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Developmental Biology

Imagiologia estruturas celulares no embrião vivo Zebrafish

doi: 10.3791/53456 Published: April 2, 2016

Introduction

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Na imagem in vivo proporciona a visualização direta de comportamentos celulares no contexto mais fisiológica. A transparência de embriões de peixe-zebra, o seu desenvolvimento rápido e externa e uma rica variedade de ferramentas genéticas que permitem a marcação fluorescente têm contribuído para o crescente uso de microscopia in vivo para elucidar a dinâmica dos eventos fundamentais de desenvolvimento. Estudos de imagem do desenvolvimento do sistema nervoso no peixe-zebra tem, por exemplo, expandiu enormemente o nosso conhecimento do comportamento das células progenitoras neurais eo destino de seus descendentes, incluindo a sua subseqüente migração, diferenciação e integração de circuitos 1-8.

O palco já está definido para investigar a dinâmica subcelulares subjacentes a esses comportamentos celulares. De fato, peixe-zebra já estão sendo exploradas como ferramentas para a biologia celular vivo. Agora é possível visualizar mitocôndrias 9-11, centrossomas 2,8,12-14, Golgi 15, O citoesqueleto de microtúbulos 4 e actina 16, endossomas e 17 componentes da membrana apical 1,18 complexo, entre outras estruturas subcelulares em embriões de peixe-zebra in vivo. Até agora, muito do que se sabe sobre a função destes organelos vem do estudo do seu comportamento em células em cultura. Embora estudos in vitro produziram tremenda visão sobre biologia celular, células em cultura não representa totalmente a complexidade da situação in vivo e, portanto, não refletem necessariamente a função e dinâmica de organelos subcelulares in vivo. Embriões de peixe-zebra oferecer uma alternativa viável em alternativa vivo para examinar a dinâmica subcelulares.

Como vertebrados, peixe-zebra possuem diversos sistemas de órgãos (por exemplo, retina neural) que são homólogos aos encontrados em espécies de mamíferos. Para além disso, os embriões de peixe-zebra são cada vez mais utilizadas para modelar doenças humanas 19,20 (por exemplo, microcefalia 21 e amaurose 22 congênita de Leber) e função mitocondrial (por exemplo, doença de Parkinson 23, Tauopatias 10,24 e síndrome de Barth 25). imagiologia in vivo a nível celular e subcelular nestes casos irá permitir uma melhor compreensão da biologia celular subjacente a estes estados patológicos.

O objetivo geral dos métodos descritos aqui é fornecer um guia completo para investigar organelas e outras estruturas subcelulares em embriões de peixe-zebra usando em microscopia de luz vivo. O todo o fluxo de trabalho envolvido na visualização e rastreamento estruturas subcelulares in vivo é descrito - a partir de rotulagem abordagens genéticas, para gerar expressam transitoriamente e peixes transgénicos estáveis, e, finalmente, para imagiologia utilizando de campo amplo e microscopia confocal. Enquanto cada um destes Procedures é utilizado por numerosos laboratórios de peixe-zebra, os protocolos descritos são otimizados e simplificado para investigar a dinâmica das estruturas subcelulares. Dois aspectos específicos do trabalho aqui descrito garante menção: Em primeiro lugar, a utilização do sistema de expressão de Gal4 UAS-em múltiplas configurações geneticamente organelos etiqueta integrada tipos de células específicos. Em segundo lugar, uma comparação directa de grande campo e microscopia confocal a estruturas subcelulares de imagem in vivo.

As estratégias actuais geneticamente organelos de etiquetas e de outras estruturas subcelulares no peixe-zebra, quer fazer uso de ARNm tampado 1,4,8 ou construções de ADN com base em elementos promotores conduzir directamente a expressão de proteínas de fusão 9,14,15. Transcrito in vitro de ARN em tampado resultados rápida e expressão ampla, que não é específico do tecido entanto. Além disso, os níveis de expressão diminuir ao longo do tempo, como o RNA tampado é diluído ou degradados. Assim, o uso de ARN baseadoconstrói para examinar a dinâmica de organelos em fases posteriores do desenvolvimento é limitado (geralmente até 3 dias pós-fertilização).

Estas limitações podem ser superadas utilizando construções de ADN, em que o controlo espacial e temporal de expressão é determinada por elementos promotores específicos. Quando construções de ADN com base são utilizados no contexto do sistema Gal4-UAS melhorias significativas para os níveis de expressão do transgene são observados 26,27. Neste sistema de expressão bipartido, de tipo célula elementos promotores específicos dirigir a expressão de um activador transcricional Gal4, enquanto que os genes repórter são clonados a jusante da sequência de activação a montante Gal4 de ligação (UAS). Através da combinação de UAS de Gal4 repórteres com condutores apropriados, a expressão pode ser restringida a tipos específicos de células, evitando a necessidade de clonar genes repórter diferentes promotores para trás cada vez que é desejado um padrão de expressão específico. Além disso, a expressão de vários genes repórter pode ser UAScomandado por um único activador Gal4. O sistema Gal4-UAS proporciona, assim, uma abordagem genética versátil e flexível para a rotulagem subcelular.

Wide-campo e microscopia confocal são os burros de carga da maioria dos laboratórios. sistemas de campo amplo tipicamente usam uma lâmpada de arco como uma fonte de luz e detectar a luz emitida com uma câmara sensível que é colocado na extremidade do percurso de luz. Esta modalidade de imagem é normalmente restrito a amostras finas como fora de foco de luz obscurece a informação em foco em amostras mais espessas. Microscópios confocal diferem dos sistemas de campo amplo, na medida em que são construídos para favorecer os sinais que se originam a partir do plano focal sobre aqueles que se originam fora de foco (ou seja, "seccionamento óptico") 28. Para atingir o seccionamento de um orifício óptico é colocado no caminho de emissão em posição conjugada com a fonte de luz pontual. Os lasers são usados ​​como fontes de luz e os sinais são detectados com tubos fotomultiplicadores (PMTs). Praticamente, um laserfeixe é passado através da amostra de ponto-a-ponto e a emissão de fluorescência em cada ponto (pixel) é detectada pelo PMT.

Aqui nós imagem as mesmas estruturas subcelulares em viver embriões de peixe-zebra usando tanto de campo amplo e microscopia confocal para proporcionar uma comparação directa de ambas as modalidades de microscopia. O objectivo subjacente de fornecer tais comparações é oferecer diretrizes para a escolha da técnica de microscopia mais apropriado para a questão específica na mão.

Usando as abordagens descritas aqui demonstramos Gal4-UAS base rotulagem genética das mitocôndrias e centrossomas. Essas organelas são gravadas em diferentes tipos de células do sistema nervoso e em células musculares utilizando todo o campo e microscopia confocal para demonstrar a adequação de cada modalidade de imagem. Os métodos descritos aqui podem ser facilmente adaptado para a investigação de outros organelos e estruturas subcelulares no embrião do peixe-zebra vivos.

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Protocol

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Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com os regulamentos locais do governo da Alta Baviera (Munique, Alemanha).

1. Rotulagem organelas e outras estruturas subcelulares

NOTA: Aqui repórter genética constrói que centrossomas tag fluorescente, mitocôndrias e membranas celulares são descritos.

  1. Use métodos de clonagem convencionais 29 para gerar proteínas de fusão que fluorescently rotulam centrossomas e mitocôndrias. O clone da sequência de codificação de centrin4 peixe-zebra (cetn4) em grelha com uma proteína fluorescente 2 (FP), tais como a proteína fluorescente amarela para gerar cetn4-YFP. Clonar a sequência de direccionamento mitocondrial da subunidade VIII do citocromo c oxidase em quadro com um FP, como proteína fluorescente ciano para gerar mitoCFP 9-11.
  2. Para restringir a expressão das proteínas de fusão (cetn4-YFP ou mitoCFP) para as células específicas do zebrafembrião ish (por exemplo, neurónios ou células musculares) utilizar o sistema de expressão de Gal4 UAS-bipartido 26,27. Em primeiro lugar gerar um constructo repórter UAS. Utilizar métodos convencionais para clonar a proteína de fusão num vector de expressão de UAS, a jusante da cassete de Gal4 UAS de ligação (variantes desde 1x até 14x UAS, ver discussão) 26,27,30 e um promotor mínimo (promotor basal E1b do carpa βactin gene), e gerar UAS: cetn4-YFP e UAS: mitoCFP.
    NOTA: Para preparar repórter UAS constrói para a geração de linhagem transgênica estável elementos adicionais precisam ser clonado (ver 3 abaixo)
  3. Para visualizar o contexto celular em que centrossomas ou mitocôndrias são rotulados, gerar repórter UAS constrói em que as membranas das células são rotulados por PQ. Clonar os primeiros vinte aminoácidos de GAP43 peixe-zebra (contendo locais de palmitoilação) em grelha com um PF de alvo que FP para a membrana celular (memFP) 31,32.
  4. obtin construções de controladores ou linhas transgénicas em que tipo de célula elementos promotores específicos conduzir a expressão do activador da transcrição Gal4-VP16 27, 33 ou Gal4FF KalTA4 30.
  5. Combinar o repórter UAS constrói com uma construção de controlador adequado para restringir a expressão do tipo de célula desejado de interesse (por exemplo, em neurónios e células musculares). Para fazer isso co-injectar Gal4 motorista e repórter UAS constrói na fase de uma célula de ovos fertilizados (para instruções detalhadas veja 2 abaixo) para gerar expressam transitoriamente peixe. Alternativamente, gerar uma linhagem transgênica estável repórter UAS (para obter instruções detalhadas consulte 3 abaixo) e atravessar para a linhagem transgênica estável Gal4 driver para gerar prole tendo ambos os transgenes.
    NOTA: Também é possível injetar UEA construção repórter / s em ovos fertilizados de uma linhagem transgênica estável Gal4 driver ou um driver Gal4 construir em FERTILIZovos ed partir de uma linhagem transgênica estável repórter UAS.
  6. Para co-expressar várias proteínas de fusão distinto que utilizam o sistema Gal4-UAS, use um driver Gal4 e UAS repórter / s em uma das seguintes configurações: A. Múltipla, construções repórter UAS separadas (por exemplo, UAS: mitoCFP e UAS: memYFP co -injected com uma construção motorista Gal4) 10, B. Várias cassetes UAS em um único repórter (por exemplo, UAS: cetn4-YFP, UAS: memCerulean) 12 C. Repórter bidirecional UAS (por exemplo UAS: memYFP, mitoCFP) 2,10,24 (Figura 1).

figura 1
Figura 1. Estratégias para co-expressar proteínas de fusão que utilizam o sistema Gal4-UAS.
A co-expressão de várias proteínas de fusão pode ser conseguida utilizando cassetes repórter UAS em várias configurações: (A) múltiplos, const-driven UAS separadaructs, (B) várias cassetes UAS em uma única construção ou (C) uma cassete UAS bidirecional em uma única construção. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Gerar expressam transitoriamente Peixe

NOTA: O seguinte é uma adaptação de protocolos previamente publicados 34,35. Uma configuração básica de injecção deve incluir um estereomicroscópio com uma gama de ampliação até 12x, um micromanipulador com um suporte de micropipeta e uma fonte de pressão de ar. Prepare 2,1-2,5 antes do tempo:

  1. Para preparar as câmaras de microinjecção de ovos, preparar uma solução de 1,5% (w / v) de agarose em água. Adicionar pó de agarose a água e microondas até a agarose estar completamente dissolvida. Encha uma placa de Petri (100 x 15 mm) com esta solução.
    1. Permitir que a solução de agarose a arrefecer a approximately 45 ° C, antes de colocar um molde de plástico de microinjecção (40 mm x 66 mm, com 6 x 50 mm de comprimento sulcos que têm 1,5 mm de largura, 1 mm de profundidade e espaçados a 3 mm) sobre a superfície da agarose fundida, tomando cuidado para não introduzir bolhas na interface.
    2. Após os conjuntos de agarose, armazenar a 4 ° CO / N. Retire cuidadosamente o molde com uma espátula. Prepare várias câmaras microinjeção de cada vez, armazenar a 4 ° C e usar repetidamente ao longo de várias semanas.
  2. Use um extrator micropipeta para gerar capilares de injeção de vidro com uma longa haste 36.
    NOTA: As configurações específicas utilizadas para gerar capilares de injeção deve ser determinada empiricamente. capilares de injecção pode ser retirado antes do tempo e armazenados antes da sua utilização.
  3. Medir a concentração de ADN de plasmídeo (condutor de Gal4 UAS e construções repórter) para microinjecção utilizando um espectrofotómetro de acordo com o manual do fabricante. A medida60; a razão de absorvância a 260 nm e 280 nm (A260 / 280). Dilui-se o ADN a uma concentração final de 100 ng / mL em água isenta de nuclease.
    NOTA: Um A260 proporção de ~ 1,8 / 280 significa DNA puro. Considere o uso de um kit comercial (com base na matriz de ligação à base de sílica) para purificar o ADN de plasmídeo a ser usado para injecção. O DNA de plasmídeo deve ser de elevada qualidade, para evitar toxicidade.
  4. Preparar 10 ul de injecção de mistura por combinação de ADN (de 0,5 a 2,5 ul de um estoque de 100 ng / mL para uma concentração final de 5 a 20 ng / ul), solução de Danieau (0,33 ul de 30X estoque), vermelho de fenol (0,25 ul, opcional) e livre de nuclease água até um volume total de 10 ul.
    NOTA: Empiricamente determinar a concentração de ADN que produz expressão adequado. condutor de Gal4 e os plasmídeos repórter UAS precisa ser co-injectado. Nenhuma expressão resultará quando apenas o condutor de Gal4 UAS ou plasmídeo repórter é injectada em ovos fertilizados de tipo selvagem. Se, contudo, tele ovos fertilizados são a partir de uma linha de condutor de Gal4, em seguida, a injecção de um ou vários plasmídeos repórter UAS suficiente. Por outro lado, se microinjecção para uma linha de UAS repórter, apenas o plasmídeo condutor de Gal4 precisa ser injectada. Finalmente, enquanto Vermelho de Fenol pode ajudar muito a visualizar injectáveis, também é em si um composto fluorescente. Portanto, Vermelho de Fenol poderia obscurecer PQ visualizando se imaging está prevista antes de 24 horas após a fecundação (hpf), pois pode não ser suficientemente diluída por esta altura.
  5. A noite antes de injecções são planejadas, configurar vários pares (tipicamente de 5 a 10) do macho e da fêmea de peixe-zebra para reprodução. Use tanques de criação com uma inserção que contém um fundo quadriculado e uma divisória removível para separar a peixes machos e fêmeas.
    NOTA: macho e fêmea de peixe-zebra pode geralmente ser distinguidos pela sua forma do corpo. Os machos tendem a ser esbelta enquanto as fêmeas tendem a exibir um abdômen protuberante ventrally. Os machos, adicionalmente, tendem a ter uma col vermelho-amareladaoring na sua área abdominal ventral.
  6. Imediatamente antes das injecções de DNA, remover os divisores para permitir que o macho e fêmea para acasalar. Aproximadamente 15 a 30 minutos após a remoção do divisor, vá para os ovos na parte inferior do tanque. Transfira o peixe adulto usando uma rede de pesca para um novo tanque de criação.
  7. Verter a água, contendo os ovos fertilizados recém-preparado, para fora do tanque de reprodução em uma peneira (por exemplo, um plástico de chá do filtro). Lave os ovos na peneira usando um frasco de spray contendo solução de Danieau. Inverta a peneira para uma placa de Petri e usar uma garrafa de pulverização com a solução de Danieau para recuperar todos os ovos (tipicamente de 50 a 200 ovos por criação de animais par de peixes adultos).
  8. Com uma pipeta microloader, back-preencher um capilar de injeção puxou com a injeção de mistura de ADN. Monte o capilar injecção no titular de um micromanipulador e aparar a ponta, sob o controle visual de um microscópio estereoscópico, usando uma pinça para criar uma micropipeta que podem penetrate o córion e citoplasma da célula, enquanto ser capaz de entregar um volume adequado do DNA.
    NOTA: O grau em que a ponta do capilar de injecção é cortado deve ser determinado empiricamente e pode ser melhor avaliada quando injectar ovos.
  9. Para determinar o volume de ADN para injecção, descarregar uma gota da solução de injecção em óleo mineral. Meça o raio (r) da queda utilizando um micrômetro de calibração e calcular o seu volume (4/3 π r 3). Modular o volume, ajustando a pressão de injecção e / ou a duração de cada impulso de injecção.
  10. Usando uma pipeta de plástico, transferir todos os ovos recolhidos (tipicamente 50-200, de 2,7 acima) para as trincheiras de uma câmara de microinjeção. Sob o controlo visual de um estereomicroscópio, utilizar uma pinça para orientar os ovos de modo a que o citoplasma das células (transparente) e gema (densa, não transparente) pode ser facilmente identificado.
  11. Sob o controlo visual de um estéreomicroscópio, injectar o DNA no citoplasma da célula do ovo fertilizado, tendo o cuidado de assegurar que o volume injectado (1-2 nl) corresponde a aproximadamente 10% do volume da célula.
    NOTA: fenol vermelho na SIDA solução de ADN na visualização do volume injectado.
  12. Após a injeção, solte os ovos das trincheiras do molde de injeção por rubor-los com um frasco de spray contendo solução de Danieau. Subsequentemente transferir os ovos para uma placa de petri fresca usando uma pipeta de transferência de plástico e manter numa incubadora C 28,5 S.
  13. Manter os ovos injetados-un como controles para determinar se as injecções contribuir para altas taxas de mortalidade, seja como resultado de danos físicos sofridos durante a penetração micropipeta ou a mistura de DNA.
    Nota: As taxas de mortalidade elevada após as injecções pode ser devido a vários fatores, incluindo volumes de concentração ou de injeção excessivamente elevado de DNA e / ou plasmídeos com contaminaNTS. Para prevenir a toxicidade de preps de ADN de baixa qualidade, kits comerciais (com base na matriz de ligação à base de sílica) pode ser usado.
  14. Em intervalos regulares seguintes injeções, usar um microscópio estereoscópico para triagem de ovos não fertilizados e embriões mortos ou malformados e descartar estes.
    NOTA: Deem os ovos que parecem estar na fase de uma célula várias horas após a fertilização, como não fertilizado. Identificar embriões mal formados por defeitos anatômicos brutas, tais como uma comprometidos eixos corporais ântero-posterior. material amorfo dentro de um córion sugere que o embrião não proceder através de estágios de desenvolvimento e morreu. Para verificar se os embriões que foram microinjetados passar por um curso normal de desenvolvimento consultar o atlas anatômicas 37.
  15. Transferir os embriões utilizando uma pipeta de transferência de plástico para a solução da Danieau 1x contendo 1-fenil-2-tioureia (1xPTU) entre 10 e 24 HPF para prevenir a formação de pigmento. Manter os embriões em cont a solução da Danieauaining PTU para a duração da experiência.
    NOTA: Para além melanóforos, iridóforos sobre a superfície da pele pode ser problemático para imagiologia. Enquanto o PTU não inibe a formação iridophore, linhas mutantes com números reduzidos de iridóforos tais como Roy orbison (Roy) existem e podem ser utilizados 38.
  16. Após a eclosão embriões (geralmente no pós-fertilização segundo ou terceiro dia, 2 ou 3 dpf), descartar as córions e trocar solução do Danieau contendo PTU.
    NOTA: Estes passos são importantes para assegurar a qualidade do meio de embrião e a viabilidade dos embriões saudáveis.

3. Gerar linhagens transgênicas estáveis

NOTA: Estável linhas transgénicas podem ser eficientemente gerada utilizando o sistema de transposão Tol2. Um vector contendo o transposão Tol2 transgene de interesse é a co-injectada juntamente com o mRNA que codifica a enzima transposase em fertilizamovos d na fase de uma célula. Proteína transposase derivado a partir do ARNm injectado catalisa a excisão da cassete do transgene a partir do vector de transposão e a sua integração no genoma 39.

  1. Clone da cassete repórter transgene (por exemplo, UAS: mitoCFP) entre Tol2 repetições terminais invertidas em um dos vectores Tol2 actualmente utilizados na comunidade peixe-zebra, tal como descrito 40.
    NOTA: Tol2 vectores que contêm uma cassete de selecção em que os elementos promotores dirigem a expressão em sistemas de órgãos FP não relacionadas com a área de interesse (por exemplo, coração 41 ou da lente 42) são úteis para o rastreio de linhas transgénicas UAS repórter na ausência de transactivação Gal4.
  2. Utilizando um estojo comercial (com base na matriz de ligação à base de sílica), purificar o ADN de plasmídeo a ser usado para injecção. Assegure-se que o DNA de plasmídeo é de alta qualidade, para evitar toxicidade.
  3. Transcrever o ARNm que codifica uma transposase Tol2 usandovector de transcrição apropriado, como PCS-TP 43. Resumidamente, linearizar PCS-TP e usar um kit comercial para gerar ARNm tapado e seguir o protocolo do fabricante. Tome cuidado para evitar a contaminação com RNases (por exemplo, usar RNase pontas para pipetas e tubos). Alíquota do ARN, a uma concentração de 100 ng / ul, para uso único e armazenar a -80 o C.
  4. Na manhã do dia das injecções, descongelar uma alíquota de ARNm da transposase em gelo. Misturar o vector de ADN de transposão (2 ul de 100 ng / ul) e transposase ARNm (2 ul de 100 ng / mL) em uma proporção de 1: 1, e adicionar 6 mL de água isenta de RNase para levar o volume total a 10 ul.
    NOTA: A concentração de 20 ng / uL é recomendado para cada, mas a concentração óptima deve ser determinada empiricamente. Use água livre de RNAse para a diluição. Use luvas ao manusear a mistura injeção de DNA-RNA e mantê-lo no gelo durante todo o período de injeções para evitar a degradação do mARN.
  5. Usando as instruções detalhadas na seção 2 acima, injetar a mistura de injeção de DNA-RNA em ovos fertilizados na fase de uma célula. Sob o controle visual de um microscópio estereoscópico alvo o citoplasma da célula na fase de uma célula para as mais altas taxas de eficiência transgenia. Manter os embriões injetados em 28,5 o C até que esteja pronto para triagem de expressão do transgene.
    NOTA: A PCR pode ser realizada para verificar a eficiência da transposase Tol2 como previamente descrito 44.
  6. embriões tela em uma placa de Petri para a transgenia utilizando as oculares de um microscópio de fluorescência de dissecação.
    NOTA: Use os filtros adequados do microscópio para visualizar a expressão FP da cassete selecionável (ou seja, a fluorescência no coração ou lentes) a 2 ou 3 dpf. Identificar potenciais embriões transgênicos pela expressão (no coração ou na lente) e levantar esses embriões para a vida adulta (F 0 geração) usando o padrãoprotocolos 45. Alternativamente, identificar potenciais embriões transgênicos por PCR como descrito no 46.
  7. Uma vez que o repórter F UAS 0 peixes são 2,5 - 3 meses de idade, atravessá-los (ver 2.5 para mais detalhes) para não-transgênico do tipo selvagem de peixe para adquirir ovos para estabelecer uma geração F 1. Alternativamente, atravessar o repórter UAS F 0 peixe para uma linha de motorista Gal4 para estabelecer uma geração F 1. Neste último caso, o transgene-driven UAS pode ser monitorizada directamente nos embriões obtidos a partir do cruzamento.
  8. Utilize uma fluorescência microscópio de dissecação para a tela F 1 embriões para a expressão do transgene ou cassete seleccionável.
    NOTA: Quando a expressão é confirmada em seguida, o transgene pode ser dito para ser germinal transmitida. Transgénese é não-Mendeliana no estádio F 0. O número de embriões que expressam o transgene podem variar a partir de um número pequeno para a grande maioria em clutche indivíduos. Integração de transposões em diferentes F 0 peixe pode variar muito, o que resulta em diferentes padrões de expressão. Portanto manter F 1 peixes de diferentes F 0 fundadores como sub-linhas separadas. Integrações transposon em F 1 peixes são estáveis ​​e são passados ​​para as gerações seguintes de uma forma mendeliana.
  9. Manter cada F 0 peixes em tanques separados para voltar a identificar portadores do transgene.

4. Prepare embriões para criação de imagens em um microscópio vertical

NOTA: Os procedimentos descritos aqui foram otimizados para geração de imagens em microscópios verticais com objetivos distância água-dipping de cone longo de trabalho.

  1. Utilize uma fluorescência microscópio de dissecação para a tela embriões para a expressão do transgene.
    NOTA: A expressão de um transgene repórter UAS dependerá da linha específica condutor de Gal4 utilizado. Selecionar embriões para experimentos com imagens baseadas em exp desejadopadrão ression.
  2. Transferir os embriões selecionados utilizando uma pipeta de plástico para uma placa de Petri separado contendo tampão de Danieau com 1x PTU e 1x tricaina.
    NOTA: Quando a rotulagem é escassa (apenas algumas células em um sistema do órgão) montar os embriões em agarose (ver 4,3-4,7 abaixo) e tela para a expressão do transgene utilizando um microscópio de campo amplo com os objetivos de alta ampliação (ver 5.1 abaixo). Tricaina anestesia do peixe e deve ser eficaz dentro de segundos. Se o peixe não são imobilizados é provável que o tricaina degradou. As possíveis razões para esta degradação incluem mau armazenamento de tricaina, que é sensível à luz 47.
  3. Preparar a agarose para incorporar o peixe por dissolução de baixo ponto de fusão de agarose em pó em tampão de Danieau para uma concentração final de 0,7%. Alíquota (1 ml) e mantê-la num bloco de calor a 40 ° C até estar pronto para usar.
    NOTA: concentrat Superioriões de agarose (até 1,5%) também pode ser utilizado para incorporar os peixes.
  4. Adicionar 50 ul de estoque de um 20x tricaina e 20 ul de uma solução de estoque de 50x PTU à alíquota de 1 ml de agarose de baixo ponto de fusão e misturar bem tocando no lado do tubo. Devolver o tubo para o bloco de calor. Usando uma pipeta de transferência de plástico, gentilmente pipeta alguns (1-10) em embriões anestesiados a agarose, a transferência de líquido tão pouco quanto possível para evitar a diluição da agarose.
  5. Usando uma pipeta de transferência de plástico todos os embriões com uma pequena quantidade de agarose para um vidro de fundo placa de Petri.
  6. Trabalhando relativamente rápido, utilizar uma pinça para posicionar os embriões na orientação desejada, dependendo da estrutura a ser trabalhada.
    NOTA: embriões Orient do seu lado, se a retina ou Rohon-Beard (RB) neurônios sensoriais devem ser trabalhada.
  7. Permitir que a agarose solidificar durante pelo menos 15 minutos. Adicionar tampão de Danieau contendo 1xPTU e 1xTricaine para cobrir os embriões embutidos em AgaroSE. Coloque o prato contendo embriões incorporado-agarose em uma incubadora a 28,5 ° C até que esteja pronto para a imagem.

5. geração de imagens celulares e subcelulares estruturas usando Wide-campo ou microscopia confocal

NOTA: Largo-campo microscopia e microscopia confocal ponto de varredura são as modalidades mais utilizadas para a imagem embriões de peixe-zebra fluorescente etiquetado tabela 1 resume as principais vantagens e desvantagens de ambos os sistemas.. Para ambas as formas de microscopia, os embriões são montados em agarose, como descrito no ponto 4 acima, e mantida a 28,5 ° C ao longo da experiência de imagem usando uma câmara de aquecimento com a fase de microscópio. É importante ressaltar que o prato com embriões incorporado-agarose é deixada equilibrar a 28,5 o C antes de imagem começa como flutuações de temperatura causar deriva na dimensão z. Ao realizar experimentos com imagens de longo prazo (mais several hora), colocar uma tampa de Plexiglas sobre a placa de petri de reduzir a evaporação do tampão.

Largo-campo Confocal ponto-scanning
Custo Relativamente barato Caro (aprox. 5x mais)
Photo-branqueamento Baixo Alto. A amostra é exposta à luz do laser acima e abaixo do plano focal.
Photo-toxicidade Baixo Alta (ver foto-branqueamento acima)
velocidade de aquisição Rápido Lento
Resolução em xy A lei de Abbe A lei de Abbe (pode ser melhorada através da aplicação de 40%, utilizando um orifício muito pequeno;. No entanto, ema maioria das configurações isso tem pouca aplicação prática)
seccionamento óptico Pobre Sim (pode ser ajustado pelo tamanho do furo de pino)
penetração nos tecidos Limitado a estruturas superficiais (por exemplo, células ou fibras musculares Rohon-Beard) Limitado a <100 mm a partir da superfície do embrião

Tabela 1. Comparação Geral de campo amplo e microscopia confocal ponto-scanning

  1. Microscopia de campo amplo
    NOTA: Aqui orientações são fornecidas para imagiologia embriões de peixe-zebra usando um microscópio de campo amplo na posição vertical com objetivos distância água-dipping de cone longo de trabalho. O microscópio é equipado com uma câmara CCD arrefecida, e os conjuntos de filtros para visualizar diferentes fluoróforos montado sobre uma roda de filtro automatizado para aquisição rápida de múltiplos canais.Aquisição de imagem é controlada por μManager, um pacote de software de fonte aberta microscopia 48. Um exemplo específico para imagiologia de mitocôndrias em neurónios sensoriais Rb é fornecida. Células RB são geneticamente marcados utilizando membrana alvo YFP e suas mitocôndrias são CFP-marcado (ver 1.1 acima).
    1. Embriões montar em seu lado em baixo ponto de fusão agarose como descrito no ponto 4 supra.
    2. Permitir que o prato com peixe montado para equilibrar a 28,5 ° C numa câmara de aquecimento na fase de microscópio antes do início de imagem.
    3. Use uma baixa ampliação objetivo água-dipping de cone e olhar através das oculares do microscópio para escolher uma área na superfície do embrião para a imagem.
      NOTA: Se a linha MitoFish repórter transgénico estável, Tg (UAS-E1b: mYFP, mitoCFP) mde6, é utilizado em conjunto com uma linha de condutor tal como HuC: Gal4, em seguida, os neurónios mais RB são rotuladas, e aparecem como uma densa mesH-obra de mandris de neurites na superfície do embrião. Se microinjecção de construções de DNA é usada para conseguir rotulagem esparsos (por exemplo, Sensorial: Gal4-VP16 com o UAS: mitoCFP e UAS: MA-YFP), embriões de tela para identificar as células de marcação dupla.
    4. Abra o software microscópio (μManager 1.4) e clique em "Iluminação '' em" Definições de configuração "para definir os conjuntos de filtros corretos para o comprimento de onda de interesse (YFP ou PCP para o exemplo atual). Em" Configurações de câmera "introduzir o tempo de exposição exigido para adquirir uma imagem adequada.
      NOTA: As "Configurações de Iluminação" é pré-definido pelo usuário no momento da instalação do software e é carregado ao abrir μManager. Se o software não está configurado para controlar a roda de filtro, mover manualmente a roda de filtro na torre para a posição apropriada.
    5. Mudar para um objectivo de água-dipping-cone distância longa de trabalho que vão desde 40-100x ampliação. Escolhero objectivo que tem a mais elevada abertura numérica (NA) e é corrigida cromaticamente (Apochromat).
    6. Clique em "Live" para escolher o campo de visão: No caso do neurônio RB, imagem Transporte mitocondrial no axônio-tronco, que emana do corpo celular, ou no caramanchão periférica.
      NOTA: Os mandris periféricos dos neurónios RB na aleta dobra caudal do embrião proporcionar uma oportunidade ideal para uma imagem de grande campo de visão que é plana e, por conseguinte, pode ser capturado numa única estrutura com um microscópio de campo amplo. É, portanto, importante para montar o embrião como categoricamente quanto possível do seu lado, de modo que a dobra caudal é paralelo ao fundo da placa de Petri.
    7. Depois de escolher um campo de visão, clique no botão "seleção retangular" no menu ImageJ, definir uma região de interesse (ROI) e clique em "ROI" na janela de μManager. Depois de selecionar o ROI para geração de imagens, clique em "Stop" e "Salvar" para take uma imagem do canal YFP para gravar a morfologia do local de neurites / s.
    8. Para a imagem de transporte mitocondrial clicar sobre o "Multi-D Acq." botão. Observe uma janela adicional ( "Multi-dimensional Aquisição") e selecione o número de pontos de tempo, bem como o intervalo entre os pontos temporais nesta janela. Use taxas de quadro de 0,3-1 Hz. Realizar gravações durante pelo menos 10 minutos para recolher o maior número de dados de pontos possível.
    9. Na janela "Multi-dimensional Aquisição", clique em "Canais", adicionar e definir o comprimento de onda para a imagem latente (PCP para mitocôndrias neste exemplo) e do tempo de exposição. Mantenha os tempos de exposição para abaixo de 400 ms para geração de imagens de transporte mitocondrial.
    10. Clique na opção "Salvar Imagens" na janela "Multi-dimensional Aquisição", para salvar automaticamente os arquivos em uma pasta específica descrita no 'root Diretório'. Clique em "Adquirir" no canto superior direito para iniciar timimagiologia e-lapse.
    11. reajustar o foco manualmente durante a gravação de lapso de tempo para compensar qualquer desvio na dimensão z.
      NOTA: Utilizando estes parâmetros de transporte mitocondrial em neurônios RB podem ser visualizados durante o tempo que 4 horas.
  2. A microscopia confocal
    NOTA: Aqui orientações são fornecidos para geração de imagens com um microscópio confocal Olympus FV1000 vertical e objetivos água-dipping de cone distância longa de trabalho. O microscópio é equipado com várias linhas de laser e vários detectores (PMT convencionais e detectores de arsenieto de gálio de fosforeto mais sensíveis) que permitem a imagiologia multicanal. é feita referência específica ao software Olympus Fluoview. No entanto, os parâmetros de imagem descritos aqui deve ser facilmente transferível para outros sistemas confocais.
    1. Montagem embriões em baixo ponto de fusão de agarose numa orientação apropriada para o órgão / estrutura a ser trabalhada, como descrito no ponto 4 acima.
    2. ° C numa câmara de aquecimento na fase de microscópio antes do início de imagem.
    3. Use distância objectivos água-dipping de cone longo trabalho para microscopia confocal em uma configuração vertical. Escolha objectivos com o mais alto possível de NA para maximizar a quantidade de sinais de fluorescência que pode ser recolhida e tem a melhor poder de resolução. Ao recolher imagens de vários canais de escolher objetivos cromaticamente corrigidos (Apochromat).
    4. Abra o software microscópio e clique em "Trans lâmpada" ou "Lâmpada Epi" para usar luz transmitida ou de fluorescência, respectivamente, para identificar a região de interesse através das oculares do microscópio.
    5. Use o software para configurar os seguintes parâmetros de digitalização para adquirir pilhas de imagens:
      1. Na janela "Aquisição Setting" verificar que o objetivo escolhido para a imagem latente corresponde ao objectivo que aparece no drop-dowMenu n dos objectivos disponíveis.
        NOTA: Este é garantir que todos os parâmetros pré-calculados para um objectivo específico (por exemplo, lateral e resolução axial, tamanho da abertura confocal etc.) são verdadeiras e podem ser usados ​​de forma confiável.
      2. Selecione os filtros de linha de laser / s, e excitação e dicróicas adequadas de emissões imagem proteína fluorescente específica (s). Faça isso clicando no botão "lista Dye" na janela "Aquisição de Imagem Controle" e escolher o apropriado fluoróforo / s. Como alternativa, clique no botão "caminho Luz e corantes" para definir estes parâmetros manualmente.
        NOTA: Quando a opção do botão "Lista Dye" é escolhido, o software seleciona automaticamente os filtros apropriados dicróicas linhas de laser, excitação e emissão e ajusta o tamanho da abertura confocal de forma adequada.
      3. Na janela "Aquisição Setting", ajustar o fator de "Zoom" e "asp Tamanhorácio ect "(ou seja, 512x512, 1024x1024 etc.) da imagem digitalizada para obter o tamanho do pixel necessária para melhor resolver as estruturas sendo fotografada. Defina o tamanho do pixel em cerca de metade da resolução teórica do objectivo, seguindo assim critérios de amostragem de Nyquist . para determinar o tamanho do pixel da imagem, clique adquirida no botão com o símbolo de informações ( "i") na janela "Aquisição de imagem Controle".
      4. Defina a velocidade de digitalização para o mais rápido possível (2 uS / pixel) na janela "Aquisição Setting".
      5. No "Aquisição de Imagem Controle" janela, clique em Kalman linha média para reduzir o fator de noise.A de 2 a 3 normalmente é suficiente.
      6. Selecione um modo de digitalização sequencial quando imagiologia fluoróforos com sobreposição de espectros. Para fazer isso, clique em "Sequential" e "Linha" na janela "Aquisição de Imagem Controle".
      7. Ajustar a potência de saída da linha de laser / s relevantes (tipicamenteabaixo de 5%). Os valores específicos têm de ser determinada empiricamente.
      8. Clique em "XY Repeat" ou "x2 Focus" ou "Foco x4" botão para fazer a varredura continuamente a região selecionada ao ajustar as definições do detector para cada canal. Ajuste "HV", "Gain" e "offset" para cada canal para obter imagens que têm a maior gama dinâmica de valores de cinza.
        NOTA: Os valores específicos para essas configurações precisam ser determinadas empiricamente. "HV" ajusta a tensão no detector para alterar a sua sensibilidade, "offset" ajusta o sinal de saída do detector e "ganho" multiplica o sinal de saída do detector por um factor constante.
      9. Pressione Ctrl + H para visualizar as imagens obtidas através de uma tabela look-up (HiLo) que identifica sub-saturada (aparecem em azul) e mais saturado pixels (aparecem em vermelho), os quais devem ser evitadas. Re-avaliar a potência do laser relevante line / s e as definições do detector.
        NOTA: A utilização de alta potência de laser e níveis elevados da "HV" do detector levará a mais sinal. potência do laser mais elevada vai, porém, levar a um aumento de branqueamento e foto-toxicidade. Aumentar o "HV" levará a um aumento de ruído. Portanto, um compromisso precisa ser encontrado ao definir potência do laser e "HV" para adquirir imagens com níveis aceitáveis ​​de ruído, evitando foto-dano (ver também Quadro 1).
      10. Recolhe imagens a partir de um volume definido, centrando-se nos limites superiores e inferiores da área de interesse. No "Aquisição Setting" janela, clique nos botões "End Set" e "Start Set" conjunto de janela do z-stack nos limites superior e inferior do volume a ser trabalhada. Seleccionar um tamanho de etapa que é metade da resolução-z para o objectivo determinado (por exemplo., Se a resolução z é 2 uM escolher 1 uM). Para determinar o z-resolução da objective clique no botão com o símbolo de informações ( "i") na janela "Aquisição de Imagem Controle".
      11. Configurar uma série de tempo para recolher z-stacks a uma frequência temporal que é apropriado para a dinâmica da estrutura subcelular sendo trabalhada. No sub-janela "TimeScan" introduzir a frequência em que z-stacks deve ser adquirida ( "Interval") e o número de vezes que as imagens devem ser adquiridas ( "Num").
      12. Clique na "profundidade" e os botões "Time" na janela "Aquisição de Imagem Controle" para confirmar que um z-stack e time-series serão adquiridos. Finalmente, clique no botão "XYZT" para começar a aquisição de imagens de lapso de tempo.
      13. Após a conclusão da aquisição da imagem, observar "Série Feito" na interface do software. Clique nele e salvar as imagens no formato "OIB" para gravar as imagens e metadados associados a eles.
        Nota: As imagens obtidas namicroscópio de campo amplo e microscópio confocal podem ser visualizados e analisados ​​utilizando software como Fiji, um programa de processamento de imagens de domínio público gratuito.

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Representative Results

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Aqui o uso de largura de campo e microscopia confocal para a mitocôndria de imagem e centrossomas em viver embriões de peixe-zebra está diretamente comparados e contrastados. Dependendo da localização das células em que a dinâmica de organelos devem ser examinadas e a frequência inerente dos eventos específicos subcelulares, em geral, quer de campo amplo ou microscopia confocal é a melhor escolha. Nós fotografada organelos nos neurónios RB localizados na superfície do embrião e em células da retina localizados mais fundo. A localização superficial de neurónios Rb conjuntamente com a sua geometria bidimensional torná-los bons candidatos para ser trabalhada por ambos de campo amplo e microscopia confocal (Figura 2). A aquisição de imagens usando microscopia confocal é, contudo, significativamente mais lento e pode levar a uma subestimação da dinâmica de eventos subcelulares específicas (por exemplo, o movimento das mitocôndrias, Figura 2C, D (Figura 3).

Para permitir a visualização simultânea de organelas e membranas celulares foi utilizado o sistema Gal4-UAS em três configurações diferentes. Em primeiro lugar, a linha de repórter UAS MitoFish Tg (UAS-E1b: mYFP, mitoCFP) foi utilizado mde6. Aqui, um UAS bidirecional permite a expressão concomitante de PCP mitocôndrias-alvo e da membrana alvo YFP. Em combinação com linhas de driver Gal4 apropriadas, MitoFish rotular as mitocôndrias e membranas celulares dos neurônios sensoriais RB (Figura 2A-C) ou as células da retina (Figura 3A, B) com PCP e YFP r espectively. Em segundo lugar, constrói dois UAS (UAS: mitoCFP e UAS: MA-YFP) foram combinados com uma construção condutor de Gal4 (Sensorial: Gal4-VP16, elementos sensoriais específicos de neurónios enhancer do gene da ilhota-1) em 7 injecções transientes. A expressão mosaico que geralmente resulta de estas injecções permitiu a identificação de células individuais ao longo de dias (Figura 2E). Uma terceira abordagem empregue o uso de duas cassetes de UAS, cada um conduzindo a expressão de uma proteína de fusão diferente, em uma única construção contígua. Esta estratégia foi utilizada para gerar CentrinFish Tg (UAS: cetn4-YFP, UAS: MA-Cerulean) TUM1, em que uma fusão centrin4-YFP etiquetas centrossomas e Cerulean é direcionado para as membranas celulares. Em combinação com as linhas específicas do controlador Gal4 os centrossomas e membranas celulares de células da retina (Figura 3C e D) ou fibras musculares (Figura 4) são rotulados.

ent "fo: manter-together.within-page =" 1 "> Figura 2
Figura 2: Geração de mitocôndrias in vivo em neurónios sensoriais RB de peixe-zebra embrionário.
Neurônios RB sensoriais na parte caudal da dobra fin de 2 dpf MitoFish foram fotografadas usando um Apochromat 40x objetivo água-dipping de cone com uma NA de 0,80, quer por todo o campo (A) ou confocal microscopia (B). Painéis para o show detalhe direita da região delimitada. C Wide-campo imagens de lapso de tempo de uma pequena região de interesse no caramanchão periférica de um neurônio RB em 2 dpf MitoFish. O movimento de uma única mitocôndria (seta em 0 '') foi monitorado mais de 100 seg; seis pontos de tempo são exibidas. A posição da mitocôndria no ponto de tempo anterior é descrito em D magenta. A posição da mitocôndria mover em C E confocal de um neurônio sensorial RB em 2 e 3 dpf. A marcação de células RB individuais e suas mitocôndrias foi conseguida por co-injecção de um Gal4 condutor sensorial específica para neurónios construção conjunta com duas construções repórter UAS, UAS: mitoCFP e UAS: MA-YFP, no estádio de uma célula e a triagem para isolado duplo células marcado com. A imagem é contraste invertido e mitocôndrias individuais são representados esquematicamente como pontos magentas. Barra de escala A, B 20 uM, C 2 uM,E 50 um. Direccionado para as mitocôndrias PCP (mitoCFP), membrana alvo YFP (MA-YFP). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3: Comparação de grande campo e microscopia confocal para organelos imagem in vivo em peixes-zebra a retina embrionária.
OTX2 elementos promotores conduzir a expressão do PCP na mitocôndria e YFP nas membranas celulares (A e B) ou YFP em centrossomas e Cerulean nas membranas celulares (C e D) na retina de 2 dpf embriões de peixe-zebra. Para alcançar este padrão de marcação, OTX2: peixes transgênicos Gal4 ou foram cruzadas para MitoFish (A e B) oR CentrinFish (C e D). Um objectivo Apochromat 40x água-imersão de cone (0,80 NA) foi usada para adquirir imagens da mesma região em cada retina utilizando de campo amplo (A, C) e confocal (B, D) de microscopia. As inserções em A e B mostram os detalhes de uma região da camada nuclear interna, inserir em C e D mostram uma célula na M-fase. Barra de escala 20? m. Direccionado para as mitocôndrias PCP (mitoCFP), membrana alvo YFP (MA-YFP), centrin4-YFP (cetn4-YFP), membrana alvo Cerulean (MA-Cerulean). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4: Comparação de todo o campo e microsc confocalopy centrossomas para imagem in vivo.
A única fibra muscular com fluorescente etiquetado membranas celulares e centrossomas (OTX2: Gal4; CentrinFish) foi fotografada usando de campo amplo (A) e microscopia confocal (B). Em ambos os casos foi utilizado um objectivo Apochromat 40x água-dipping de cone (NA 0,80). Barra de escala 10? m. Centrin4-YFP (cetn4-YFP), membrana alvo Cerulean (MA-Cerulean) Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

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Aqui, demonstramos a versatilidade do sistema de expressão de Gal4 UAS-tag fluorescente para a mitocôndria, centrossomas e as membranas celulares do-tipos específicos de células in vivo em embriões de peixe-zebra. Muitas proteínas de fusão fluorescentes que rotular outros organelos e estruturas subcelulares podem ser encontrados na literatura publicada e pode ser obtido a partir do respectivo laboratório, fontes comerciais ou depositários plasmídeo não-comerciais (por exemplo, Addgene). Para conceber uma nova proteína de fusão fluorescente, vários parâmetros têm de ser considerados, incluindo os que FP de usar e se fundir o PQ no extremo amina ou carboxilo terminal da proteína de interesse. Para uma discussão mais aprofundada sobre a geração de proteínas de fusão fluorescentes, os leitores são referidos artigos detalhados sobre o assunto 49-51.

Destacamos três estratégias para alcançar a co-expressão de proteínas de fusão utilizando transgenes UAS-driven. Múltipla, separate UAS construções repórter para permitir a combinação de diferentes construções repórter já existente sem a necessidade de clonagem adicional. Os níveis de expressão repórter pode também ser titulada de forma independente. No entanto, os níveis mais elevados de co-expressão são alcançados quando são utilizados quer múltiplas cassetes UAS ou uma cassete de UAS bidireccional numa única construção. Desde PQ são usados ​​como marcas que é relativamente fácil de verificar a co-expressão. Deve notar-se que outros métodos para a expressão de multi-cistrónico também existem, incluindo o uso de locais internos de entrada do ribossoma e 40 péptidos virais 2A 52,53. Como uma alternativa a construções à base de ADN, transcrito in vitro, tampado ARNm pode ser utilizado para expressar proteínas de fusão fluorescentes para marcar estruturas subcelulares 1,4,8. A limitação desta abordagem é, contudo, que a expressão é limitada para os primeiros dias de desenvolvimento, não é de célula ou tecido específico. Independentemente do método escolhido para expressar proteínas de fusão, é críticopara assegurar que os níveis de expressão não conduzem a marcação não-específica e comprometer o estado fisiológico das células. A este respeito, a amplificação da expressão do gene repórter inerente ao sistema Gal4 UAS-27 pode ser problemático, manifestando-se por exemplo como rotulagem citosólica mesmo quando o FP é direccionada para um organelo específico. Quando disponíveis, os anticorpos devem ser utilizados para verificar se os padrões de expressão obtidos por proteínas de fusão reflectem a situação endógena. Em alguns casos, a injecção de baixas concentrações (ER) de ADN pode mitigar o problema da mis-localização da proteína de fusão. Alternativamente, os vectores com um baixo número de repetições UAS poderia ajudar a titular para baixo os níveis de expressão do transgene 30. Da mesma forma, para o activador de Gal4-VP16, existem versões modificadas, que são relatados para conduzir a expressão relativamente fraca e, por conseguinte, são menos tóxicos 30,33. Se mis-localização da proteína de fusão persiste apesar dos esforços para Titula Down níveis de expressão de transgene, pode ser necessário renunciar o sistema Gal4-UAS e dirigir a expressão por elementos promotores diretamente.

As linhagens transgênicas estáveis, MitoFish 10 e CentrinFish 12, descrevemos neste manuscrito foram feitas usando cassetes 14xUAS. Mantemos estas linhas no fundo de linhas de driver Gal4 para detectar alterações na expressão ao longo de gerações, uma vez que as linhas repórter com múltiplas repetições UAS foram relatados para ser propenso a silenciar 54. Nós não vimos evidências de silenciar sobre as 3 gerações temos propagadas a CentrinFish. No entanto, temos visto a expressão variada em MitoFish e, portanto, rigorosamente seleccionar embriões com 'completos', fortes níveis de expressão para propagar para as gerações futuras. A literatura atual sugere que os vectores de expressão com repetições 5xUAS poderia ser uma alternativa para a geração de linhagens transgênicas estáveis ​​- o repórter éimpulsionada a níveis altos o suficiente 30 e comparativamente baixo número de UAS repete pode torná-lo menos propenso ao silenciamento do transgene, embora repete UAS não repetitivos são declaradamente ainda menos suscetíveis 54.

A paleta de PQ atualmente disponíveis para organelas tag ou outras estruturas subcelulares é muito amplo 55. Ao escolher um em particular FP como uma marcação, deve considerar-se com os seguintes parâmetros: primeiro, a espectros de excitação e emissão do PQ para determinar a linha de laser específica, bem como os filtros de excitação e de emissão necessárias para a sua visualização. Em segundo lugar, o brilho e foto-estabilidade da FP. Em terceiro lugar, a velocidade com que o FP amadurece tradução seguinte. Em quarto lugar, se o FP tem uma tendência para se agregar em fusões. Em relação ao último parâmetro, o cuidado deve ser exercido e experimentos de controle deve ser feito para testar a adequação de cada FP para experiências específicas. Por exemplo, enquanto que a red PQ mCherry e DsRed são amplamente utilizados, eles supostamente formar agregados em certas fusões 56. Encontramos TagRFP-T 57, uma variante mais foto-estável de TagRFP, para um bom desempenho quando alvejado a mitocôndria e as membranas celulares (observações não publicadas). Quando vários organelos precisa ser visualizado concomitantemente, PQ com espectros de não sobreposição deve ser usado. Temos combinações de PQ ciano (PCP e Cerulean) e YFP (Figuras 2-4) usado com sucesso. Ao explorar toda a gama espectral do azul para o infravermelho próximo, pode-se expandir o número de estruturas subcelulares que podem ser visualizadas simultaneamente dois. Além do PQ convencional, PQ foto-activáveis ​​são particularmente úteis para sondar dinâmica de organelos, por exemplo, o uso do PQ Kaede para rastrear o destino de mitocôndrias individuais 58.

Qual microscopia técnica - wide-campo ou confocal - é o maisadequado para imagiologia depende de um número de factores, incluindo a localização das células a ser trabalhada e a velocidade com que são esperados eventos subcelulares ou celulares específicos para ocorrer. microscopia de campo amplo é a modalidade preferida em locais superficiais e amostras pouco marcados. Ele oferece baixo foto-toxicidade e de imagem em alta velocidade a um preço razoável. No entanto, se a imagem necessita de ser realizada em partes não-superficiais do peixe-zebra, em amostras densamente marcados ou para obter informação tridimensional, confocal ou outra forma de microscopia óptica de corte torna-se o método de escolha.

Independentemente de qual estrutura celular ou subcelular está sendo monitorado, muitas vezes há um trade-off entre adquirir a melhor imagem possível e mantendo a amostra viva e em boa condição fisiológica para a imagem latente repetida time-lapse. Photo-toxicidade pode se manifestar como mudanças no comportamento de organelas, morfologia aberrante de células ou até mesmo celularmorte. Chave para a redução de foto-branqueamento e foto-toxicidade tanto para todo o campo e microscopia confocal é usar os mais baixos níveis possíveis de luz para adquirir imagens. A este respeito, os objectivos com o mais alto possível de NA são a chave para maximizar a quantidade de sinal de fluorescência que pode ser recolhido. Para a microscopia confocal, uma série de parâmetros podem ser ajustados para compensar a utilização de menor potência do laser. Detectores com maior eficiência quântica comparação com PMTs convencionais, por exemplo, detectores de fosforeto de arsenieto de gálio, pode ser utilizado para assegurar que os fotões emitidos são mais propensos a ser detectado. Alternativamente ou adicionalmente, as tensões dynode mais elevadas podem ser aplicadas na PMT para aumentar a sensibilidade dos detectores. A abertura confocal (orifício) pode ser aberta para permitir a recolha de sinal fluorescente mais, embora com uma perda de resolução axial. Para expor as amostras a tão pouco quanto possível a luz, de varrimento deve ser feito em altas velocidades de tal modo que o tempo de permanênciao laser por pixel é baixa. Digitalização com menor resolução espacial também tem o efeito de aumentar a velocidade de digitalização. Imagiologia com menos frequência tem a vantagem adicional de expor a amostra para menos luz, no entanto, apenas deve ser considerado se não comprometa a amostragem abrangente dos processos investigados.

Como alternativa, disco de giro microscópios confocal e microscopia confocal que estão equipados com um chamado scanner de ressonância 'oferecem a capacidade de digitalização rápida. Ambas as modalidades têm a vantagem de que eles são mais rápidos e menos microscópios confocal 'clássica', ponto-de digitalização de foto-tóxico do que. No entanto, disco de giro microscópios confocal são mais limitados no z-resolução e não pode penetrar tão profundamente no tecido, como microscópios ponto-scanning confocal. Do mesmo modo, a aplicação de microscópios confocais ressonante do scanner, pode ser limitado, como o tempo de paragem muito curto de pixel irá levar a uma qualidade de imagem que podem,por sua vez, impede a detecção de eventos sub-celular (por exemplo, imagens binárias com reduzida sinal-ruído).

Por último, enquanto em todo o campo e imagem confocal são destacadas aqui, outras formas de microscopia de luz, como dois fótons 59 e microscopia de luz folhas 60 pode ser mais apropriado para perguntas específicas. microscopia de dois fótons baseia-se na excitação de um fluoróforo pela absorção simultânea de dois fotões na gama do infravermelho do espectro da luz. Em comum com a microscopia confocal, ele usa a exploração ponto de adquirir imagens da amostra e tem capacidades de seccionamento ópticos por virtude da não-linearidade da excitação de dois fotões. O uso da luz de comprimento de onda longo para excitação fluoróforo permite imagens em profundidades várias centenas de microns a partir da superfície. Além disso, a restrição de excitação para um volume pequeno de imagem impede foto-branqueamento e foto-toxicidade do lado de fora do plano focal. No entanto, nem todos FPs têm alta absorção multiphoton secções transversais, um problema que é especial predominante em PQ vermelho. Além disso, em encontrar um único comprimento de onda infravermelho para excitar simultaneamente múltiplos PQ distinta é difícil, fazendo imagiologia de multi-canal pesado. A microscopia de luz folhas usa uma "folha" fina (tipicamente uma espessura na gama de 2 a 10 uM) de luz laser para excitar a amostra e detecta sinais de fluorescência deste plano focal iluminada a um ângulo perpendicular utilizando uma câmara sensível. seccionamento óptica é conseguido iluminando um plano único de cada vez. Esta restrição da luz de excitação reduz a ocorrência de foto-toxicidade. Desde sinais de fluorescência de todo o plano iluminado são recolhidas simultaneamente, aquisição de imagem é significativamente mais rápido do que confocal de varredura ponto e microscópios multifotônica. Todas estas características fazem microscopia de luz folhas particularmente adequados para imagiologia eventos celulares dinâmicos com alta resolução espaço-temporal emgrandes volumes de amostras vivas. De facto, usando o destino celular microscopia de luz-folha em todo o embrião do peixe-zebra foi exaustivamente rastreadas durante as primeiras 24 h de desenvolvimento 61. Com as melhorias continuaram a melhor 62,63 penetração de imagem e resolução espacial de 64, é concebível que a microscopia de luz folha será utilizado para sondar a dinâmica não só no celular, mas também ao nível subcelular em embriões de peixe-zebra inteiras.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose (2-hydroxyethylagarose) Sigma-Aldrich A4018-10G Low-gelling temperature Type VII
Block heater Eppendorf Thermomixer compact
Ca(NO3)2 Calcium nitrate hydrate, 99.996%  Aldrich 202967-50g To prepare 30x Danieau's
CCD camera Qimaging Retiga Exi Fast 1394
Ceramic Coated Dumont #5 Forceps Dumont - Fine Science Tools 11252-50 #5 Forceps
Confocal laser-scanning microscope Olympus FV1000 Fluoview
Culture dish heater Warner Instrument Corporation DH-35 Heating ring
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfate salt PharmaQ Tricaine PharmaQ-25g Tricaine (anesthetic)
Fluorescence dissecting microscope Leica M205 FA
GeneClean kit MP Biomedicals 111001200
Glass Bottom Culture Dishes MatTek Corporation P35G-0-14-C 35 mm petri dish, 14 mm microwell, No. 0 coverglass
Glass needles World Precision Instruments Inc.  TW100F-4 For microinjections
HEPES Sigma H3375-250g To prepare 30x Danieau's
High vacuum grease Dow Corning  DCC000001242 150g Silicon dioxide grease
KCl 99% Sigma-Aldrich S7643-5kg To prepare 30x Danieau's
MgSO4.7H2O   Magnesium sulfate heptahydrate 98+% A.C.S reagent Sigma-Aldrich 230291-500g To prepare 30x Danieau's
Microinjector  Eppendorf FemtoJet
Microloader tips Eppendorf 930001007 0.5-20 ul
Micromanipulator Maerzhaeuser Wetzlar MM33 Rechts/00-42-101-0000/M3301R
Micropipette holder Intracel P/N 50-00XX-130-1
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit Ambion AM1340 To transcribe PCS-Transposase
NaCl BioXtra >99.5% Sigma-Aldrich P9541-1kg To prepare 30x Danieau's
Nanophotometer To measure DNA/RNA concentration
Needle puller Sutter Instrument P-1000 Flaming/Brown
NIR Apo 40x/0.80W  Nikon Water-dipping-cone objective
N-Phenylthiourea Grade I, approx. 98% Sigma P7629-10G PTU (prevents pigmentation)
Petri dishes Sarstedt AG  821472 92 x 16mm 
Plastic molds  Adaptive Science Tools TU-1 For microinjections
Plexiglas cover-with a hole Custom-made The hole in the Plexiglas cover should be 3 mm larger than the diameter of the water-dipping-cone objective
Tea-strainer (Plastic) To collect zebrafish eggs
Temperature controller Warner Instrument Corporation TC-344B Dual Automatic Temperature Controller
Transfer pipettes Sarstedt AG  86.1171 3.5mL plastic transfer pipettes
UMPlanFI 100x/1.00W Olympus Water-dipping-cone objective
UMPlanFLN 20x/0.50W  Olympus Water-dipping-cone objective
Widefield microscope Olympus BX51WI
PTU (50x Stock) Dissolve 76 mg PTU in 50 ml distilled water
Stir vigorously at room temperature 
Store at -20 oC in 1 ml aliquots
Use at 1x working solution
Tricaine (20x Stock) Dissolve 200 mg Tricaine in 48 ml distilled water
Add 2 ml 1M Tris base (pH9)
Adjust to pH 7 
Store at -20 oC in 1 ml aliquots
Use at 1x working solution
Danieau's Solution (30x Stock) 1,740 mM  NaCl 
21 mM      KCl 
12 mM      MgSO4.7H2
18 mM      Ca (NO3)2
150 mM    HEPES buffer 
Distilled water upto 1 L 
Store at 4 o
Use at 0.3x working solution

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References

  1. Alexandre, P., Reugels, A. M., Barker, D., Blanc, E., Clarke, J. D. Neurons derive from the more apical daughter in asymmetric divisions in the zebrafish neural tube. Nat Neurosci. 13, (6), 673-679 (2010).
  2. Distel, M., Hocking, J. C., Volkmann, K., Koster, R. W. The centrosome neither persistently leads migration nor determines the site of axonogenesis in migrating neurons in vivo. J Cell Biol. 191, (4), 875-890 (2010).
  3. Godinho, L., et al. Nonapical symmetric divisions underlie horizontal cell layer formation in the developing retina in vivo. Neuron. 56, (4), 597-603 (2007).
  4. Norden, C., Young, S., Link, B. A., Harris, W. A. Actomyosin is the main driver of interkinetic nuclear migration in the retina. Cell. 138, (6), 1195-1208 (2009).
  5. Godinho, L., et al. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. 132, (22), 5069-5079 (2005).
  6. Mumm, J. S., et al. In vivo imaging reveals dendritic targeting of laminated afferents by zebrafish retinal ganglion cells. Neuron. 52, (4), 609-621 (2006).
  7. Sagasti, A., Guido, M. R., Raible, D. W., Schier, A. F. Repulsive interactions shape the morphologies and functional arrangement of zebrafish peripheral sensory arbors. Current biology : CB. 15, (9), 804-814 (2005).
  8. Zolessi, F. R., Poggi, L., Wilkinson, C. J., Chien, C. B., Harris, W. A. Polarization and orientation of retinal ganglion cells in vivo. Neural Dev. 1, 2 (2006).
  9. Kim, M. J., Kang, K. H., Kim, C. H., Choi, S. Y. Real-time imaging of mitochondria in transgenic zebrafish expressing mitochondrially targeted GFP. Biotechniques. 45, (3), 331-334 (2008).
  10. Plucinska, G., et al. In vivo imaging of disease-related mitochondrial dynamics in a vertebrate model system. J Neurosci. 32, (46), 16203-16212 (2012).
  11. O'Donnell, K. C., Vargas, M. E., Sagasti, A. WldS and PGC-1alpha regulate mitochondrial transport and oxidation state after axonal injury. J Neurosci. 33, (37), 14778-14790 (2013).
  12. Engerer, P., Yoshimatsu, T., Suzuki, S. C., Godinho, L. CentrinFish permit the visualization of centrosome dynamics in a cellular context in vivo. Zebrafish. 11, (6), 586-587 (2014).
  13. Wang, K., et al. Rapid adaptive optical recovery of optimal resolution over large volumes. Nat Methods. 11, (6), 625-628 (2014).
  14. Randlett, O., Poggi, L., Zolessi, F. R., Harris, W. A. The oriented emergence of axons from retinal ganglion cells is directed by laminin contact in vivo. Neuron. 70, (2), 266-280 (2011).
  15. Tanabe, K., et al. Atypical protein kinase C regulates primary dendrite specification of cerebellar Purkinje cells by localizing Golgi apparatus. J Neurosci. 30, (50), 16983-16992 (2010).
  16. Hocking, J. C., Distel, M., Koster, R. W. Studying cellular and subcellular dynamics in the developing zebrafish nervous system. Exp Neurol. 242, 1-10 (2013).
  17. Clark, B. S., Winter, M., Cohen, A. R., Link, B. A. Generation of Rab-based transgenic lines for in vivo studies of endosome biology in zebrafish. Dev Dyn. 240, (11), 2452-2465 (2011).
  18. Paolini, A., et al. Asymmetric inheritance of the apical domain and self-renewal of retinal ganglion cell progenitors depend on Anillin function. Development. 142, (5), 832-839 (2015).
  19. Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. The Journal of clinical investigation. 122, (7), 2337-2343 (2012).
  20. Steele, S. L., Prykhozhij, S. V., Berman, J. N. Zebrafish as a model system for mitochondrial biology and diseases. Translational research : the journal of laboratory and clinical medicine. 163, (2), 79-98 (2014).
  21. Novorol, C., et al. Microcephaly models in the developing zebrafish retinal neuroepithelium point to an underlying defect in metaphase progression. Open biology. 3, (10), 130065 (2013).
  22. Baye, L. M., et al. The N-terminal region of centrosomal protein 290 (CEP290) restores vision in a zebrafish model of human blindness. Human molecular genetics. 20, (8), 1467-1477 (2011).
  23. Flinn, L. J., et al. TigarB causes mitochondrial dysfunction and neuronal loss in PINK1 deficiency. Annals of neurology. 74, (6), 837-847 (2013).
  24. Paquet, D., et al. A zebrafish model of tauopathy allows in vivo imaging of neuronal cell death and drug evaluation. The Journal of clinical investigation. 119, (5), 1382-1395 (2009).
  25. Khuchua, Z., Yue, Z., Batts, L., Strauss, A. W. A zebrafish model of human Barth syndrome reveals the essential role of tafazzin in cardiac development and function. Circulation research. 99, (2), 201-208 (2006).
  26. Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of development. 80, (2), 153-158 (1999).
  27. Koster, R. W., Fraser, S. E. Tracing transgene expression in living zebrafish embryos. Dev Biol. 233, (2), 329-346 (2001).
  28. Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nat Methods. 2, (12), 920-931 (2005).
  29. Sambrook, J., Russell, D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  30. Distel, M., Wullimann, M. F., Koster, R. W. Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (32), 13365-13370 (2009).
  31. Skene, J. H., Virag, I. Posttranslational membrane attachment and dynamic fatty acylation of a neuronal growth cone protein, GAP-43. J Cell Biol. 108, (2), 613-624 (1989).
  32. Zuber, M. X., Strittmatter, S. M., Fishman, M. C. A membrane-targeting signal in the amino terminus of the neuronal protein GAP-43. Nature. 341, (6240), 345-348 (1989).
  33. Asakawa, K., et al. Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (4), 1255-1260 (2008).
  34. Godinho, L. Injecting zebrafish with DNA or RNA constructs encoding fluorescent protein reporters. Cold Spring Harb Protoc. 2011, (7), 871-874 (2011).
  35. Palanca, A. M., Sagasti, A. Optogenetic activation of zebrafish somatosensory neurons using ChEF-tdTomato. J Vis Exp. (71), e50184 (2013).
  36. Dean, D. A., Gasiorowski, J. Z. Preparing injection pipettes on a flaming/brown pipette puller. Cold Spring Harb Protoc. 2011, (3), prot5586 (2011).
  37. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, (3), 253-310 (1995).
  38. Ren, J. Q., McCarthy, W. R., Zhang, H. W., Adolph, A. R., Li, L. Behavioral visual responses of wild-type and hypopigmented zebrafish. Vision Research. 42, (3), 293-299 (2002).
  39. Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, Suppl 1. S7 (2007).
  40. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev Dyn. 236, (11), 3088-3099 (2007).
  41. Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Dev Dyn. 228, (1), 30-40 (2003).
  42. Davidson, A. E., et al. Efficient gene delivery and gene expression in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon. Dev Biol. 263, (2), 191-202 (2003).
  43. Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Dev Cell. 7, (1), 133-144 (2004).
  44. Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. Efficient transposition of the Tol2 transposable element from a single-copy donor in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (50), 19827-19832 (2008).
  45. Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th ed, University of Oregon Press. (2007).
  46. Wilkinson, R. N., Elworthy, S., Ingham, P. W., van Eeden, F. J. A method for high-throughput PCR-based genotyping of larval zebrafish tail biopsies. Biotechniques. 55, (6), 314-316 (2013).
  47. Carter, K. M., Woodley, C. M., Brown, R. S. A review of tricaine methanesulfonate for anesthesia of fish. Rev Fish Biol Fisher. 21, (1), 51-59 (2011).
  48. Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using microManager. Curr Protoc Mol Biol. 14.20 (2010).
  49. Snapp, E. L. Design and Use of Fluorescent Fusion Proteins in Cell Biology. Curr Protoc Cell Biol. 21.4 (2005).
  50. Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends in cell biology. 19, (11), 649-655 (2009).
  51. Costantini, L. M., Snapp, E. L. Fluorescent proteins in cellular organelles: serious pitfalls and some solutions. DNA and cell biology. 32, (11), 622-627 (2013).
  52. Provost, E., Rhee, J., Leach, S. D. Viral 2A peptides allow expression of multiple proteins from a single ORF in transgenic zebrafish embryos. Genesis. 45, (10), 625-629 (2007).
  53. Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLoS One. 6, (4), e18556 (2011).
  54. Akitake, C. M., Macurak, M., Halpern, M. E., Goll, M. G. Transgenerational analysis of transcriptional silencing in zebrafish. Dev Biol. 352, (2), 191-201 (2011).
  55. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2, (12), 905-909 (2005).
  56. Katayama, H., Yamamoto, A., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. GFP-like proteins stably accumulate in lysosomes. Cell Struct Funct. 33, (1), 1-12 (2008).
  57. Shaner, N. C., et al. Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins. Nat Methods. 5, (6), 545-551 (2008).
  58. Marinkovic, P., et al. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (11), 4296-4301 (2012).
  59. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2, (12), 932-940 (2005).
  60. Keller, P. J., Ahrens, M. B. Visualizing Whole-Brain Activity and Development at the Single-Cell Level Using Light-Sheet Microscopy. Neuron. 85, (3), 462-483 (2015).
  61. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, (5904), 1065-1069 (2008).
  62. Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nat Methods. 8, (9), 757-760 (2011).
  63. Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy. Nat Methods. 9, (7), 755-763 (2012).
  64. Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346, (6208), 1257998 (2014).
Imagiologia estruturas celulares no embrião vivo Zebrafish
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