Introduction
في السنوات الأخيرة، التكنولوجيا المتقدمة العمود عالية الأداء اللوني السائل (HPLC) إلى حد كبير؛ زادت قدرات الذروة إلى حد كبير إلى حد كبير بفضل استخدام أحجام الجسيمات الأصغر حجما وأكثر كفاءة الجسيمات الأساسية قذيفة. منذ الانفصال عادة ما تكون أكثر كفاءة، وقد تدفق على أثر زيادة في حساسية منذ القمم هي الآن أكثر وضوحا، وبالتالي اطول 1-8.
ومع ذلك، عدم التجانس السرير شعاعي لا يزال عاملا مقيدا في أداء جميع الأعمدة، ولكن هذه ليست قصة جديدة منذ chromatographers ويعرف هذا لسنوات عديدة. سرير عمود غير متجانسة في كل من الاتجاه شعاعي 12/09، وعلى طول العمود محور 10،12-15. للتأثير الجدار خصوصا ومساهما هاما في فقدان 7،16-18 أداء الانفصال. Shalliker وريتشي 7 استعرضت مؤخرا جوانب عدم التجانس عمود السرير وبالتالي هذا لا يلزم أن يكون discusseد هنا أبعد من ذلك. على الرغم من أن يكفي القول، أن الاختلاف في العمود كثافة السرير التعبئة والتغليف وآثار جدار يؤدي إلى تشويه المكونات المذاب، ان هذه العصابات أزل من خلال العمود في المقابس، وتماثل مملوءة جزئيا الحساء الأطباق بدلا من رقيقة أقراص صلبة مسطحة 7 التي هي يصور عادة في النصوص التعليمية الأساسية. عندما أجريت تجارب من هذا القبيل أن الهجرة المذاب من خلال السرير يمكن تصور كانت لمحات المكونات داخل العمود جوفاء جزئيا وقسم المخلفات في الفرقة هو إلى حد كبير مكون جدار المكونات العينة. والنتيجة النهائية هي أنه يأخذ الكثير من لوحات لفصل هذه المقابس "جوفاء جزئيا" من شأنه أن يكون مطلوبا إذا كانت أقراص صلبة ومسطحة 12،14،17. للتغلب على الفرقة توسيع القضايا المرتبطة آثار الجدار والاختلاف في كثافة التعبئة شعاعي، وقد تم تصميم شكل جديد من التكنولوجيا العمود المعروفة باسم النشطين تقنية التدفق (AFT) 7،19. وكان الهدف من هذا التصميملإزالة آثار الجدار من خلال الفصل المادي بين يبلغ حجمه المذيبات على طول منطقة الجدار، من أن من الطور المتحرك يبلغ حجمه في المنطقة الوسطى شعاعي العمود 19. هناك نوعان رئيسيان من الأعمدة AFT. موازية مقطع التدفق (PSF) الأعمدة والستار تدفق (CF) أعمدة 7. منذ يهدف هذا البروتوكول في استخدام والاستفادة المثلى من الأعمدة CF، لن يتم مواصلة مناقشة الأعمدة قوات الأمن الفلسطينية.
الستار تدفق (CF)
الستار تدفق (CF) صيغ العمود الاستفادة AFT-التجهيزات نهاية في كل من مدخل ومخرج العمود. تتكون AFT نهاية التجهيزات لفريت الحلقي تقع داخل تركيب متعدد المنافذ. ويتكون فريت تتكون من ثلاثة أجزاء: الجزء المركزي شعاعي يسهل اختراقها والتي تتماشى مع الميناء الرئيسي للنهاية المناسب، وهو الجزء الخارجي يسهل اختراقها والتي تتماشى مع ميناء الطرفية (ق) من نهاية مناسبة، وحلقة كتيمة أن يفصل بين الأجزاء التي يسهل اختراقها منع أي عبر-flow بين المنطقتين الوسطى والخارجية شعاعي للفريت 19 الشكل 1 يوضح تصميم فريت الخلف ويوضح الشكل 2 الشكل العمود CF. في هذا النمط من العمليات (CF) يتم حقن العينة إلى ميناء المركزي شعاعي من مدخل المناسب، في حين يتم إدخال الطور المتحرك إضافية عن طريق ميناء الطرفية من مدخل إلى 'ستار' هجرة المواد المذابة من خلال المنطقة الوسطى شعاعي لل عمود. ومن هنا يدخل عينة السرير في المنطقة الوسطى الشعاعية للعمود مع المنطقة الخارجية للعمود وجود الطور المتحرك مرت فقط من خلال ذلك. وقد أظهرت الدراسات أن نسبة حجمية معدل تدفق حوالي 40:60 (وسط: منفذ الطرفية) لمدخل نهاية تركيب عمود 4.6 مم القطر الداخلي (معرف) هو 6،7،16 الأمثل. منفذ الخلف العمود CF يسمح تعديل تدفق المركزي والمحيطي لجزء نسبي ويمكن أن تختلف إلى ما يقرب من أي راتي المطلوبس من خلال إدارة الضغوط. الاستفادة المثلى من عمود CF يمكن أن تحسن بشكل كبير الجوانب الفنية المختلفة للتكنولوجيا العمود، مثل كفاءة الفصل أو حساسية الكشف. في هذه الطريقة يتم تأسيس "الجدار أقل '،' لا حصر له القطر" أو عمود "الظاهري" 6،10،18،20. والغرض من الأعمدة CF هو إدارة بنشاط في الهجرة من العينة من خلال العمود لمنع عينة من الوصول إلى منطقة الجدار. وبالتالي، يتم تكبير تركيز المذاب عند الخروج إلى كشف، وزيادة حساسية أكبر نحو 2.5 مرة من شكل العمود التقليدي عند استخدام الأشعة فوق البنفسجية (UV) كشف 16، وحتى أكبر عند استخدام الكشف الطيفي الشامل 6.
هي مناسبة الأعمدة CF مثالي لعينات التركيز المنخفض، حيث تزداد حساسية الكشف. وعلاوة على ذلك، فهي مثالية عندما يقترن إلى معدل التدفق للكشف عن محدودة، مثل مطياف الكتلة (MS) 6. [أالعمود FT في شكل معرف 4.6 مم، على سبيل المثال يمكن ضبطها لتقديم نفس الحجم من المذيب لكشف باعتباره 2.1 ملم عمود شكل معيار الهوية عندما كانت تعمل في نفس السرعات الخطية، من خلال تعديل الخروج تدفق المركزي إلى 21٪. وبالمثل العمود الخلف كما يمكن ضبطها لتسليم نفسه تحميل الصوت إلى جهاز الكشف عن كعمود معرف 3.0 ملم، من خلال تعديل الخروج تدفق المركزي إلى 43٪. في الواقع يمكن أن تنتج أي شكل عمود "التقديرية" لتتناسب مع متطلبات التحليلي 6،18،22. باستخدام هذه نهاية التجهيزات المصممة خصيصا في مدخل ومخرج يضمن أن يتم إنشاء عمود صحيح الجدار أقل.
هناك طريقتان لإعداد نظام تسليم المذيبات إلى موانئ المركزية والطرفية للمدخل: نظام تقسيم تدفق 6 واثنين من 6،7 نظام مضخة الشكل 3 يوضح كل من هذه المجموعة المنبثقة نظام CF.
نظام تقسيم التدفق
أناغ نظام تقسيم التدفق (الشكل 3A) تدفق المضخة مما يؤدي إلى حاقن منقسمون ما قبل حاقن باستخدام ميت الصفر حجم T-قطعة، حيث يتم توصيل تيار تدفق واحد من الطور المتحرك لحاقن، وهو بعد ذلك متصلا ميناء المركزي للمدخل نهاية تركيب العمود. تيار تدفق الثاني من المرحلة المتنقلة، يمر حاقن ويرتبط إلى ميناء الطرفية على مدخل العمود. خلال تقسيم التدفق، ويتم تعديل نسبة تدفق تدفق إلى 40:60 (مركز: الطرفية) قبل أن يتم توصيل خطوط العمود، أي من حاقن لمركز ومضخة لالطرفية.
نظام ثنائي مضخة
يتطلب العمود CF تيارين التدفق في مدخل نهاية تركيب العمود. اعتمادا على نوع من الاوتوماتيكى / حاقن للHPLC أداة، وانقسام تدفق اقامة قد لا يكون من الممكن، وهكذا CF ويمكن بعد ذلك أن يتحقق من خلال 2 مضخات (الشكل 3B 21). يخصص لكل مضخة وتوصيلها الى ميناء المركزي أو الطرفي ويتم تعيين معدل التدفق لتمثيل 40٪ من تدفق لميناء المركزي و 60٪ لميناء الطرفية. على سبيل المثال، إذا كان معدل تدفق 1.0 مل دقيقة -1، يتم تعيين معدل تدفق ضخ المركزي إلى 0.4 مل دقيقة -1 ويتم تعيين مضخة الطرفية إلى 0.6 مل دقيقة -1.
واختيار أي طريقة عملها يعتمد إلى حد كبير على أجهزة HPLC ووضع الكروماتوغرافي من العملية. على سبيل المثال في بعض autosamplers تغيير في الضغط بين عينة موقف الحمل وعينة حقن قد يحدث موقف تعطيل نسبة الانقسام التدفق وبالتالي في هذه الحالة مضخة مزدوجة انشاء أن يكون الموصى بها لأداء CF الأمثل. بغض النظر عن نظام تسليم المذيبات اقامة المختار للمدخل العمود CF، ومنفذ الأمثل CF لا يزال هو نفسه. ويرد ميناء المركزي منفذ العمود CF إلى كاشف الأشعة فوق البنفسجية-مرئي (أشعة فوق البنفسجية فيس) مع األصغرخشية أن حجم ممكن من الأنابيب للحد من آثار ما بعد العمود حجم القتلى. منذ ذلك الحين، أعمدة CF محاكاة أعمدة ضيقة الجوف، حجم القتلى بين منفذ عمود وكاشف هو ضار لأداء فصل العمود CF. فمن الأهمية بمكان لضمان أقل قدر من حجم أنابيب بين ميناء المركزي وكاشف للأشعة فوق البنفسجية فيس للحد من آثار حجم القتلى مثل توسيع النطاق، وفقدان الكفاءة وحساسية. وبالتالي، ينصح استخدام أنابيب تتحمل الضيق (0.1 ملم معرف) للسماح بسهولة التعديلات الضغط دون إضافة حجم القتلى غير مناسب. ويرد الأنابيب أيضا إلى ميناء الطرفية وإخراج سدى. على منفذ العمود CF، نسبة تجزئة يمكن تعديلها في أي النسبة التي تناسب الغرض من المحللين. عند استخدام معرف CF 4.6 مم، على سبيل المثال، غالبا ما يكون ملائم لتعيين نسبة إما 43:57 أو 21:79 (مركز: الطرفية) لمضاهاة "الظاهري" 3.0 ملم عمود الهوية أو 2.1 ملم عمود الهوية،باحترام. بهذه الطريقة أداء الانفصال بسهولة بعلامات مقاعد البدلاء. يتم قياس نسبة تجزئة وزنها عن طريق كمية تدفق الخروج من الكشف الذي يتم توصيله بمنفذ المركزي وتدفق الخروج من ميناء الطرفية خلال فترة زمنية. تدفق مئوية خلال كل منفذ يمكن بعد ذلك يتم تحديد ونسب يمكن تعديلها عن طريق تغيير طول الأنبوب المرفقة أو باستخدام الأنابيب التي يبلغ قطرها الداخلي مختلفة (معرف).
تفاصيل هذا البروتوكول الفيديو إجراءات عملية والاستغلال الأمثل للعمود CF من أجل تحسين الأداء الكروماتوغرافي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تنبيه: يرجى الرجوع إلى بيانات سلامة المواد (MSDS) لجميع المواد والكواشف قبل الاستخدام (أي، MSDS من الميثانول). ضمان استخدام جميع ممارسات السلامة المناسبة عند التعامل مع المذيبات وعالية الأداء اللوني السائل (HPLC) شاطف. ضمان الاستخدام الملائم للضوابط هندسية من HPLC والتحليلية التوازن وكشف عن الأجهزة، وضمان استخدام معدات الوقاية الشخصية (النظارات الواقية والقفازات ومعطف المختبر، كامل طول السراويل، وأحذية مغلقة اصبع القدم).
ملاحظة: هذا البروتوكول يحتوي على تعليمات حول كيفية استخدام عمود CF على نظام HPLC إلى جانب وجود كاشف الأشعة فوق البنفسجية فيس. لقد كتب البروتوكول على افتراض أن القارئ لديه معرفة الأساسية والخبرة في اللوني.
1. إعداد من HPLC صك
ملاحظة: هذا القسم يمكن تغيير لتتناسب مع احتياجات المحللين، أي اختيار المذيبات، للكشف عن الطول الموجي ومعدل التدفق الذيهي مناسبة لعينة من الفائدة.
- إعداد الصك HPLC مع 100٪ الماء عالى النقاء (على سبيل المثال، ميلي-Q الماء) لمدة ألف خط والميثانول بنسبة 100٪ لخط B كما الطور المتحرك وتطهير المضخات وفقا لمتطلبات الشركة المصنعة.
- تعيين كاشف الأشعة فوق البنفسجية فيس إلى 254 نانومتر.
- اختيار إما قبل حقن وضع تدفق انقسام انشاء، أو مزدوج تدفق مضخة انشاء. لطريقة تقسيم تدفق انتقل إلى الخطوة 2، لوضع مضخة مزدوجة انتقل إلى الخطوة 3.
إعداد النظام 2. تقسيم التدفق
- قطع خط ضخ من صمام محقن لصناعة السيارات في العينات.
- إرفاق T-قطعة من خط الضخ.
- نعلق قطعة 15 سم من 0.13 ملم معرف الأنابيب إلى كل منفذ من T-قطعة.
- وربط أنبوب واحد من T-قطعة لحاقن صمام لصناعة السيارات في العينات.
- ضبط مضخة إلى 1.0 مل دقيقة -1.
- قبل توصيل خطوط مضخة إلى مدخل العمود CF، ضبط نسبة تقسيم تدفق إلى 40٪: 6 0٪ (خط الوسط: خط محيطي) على النحو التالي في الخطوة 2.7.
- ضبط نسبة مدخل CF على نظام تقسيم التدفق
- قياس كتلة سفينتين جمع فارغة باستخدام الميزان التحليلي وتسمية السفينة مجموعة واحدة المركزية وغيرها من واحد المحيطي (واحد للخط من السيارات العينات إلى مركز الميناء واحد للخط من T-قطعة إلى ميناء الطرفية) .
- ل1.0 دقيقة، وجمع الطور المتحرك الخروج من خط القادمة من حاقن (في النقطة التي سوف تكون متصلا عمود) في الإناء جمع، التي تم قياسها في 2.7.1 كتلة.
- إعادة تزن السفينة المجموعة على نطاق والتحليلي وتحديد كتلة مرحلة النقالة التي تم جمعها.
- كرر الخطوات من 2.7.2 إلى 2.7.3 للشاطف الخروج من خط من T-قطعة المراد توصيله بمنفذ الطرفية.
- تحديد نسبة تدفق (مل دقيقة -1) من كل سطر من تدفق وفقا لمعادلات التالية:
1 "SRC =" / ملفات / ftp_upload / 53471 / 53471eq1.jpg "/> - ضبط نسبة تدفق إلى 40٪: 60٪ (± 2٪) (خط من حاقن إلى ميناء المركزي: خط من T-قطعة إلى ميناء الطرفية). إذا كان الخط من حاقن إلى نسبة تدفق الساحلية بوسط فوق 40٪، وزيادة هبوط الضغط عن طريق تقليل القطر الداخلي للأنابيب، أو زيادة طوله. إذا كان الخط من حاقن إلى نسبة تدفق الساحلية بوسط أقل من 40٪، وزيادة القطر الداخلي للأنابيب أو تقليل طول الأنبوب.
- مرة واحدة يتم ضبطها نسب تدفق تشغيل المضخة تدفق قبالة.
- قم بتوصيل خط من حاقن إلى ميناء المركزي للمدخل عمود وخط من T-قطعة إلى ميناء الطرفية من مدخل عمود.
- المنحدر ببطء معدل التدفق إلى 1.0 مل دقيقة -1 في 100٪ خط B.
- تتوازن العمود (4.6 ملم طول معرف × 100 مم) من خلال السماح لل100٪ ميثانول (خط B) الطور المتحرك بالتدفق من خلال عمود في 1.0 مل دقيقة -1 لمدة 10 دقيقة. يتم تحجيم هذه المرة وفقا لأبعاد الأعمدة الأخرى قد تستخدم المستخدم.
- لضبط للمخرج CF انتقل إلى الخطوة 4. "ضبط تدفق منفذ CF".
الإعداد 3. المزدوج نظام مضخة
- توصيل مضخة نظام HPLC لحاقن ثم قم بتوصيل خط من حاقن لمدخل الميناء الرئيسي للعمود.
- توصيل مضخة إضافية مباشرة إلى ميناء الطرفية مدخل العمود. لاحظ أن هذه المضخة الثانية، يمر حاقن.
- المنحدر معدل تدفق مضخة نظام الملحقة بالميناء المركزي إلى 0.4 مل دقيقة -1 (ممثل 40٪ من معدل التدفق الكلي 1.0 مل دقيقة -1) في الميثانول٪ 100 (خط B).
- في نفس الوقت الخطوة 3.3، المنحدر معدل تدفق المضخة المحيطية إلى 0.6 مل دقيقة -1 (ممثل 60٪ من معدل التدفق الكلي لل1.0 مل دقيقة -1) في الميثانول٪ 100 (خط B).
- تتوازن العمود (4.6 ملم طول معرف × 100 مم) من خلال السماح للميثانول٪ 100 (خط B) الطور المتحرك في التدفق من خلال عمود في 1.0 مل دقيقة -1 لمدة 10 دقيقة. يتم تحجيم هذه المرة وفقا لأبعاد الأعمدة الأخرى قد تستخدم المستخدم.
- لضبط للمخرج CF انتقل إلى الخطوة 4. "ضبط تدفق منفذ CF".
4. ضبط من CF المخرج تدفق
- ربط ميناء منفذ المركزي للكشف عن الأشعة فوق البنفسجية فيس باستخدام قطعة 15 سم من 0.13 ملم معرف الأنابيب.
- ربط قطعة 15 سم من 0.13 ملم معرف أنابيب إلى ميناء منفذ طرفي العمود CF.
- تزن كتلة سفينتين جمع فارغة على الميزان التحليلي وتسمية سفينة واحدة مركزية والأخرى هامشية.
- ل1.0 دقيقة، وجمع الطور المتحرك الخروج من مجسات (تدفق المركزي) أشعة فوق البنفسجية فيس في تسمية السفينة جمع المركزية، التي تم قياسها في 4.2 كتلة.
- إعادة تزن السفينة مجموعة تحتوي على شاطف التي تم جمعها على نطاق والتحليلي وتحديد كتلة مرحلة النقالة التي تم جمعها.
- كرر الخطوات من 4،4-4،5 لشاطف الخروج من خط من ميناء منفذ الطرفية.
- تحديد نسبة تدفق من كل سطر من تدفق وفقا لمعادلات التالية:
- ضبط نسبة تدفق إلى 21٪: 79٪ (± 2٪) (تدفق منفذ المركزي من الأشعة فوق البنفسجية فيس: تدفق منفذ الطرفية من خط). وإذا كانت نسبة تدفق المركزية من الأشعة فوق البنفسجية فيس فوق 21٪، وزيادة هبوط الضغط من خلال خفض القطر الداخلي للأنابيب المرفقة للخروج من كاشف للأشعة فوق البنفسجية فيس، أو زيادة طوله. إذا كانت نسبة تدفق المركزية من الأشعة فوق البنفسجية فيس أقل من 21٪، وزيادة القطر الداخلي للأنابيب المرفقة للخروج من كاشف للأشعة فوق البنفسجية فيس، أو تقليل طول الأنبوب. في كل مرة تم تغيير طول الأنبوب، كررالخطوات 4،3-4،7.
ملاحظة: عمود CF في 2.1 مم وضع معرف "الظاهري" جاهز للتحليل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقد وضعت أعمدة AFT باستخدام تصميم فريت المتخصصة (الشكل 1) في العمود متعدد المنافذ نهاية التجهيزات للتغلب على عدم التجانس السرير العمود وتحسين الأداء الانفصال. وقد أجريت دراسة بين المختبرات على أداء الفصل بين الأعمدة اللوني التليف الكيسي (الشكل 2) خارجا مع نظام مضخة مزدوجة انشاء (الشكل 3B) كما هو موضح في المادة 3 من هذا البروتوكول 23. تم تحليل خليط ثلاثة اختبار مكون تحت عبر معرف 2.1 مم "الظاهري" حيث تم توجيه 21٪ من تدفق منفذ المركزي للعمود CF إلى كاشف. فصل خليط اختبار مكون ثلاثة يوضح تحسن أداء من حيث الكفاءة وحساسية، من عمود CF بالنسبة إلى الأعمدة القياسية. اختبار خليط مكون ثلاثة يرد فينيتول، butylbenzene وpentylbenzene وتحليلها على التقليدية 4.6 و 2.1 ملم أعمدة الهوية و4.6 ملم عمود معرف CF مع نسبة تجزئة 22:78 (مركز: الطرفية) لمحاكاة معرف 2.1 مم (الشكل 4). تم تقييم كفاءة الفصل من حيث لوحة العد (N)، والحساسية. وأظهر استخدام عمود CF لتحليل حد أدنى للكشف (الشكل 5)، وزيادة في الحساسية (الأرقام 4 و 6) مقارنة يحلل العمود التقليدي. كما وجدت الدراسة أنه بغض النظر عن المختبر أو نوع من نظام HPLC أن يعمل، كانت النتيجة أداء الفصل للعمود CF نفس نسبيا، مما أسفر عن تحسن الأداء الفصل عندما توظف CF الأعمدة اللوني 23.
الشكل 1. رسم توضيحي للتكنولوجيا تدفق العمود المناسب نهاية تصميم فريت نشط. OAD / 53471 / 53471fig1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. AFT العمود - شكل عمود CF الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. مجموعة تتكون من CF تدفق العمود مدخل في إعداد النظام (A) تقسيم تدفق و (ب) إعداد النظام 2 مضخة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
/53471fig4.jpg "/>
الرقم 4. فصل نموذجي من خليط اختبار مكون ثلاثة تم الحصول عليها باستخدام النظام في نهاية المطاف 3000. (أ) التقليدية 4.6 ملم عمود الهوية، (ب) التقليدية 2.1 ملم عمود الهوية، والعمود (ج) تدفق الستار تعمل مع 22٪ منفذ تجزئة نسبة. المواد المذابة: (ط) فينيتول، (ب) butylbenzene و (ج) pentylbenzene. تم استخراج هذا الرقم من 23. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5. ملامح الفرقة شطف من butylbenzene في الحد من الكشف على (أ) العمود التقليدي، و (ب) تدفق الستار عمود النظام: شيمادزو في 2.0 مل / دقيقة، 5 حقن ميكرولتر، كشف في 254 نانومتر. تم استخراج هذا الرقم من
الشكل 6. مقارنة في لمحات شطف من butylbenzene الحصول على النظام في نهاية المطاف 3000. (أ) التقليدية 4.6 ملم معرف عمود، (ب) 2.1 ملم عمود الهوية التقليدية، (ج) عمود تدفق الستار مع 22٪ منفذ تجزئة نسبة. تم استخراج هذا الرقم من 23. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وشملت هذه الدراسة تحليل بين المختبرات الأعمدة اللوني CF لاختبار الأداء التحليلي من حيث الكفاءة والحساسية. تم تعيين عمود CF مع نظام الضخ المزدوج كما هو موضح في قسم "3. تعيين نظام مضخة مزدوجة تصل إلى تحقيق نسبة تدفق 40:60 (مركز: الطرفية) على مدخل العمود CF. وقد تحقق نسبة التدفق من خلال تحديد معدل تدفق كل مضخة إلى القيمة التي تمثل 40٪ و 60٪ من إجمالي معدل التدفق، على التوالي: و40:60 (هامشية في الوسط). تم ضبطها منفذ العمود CF إلى عمود "الظاهري" مع معرف من 2.1 ملم باتباع الإجراء الموضح في قسم "4. ضبط تدفق منفذ CF ". وقد تم استخدام خليط عينة تحتوي على فينيتول، butylbenzene وpentylbenzene كمعيار اختبار لمقارنة الأداء الفصل بين 4.6 ملم عمود معرف CF (22:78) والأعمدة معرف 4.6 و 2.1 مم التقليدية الشكل 4 هو تراكب chromatograpالفصل الائتلاف من خليط اختبار الاضطلاع بها باستخدام كل من الأعمدة الثلاثة. والفرق الرئيسي لوحظ في هذا الرقم هو زيادة كبيرة في الاستجابة إشارة للفصل الحصول عليها باستخدام العمود CF. وكانت استجابة إشارة للأعمدة التقليدية 4.6 و 2.1 ملم معرف متطابقة تقريبا كما هو متوقع حيث تم تحجيمها الظروف الكروماتوغرافي لتتناسب مع سطح مستعرضة من الأعمدة.
تم تقييم الخطي وحدود الكشف أيضا بين قوات التحالف وسائط تقليدية من العملية، حيث تم إعداد سلسلة من المعايير وتحليلها في مكررات على أنظمة HPLC مختلفة مع معدلات تدفق مختلفة. بغض النظر عن الذي كان يستخدم نظام HPLC وبأي معدل تدفق كانت نتائج التحليل في الأساس نفسه، حيث كانت الاستجابة إشارة لقوات التحالف دائما أكبر بكثير من الأعمدة التقليدية الأخرى. كانت المكاسب استجابة إشارة عادة بين 1.7 و 2.8 مرة أكبر من الأعمدة التقليدية. على بعد 5 أضعافوقد لوحظ - (RSD٪ أي النسبية الانحراف المعياري) ذروة ارتفاع لأدنى سلسلة موحدة لوضع CF التشغيل بنسبة 22٪ بالمقارنة مع عمود هوية 2.1 مم التقليدية تحسن في دقة القياسات. CF يحسن من دقة القياسات الذروة وذلك بسبب الزيادة في الحساسية التي يتم الحصول عليها من قبل قوات التحالف. وكلما زاد استجابة إشارة وانخفاض قيمة RSD. وهكذا، كما تم تحسين نتيجة لتحسين إشارة استجابة ذروة الدقة أيضا، أيضا كفاءة أعلى، لذلك فرق الذيل أقل، وبالتالي ذروة التكامل هو أكثر دقة. حدود الاعتقال والكمي باستخدام الأعمدة CF مع نسبة منفذ تجزئة 22:78 (مركز: الطرفية). وقد تحسنت أيضا بنسبة تصل إلى 2.3 مرة من التقليدية 2.1 ملم عمود معرف 23 الشكل 5 يوضح الحد القريب من استجابة الكشف عن butylbenzene الذروة وفقا للشروط والأوضاع CF التقليدية.
جانبا هاما إلى كومparison بين قوات التحالف والأعمدة التقليدية التي ليست واضحة في الشكل (4) هو الحد في ذروة حجم للالتحاليل في العينات في ظل ظروف CF الشكل 4 يقدم قمم فيما يتعلق الوقت، ومع ذلك، لأنه في وضع CF فقط جزء من يتم استخدام التدفق الكلي، ذروة العرض يمكن تعديلها من حيث الحجم والشكل 6 يقارن الشخصي butylbenzene شطف فيما يتعلق ذروة حجم لقوات التحالف (22:78) الاقتداء "الظاهري" 2.1 مم الهوية، وعمود معرف 4.6 مم التقليدية والتقليدي 2.1 ملم معرف بلغ حجم الذروة بين قوات التحالف والتقليدية الأعمدة 2.1 ملم متطابقة تقريبا، ومع ذلك، كان حجم ذروة العمود التقليدي 4.6 ملم حوالي 5 مرات أكبر من كل من التقليدية 2.1 ملم وCF (22:78) . الأهم من ذلك، فإن الانخفاض في ذروة حجم في وضع CF لا يؤدي إلى تخفيض استجابة إشارة، وإنما زيادة بنحو 3 مرات من الأعمدة التقليدية regardlوفاق سطيف من القطر الداخلي 23. وعلى الرغم من انخفاض في ذروة الصوت قد لا تكون مهمة للكشف عن الأشعة فوق البنفسجية فيس، ونفس لا يمكن أن يقال عن عمليات الكشف التي هي معدل التدفق تعتمد أو محدودة، على سبيل المثال، مطياف الكتلة أو ضوء التبخر نثر كاشف.
العيب إلى وضع CF من عملية من هذا القبيل من الأعمدة التقليدية الجوف أضيق هو قابليته للتأثير في مرحلة ما بعد العمود حجم القتلى، والتي يمكن أن تتدهور بشكل كبير من أداء الفصل عن طريق التسبب في توسيع نطاق والاضمحلال في شدة الإشارة. ومع ذلك، فإن حجم القتلى في مدخل أقل أهمية. وهكذا، العناية الواجبة لأنابيب بعد عمود ضرورية لتحقيق الأداء الأمثل الفصل CF. اللوني CF هو شكل جديد إلى حد ما من التكنولوجيا العمود الذي لديها امكانات كبيرة في التطبيقات المستقبلية. على سبيل المثال، وحقن منخفضة عينة تركيز في وسط العمود CF، هو "ستائر" من الجدار (الطرفية) مرحلة تناسق المحمولتقييم العينة داخل مركز العمود CF، وبالتالي تحقيق أقصى قدر من الاستجابة إشارة. على منفذ يؤخذ فقط تدفق المركزي الذي يحتوي على العينة تتركز 'إلى كشف، وتوفير زيادة في الحساسية، مثالية لتحليل عالية السرعة باستخدام معدلات تدفق عالية على تدفق كاشفات محدودة مثل MS 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HPLC instrument | |||
| Additional Pump | Required if 2 pump CF system set up is to be used. | ||
| Curtain Flow HPLC column | Thermo Fisher Scientific | Not Defined | Soon to be commercialized |
| Methanol | Any brand | HPLC Grade | |
| PEEK tubing | Any brand | Various lengths and i.d. | |
| PEEK tube cutter | Any brand | ||
| Analytical Scale Balance | Any brand | ||
| Stop watch | Any brand | ||
| Eluent collection vessels | Any brand | 1-2 ml sample vials can be used as eluent collection vessels | |
| T-piece | Any brand |
References
- Camenzuli, M., et al. The use of parallel segmented outlet flow columns for enhanced mass spectral sensitivity at high chromatographic flow rates. Rapid Commun. Mass Sp. 26 (8), 943-949 (2012).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. Enhanced separation performance using a new column technology: Parallel segmented outlet flow. J. Chromatogr. A. 1232 (0), 47-51 (2012).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. Gradient elution chromatography with segmented parallel flow column technology: A study on 4.6mm analytical scale columns. J. Chromatogr. A. 1270 (0), 204-211 (2012).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. Improving HPLC separation performance using parallel segmented flow chromatography. Microchem. J. 111 (0), 3-7 (2013).
- Camenzuli, M., et al. Parallel segmented outlet flow high performance liquid chromatography with multiplexed detection. Anal. Chim. Acta. 803 (0), 154-159 (2013).
- Kocic, D., et al. High through-put and highly sensitive liquid chromatography-tandem mass spectrometry separations of essential amino acids using active flow technology chromatography columns. J. Chromatogr. A. 1305 (0), 102-108 (2013).
- Shalliker, R. A., Ritchie, H. Segmented flow and curtain flow chromatography: Overcoming the wall effect and heterogeneous bed structures. J. Chromatogr. A. 1335 (0), 122-135 (2014).
- Shellie, R., Haddad, P. Comprehensive two-dimensional liquid chromatography. Anal. Bioanal. Chem. 386 (3), 405-415 (2006).
- Abia, J. A., Mriziq, K. S., Guiochon, G. A. Radial heterogeneity of some analytical columns used in high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A. 1216 (15), 3185-3191 (2009).
- Knox, J. H., Laird, G. R., Raven, P. A. Interaction of radial and axial dispersion in liquid chromatography in relation to the "infinite diameter effect". J. Chromatogr. A. 122 (0), 129-145 (1976).
- Miyabe, K., Guiochon, G. Estimation of the column radial heterogeneity from an analysis of the characteristics of tailing peaks in linear chromatography. J. Chromatogr. A. 830 (1), 29-39 (1999).
- Shalliker, R. A., Scott Broyles, B., Guiochon, G. Axial and radial diffusion coefficients in a liquid chromatography column and bed heterogeneity. J. Chromatogr. A. 994 (1-2), 1-12 (2003).
- Gritti, F., Guiochon, G. Effects of the thermal heterogeneity of the column on chromatographic results. J. Chromatogr. A. 1131 (1-2), 151-165 (2006).
- Shalliker, R. A., Wong, V., Broyles, B. S., Guiochon, G. Visualization of bed compression in an axial compression liquid chromatography column. J. Chromatogr. A. 977 (2), 213-223 (2002).
- Tallarek, U., Albert, K., Bayer, E., Guiochon, G. Measurement of transverse and axial apparent dispersion coefficients in packed beds. AICHE J. 42 (11), 3041-3054 (1996).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. Active flow management in preparative chromatographic separations: A preliminary investigation into enhanced separation using a curtain flow inlet fitting and segmented flow outlet. J. Sep. Sci. 35 (3), 410-415 (2012).
- Shalliker, R. A., Broyles, B. S., Guiochon, G. Physical evidence of two wall effects in liquid chromatography. J. Chromatogr. A. 888 (1-2), 1-12 (2000).
- Shalliker, R. A., Camenzuli, M., Pereira, L., Ritchie, H. J. Parallel segmented flow chromatography columns: Conventional analytical scale column formats presenting as a 'virtual' narrow bore column. J. Chromatogr. A. 1262 (0), 64-69 (2012).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. The design of a new concept chromatography column. Analyst. 136 (24), 5127-5130 (2011).
- Foley, D., et al. Precision and Reliability: an Intercontinental Study of Curtain Flow Chromatography. Thermo Scientific. , (2013).
- Pravadali-Cekic, S. Multidimensional Approaches for the Analysis of Complex Samples using HPLC. University of Western Sydney. , PhD thesis (2014).
- Soliven, A., et al. Improving the performance of narrow-bore HPLC columns using active flow technology. Microchem. J. 116 (0), 230-234 (2014).
- Foley, D., et al. Curtain flow chromatography ('the infinite diameter column') with automated injection and high sample through-put: The results of an inter-laboratory study. Microchem. J. 110 (0), 127-132 (2013).
