्देश्य के सैद्धांतिक संकल्प, होना करने के लिए । "छवि अधिग्रहण नियंत्रण" विंडो में जानकारी के लिए प्रतीक ( "मैं") के साथ बटन पर क्लिक अधिग्रहीत छवि के पिक्सेल आकार निर्धारित करने के लिए।
      4. "अधिग्रहण सेटिंग" विंडो में सबसे तेजी से संभव (2 μs / पिक्सेल) के लिए स्कैन गति सेट करें।
      5. Kalman लाइन औसतन पर "छवि अधिग्रहण नियंत्रण" विंडो क्लिक करें noise.A फैक्टर को कम करने के लिए 2 से 3 आमतौर पर काफ़ी है।
      6. स्पेक्ट्रा ओवरलैपिंग के साथ fluorophores इमेजिंग जब एक अनुक्रमिक स्कैनिंग मोड का चयन करें। ऐसा करने के लिए, "छवि अधिग्रहण नियंत्रण" विंडो में "अनुक्रमिक" और "रेखा" पर क्लिक करें।
      7. (आम तौर पर प्रासंगिक लेजर लाइन / s बिजली उत्पादन को समायोजित5% से नीचे)। विशिष्ट मूल्यों अनुभव से निर्धारित किए जाने की जरूरत है।
      8. "XY दोहराएँ" या "फोकस X2" या "x4 फोकस" बटन पर क्लिक करें लगातार चयनित क्षेत्र स्कैन करने के लिए है, जबकि प्रत्येक चैनल के लिए डिटेक्टर सेटिंग्स का समायोजन। "एचवी", "लाभ" समायोजित करें और छवियों ग्रे मूल्यों के उच्चतम गतिशील रेंज है कि प्राप्त करने के लिए प्रत्येक चैनल के लिए "ऑफसेट"।
        नोट: ये सेटिंग्स के लिए विशिष्ट मूल्यों अनुभव से निर्धारित किए जाने की जरूरत है। "एचवी" डिटेक्टर पर वोल्टेज समायोजित कर देता है अपनी संवेदनशीलता को बदलने के लिए, "ऑफसेट" डिटेक्टर के उत्पादन में संकेत समायोजित कर देता है और 'लाभ' एक निरंतर पहलू से डिटेक्टर के उत्पादन में संकेत पलता।
      9. प्रेस Ctrl + एच एक नज़र सारणी (हिलो) के तहत है कि संतृप्त पहचानती के माध्यम से प्राप्त कर लिया छवियों कल्पना करने के लिए (नीला दिखाई देते हैं) और अधिक संतृप्त पिक्सल (लाल दिखाई देते हैं), जो दोनों के आम तौर पर बचा जाना चाहिए। प्रासंगिक लेजर लिन की बिजली उत्पादन का पुन: मूल्यांकन करेंई / एस और डिटेक्टर सेटिंग्स।
        नोट: उच्च लेजर शक्ति और डिटेक्टर की "एचवी" के उच्च स्तर का प्रयोग अधिक संकेत को बढ़ावा मिलेगा। उच्च शक्ति लेजर हालांकि वृद्धि हुई विरंजन और फोटो विषाक्तता को बढ़ावा मिलेगा। बढ़ाने से "एचवी" वृद्धि शोर को बढ़ावा मिलेगा। इसलिए, एक समझौता जब लेजर शक्ति और "एचवी" जबकि तस्वीर क्षति को रोकने के शोर के स्वीकार्य स्तर के साथ छवियों को प्राप्त करने के लिए सेटिंग पाया जा करने की जरूरत है (यह भी 1 टेबल देखें)।
      10. ब्याज की क्षेत्र के ऊपरी और निचले सीमा पर ध्यान केंद्रित करके एक निर्धारित मात्रा से छवियों को ले लीजिए। मात्रा के ऊपरी और निचले सीमा पर जेड ढेर खिड़की के "अंत निर्धारित" और "प्रारंभ सेट" सेट बटन पर "अधिग्रहण सेटिंग" विंडो क्लिक में imaged किया जाना है। एक कदम आकार है कि दिए गए उद्देश्य के लिए Z संकल्प के आधे का चयन करें (जैसे।, जेड संकल्प है अगर 2 माइक्रोन 1 माइक्रोन का चयन)। लीजेंड के Z संकल्प निर्धारित करने के लिएई "छवि अधिग्रहण नियंत्रण" विंडो में जानकारी के लिए प्रतीक ( "मैं") के साथ बटन पर क्लिक करें।
      11. एक लौकिक आवृत्ति है कि subcellular संरचना की गतिशीलता के लिए उचित imaged किया जा रहा है पर जेड के ढेर इकट्ठा करने के लिए एक समय श्रृंखला सेट करें। "TimeScan" उप विंडो में आवृत्ति, जिस पर जेड के ढेर का अधिग्रहण किया जाना चाहिए ( "अंतराल" ') और कई बार छवियों का अधिग्रहण किया जाना चाहिए ( "अंक") की संख्या दर्ज करें।
      12. "छवि अधिग्रहण नियंत्रण" विंडो में "गहराई" और "टाइम" बटन पर क्लिक करें पुष्टि करने के लिए कि एक z ढेर और समय श्रृंखला का अधिग्रहण किया जाएगा। अंत में समय चूक छवियों को प्राप्त करने शुरू करने के लिए "XYZT" बटन पर क्लिक करें।
      13. छवि अधिग्रहण के पूरा होने के बाद, निरीक्षण "श्रृंखला किया" सॉफ्टवेयर इंटरफेस पर। इस पर क्लिक करें और छवियों और उनके साथ जुड़े मेटाडाटा रिकॉर्ड करने के लिए "OIB" प्रारूप में छवियों को बचाने के लिए।
        नोट: छवियों पर प्राप्तव्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोप और confocal खुर्दबीन कल्पना और इस तरह फिजी, एक मुक्त सार्वजनिक डोमेन छवि प्रसंस्करण कार्यक्रम के रूप में सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है।

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Representative Results

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यहां व्यापक क्षेत्र और छवि माइटोकॉन्ड्रिया और zebrafish भ्रूण जीने में centrosomes को confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग सीधे तुलना और विषम है। जो कोशिकाओं में organelle गतिशीलता हैं के स्थान की जांच की जाए और विशिष्ट subcellular घटनाओं के निहित आवृत्ति के आधार पर, आम तौर पर या तो व्यापक क्षेत्र या confocal माइक्रोस्कोपी बेहतर विकल्प है। हम आरबी भ्रूण की सतह पर स्थित न्यूरॉन्स में और रेटिना गहरी स्थित कोशिकाओं में अंगों imaged। उनके दो आयामी ज्यामिति के साथ आरबी न्यूरॉन्स एक साथ की सतही स्थान दोनों व्यापक क्षेत्र और confocal माइक्रोस्कोपी (चित्रा 2) द्वारा imaged किया जा रहा करने के लिए उन्हें अच्छा उम्मीदवार बनाते हैं। Confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग हासिल छवियों हालांकि काफी धीमी है और विशिष्ट subcellular घटनाओं (जैसे, माइटोकॉन्ड्रिया की आवाजाही, चित्रा -2 सी, डी की गतिशीलता के लिए एक मूल्यवान समझना के लिए नेतृत्व कर सकते हैं (चित्रा 3)।

अंगों और सेलुलर झिल्ली की समवर्ती दृश्य सक्षम करने के लिए हम तीन अलग अलग विन्यास में Gal4 यूएएस प्रणाली का इस्तेमाल किया। सबसे पहले, यूएएस MitoFish संवाददाता लाइन टीजी (यूएएस E1B: mYFP, mitoCFP) mde6 इस्तेमाल किया गया था। इधर, एक द्विदिश यूएएस mitochondrially-लक्षित सीएफपी और झिल्ली लक्षित YFP के सहवर्ती अभिव्यक्ति परमिट। उचित Gal4 चालक लाइनों के साथ संयोजन में, MitoFish (चित्रा 3 ए, बी) के सीएफपी और YFP आर के साथ आरबी संवेदी न्यूरॉन्स के माइटोकॉन्ड्रिया और कोशिका झिल्ली (चित्रा 2A सी) या रेटिना की कोशिकाओं लेबल espectively। दूसरा, दो यूएएस constructs (यूएएस: mitoCFP और यूएएस: एमए-YFP) एक Gal4 चालक निर्माण के साथ संयुक्त थे (संवेदी: Gal4-VP16, आइलेट -1 जीन से संवेदी न्यूरॉन विशिष्ट बढ़ाने तत्व) क्षणिक इंजेक्शन में 7। मूसा की अभिव्यक्ति है कि आम तौर पर इन इंजेक्शनों का परिणाम दिन (चित्रा 2 ई) पर व्यक्ति की कोशिकाओं की ट्रैकिंग की अनुमति दी। एक तीसरा दृष्टिकोण दो यूएएस कैसेट का उपयोग कार्यरत हैं, प्रत्येक एक अलग संलयन प्रोटीन की अभिव्यक्ति ड्राइविंग, एक भी सन्निहित निर्माण पर। Tum1, जिसमें एक centrin4-YFP संलयन centrosomes लेबल और आसमानी कोशिका झिल्ली को लक्षित है इस रणनीति CentrinFish टीजी (: cetn4-YFP, यूएएस एमए-आसमानी यूएएस) उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। विशिष्ट Gal4 चालक लाइनों के साथ संयोजन में centrosomes और रेटिना की कोशिकाओं (चित्रा -3 सी, डी) या मांसपेशी फाइबर (चित्रा 4) की कोशिका झिल्ली लेबल रहे हैं।

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चित्रा 2: भ्रूण zebrafish की आरबी संवेदी न्यूरॉन्स में विवो में माइटोकॉन्ड्रिया इमेजिंग।
2 के पंख गुना की दुम भाग में आरबी संवेदी न्यूरॉन्स DPF MitoFish 0.80 की एक एनए के साथ एक Apochromat 40x पानी की सूई-कोन उद्देश्य का उपयोग imaged थे, या तो व्यापक क्षेत्र (ए) या ​​confocal (बी) माइक्रोस्कोपी द्वारा। क्षेत्र को रेखांकित किया। सी वाइड-फील्ड समय चूक परिधीय MitoFish DPF 2 में एक आरबी न्यूरॉन के कुंज में ब्याज की एक छोटे से क्षेत्र की छवियों का सही शो विस्तार करने के लिए पैनलों। एक भी माइटोकॉन्ड्रियन के आंदोलन ( '0 में तीर') 100 सेकंड से अधिक लगाया गया था; छह समय अंक प्रदर्शित कर रहे हैं। पिछले समय बिंदु में माइटोकॉन्ड्रियन की स्थिति मैजेंटा में उल्लिखित है। डी सी में आगे बढ़ माइटोकॉन्ड्रियन की स्थिति ई Confocal छवियों को प्रकट नहीं करता।। व्यक्तिगत आरबी कोशिकाओं और उनके माइटोकॉन्ड्रिया की लेबलिंग द्वारा प्राप्त किया गया था सह इंजेक्शन लगाने के एक संवेदी न्यूरॉन विशिष्ट Gal4 चालक दो यूएएस संवाददाता निर्माणों, यूएएस के साथ मिलकर निर्माण: mitoCFP और यूएएस: एमए-YFP, एक सेल मंच पर और अलग-थलग डबल के लिए स्क्रीनिंग -labeled कोशिकाओं। छवि के विपरीत उल्टे और व्यक्तिगत माइटोकॉन्ड्रिया मैजेंटा डॉट्स के रूप में रेखाचित्र के रूप में चित्रित कर रहे है। स्केल पट्टी ए, बी 20 माइक्रोन, सी 2 माइक्रोन, 50 माइक्रोन। Mitochondrially लक्षित सीएफपी (mitoCFP), झिल्ली लक्षित YFP (एमए-YFP)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: भ्रूण zebrafish रेटिना में विवो में छवि अंगों को व्यापक क्षेत्र और confocal माइक्रोस्कोपी की तुलना।
Otx2 प्रमोटर तत्वों माइटोकॉन्ड्रिया और कोशिका झिल्ली (ए और बी) या centrosomes और zebrafish भ्रूण DPF 2 की रेटिना में कोशिका झिल्ली (सी और डी) में आसमानी में YFP में YFP में सीएफपी की अभिव्यक्ति ड्राइव। इस लेबलिंग पैटर्न, Otx2 लक्ष्य को हासिल करने के लिए: Gal4 ट्रांसजेनिक मछली या तो MitoFish (ए और बी) को पार कर रहे थे ओआर CentrinFish (सी और डी)। एक 40x पानी की सूई-कोन Apochromat उद्देश्य (एनए 0.80) व्यापक क्षेत्र (ए, सी) और confocal (बी, डी) माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर प्रत्येक रेटिना में एक ही क्षेत्र की छवियों को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। में insets और भीतर परमाणु परत के एक क्षेत्र के बी शो विस्तार, सी और डी में insets एम चरण में एक सेल दिखा। स्केल बार 20 माइक्रोन। Mitochondrially लक्षित सीएफपी (mitoCFP), झिल्ली लक्षित YFP (एमए-YFP), centrin4-YFP (cetn4-YFP), झिल्ली लक्षित आसमानी (एमए-आसमानी)। यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: व्यापक क्षेत्र और confocal microsc की तुलनाविवो में छवि centrosomes करने की प्रतिलिपि बनाएं।
Fluorescently के साथ एक एकल मांसपेशी फाइबर कोशिका झिल्ली और centrosomes (Otx2: Gal4; CentrinFish) टैग कर ली गई है व्यापक क्षेत्र (ए) और confocal (बी) माइक्रोस्कोपी का उपयोग। दोनों ही मामलों में एक 40x पानी की सूई-कोन Apochromat उद्देश्य (एनए 0.80) का इस्तेमाल किया गया था। स्केल बार 10 माइक्रोन। Centrin4-YFP (cetn4-YFP), झिल्ली लक्षित आसमानी (एमए-आसमानी) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

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यहाँ, हम fluorescently टैग माइटोकॉन्ड्रिया, centrosomes और सेलुलर zebrafish भ्रूण में vivo में विशेष सेल प्रकार की झिल्ली Gal4 यूएएस अभिव्यक्ति प्रणाली की बहुमुखी प्रतिभा का प्रदर्शन। कई फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन है कि अन्य अंगों या subcellular संरचनाओं लेबल प्रकाशित साहित्य में पाया जा सकता है और संबंधित प्रयोगशाला, वाणिज्यिक स्रोतों या गैर वाणिज्यिक प्लाज्मिड डिपॉजिटरी (जैसे, Addgene) से प्राप्त किया जा सकता है। एक नए फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन डिजाइन करने के लिए, कई मापदंडों जो एफपी का उपयोग करने के लिए और ब्याज की प्रोटीन के अमीनो या carboxy टर्मिनस पर एफपी फ्यूज करने के लिए है कि क्या शामिल है, पर विचार करने की जरूरत है। फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन पैदा करने के बारे में और अधिक गहन चर्चा के लिए, पाठकों विषय 49-51 के बारे में गहराई से लेख के लिए भेजा जाता है।

हम यूएएस संचालित transgenes का उपयोग कर संलयन प्रोटीन के सह-अभिव्यक्ति को प्राप्त करने के लिए तीन रणनीतियों पर प्रकाश डाला। एकाधिक, separatई यूएएस संवाददाता निर्माणों अलग मौजूदा रिपोर्टर के संयोजन के लिए अनुमति देने के अतिरिक्त क्लोनिंग के लिए आवश्यकता के बिना निर्माण करती है। संवाददाता अभिव्यक्ति का स्तर भी स्वतंत्र रूप से titrated जा सकता है। हालांकि, सह अभिव्यक्ति के उच्च स्तर को प्राप्त कर रहे हैं जब या तो कई यूएएस कैसेट या एक भी निर्माण पर एक द्विदिश यूएएस कैसेट इस्तेमाल कर रहे हैं। चूंकि एफपीएस टैग के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं यह अपेक्षाकृत सह अभिव्यक्ति को सत्यापित करने के लिए आसान है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि बहु-cistronic अभिव्यक्ति के लिए अन्य तरीकों में भी आंतरिक ribosomal प्रविष्टि साइटों 40 और वायरल 2A पेप्टाइड्स 52,53 के उपयोग सहित मौजूद हैं। इन विट्रो लिखित छाया में डीएनए आधारित निर्माणों के लिए एक विकल्प के रूप में, mRNA subcellular संरचनाओं 1,4,8 लेबल करने के लिए फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस दृष्टिकोण की चेतावनी है कि अभिव्यक्ति के विकास के पहले कुछ दिनों तक ही सीमित है और सेल या ऊतक विशिष्ट नहीं है तथापि है। विधि संलयन प्रोटीन व्यक्त करने के लिए चुना के चाहे, यह महत्वपूर्ण हैयह सुनिश्चित करें कि अभिव्यक्ति के स्तर गैर विशिष्ट लेबलिंग करने के लिए नेतृत्व नहीं है और कोशिकाओं की शारीरिक स्थिति में समझौता। इस संबंध में पत्रकार जीन अभिव्यक्ति Gal4 यूएएस प्रणाली 27 में निहित के प्रवर्धन समस्याग्रस्त हो सकता है, साइटोसोलिक लेबलिंग भी जब एफपी एक विशिष्ट organelle करने का लक्ष्य है, उदाहरण के लिए प्रकट। जब उपलब्ध हो, एंटीबॉडी सत्यापित करने के लिए अभिव्यक्ति संलयन प्रोटीन द्वारा प्राप्त पैटर्न अंतर्जात स्थिति को दर्शाते है कि इस्तेमाल किया जाना चाहिए। कुछ उदाहरणों में, कम (ईआर) डीएनए सांद्रता के इंजेक्शन संलयन प्रोटीन की गलत स्थानीयकरण की समस्या को कम कर सकता है। वैकल्पिक रूप से, यूएएस दोहराता की कम संख्या के साथ वैक्टर transgene अभिव्यक्ति के स्तर 30 नीचे titrate करने में मदद कर सकता है। इसी तरह, उत्प्रेरक Gal4-VP16, संशोधित संस्करण मौजूद है, जो अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए अपेक्षाकृत कमजोर सूचना दी और इसलिए कम विषाक्त 30,33 हैं कर रहे हैं। संलयन प्रोटीन की गलत स्थानीयकरण डॉव titrate करने के प्रयासों के बावजूद बनी रहती हैn transgene अभिव्यक्ति के स्तर, यह Gal4 यूएएस प्रणाली छोड़ और सीधे प्रमोटर तत्वों द्वारा अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए आवश्यक हो सकता है।

स्थिर ट्रांसजेनिक लाइनों, MitoFish 10 और 12 CentrinFish, हम इस पांडुलिपि 14xUAS कैसेट का उपयोग किया गया में वर्णन है। हम पीढ़ियों से अधिक अभिव्यक्ति में परिवर्तन का पता लगाने के बाद से कई यूएएस दोहराता साथ संवाददाता लाइनों 54 मुंह बंद होने का खतरा होने की सूचना दी गई है Gal4 चालक लाइनों की पृष्ठभूमि में इन लाइनों को बनाए रखने। हम 3 पीढ़ियों हम CentrinFish प्रचारित है पर मुंह बंद करने के सबूत नहीं देखा है। हम फिर भी MitoFish में तरह तरह की अभिव्यक्ति को देखा है और इसलिए इसरो भविष्य की पीढ़ियों के लिए प्रचार करने के लिए अभिव्यक्ति की 'पूर्ण', मजबूत स्तर के साथ भ्रूण का चयन करें। वर्तमान साहित्य चलता है कि 5xUAS दोहराता साथ अभिव्यक्ति वैक्टर स्थिर ट्रांसजेनिक लाइनों पैदा करने के लिए एक विकल्प हो सकता है - पत्रकार हैपर्याप्त उच्च स्तरों के 30 करने के लिए प्रेरित और यूएएस की अपेक्षाकृत कम संख्या में यह कम ट्रांस्जीन मुंह बंद होने का खतरा बना सकता है दोहराता है, हालांकि गैर दोहराए यूएएस दोहराता कथित तौर पर और भी कम अतिसंवेदनशील 54 हैं।

वर्तमान में टैग अंगों या अन्य subcellular संरचनाओं के लिए उपलब्ध एफपीएस के पैलेट बहुत व्यापक 55 है। जब एक टैग के रूप में एक विशेष एफपी का चयन, विचार निम्नलिखित मानकों को दी जानी चाहिए: सबसे पहले, एफपी की उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा विशिष्ट लेजर लाइन के साथ ही अपने दृश्य के लिए आवश्यक उत्तेजना और उत्सर्जन फिल्टर निर्धारित करने के लिए। दूसरा, चमक और एफपी की तस्वीर-स्थिरता। तीसरा, जो गति के साथ एफपी निम्नलिखित अनुवाद परिपक्व होती है। चौथा, एफपी fusions में कुल करने के लिए एक प्रवृत्ति है या नहीं। पिछले पैरामीटर के बारे में, देखभाल प्रयोग किया जाना चाहिए और नियंत्रण प्रयोगों विशिष्ट प्रयोगों के लिए प्रत्येक एफपी की उपयुक्तता का परीक्षण करने के लिए किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, पुन जबकिडी एफपीएस mCherry और DsRed व्यापक रूप से इस्तेमाल कर रहे हैं, वे कथित तौर पर कुछ fusions 56 में समुच्चय के रूप में। हम जब माइटोकॉन्ड्रिया के लिए और सेलुलर झिल्ली (अप्रकाशित टिप्पणियों) करने का लक्ष्य अच्छा प्रदर्शन करने TagRFP टी 57, TagRFP का एक और अधिक तस्वीर स्थिर संस्करण, मिल गया है। कई अंगों समन्वित रूप से देखे जा करने के लिए, एफपीएस गैर अतिव्यापी स्पेक्ट्रा के साथ की जरूरत है जब इस्तेमाल किया जाना चाहिए। हम सफलतापूर्वक सियान एफपीएस (सीएफपी और आसमानी) और YFP (आंकड़े 2-4) के संयोजन का इस्तेमाल किया है। नीले रंग से निकट अवरक्त वर्णक्रम के लिए पूरी रेंज का शोषण करके, एक बहुत subcellular संरचनाओं कि समवर्ती देखे जा सकते हैं 2 की संख्या का विस्तार कर सकते हैं। पारंपरिक एफपीएस के अलावा, फोटो सक्रिय एफपीएस विशेष रूप से organelle गतिशीलता की जांच के लिए, जैसे, एफपी Kaede का उपयोग व्यक्तिगत माइटोकॉन्ड्रिया 58 के भाग्य का ट्रैक करने के लिए उपयोगी होते हैं।

कौन सा माइक्रोस्कोपी तकनीक - व्यापक क्षेत्र या confocal - सबसे हैइमेजिंग के लिए उपयुक्त कारकों, कोशिकाओं के स्थान imaged किया जा करने के लिए और गति के साथ जो विशिष्ट subcellular या सेलुलर घटनाओं होने की उम्मीद कर रहे हैं सहित की एक संख्या पर निर्भर करता है। व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोपी सतही स्थानों और कम लेबल नमूने में पसंदीदा साधन है। यह एक उचित मूल्य पर उच्च गति से कम तस्वीर विषाक्तता और इमेजिंग प्रदान करता है। हालांकि, इमेजिंग घनी लेबल नमूनों में, zebrafish की गैर-सतही हिस्सों में प्रदर्शन किया जाएगा या तीन आयामी जानकारी, confocal या ऑप्टिकल सेक्शनिंग माइक्रोस्कोपी का दूसरा रूप हासिल करने के लिए की जरूरत है अगर पसंद की विधि हो जाता है।

चाहे जो के सेलुलर या subcellular संरचना पर नजर रखी जा रही है, वहां अक्सर सबसे अच्छा संभव छवि प्राप्त करने और नमूना जीवित है और बार-बार समय चूक इमेजिंग के लिए अच्छा शारीरिक हालत में रखने के बीच एक व्यापार बंद है। फोटो-विषाक्तता अंगों के व्यवहार में परिवर्तन, कोशिकाओं की न्यायपालिका आकृति विज्ञान या यहां तक ​​कि सेल के रूप में प्रकट कर सकते हैंमौत। दोनों व्यापक क्षेत्र और confocal माइक्रोस्कोपी के लिए तस्वीर विरंजन और फोटो विषाक्तता को कम करने के लिए कुंजी छवियों को प्राप्त करने के लिए प्रकाश की संभव सबसे कम स्तर का उपयोग करने के लिए है। इस संबंध में उच्चतम संभव एनए के साथ उद्देश्यों फ्लोरोसेंट संकेत की राशि एकत्र किया जा सकता है कि अधिकतम करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। confocal माइक्रोस्कोपी के लिए, मानकों के एक नंबर कम लेजर शक्ति के उपयोग के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए समायोजित किया जा सकता है। पारंपरिक PMTs, जैसे, गैलियम आर्सेनाइड फास्फाइड डिटेक्टरों की तुलना में अधिक मात्रा दक्षता के साथ डिटेक्टरों, यह सुनिश्चित करने के लिए कि उत्सर्जित फोटॉनों अधिक का पता लगाया जाने की संभावना है इस्तेमाल किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से या इसके अतिरिक्त, उच्च dynode voltages डिटेक्टरों की संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए पीएमटी में लागू किया जा सकता है। confocal एपर्चर (पिनहोल), अधिक फ्लोरोसेंट संकेत के संग्रह के लिए अनुमति देने के लिए अक्षीय संकल्प के नुकसान के साथ यद्यपि खोला जा सकता है। जितना संभव हो कम प्रकाश में नमूनों को बेनकाब करने के लिए, स्कैनिंग उच्च गति पर किया जाना चाहिए कि इस तरह के समय ध्यान केन्द्रित करनापिक्सेल प्रति लेजर कम है। कम स्थानिक संकल्प पर स्कैनिंग भी स्कैनिंग की गति बढ़ाने का असर है। इमेजिंग कम बार हालांकि सिर्फ अगर यह जांच की प्रक्रियाओं के व्यापक नमूने समझौता नहीं करता विचार किया जाना चाहिए, कम रोशनी के लिए नमूना प्रकाश में लाने के अतिरिक्त लाभ है।

एक विकल्प के रूप में, कताई डिस्क confocal सूक्ष्मदर्शी और confocal सूक्ष्मदर्शी है कि एक तथाकथित 'गुंजयमान' स्कैनर के साथ लैस कर रहे हैं तेजी से स्कैनिंग के लिए क्षमता प्रदान करते हैं। दोनों के तौर तरीकों लाभ यह है कि वे तेजी से और कम तस्वीर विषैले से 'शास्त्रीय, बिंदु स्कैनिंग confocal सूक्ष्मदर्शी कर रहे हैं। हालांकि, कताई डिस्क confocal सूक्ष्मदर्शी Z संकल्प में और अधिक सीमित हैं और बिंदु स्कैनिंग confocal सूक्ष्मदर्शी के रूप में ऊतक में के रूप में गहरी पैठ नहीं कर सकते। इसी तरह, गुंजयमान-स्कैनर confocal सूक्ष्मदर्शी के आवेदन गरीब छवि गुणवत्ता जो कर सकते थे करने के लिए नेतृत्व करेंगे बहुत ही कम पिक्सेल ध्यान केन्द्रित करना समय के रूप में सीमित किया जा सकता है,बारी में, उप सेलुलर घटनाओं (जैसे, कम संकेत करने वाली शोर के साथ बाइनरी छवियों) का पता लगाने में बाधा।

अन्त में, जबकि व्यापक क्षेत्र और confocal इमेजिंग यहां डाला जाता है, प्रकाश माइक्रोस्कोपी जैसे दो photon 59 और प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी 60 के अन्य रूपों विशिष्ट प्रश्न के लिए अधिक उपयुक्त हो सकता है। दो photon माइक्रोस्कोपी प्रकाश स्पेक्ट्रम के अवरक्त रेंज में दो फोटॉनों के एक साथ अवशोषण द्वारा एक fluorophore की उत्तेजना पर आधारित है। confocal माइक्रोस्कोपी के साथ आम में, यह बात स्कैनिंग का उपयोग करता नमूना से छवियों को प्राप्त करने के लिए और दो photon उत्तेजना की गैर linearity के आधार पर ऑप्टिकल सेक्शनिंग क्षमताओं की है। fluorophore उत्तेजना के लिए लंबे तरंगदैर्ध्य के प्रकाश का इस्तेमाल गहराई सतह से कई सौ माइक्रोन पर इमेजिंग परमिट। इसके अलावा एक छोटा सा इमेजिंग मात्रा को उत्तेजना के प्रतिबंध के फोकल हवाई जहाज़ के बाहर तस्वीर विरंजन और फोटो विषाक्तता से बचाता है। हालांकि, सभी एफपीउच्च multiphoton अवशोषण पार वर्गों एक समस्या लाल एफपीएस में विशेष रूप से प्रचलित है कि राशि। इसके अलावा, एक भी अवरक्त तरंगदैर्ध्य एक साथ कई अलग एफपीएस उत्तेजित करने के लिए खोजने मल्टी चैनल इमेजिंग बोझिल बना पाना मुश्किल है। लाइट-चादर माइक्रोस्कोपी एक पतली लेजर प्रकाश की 'चादर' (आम तौर पर 2 से 10 माइक्रोन से लेकर मोटाई) का उपयोग करता नमूना उत्तेजित करने के लिए और एक सीधा कोण एक संवेदनशील कैमरे का उपयोग करने पर इस प्रबुद्ध फोकल हवाई जहाज़ से प्रतिदीप्ति संकेतों का पता लगाता है। ऑप्टिकल सेक्शनिंग एक समय में एक ही विमान रोशन द्वारा हासिल की है। उत्तेजना प्रकाश की यह प्रतिबंध फोटो विषाक्तता की घटना कम कर देता है। चूंकि पूरे प्रबुद्ध विमान से प्रतिदीप्ति संकेतों एक साथ एकत्र कर रहे हैं, छवि अधिग्रहण बिंदु स्कैनिंग confocal और multiphoton सूक्ष्मदर्शी की तुलना में काफी तेज है। इन सभी विशेषताओं प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी विशेष रूप में उच्च spatiotemporal संकल्प के साथ गतिशील सेलुलर घटनाओं इमेजिंग के लिए अनुकूल बनाने केलाइव नमूनों की बड़ी मात्रा में। दरअसल, का उपयोग करते हुए प्रकाश चादर पूरे zebrafish भ्रूण में माइक्रोस्कोपी सेल भाग्य व्यापक विकास 61 के पहले 24 घंटे के दौरान लगाया गया था। बेहतर इमेजिंग पैठ 62,63 और स्थानिक संकल्प 64 को निरंतर सुधार के साथ, यह है कि प्रकाश-चादर माइक्रोस्कोपी न केवल सेलुलर पर बल्कि पूरे zebrafish भ्रूण में subcellular स्तर पर गतिशीलता की जांच के लिए नियोजित किया जाएगा बोधगम्य है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose (2-hydroxyethylagarose) Sigma-Aldrich A4018-10G Low-gelling temperature Type VII
Block heater Eppendorf Thermomixer compact
Ca(NO3)2 Calcium nitrate hydrate, 99.996%  Aldrich 202967-50g To prepare 30x Danieau's
CCD camera Qimaging Retiga Exi Fast 1394
Ceramic Coated Dumont #5 Forceps Dumont - Fine Science Tools 11252-50 #5 Forceps
Confocal laser-scanning microscope Olympus FV1000 Fluoview
Culture dish heater Warner Instrument Corporation DH-35 Heating ring
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfate salt PharmaQ Tricaine PharmaQ-25g Tricaine (anesthetic)
Fluorescence dissecting microscope Leica M205 FA
GeneClean kit MP Biomedicals 111001200
Glass Bottom Culture Dishes MatTek Corporation P35G-0-14-C 35 mm petri dish, 14 mm microwell, No. 0 coverglass
Glass needles World Precision Instruments Inc.  TW100F-4 For microinjections
HEPES Sigma H3375-250g To prepare 30x Danieau's
High vacuum grease Dow Corning  DCC000001242 150g Silicon dioxide grease
KCl 99% Sigma-Aldrich S7643-5kg To prepare 30x Danieau's
MgSO4.7H2O   Magnesium sulfate heptahydrate 98+% A.C.S reagent Sigma-Aldrich 230291-500g To prepare 30x Danieau's
Microinjector  Eppendorf FemtoJet
Microloader tips Eppendorf 930001007 0.5-20 ul
Micromanipulator Maerzhaeuser Wetzlar MM33 Rechts/00-42-101-0000/M3301R
Micropipette holder Intracel P/N 50-00XX-130-1
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit Ambion AM1340 To transcribe PCS-Transposase
NaCl BioXtra >99.5% Sigma-Aldrich P9541-1kg To prepare 30x Danieau's
Nanophotometer To measure DNA/RNA concentration
Needle puller Sutter Instrument P-1000 Flaming/Brown
NIR Apo 40x/0.80W  Nikon Water-dipping-cone objective
N-Phenylthiourea Grade I, approx. 98% Sigma P7629-10G PTU (prevents pigmentation)
Petri dishes Sarstedt AG  821472 92 x 16mm 
Plastic molds  Adaptive Science Tools TU-1 For microinjections
Plexiglas cover-with a hole Custom-made The hole in the Plexiglas cover should be 3 mm larger than the diameter of the water-dipping-cone objective
Tea-strainer (Plastic) To collect zebrafish eggs
Temperature controller Warner Instrument Corporation TC-344B Dual Automatic Temperature Controller
Transfer pipettes Sarstedt AG  86.1171 3.5mL plastic transfer pipettes
UMPlanFI 100x/1.00W Olympus Water-dipping-cone objective
UMPlanFLN 20x/0.50W  Olympus Water-dipping-cone objective
Widefield microscope Olympus BX51WI
PTU (50x Stock) Dissolve 76 mg PTU in 50 ml distilled water
Stir vigorously at room temperature 
Store at -20 oC in 1 ml aliquots
Use at 1x working solution
Tricaine (20x Stock) Dissolve 200 mg Tricaine in 48 ml distilled water
Add 2 ml 1M Tris base (pH9)
Adjust to pH 7 
Store at -20 oC in 1 ml aliquots
Use at 1x working solution
Danieau's Solution (30x Stock) 1,740 mM  NaCl 
21 mM      KCl 
12 mM      MgSO4.7H2
18 mM      Ca (NO3)2
150 mM    HEPES buffer 
Distilled water upto 1 L 
Store at 4 o
Use at 0.3x working solution

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References

  1. Alexandre, P., Reugels, A. M., Barker, D., Blanc, E., Clarke, J. D. Neurons derive from the more apical daughter in asymmetric divisions in the zebrafish neural tube. Nat Neurosci. 13, (6), 673-679 (2010).
  2. Distel, M., Hocking, J. C., Volkmann, K., Koster, R. W. The centrosome neither persistently leads migration nor determines the site of axonogenesis in migrating neurons in vivo. J Cell Biol. 191, (4), 875-890 (2010).
  3. Godinho, L., et al. Nonapical symmetric divisions underlie horizontal cell layer formation in the developing retina in vivo. Neuron. 56, (4), 597-603 (2007).
  4. Norden, C., Young, S., Link, B. A., Harris, W. A. Actomyosin is the main driver of interkinetic nuclear migration in the retina. Cell. 138, (6), 1195-1208 (2009).
  5. Godinho, L., et al. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. 132, (22), 5069-5079 (2005).
  6. Mumm, J. S., et al. In vivo imaging reveals dendritic targeting of laminated afferents by zebrafish retinal ganglion cells. Neuron. 52, (4), 609-621 (2006).
  7. Sagasti, A., Guido, M. R., Raible, D. W., Schier, A. F. Repulsive interactions shape the morphologies and functional arrangement of zebrafish peripheral sensory arbors. Current biology : CB. 15, (9), 804-814 (2005).
  8. Zolessi, F. R., Poggi, L., Wilkinson, C. J., Chien, C. B., Harris, W. A. Polarization and orientation of retinal ganglion cells in vivo. Neural Dev. 1, 2 (2006).
  9. Kim, M. J., Kang, K. H., Kim, C. H., Choi, S. Y. Real-time imaging of mitochondria in transgenic zebrafish expressing mitochondrially targeted GFP. Biotechniques. 45, (3), 331-334 (2008).
  10. Plucinska, G., et al. In vivo imaging of disease-related mitochondrial dynamics in a vertebrate model system. J Neurosci. 32, (46), 16203-16212 (2012).
  11. O'Donnell, K. C., Vargas, M. E., Sagasti, A. WldS and PGC-1alpha regulate mitochondrial transport and oxidation state after axonal injury. J Neurosci. 33, (37), 14778-14790 (2013).
  12. Engerer, P., Yoshimatsu, T., Suzuki, S. C., Godinho, L. CentrinFish permit the visualization of centrosome dynamics in a cellular context in vivo. Zebrafish. 11, (6), 586-587 (2014).
  13. Wang, K., et al. Rapid adaptive optical recovery of optimal resolution over large volumes. Nat Methods. 11, (6), 625-628 (2014).
  14. Randlett, O., Poggi, L., Zolessi, F. R., Harris, W. A. The oriented emergence of axons from retinal ganglion cells is directed by laminin contact in vivo. Neuron. 70, (2), 266-280 (2011).
  15. Tanabe, K., et al. Atypical protein kinase C regulates primary dendrite specification of cerebellar Purkinje cells by localizing Golgi apparatus. J Neurosci. 30, (50), 16983-16992 (2010).
  16. Hocking, J. C., Distel, M., Koster, R. W. Studying cellular and subcellular dynamics in the developing zebrafish nervous system. Exp Neurol. 242, 1-10 (2013).
  17. Clark, B. S., Winter, M., Cohen, A. R., Link, B. A. Generation of Rab-based transgenic lines for in vivo studies of endosome biology in zebrafish. Dev Dyn. 240, (11), 2452-2465 (2011).
  18. Paolini, A., et al. Asymmetric inheritance of the apical domain and self-renewal of retinal ganglion cell progenitors depend on Anillin function. Development. 142, (5), 832-839 (2015).
  19. Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. The Journal of clinical investigation. 122, (7), 2337-2343 (2012).
  20. Steele, S. L., Prykhozhij, S. V., Berman, J. N. Zebrafish as a model system for mitochondrial biology and diseases. Translational research : the journal of laboratory and clinical medicine. 163, (2), 79-98 (2014).
  21. Novorol, C., et al. Microcephaly models in the developing zebrafish retinal neuroepithelium point to an underlying defect in metaphase progression. Open biology. 3, (10), 130065 (2013).
  22. Baye, L. M., et al. The N-terminal region of centrosomal protein 290 (CEP290) restores vision in a zebrafish model of human blindness. Human molecular genetics. 20, (8), 1467-1477 (2011).
  23. Flinn, L. J., et al. TigarB causes mitochondrial dysfunction and neuronal loss in PINK1 deficiency. Annals of neurology. 74, (6), 837-847 (2013).
  24. Paquet, D., et al. A zebrafish model of tauopathy allows in vivo imaging of neuronal cell death and drug evaluation. The Journal of clinical investigation. 119, (5), 1382-1395 (2009).
  25. Khuchua, Z., Yue, Z., Batts, L., Strauss, A. W. A zebrafish model of human Barth syndrome reveals the essential role of tafazzin in cardiac development and function. Circulation research. 99, (2), 201-208 (2006).
  26. Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of development. 80, (2), 153-158 (1999).
  27. Koster, R. W., Fraser, S. E. Tracing transgene expression in living zebrafish embryos. Dev Biol. 233, (2), 329-346 (2001).
  28. Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nat Methods. 2, (12), 920-931 (2005).
  29. Sambrook, J., Russell, D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  30. Distel, M., Wullimann, M. F., Koster, R. W. Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (32), 13365-13370 (2009).
  31. Skene, J. H., Virag, I. Posttranslational membrane attachment and dynamic fatty acylation of a neuronal growth cone protein, GAP-43. J Cell Biol. 108, (2), 613-624 (1989).
  32. Zuber, M. X., Strittmatter, S. M., Fishman, M. C. A membrane-targeting signal in the amino terminus of the neuronal protein GAP-43. Nature. 341, (6240), 345-348 (1989).
  33. Asakawa, K., et al. Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (4), 1255-1260 (2008).
  34. Godinho, L. Injecting zebrafish with DNA or RNA constructs encoding fluorescent protein reporters. Cold Spring Harb Protoc. 2011, (7), 871-874 (2011).
  35. Palanca, A. M., Sagasti, A. Optogenetic activation of zebrafish somatosensory neurons using ChEF-tdTomato. J Vis Exp. (71), e50184 (2013).
  36. Dean, D. A., Gasiorowski, J. Z. Preparing injection pipettes on a flaming/brown pipette puller. Cold Spring Harb Protoc. 2011, (3), prot5586 (2011).
  37. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, (3), 253-310 (1995).
  38. Ren, J. Q., McCarthy, W. R., Zhang, H. W., Adolph, A. R., Li, L. Behavioral visual responses of wild-type and hypopigmented zebrafish. Vision Research. 42, (3), 293-299 (2002).
  39. Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, Suppl 1. S7 (2007).
  40. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev Dyn. 236, (11), 3088-3099 (2007).
  41. Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Dev Dyn. 228, (1), 30-40 (2003).
  42. Davidson, A. E., et al. Efficient gene delivery and gene expression in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon. Dev Biol. 263, (2), 191-202 (2003).
  43. Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Dev Cell. 7, (1), 133-144 (2004).
  44. Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. Efficient transposition of the Tol2 transposable element from a single-copy donor in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (50), 19827-19832 (2008).
  45. Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th ed, University of Oregon Press. (2007).
  46. Wilkinson, R. N., Elworthy, S., Ingham, P. W., van Eeden, F. J. A method for high-throughput PCR-based genotyping of larval zebrafish tail biopsies. Biotechniques. 55, (6), 314-316 (2013).
  47. Carter, K. M., Woodley, C. M., Brown, R. S. A review of tricaine methanesulfonate for anesthesia of fish. Rev Fish Biol Fisher. 21, (1), 51-59 (2011).
  48. Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using microManager. Curr Protoc Mol Biol. 14.20 (2010).
  49. Snapp, E. L. Design and Use of Fluorescent Fusion Proteins in Cell Biology. Curr Protoc Cell Biol. 21.4 (2005).
  50. Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends in cell biology. 19, (11), 649-655 (2009).
  51. Costantini, L. M., Snapp, E. L. Fluorescent proteins in cellular organelles: serious pitfalls and some solutions. DNA and cell biology. 32, (11), 622-627 (2013).
  52. Provost, E., Rhee, J., Leach, S. D. Viral 2A peptides allow expression of multiple proteins from a single ORF in transgenic zebrafish embryos. Genesis. 45, (10), 625-629 (2007).
  53. Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLoS One. 6, (4), e18556 (2011).
  54. Akitake, C. M., Macurak, M., Halpern, M. E., Goll, M. G. Transgenerational analysis of transcriptional silencing in zebrafish. Dev Biol. 352, (2), 191-201 (2011).
  55. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2, (12), 905-909 (2005).
  56. Katayama, H., Yamamoto, A., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. GFP-like proteins stably accumulate in lysosomes. Cell Struct Funct. 33, (1), 1-12 (2008).
  57. Shaner, N. C., et al. Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins. Nat Methods. 5, (6), 545-551 (2008).
  58. Marinkovic, P., et al. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (11), 4296-4301 (2012).
  59. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2, (12), 932-940 (2005).
  60. Keller, P. J., Ahrens, M. B. Visualizing Whole-Brain Activity and Development at the Single-Cell Level Using Light-Sheet Microscopy. Neuron. 85, (3), 462-483 (2015).
  61. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, (5904), 1065-1069 (2008).
  62. Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nat Methods. 8, (9), 757-760 (2011).
  63. Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy. Nat Methods. 9, (7), 755-763 (2012).
  64. Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346, (6208), 1257998 (2014).
लिविंग zebrafish भ्रूण में subcellular संरचनाओं इमेजिंग
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Engerer, P., Plucinska, G., Thong, R., Trovò, L., Paquet, D., Godinho, L. Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (110), e53456, doi:10.3791/53456 (2016).More

Engerer, P., Plucinska, G., Thong, R., Trovò, L., Paquet, D., Godinho, L. Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (110), e53456, doi:10.3791/53456 (2016).

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