בידוד של Exosomes מהפלזמה של HIV-1 אנשים חיוביים
Summary
Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.
Abstract
Exosomes הוא שלפוחית קטנה החל בגודל 30 ננומטר ל -100 ננומטר שפורסמו constitutively והן על גירוי ממגוון רחב של סוגי תאים. הם נמצאים במספר הנוזלים ביולוגיים וידועים לבצע מגוון רחב של חלבונים, שומנים, ומולקולות של חומצות גרעין. חשב במקור להיות קצת יותר ממאגרים לסלולריים פסולת, את התפקידים של exosomes ויסות תהליכים ביולוגיים ובמחלות מוערכות יותר ויותר.
כמה שיטות שתוארו לבידוד exosomes מתקשורת והתרבות התאית ונוזלים ביולוגיים. בשל גודלם הקטן וצפיפות נמוכה, ultracentrifugation ההפרש ו / או אולטרה הן הטכניקות הנפוצות ביותר לבידוד exosome. עם זאת, פלזמה של HIV-1 אנשים נגועים מכילה שני exosomes וחלקיקים נגיפיים HIV, אשר דומה בגודל ובצפיפות. כך, הפרדה יעילה של exosomes מחלקיקים נגיפיים HIV בפלזמה אנושית הייתהאתגר.
כדי לטפל במגבלה זו, פיתחנו הליך שונה מCantin et. al., 2008 לטיהור exosomes מחלקיקי HIV בפלזמה אנושית. מילויים מהירות iodixanol שמשו להפרדת exosomes מHIV-1 חלקיקים בפלזמה של HIV-1 אנשים חיוביים. חלקיקי נגיף זוהו על ידי p24 ELISA. Exosomes זוהו על בסיס acetylcholinesterase סמני exosome (AChE), ואנטיגנים CD9, CD63, CD45 ו. הליך השיפוע שלנו הניב הכנות exosome חופשיות של חלקיקי נגיף. הטיהור היעילה של exosomes מפלסמה אנושית אפשרה לנו לבחון את התוכן של exosomes המופק מפלזמה ולחקור את הפוטנציאל שלהם חיסוני modulatory ופונקציות ביולוגיות אחרות.
Introduction
מגיפת HIV-1 ממשיכה להשפיע באופן משמעותי בכל העולם. נכון לשנת 2013, כ -35 מיליון אנשים ברחבי העולם חיים עם HIV, ו -2.1 מיליון מהם היו אנשים נגועים חדש 1. אסטרטגיות מניעה וגישה משופרת לטיפול התרופתי היו מועילות בהפחתת הרכישה הכוללת של HIV. עם זאת, אוכלוסיות בודדות עדיין חווים עליות ברכישת 1 HIV. לפיכך, יש צורך במאמצים המשיכו לטפל במגיפה זו.
אחד המנבאים החזקים ביותר להתקדמות המחלה HIV הוא הפעלה חיסונית כרונית (CIA) 2-10. שהוגדר על ידי רמות גבוהות של ציטוקינים בהתמדה לזיהוי סמני ביטוי גבוהים על פני השטח של לימפוציטים מסוג T, ה- CIA יוחס ל: i) ייצור תאים דנדריטים רציף של סוג אני IFN 11; (Ii) הפעלה חיסונית ישירה מונעת על ידי חלבוני HIV טאט, Nef וgp120 12; (Iiiטרנסלוקציה) של חלבונים חיידקיים בתאי מערכת חיסון במעיים הקשורים 6. עם זאת, המנגנון המדויק (ים) כרוני, הפעלה חיסונית מערכתית בהידבקות ב- HIV להישאר להיות הובהר במלואו.
קבוצת המחקר שלנו ואחרים הוכיחו תפקיד של exosomes בפתוגנזה של HIV 15-18. הקבוצה שלנו קבעה כי חלבון Nef מופרש מהתאים נגועים בexosomes 15, וexosomal Nef (exNef) נמצא בפלזמה של אנשים שנדבקו ב- HIV ברמות ננוגרם 18. הראינו עובר אורח שCD4 + T-תאים שנחשפו לexNef הסתיימו במוות תא מושרה הפעלה תלויה במסלול CXCR4 19, 20. לחלופין, מונוציטים / מקרופאגים היו עקשן לאפופטוזיס המושרה exNef, אבל הצגתי פונקציות סלולריות שינו וביטוי ציטוקינים. exosomes לאחרונה, הקבוצה שלנו הראתה מבודד מהפלזמה של אנשים שנדבקו ב- HIV מכיל מגוון של ציטוקינים פרו-דלקתיים. פוrther, תאי mononuclear נאיביים דם היקפי נחשפו לexosomes המופק מפלזמה מחולים נגועים באיידס נגרמים ביטוי של CD38 על תאי זיכרון נאיבי ומרכזי מסוג CD4 + CD8 + T ו. זה סביר תורם לדלקת מערכתית והתפשטות נגיפית באמצעות תא עובר אורח הפעלה 21, ומצביע על כך שexosomes לשחק תפקיד משמעותי בפתוגנזה HIV.
בחקירת תפקידו של exosomes בפתוגנזה HIV, אתגר אחד הוא פיתוח טכניקות לexosomes יעילות נפרדת מחלקיקי HIV תוך שמירה על תוכן exosomal כמו גם יכולת modulatory התפקודית החיסונית. כמה שיטות שתוארו לבידוד exosomes מתרבית תאים ונוזלים ביולוגיים 22,23. בגלל גודלם הקטן והצפיפות נמוכה (exosomes לצוף בצפיפות של 1.15-1.19 g / מיליליטר), ultracentrifugation ההפרש ו / או אולטרה הן הטכניקות הנפוצות ביותר לבידוד exosome 23.עם זאת, supernatants תרבית תאים נגוע ב- HIV והפלזמה של החולים מכילים את שני exosomes וHIV-1 חלקיקים נגיפיים. Exosomes וHIV-1 חלקיקים דומים מאוד בגודל וצפיפות. לחלופין, לנצל את הביטוי של סמני exosomal ייחודיים כגון CD63, CD45, CD81 ו, exosomes היה מבודד בשיטות לכידה immunoaffinity 23. הליך זה יכול להפריד בין וירוס מexosomes. עם זאת, החסרון של שיטה זו הוא הקובץ המצורף ההדוק של נוגדנים לexosomes המטוהר, אשר יכול להפריע להערכת הפוטנציאל של המערכת החיסונית exosomes בתרבות.
כדי לטפל במגבלות אלה, פיתחנו הליך טיהור exosomes מחלקיקי HIV בפלזמה אנושית שונה מCantin ועמיתים לעבודה באמצעות 22 הדרגתיים מהירות iodixanol. Exosomes נמצא להפריד בצפיפות נמוכה / שברים העליונים של מילויים iodixanol, ואילו חלקיקי נגיף הפרדה בגבוהצפיפות / שברים נמוכים יותר. חלקיקי נגיף זוהו על ידי p24 ELISA וexosomes זוהו באמצעות סמני exosome AChE, CD9, CD63, CD45 ו. שברים בצפיפות נמוכה העליונים נאספו הכילו exosomes שהיו שליליים לזיהום p24 HIV-1. הטיהור וההפרדה היעילה של exosomes מחלקיקי HIV בפלזמה אנושית מאפשרת בדיקה מדויקת של התוכן של exosomes נגזר מפלסמה אנושית, כמו גם החקירה של פוטנציאל modulatory החיסון שלהם וערך האבחון ופרוגנוסטיים של exosomes בפתוגנזה של HIV-1.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפעלה כרונית חיסונית (CIA) ודלדול של תאי CD4 + שני סימני ההיכר חשובים של זיהום HIV-1. הם הוקמו כמנבאים לפתוגנזה, עם ה- CIA להיות המנבא הטוב ביותר. עם זאת, מנגנוני נהיגה הפעלה כרונית מערכתית חיסונית וירידה של תאי CD4 + עדיין לא הובהרו במלואו. אנחנו ומעבדות אחרות פיתחנו ראיות מוצקו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the following people: Jane Chu, Cameron Tran, James Lillard, Mafuz Khan, Masebonang Albert, Ken Rogers, and Syed A. Ali. Kateena Addae-Konadu was supported by UNCF/Merck Graduate Research Fellowship, American Medical Association Foundation, CRECD Grant 8R25MD007589-10, and NIH NIGMS MBRS Grant R25 GM058268. This work was supported by NIMHD grants 8G12MD007602, and 8U54MD007588, NIAID grant 1R21AI095150-01A1, Georgia Research Alliance grant GRA.VAC08.W, and Emory CFAR grant P30 A1050409.
Materials
| BD Vacutainer EDTA tubes (10ml) | Becton Dickinson | 368589 | pink top tubes |
| Lymphoprep Ficoll reagent | Cosmo Bio | AXS-1114545 | |
| Optiprep iodixanol reagent | Sigma | D1556 | |
| 14ml ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 344060 | ultraclear tubes |
| Gradient Former Model 485 | BIO-RAD | 165-4120 | |
| Acetylthiocholine iodide | Sigma | 1480 | |
| Benzoic Acid | Sigma | D8130 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Acetyl Cholinesterase | Sigma | C3389 | |
| 96-well clear microtiter plate | Medical Supply Partners | TR5003 | |
| SpectraMax 190 microplate reader | Molecular Devices | 190 | Fluorescent plate reader |
| Criterion Gel Electrophoresis Cell | BIO-RAD | 165-6001 | |
| Transblot Gel | BIO-RAD | 170-3910 | |
| Transfer Cell | |||
| Tris-HCl Criterion precast gels | BIO-RAD | 567-1093 | |
| Anti-CD45 antibody | Abcam | Ab10558 | |
| CD63 Antibody (H-193) | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-15363 | |
| CD9 Antibody (H-110) | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-9148 | |
| Rabbit pAb p24 HIV-1 | ImmunoDX, LLC | 1303 | |
| Nitrocellulose membrane | BIO-RAD | G1472430 | |
| Tris Buffered Saline | BIO-RAD | 170-6435 | |
| HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Scientific | 31460 | Goat-Anti-Rabbit |
| HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Scientific | 31430 | Goat-Anti-Mouse |
| Western Blotting Luminol Reagent | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-2048 | |
| GE LAS-4010 Imager | GE Healthcare | LAS-4010 | |
| Human Procarta Cytokine Immunoassay Kit | Affymetrix | N/A | Custom immunoassay panel |
| Bio-Plex 200 Immunobead Reader | BIO-RAD | 171-000201 | |
| Coulter Z2 Particle Counter | Beckman Coulter | 383552 | Cell counter |
| Alexa Fluor 700-labeled anti-CD3 | BD Bioscience (UCHT1) | 300424 | |
| APC/Cy7-labeled anti-CD4 | Biolegend (OKT4) | 317418 | |
| PerCP-labeled anti-CD4 | BD Bioscience (RPA-T8) | 550631 | |
| V450-labeled anti-CD8 | BD Bioscience (RPA-T8) | 560347 | |
| Biotin-labeled anti-CD45RA | BD Bioscience (HI100) | 555487 | |
| PE/Cy7-labeled anti-CD62L | Biolegend (DREG-56) | 304822 | |
| PE/Cy5-labeled anti-CD38 | Biolegend (HIT2) | 303508 | |
| APC/Cy7-labeled anti-HLADR | Biolegend (L243) | 307618 | |
| PE-Texas Red-labeled anti-streptavidin | BD Bioscience | 551487 | |
| PE/Cy5-labeled mouse IgG1K | Biolegend (MOPC-21) | 400116 | |
| APC/Cy7-labeled mouse IgG2aK | Biolegend (MOPC-173) | 400229 |
References
- Joint United Nations Programme on HIV/AIDS(UNAIDS). . UNAIDS Report on the Global AIDS Epidemic. , (2013).
- Levacher, M., Hulstaert, F., Tallet, S., Ullery, S., Pocidalo, J. J., Bach, B. A. The significance of activation markers on CD8 lymphocytes in human immunodeficiency syndrome: staging and prognostic value. Clin Exp Immun. 90, 376-382 (1992).
- Giorgi, J. V., Liu, Z., Hultin, L. E., Cumberland, W. G., Hennessey, K., Detels, R. Elevated levels of CD38+ CD8+ T cells in HIV infection add to the prognostic value of low CD4+ T cell levels: results of 6 years of follow-up. The Los Angeles Center, Multicenter AIDS Cohort Study. J Acq Immun Def Synd. 6, 904-912 (1993).
- Bofill, M., et al. Increased numbers of primed activated CD8+CD38+CD45RO+ T cells predict the decline of CD4+ T cells in HIV-1-infected patients. AIDS. 10, 827-834 (1996).
- Liu, Z., Cumberland, W. G., Hultin, L. E., Prince, H. E., Detels, R., Giorgi, J. V. Elevated CD38 antigen expression on CD8+ T cells is a stronger marker for the risk of chronic HIV disease progression to AIDS and death in the Multicenter AIDS Cohort Study than CD4+ cell count, soluble immune activation markers, or combinations of HLA-DR and CD38 expression. J Acq Immun Def Synd. 16, 83-92 (1997).
- Douek, D. C., Roederer, M., Koup, R. A. Emerging concepts in the immunopathogenesis of AIDS. Annu Rev Med. 60, 471-484 (2009).
- Roberts, L., et al. Plasma cytokine levels during acute HIV-1 infection predict HIV disease progression. AIDS. 24, 819-831 (2010).
- Mueller, Y. M., et al. Interleukin-15 increases effector memory CD8+ T cells and NK Cells in simian immunodeficiency virus-infected macaques. J Virol. 79, 4877-4885 (2005).
- Picker, L. J., et al. IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates. J Clin Invest. 116, 1514-1524 (2006).
- Mueller, Y. M., et al. IL-15 treatment during acute simian immunodeficiency virus (SIV) infection increases viral set point and accelerates disease progression despite the induction of stronger SIV-specific CD8+ T cell responses. J Immunol. 180, 350-360 (2008).
- O’Brien, M., Manches, O., Bhardwaj, N. Plasmacytoid dendritic cells in HIV infection. Adv Exp Med Biol. 762, 71-107 (2013).
- Chihara, T., et al. HIV-1 proteins preferentially activate anti-inflammatory M2-type macrophages. J Immunol. 188, 3620-3627 (2012).
- Johnstone, R. M., Adam, M., Hammond, J. R., Orr, L., Turbide, C. Vesicle formation during reticulocyte maturation. J Bio Chem. 262, 9412-9420 (1987).
- Meckes Jr, D. G., Raab-Traub, N. Microvesicles and viral infection. J. Virol. 85, 12844-12854 (2011).
- Campbell, T. D., Khan, M., Huang, M. B., Bond, V. C., Powell, M. D. HIV-1 Nef protein is secreted into vesicles that can fuse with target cells and virions. Ethn. Dis. 18 (2 Suppl 2), S2-S9 (2008).
- Muratori, C., et al. Massive Secretion by T Cells Is Caused by HIV Nef in Infected Cells and by Nef Transfer to Bystander Cells. Cell Host. Microbe. 6, 218-230 (2009).
- Lenassi, M., et al. HIV Nef is Secreted in Exosomes and Triggers Apoptosis in Bystander CD4 T Cells. Traffic. 11, 110-122 (2009).
- Raymond, A. D., et al. HIV Type 1 Nef Is Released from Infected Cells in CD45+ Microvesicles and Is Present in the Plasma of HIV-Infected Individuals. AIDS Res Hum Retrovir. 27, 167-178 (2011).
- James, C. O., Huang, M. B., Khan, M., Garcia-Barrio, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Extracellular Nef Protein Targets CD4+ T Cells for Apoptosis by Interacting with CXCR4 Surface Receptors. Journal of Virology. 78, 3099-3109 (2004).
- Huang, M. B., Jin, L. L., James, C. O., Khan, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Characterization of Nef-CXCR4 Interactions Important for Apoptosis Induction. Journal of Virology. 78, 11084-11096 (2004).
- Konadu, K. A., et al. Association of cytokines with exosomes in the plasma of HIV-1-seropositive individuals. Journal of Infectious Diseases. , (2014).
- Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. Discrimination between exosomes and HIV-1: purification of both vesicles from cell-free supernatants. J Immunol Methods. 338, 21-30 (2008).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracellular Vesicles. 2, 20360 (2013).
- Lässer, C., Eldh, M., Lötvall, J. Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes. J. Vis. Exp. (59), e3037 (2012).
- McDonald, M. K., Capasso, K. E., Ajit, S. K. Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media. J. Vis. Exp. (76), e50294 (2013).
- Kanchi Ravi, R., Khosroheidari, M., DiStefano, J. K. A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes. J. Vis. Exp. (95), e51158 (2015).
- Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. J Extracell Vesicles. 3, 26913 (2014).
