Abstract
Los exosomas son pequeñas vesículas que van en tamaño desde 30 nm a 100 nm que se liberan tanto de manera constitutiva y a la estimulación de una variedad de tipos de células. Se encuentran en un número de fluidos biológicos y son conocidos por llevar una variedad de proteínas, lípidos y moléculas de ácido nucleico. Originalmente pensado para ser poco más que depósitos para desechos celulares, los roles de los exosomas que regulan los procesos biológicos y en enfermedades son cada vez más apreciados.
Varios métodos han sido descritos para el aislamiento de exosomas de medios de cultivo celular y los fluidos biológicos. Debido a su pequeño tamaño y baja densidad, ultracentrifugación diferencial y / o ultrafiltración son las técnicas más comúnmente utilizadas para el aislamiento exosome. Sin embargo, el plasma del VIH-1 en individuos infectados contiene tanto exosomas y las partículas virales del VIH, que son similares en tamaño y densidad. Por lo tanto, la separación eficiente de los exosomas de partículas virales de VIH en plasma humano ha sidoun desafío.
Para hacer frente a esta limitación, hemos desarrollado un procedimiento modificado de Cantin et. al., 2008 para la purificación de exosomas de partículas de VIH en el plasma humano. Iodixanol gradientes de velocidad se utilizaron para separar los exosomas del VIH-1 partículas en el plasma de VIH-1 en individuos positivos. Las partículas de virus fueron identificados por ELISA p24. Los exosomas se identificaron sobre la base de marcadores de exosoma de la acetilcolinesterasa (AChE), y los antígenos CD9, CD63, CD45 y. Nuestro procedimiento de gradiente produjo preparaciones exosome libres de partículas de virus. La purificación eficiente de los exosomas del plasma humano nos permitió examinar el contenido de los exosomas derivados de plasma y para investigar su potencial modulador inmune y otras funciones biológicas.
Introduction
El VIH-1 epidemia sigue teniendo un impacto significativo en todo el mundo. A partir de 2013, aproximadamente 35 millones de personas en el mundo vivían con el VIH, y 2,1 millones de ellos eran personas recién infectadas 1. Las estrategias de prevención y un mayor acceso a la terapia antirretroviral han sido de gran ayuda en la reducción de la adquisición global de VIH. Sin embargo, las poblaciones individuales siguen experimentando alzas en la adquisición del VIH 1. Por lo tanto, existe la necesidad de seguir trabajando para hacer frente a esta epidemia.
Uno de los más fuertes predictores de la progresión de la enfermedad del VIH es la activación inmune crónica (CIA) 2-10. Definido por niveles persistentemente elevados de citocinas y marcadores detectables elevada expresión en la superficie de los linfocitos T, la CIA se ha atribuido a: i) la producción de células dendríticas continua de IFN de tipo I 11; (ii) la activación inmune directa impulsado por las proteínas del VIH Tat, Nef y gp120 12; (iii) Translocación de proteínas bacterianas en el intestino asociado células inmunes 6. Sin embargo, el mecanismo exacto (s) crónica subyacente, la activación inmune sistémica en la infección por el VIH aún no se han esclarecido completamente.
Nuestro grupo de investigación y otros han demostrado un papel de exosomas en la patogénesis del VIH de 15-18. Nuestro grupo ha determinado que la proteína Nef se excreta de las células infectadas en exosomas 15 y exosomal Nef (exNef) está presente en el plasma de individuos infectados por el VIH a niveles de nanogramos 18. Hemos demostrado que transeúnte células T CD4 + expuestos a exNef dieron lugar a la activación inducida por la muerte celular dependiente de la vía de CXCR4 19, 20. Alternativamente, los monocitos / macrófagos fueron refractarios a la apoptosis inducida por exNef, pero exhibido funciones celulares alteradas y la expresión de citoquinas. Exosomas Recientemente, nuestro grupo ha demostrado aisladas del plasma de personas infectadas con el VIH contienen una variedad de citoquinas pro-inflamatorias. Further, las células mononucleares de sangre periférica tratados previamente expuestos a exosomas derivados del plasma de pacientes infectados por el VIH inducidas expresión de CD38 en las células de memoria naïve y el centro de T CD4 + y CD8 +. Esto probablemente contribuye a la inflamación sistémica y la propagación viral través de la activación celular espectadora 21, y sugiere que los exosomas juegan un papel importante en la patogénesis del VIH.
Al investigar el papel de los exosomas en la patogénesis del VIH, un desafío está desarrollando técnicas para exosomas eficazmente separados de partículas de VIH manteniendo al mismo tiempo el contenido exosomal así como su capacidad inmunomoduladora funcional. Varios métodos han sido descritos para el aislamiento de exosomas del cultivo de células y fluidos biológicos 22,23. Debido a su pequeño tamaño y baja densidad (exosomas flotan a una densidad de 1,15 - 1,19 g / ml), ultracentrifugación diferencial y / o ultrafiltración son las técnicas más comúnmente utilizadas para el aislamiento exosome 23.Sin embargo, con infección por VIH sobrenadantes de cultivo celular y el plasma de los pacientes contienen tanto exosomas y el VIH-1 partículas virales. Los exosomas y el VIH-1 partículas son muy similares en tamaño y densidad. Alternativamente, aprovechando la expresión de marcadores exosomal únicas, tales como CD63, CD45, CD81 y, exosomas han sido aislados utilizando métodos de captura de inmunoafinidad 23. Este procedimiento puede separar virus de exosomas. Sin embargo, el inconveniente de esta técnica es la unión apretada de anticuerpos frente a los exosomas purificados, lo que podría interferir con la evaluación del potencial inmunomodulador de los exosomas en cultivo.
Para hacer frente a estas limitaciones, hemos desarrollado un procedimiento para la purificación de exosomas de partículas de VIH en el plasma humano modificados de Cantin y compañeros de trabajo 22 utilizando gradientes de velocidad Iodixanol. Fueron encontrados exosomas para segregar en el de baja densidad / fracciones superiores del gradiente iodixanol, mientras que las partículas de virus segregados en el altofracciones de densidad / inferiores. Las partículas de virus fueron identificados por ELISA p24 y exosomas se identificaron utilizando marcadores exosome AChE, CD9, CD63, CD45 y. Las fracciones de baja densidad superiores recogidos contenían exosomas que fueron negativas para la contaminación del VIH-1 p24. La purificación eficiente y la separación de exosomas de partículas de VIH en plasma humano permite examen preciso del contenido de exosomas derivados de plasma humano, así como la investigación de su potencial inmunomodulador y el valor diagnóstico y pronóstico de exosomas en el VIH-1 patogénesis.
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Protocol
Un esquema general del procedimiento de aislamiento exosoma y purificación se proporciona en la Figura 1. Toda la sangre se obtiene de donantes voluntarios sanos y de personas con VIH que no reciben theraoy antirretroviral asistir a la Clínica de la Esperanza, de la Universidad de Emory y el Programa de Enfermedades Infecciosas del Sistema de Salud Grady en Atlanta, Georgia. Este estudio fue aprobado por las juntas de revisión institucional de la Universidad de Emory y la Escuela de Medicina Morehouse. Todas las personas que participan en el estudio dieron por escrito y el consentimiento informado.
1. Preparación de exosomas del plasma sanguíneo
- Extracción de sangre humana y Procesamiento
- Recoger 10 ml de sangre periférica por punción venosa en tubos de recogida de sangre EDTA (que contienen 18 mg de potasio EDTA), e invertir suavemente cinco veces para mezclar.
- Centrifugar los tubos de recogida de sangre a 1.000 xg durante 20 min a TA para sedimentar las células sanguíneas. Utilice una pipeta estérilte para transferir la fracción de plasma (4-5 ml) a un tubo cónico de 25 ml. Diluir el plasma con 10 ml de 1 X PBS. Deseche las células sanguíneas (glóbulos rojos y glóbulos blancos, también conocidos como PBMC) en un recipiente debidamente marcado para los residuos de riesgo biológico.
NOTA: En el caso de las muestras de sangre de donantes infectados, las CMSP se puede reservar para uso posterior (ver procedimiento IV.2, a continuación). - Almacene las muestras de plasma a 4 ° C para el corto plazo (2-3 días) o a -80 ° C para el almacenamiento a largo plazo.
NOTA: Llevar las muestras de plasma congelado a 4 ° C antes de su procesamiento posterior.
- Preparación de la Fracción de Plasma exosome
- Plasma Centrifugar a 10.000 xg durante 30 min a 4 ° C para eliminar los desechos celulares. Utilizar una pipeta serológica estéril para transferir el sobrenadante de plasma depurado a un tubo de ultracentrífuga de 25 ml limpio. Deseche la pastilla en el contenedor de riesgo biológico.
- Centrifugar el plasma depurado a 100.000 xg durante 2hora a 4 ° C para eliminar grandes vesículas. Eliminar el sobrenadante 100.000 xg cuidadosamente con la pipeta, y desechar los residuos de riesgo biológico. Resuspender el precipitado 100.000 xg en 1 ml de PBS 1X en un tubo limpio y se incuba a TA durante 30 min, agitando suavemente para desalojar y partículas separadas.
- Lavar el pellet 100.000 xg exosome / virus en suspensión mediante la adición de 25 ml de PBS. Invierta suavemente el tubo cinco veces para mezclar y centrifugar de nuevo a 100.000 xg durante 2 horas a 4 ° C. Deseche la solución de lavado PBS en el envase para peligros biológicos.
- Resuspender el precipitado 100.000 xg en 1 ml de 1 X PBS y se incuba a TA durante 30 min agitando suavemente para desalojar y disolver el precipitado.
NOTA: Si no es posible proceder directamente a la etapa gradiente de iodixanol, almacenar el sedimento, que contiene los exosomas y partículas de virus, a 4 ° C durante 1-2 días hasta la etapa de gradiente de iodixanol.
2. Purificación de exosomas
- Generar 6% -18% velocgradientes dad de iodixanol utilizando un gradiente antiguo aparato de doble cámara.
- Preparar 6% y 18% soluciones del reactivo de iodixanol y suministrados como una solución al 60% en agua, por dilución en PBS. Pipetear 5,5 ml de la solución de 18% en la cámara de agitación, y pipeta de 5,5 ml de la solución de 6% en la cámara de depósito. Encienda el agitador, abra la llave de paso, y permitir que cada gradiente fluya hacia un tubo de ultracentrífuga 14 ml.
NOTA: Cualquiera de utilizar inmediatamente o almacenar gradientes preparados O / N a 4 ° C antes de su uso. - Capa cuidadosamente 1 ml de la solución exosoma / virus en la parte superior de cada gradiente de 11 ml. Gradientes centrifugar a 250.000 g durante 2 horas a 4 ° C, usando un rotor basculante SW40Ti.
- Etiqueta de doce (12) de 1,5 ml tubos de microcentrífuga. Retirar 1,0 ml de la parte superior del gradiente y transferir al tubo # 1. Transfiera las restantes fracciones de 1 ml a tubos de 2-12 en orden secuencial.
NOTA: La fracción más alta será, pues, # 1, la fracción de fondo, # 12. Stmineral las fracciones del gradiente a 4 ° C. Los exosomas purificados, que debe ser en las fracciones 1-3 en la parte superior de la pendiente, son estables durante 3-4 semanas cuando se almacena a 4 ° C.
- Preparar 6% y 18% soluciones del reactivo de iodixanol y suministrados como una solución al 60% en agua, por dilución en PBS. Pipetear 5,5 ml de la solución de 18% en la cámara de agitación, y pipeta de 5,5 ml de la solución de 6% en la cámara de depósito. Encienda el agitador, abra la llave de paso, y permitir que cada gradiente fluya hacia un tubo de ultracentrífuga 14 ml.
3. exosome Caracterización
- La acetilcolinesterasa (AChE) ensayo de actividad
- Preparar 100 mM sustrato social mezclando acetiltiocolina yoduro de 28,9 mg en 1 ml de PBS 1X. Tienda sustrato social a -20 ° C hasta 1 mes.
- Preparar indicador de color 10 mM de stock mediante la mezcla de 39.6mg ácido benzoico y bicarbonato de sodio 15 mg en 10 ml de 1X PBS. Tienda indicador de color stock a 4 ° C hasta dos semanas.
- Preparar reactivo de ensayo mezclando 1X PBS, sustrato, y indicador de color en una proporción de 100: 2: 5 (por ejemplo, 10 ml de 1X PBS + 200 l de sustrato indicador de color + 500 l).
- Transferencia de 50 l de cada tubo de fracción de gradiente de 1,5 ml (con la etiqueta 1-12 de procedimiento III.3) a los pocillos de una microtite de 96 pocillosplaca r. Preparar pocillos duplicados para cada muestra de degradado.
- Preparar un conjunto de normas, haciendo primero una mU / ml AChE Stock 2000 en PBS. Hacer once (11) 2 veces diluciones seriadas de esta población y añadir 50 l de cada dilución a un solo pocillo de una placa de microtitulación, de modo que estándar # 1 = 2.000 mU / ml, # 2 = 1.000 mU / ml, # 3 = 500 mU / ml, etc. hasta # 12 = 0,98 mU / ml. Los doce normas AchE serán por lo tanto ocupar una sola fila de una placa de ensayo de 96 pocillos.
- Añadir 200 l de mezcla de reactivo de ensayo a cada pocillo e incubar 20 min (en la oscuridad) a temperatura ambiente para permitir el desarrollo del producto de reacción coloreado. Medir la actividad de AChE en una longitud de onda de 450 nm usando un lector de microplacas fluorescente.
NOTA: El porcentaje de material que queda después de la purificación exosome de partida se evaluó mediante el ensayo de AchE del plasma no fraccionada.
- El análisis por inmunotransferencia
- Proteínas separadas en fracciones de gradiente 1-12 (desde irá al barrioure 2.1.3) por SDS-PAGE al 4-20% en Tris-HCl geles prefabricados en 100V x 1 hr. Transferencia de las proteínas en el gel a una membrana de nitrocelulosa utilizando una célula de transferencia electro-secante de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Permita que las transferencias de borrar de 12 a 16 horas (O / N) a 350V.
- Retire la membrana desde el aparato de transferencia y lavar en Tris-solución salina tamponada (TBS) durante 5 min. Bloque con 5% de leche sin grasa en TTBS (TBS con 0,1% de Tween 20) durante 1 hora agitando a TA.
- Incubar la membrana con anticuerpos primarios específicos para exosomas (CD9, CD45, CD63) o el VIH-1 proteína de la cápside (p24) en 5% de leche sin grasa con agitación a 4 ° C durante 12 a 16 hr (O / N). Las diluciones de anticuerpos primarios para inmunotransferencias van desde 1: 2000 -1: 5000.
- Lavar la mancha en TTBS durante 20 min, seguido de incubación con una dilución 1: 2000 de peroxidasa de rábano (HRP) conjugado con anti-IgG (anticuerpo secundario), en 5% de leche descremada durante 1 hora a RT. Lave la mancha 3 veces con TTBS, 10 min por lavado.
- Guarde las imágenes como archivos TIFF que se pueden ver en Adobe Photoshop. Realizar análisis de densitometría de las bandas que utilizan el software ImageJ (Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD).
- Ensayo de citoquinas
- Antes de la ensayo de citoquinas, interrumpir complejos inmunes que suelen estar presentes en el plasma humano por la disociación de ácido y lisar los exosomas por tratamiento con detergente. Ensayo de ambas muestras de plasma de partida y las preparaciones purificadas de exosoma.
- A 100 l de plasma humano añadir 100 l 0,33 N HCL y se incuba a 37 ° C durante 1 hr. Añadir 100 l 0.33 N NaOH para neutralizar plasma tratado con ácido. Añadir Triton X-100 para muestras tanto del plasma neutralizado y exosome purificada, a una ficoncentración final de 1%, para causar la lisis de los exosomas.
- Para este ensayo (un procedimiento basado en perlas fluorescentes), utilizan perlas magnéticas pre-recubiertas con anticuerpos por parte del fabricante. Utilice un panel de diseño personalizado de perlas recubiertas de anticuerpos de citoquinas anti-humanos; listado en la Tabla 1. Vortex las perlas magnéticas recubiertas con anticuerpo del kit de ensayo de citoquinas durante 30 segundos y añadir 50 l perlas a cada pocillo de una placa de 96 pocillos para ser utilizado en el ensayo.
- Preparar una serie de diluciones de los estándares en tampón estándar de plasma (ambos contenidos en el kit de ensayo de citoquinas) como se describe en el manual de instrucciones del kit de ensayo de citoquina, para generar una curva estándar de 8 puntos.
- Añadir 150 ml de tampón de lavado 1X (del kit) a cada pocillo y lavar las perlas usando una arandela de perla magnética, como se describe en el manual. Añadir 25 l de tampón de ensayo de plasma (del kit) a cada pocillo. Añadir 25 l de estándares y muestras a todos los pocillos usados en el ensayo. Añadir 25 l de plasmatampón de muestra a los pocillos de control negativo. Selle y agitar la placa a 700 rpm durante 60 minutos a temperatura ambiente y se incuba O / N a 4 ° C.
- Añadir 150 ml de tampón de lavado 1X a cada pocillo y lavar la placa (como en el paso 3.3.4, más arriba). Añadir 25 l de anticuerpos de detección en cada pozo, sellado y agitar la placa a 700 rpm durante 30 minutos a temperatura ambiente. Repita el paso de lavado.
- Añadir 50 l de solución de estreptavidina (SAPE, desde kit) en cada pocillo, sellado y agitar placa a 700 rpm durante 30 min a TA. Lavados de placa de repetición como en 3.3.4.
- Añadir 120 l de tampón de lectura (del kit) en cada pocillo y agitar en un agitador de laboratorio de sobremesa a 700 rpm durante 5 min a temperatura ambiente para permitir que la señal fluorescente se desarrolle. Leer la placa en el lector de placas según las instrucciones del fabricante.
- Con el fin de dar cuenta de la cantidad de exosomas perdidos durante el procedimiento de aislamiento, utilizar la siguiente ecuación: [(volumen original de lectura / plasma) x 66,6 = lectura de citoquinas ajustado].
- Antes de la ensayo de citoquinas, interrumpir complejos inmunes que suelen estar presentes en el plasma humano por la disociación de ácido y lisar los exosomas por tratamiento con detergente. Ensayo de ambas muestras de plasma de partida y las preparaciones purificadas de exosoma.
4. Ensayo de potencial inmunomodulador
- Preparación del medio de cultivo con la empobrecida en exosome suero bovino fetal
- Centrífuga de 500 ml de suero bovino fetal (FBS) a 100.000 xg durante 20 horas a 4 ° C para sedimentar contaminar exosomas y microvesículas. Retire con cuidado y guarde el FBS sobrenadante exosoma empobrecido. Deseche el sedimento en los residuos de riesgo biológico.
- Combinar 20% de FBS el sobrenadante exosome-agotado con 500 ml de Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) medio. Se filtra el medio a través de un filtro de membrana de 0,45 micras.
- Añadir estreptomicina (100 U / ml), penicilina (100 U / ml), L-glutamina (2 mM), solución salina tamponada con HEPES (10 mM), e IL-2 (20 U / ml) al medio de filtrado.
- Cultivo de células y exosome exposición
- Expose exosomas a las células mononucleares de sangre periférica de donantes (PBMC) obtenidas a partir de voluntarios sanos clínica. Suspender PBMC enpreparado medio de cultivo y contar las células usando un contador de células / partículas (según el método estándar del fabricante).
NOTA: El PBMC se obtienen durante la preparación de plasma se ha descrito anteriormente (paso 1.2). - El uso de medio preparado a partir de procedimiento 4.1.3, co-cultivo 3,0 x 10 6 (PBMC) con 1 g / ml de exosomas agrupados de tres (3) VIH-1 seropositivos o de tres (3) VIH-1 individuos seronegativos en un total volumen de 1 ml en los pocillos de una placa de cultivo de 12 pocillos (con tapa). Incubar los cultivos durante 48 horas a 37 ° C.
- Preparar cultivos de PBMC no tratados y tratados con Concanavalina culturas A (Con A; 5 mg / ml) para servir como controles negativos y positivos, respectivamente, como se ha descrito anteriormente (4.2.2). Incubar todos los cultivos de PBMC durante 48 horas a 37 ° C.
- Inmediatamente antes de recoger las células, preparar diluciones de los siguientes anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromo: Alexa Fluor 700 marcado con anti-CD3 (dilución 1: 400), allophycocyAnin (APC) / cianina 7 (Cy7) marcado con anti-CD4 (1: 400), proteína peridinina clorofila anti-CD4 (1: 400) marcado complejo, V450-anticuerpo anti-CD8 (1: 400), biotina anticuerpo anti-CD45RA (1: 1000), ficoeritrina (PE) / Cy7 marcado con anti-CD62L (1: 1000), PE / cianina 5 (Cy5) marcado con anti-CD38 (1: 200), PE-de Texas Red- anti-estreptavidina marcada (1: 2000), y el control de isotipo de ratón marcado con Cy5 IgG1k PE / (1: 200).
- Después de que el período de incubación de 48 horas, la cosecha de las CMSP. Wash PBMC en PBS para eliminar los exosomas y teñir las células por incubación durante 1 hora a 4 ° C con anticuerpos marcados con fluorocromos individuales. Analizar el manchado PBMC por citometría de flujo para cuantificar la expresión de quimioquinas (tal como se describe 21).
- Expose exosomas a las células mononucleares de sangre periférica de donantes (PBMC) obtenidas a partir de voluntarios sanos clínica. Suspender PBMC enpreparado medio de cultivo y contar las células usando un contador de células / partículas (según el método estándar del fabricante).
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Representative Results
Los exosomas son purificados eficazmente a partir de VIH-1 en plasma humano positivo. Exosomas aislados, identificados por actividad de la acetilcolinesterasa (AChE), separados en fracciones de menor densidad 1-3 en la parte superior de los gradientes de iodixanol, mientras que las partículas de virus, identificados por el VIH-1 antígeno p24 , segregados en las fracciones de mayor densidad (10-12, cerca de la parte inferior). La presencia de exosomas se confirmó adicionalmente mediante la identificación de marcadores de inmunotransferencia exosome AChE, CD9, CD45, CD63 y, y por microscopía electrónica (Figura 2).
Citoquinas pro-inflamatorias y quimiocinas están asociados con y significativamente elevados en los exosomas de VIH-1 en individuos seropositivos. Exosomas purificados y plasma no fraccionada del VIH-1 infectadas y se analizaron VIH-1 en individuos seronegativos durante 21 citocinas / quimiocinas por ensayo multiplex. Todos los 21 citoquinas / quimioterapiaSe detectaron kines en exosomas aislados de VIH-1 en individuos positivos. Además, sus niveles fueron significativamente elevados en comparación con el plasma y los exosomas del VIH-1 controles seronegativos (Tabla 1).
Expresión CD38 se aumentó en la superficie de las células expuestas a exosomas de VIH-1 en individuos seropositivos. PBMCs de donantes humanos no infectados se expusieron durante 48 hr a exosomas agrupados de VIH-1 seropositivos o seronegativos y se evaluaron para los niveles de la CD38 marcador de activación en CD4 + y células T CD8 + a través de citometría de flujo. Hemos observado que en un 48 horas después de la exposición, la expresión de CD38 en la superficie de ingenuo y el centro de la memoria de células T CD4 + y CD8 + fueron significativamente elevados en las células T expuestas a exosomas del VIH-1 en individuos positivos en comparación con el tratamiento exosoma VIH-negativo y sin tratar los controles (Figura 3).
Figura 1. Representación esquemática de aislamiento exosome del VIH-1 en plasma humano positivo. (A) 10 ml de sangre periférica se recogió de VIH-1 y seropositve individuos seronegativos. (B) los tubos de recogida de sangre EDTA se centrifugaron a 1000 xg durante 20 min a TA. (C) plasma separado se transfirió a tubos cónicos de 50 ml y se diluye con 1x PBS ½ y (D) centrifugó 10.000 xg durante 30 min. (E) El sobrenadante se transfirió a tubos ultracentrifugar y (F) se centrifugó a 10.000 xg durante 2 hr. (G, H) El sobrenadante se descartó y el sedimento exosome re-suspendió y se lavó en 1 ml de 1X PBS. (I) Después de la centrifugación, el sobrenadante fue descartado y el pellet se resuspendieron en 1 ml de PBS 1x y superpuestos en 6-18% gradiente de velocidad iodixanol y (J) se centrifuga a 250.000 xg durante 2 horas. (K) Después de la centrifugación, fracciones de 1 ml de arriba a abajo de la pendiente fueron transferred a tubos de 1,5 ml y se analizaron para el contenido de AChE y análisis de inmunotransferencia. (L) Las fracciones 2 y 3 eran que combinados y se diluyó con 4 ml de PBS 1X y (M) se centrifugó a 400.000 xg durante 2 hr. (N) Después de la centrifugación, el sobrenadante se desechó y el sedimento se resuspendió en 1 ml de PBS 1X para el análisis de los pro-inflamatoria de citoquinas y quimioquinas expresión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Los exosomas se purifican de manera eficiente a partir de plasma humano. Iodixanol individual gradiente de velocidad fracciones de individuos VIH seropositivos o seronegativos fueron sometidos a (A) ensayo enzimático para la acetilcolinesterasa (AChE), y (B) Análisis de transferencia Western para marcadores exosomal CD9, CD45, y CD63 y p24 viral proteína y eran (C) immunolabeled con anti-CD63 y se examinaron con microscopía electrónica para confirmar preparación de exosomas purificados (C). (Figura de Konadu et al, 2014 21, utilizado por permiso). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Ensayo de potencial inmunomodulador. PBMCs de VIH-1 en individuos seronegativos fueron expuestos a cualquiera de los exosomas agrupados de plasma de VIH-1 seropositivos (VIH + Exo) o seronegativo (VIH- Exo) individuos, no se trata, o tratado con 5 mg / ml de Concanavalina A (Con A) como control positivo. Después de 48 horas de exposición, Naïve (CD45RA + / CD62L +), Central (TCM; CD45RA- / CD62L +) y de efectos (TEM; CD45RA- / CD62L-) De memoria CD4 + y Se analizaron las células T CD8 + para la expresión CD38 por citometría de flujo. Concentración exosome se normalizó por proteínas totales y añadió a 1 mg / ml. Las barras de error representan la media +/- SEM de seis donantes independientes. Diferencia entre los grupos se pusieron a prueba para la significación estadística mediante la prueba de ANOVA One Way. * P <0.05, ** p <0,01, *** p <0,001, **** p <0,0001. (Figura de Konadu et al, 2014 21,, utilizado por permiso). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1. Análisis de exosomas purificados y todo el plasma de VIH-1 seropositivos y seronegativos para individuos citoquina pro-inflamatoria y la expresión de quimioquinas. * P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, **** p <0,0001. (Figura de Konadu et al, 2014 21, utilizado por permiso). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La activación crónica inmune (CIA) y la depleción de células T CD4 + son dos características importantes de la infección VIH-1. Ellos se han establecido como predictores de la patogénesis, con la CIA de ser el mejor predictor. Sin embargo, los mecanismos subyacentes que impulsan la activación inmune sistémica crónica y el deterioro de las células T CD4 + todavía no han sido completamente aclarada. Nosotros y otros laboratorios han desarrollado pruebas firmes de que los exosomas secretadas por el VIH-1 en las células infectadas tienen un papel en ambas características.
El interés continuo en la composición y la función de las vesículas extracelulares ha conducido a la publicación de diversos métodos para el aislamiento exosome de ambos medios de cultivo celular y fluidos biológicos 24-26. Sin embargo, una barrera para investigar el papel de los exosomas en el VIH-1 patogénesis ha sido la separación eficiente de los exosomas del VIH-1 partículas mientras se mantiene la capacidad para investigar tanto el contenido exosome y la actividad funcional. Hemos desarrollado un protocol para la purificación de exosomas del VIH-1 partículas en el plasma humano, utilizando gradientes de velocidad iodixanol. Los donantes VIH-positivas utilizadas en este estudio no habían recibido tratamiento antirretroviral y las muestras de plasma utilizadas para estos experimentos contenidos de 1.500 a 400.000 partículas de virus / ml con una media de 206.000 partículas de virus / ml 21. De este modo, se demuestra que los exosomas en el plasma de VIH-1 en individuos infectados se pueden separar de manera eficiente a partir de partículas de VIH-1 del virus, incluso cuando las cargas virales son altos. Aunque similares en tamaño y densidad, exosomas segregados en las de baja densidad / fracciones superiores de los gradientes iodixanol en comparación con las partículas virales, que segregados en el de alta densidad / fracciones inferiores. Los exosomas preparadas por el método de gradiente de iodixanol son altamente purificado y libre de contaminación de las proteínas extracelulares. La pureza de la población exosomas aislado se confirmó usando p24 ELISA y Western blot para el VIH-1 p24 proteína de la cápsideasí como el análisis occidental de marcadores exosomal, dolor, CD9, CD45, CD63 y. El uso de estos marcadores es coherente con las directrices publicadas recientemente para la identificación exosoma 27.
Más fisiológicamente relevante a la activación inmune, se encontraron los exosomas purificados a partir de VIH-1 en individuos infectados para contener citocinas / quimiocinas en concentraciones significativamente más altos que los exosomas de VIH-1 controles seronegativos. Por otra parte, los exosomas del VIH-1 en individuos infectados eran biológicamente activa, que exhibe la capacidad de inducir aumento de los niveles del marcador de activación, CD38, en la superficie de las células de memoria naïve y el centro de T CD4 + y CD8 +. Colectivamente, estos datos sugieren un mecanismo que podría conducir activación inmunitaria persistente durante la infección por VIH.
Los resultados que fueron capaces de obtener utilizando nuestro sistema de purificación de exosomas, que combina centrifugación diferencial y separación iodixanol gradiente de velocidad muestran el valordel uso de exosomas altamente purificadas para bioensayos fisiológicos y funcionales. El procedimiento tiene ciertas dificultades y limitaciones. Una cantidad considerable de los exosomas, a menudo una mayoría del material de partida tal como se calcula por medio de mediciones de la actividad AChE, se pierden durante el proceso. Además, el procedimiento es también mucho tiempo y requiere acceso a un equipo costoso. Por último, la generación de los gradientes de iodixanol utilizando el aparato de fromer gradiente requiere una práctica considerable para asegurar la reproducibilidad. Un método alternativo para la generación de gradiente podría ser para preparar una serie graduada de soluciones de iodixanol, seguido por una cuidadosa disposición en capas de las soluciones en tubos de centrífuga e incubando O / N para permitir que los gradientes a la forma. Sin embargo, no hemos probado esta alternativa.
El protocolo experimental descrito aquí para el aislamiento y la separación de exosomas del VIH-1 partículas en el plasma humano es un método eficaz para garantizar la pureza de exosomes. El uso de este método ha dado lugar a vías interesantes para la investigación futura sobre el papel de los exosomas en el VIH-1 patogénesis e igualmente podría ser utilizado en las investigaciones para otros procesos biológicos.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer EDTA tubes (10ml) | Becton Dickinson | 368589 | pink top tubes |
| Lymphoprep Ficoll reagent | Cosmo Bio | AXS-1114545 | |
| Optiprep iodixanol reagent | Sigma | D1556 | |
| 14ml ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 344060 | ultraclear tubes |
| Gradient Former Model 485 | BIO-RAD | 165-4120 | |
| Acetylthiocholine iodide | Sigma | 1480 | |
| Benzoic Acid | Sigma | D8130 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Acetyl Cholinesterase | Sigma | C3389 | |
| 96-well clear microtiter plate | Medical Supply Partners | TR5003 | |
| SpectraMax 190 microplate reader | Molecular Devices | 190 | Fluorescent plate reader |
| Criterion Gel Electrophoresis Cell | BIO-RAD | 165-6001 | |
| Transblot Gel | BIO-RAD | 170-3910 | |
| Transfer Cell | |||
| Tris-HCl Criterion precast gels | BIO-RAD | 567-1093 | |
| Anti-CD45 antibody | Abcam | Ab10558 | |
| CD63 Antibody (H-193) | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-15363 | |
| CD9 Antibody (H-110) | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-9148 | |
| Rabbit pAb p24 HIV-1 | ImmunoDX, LLC | 1303 | |
| Nitrocellulose membrane | BIO-RAD | G1472430 | |
| Tris Buffered Saline | BIO-RAD | 170-6435 | |
| HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Scientific | 31460 | Goat-Anti-Rabbit |
| HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Scientific | 31430 | Goat-Anti-Mouse |
| Western Blotting Luminol Reagent | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-2048 | |
| GE LAS-4010 Imager | GE Healthcare | LAS-4010 | |
| Human Procarta Cytokine Immunoassay Kit | Affymetrix | N/A | Custom immunoassay panel |
| Bio-Plex 200 Immunobead Reader | BIO-RAD | 171-000201 | |
| Coulter Z2 Particle Counter | Beckman Coulter | 383552 | Cell counter |
| Alexa Fluor 700-labeled anti-CD3 | BD Bioscience (UCHT1) | 300424 | |
| APC/Cy7-labeled anti-CD4 | Biolegend (OKT4) | 317418 | |
| PerCP-labeled anti-CD4 | BD Bioscience (RPA-T8) | 550631 | |
| V450-labeled anti-CD8 | BD Bioscience (RPA-T8) | 560347 | |
| Biotin-labeled anti-CD45RA | BD Bioscience (HI100) | 555487 | |
| PE/Cy7-labeled anti-CD62L | Biolegend (DREG-56) | 304822 | |
| PE/Cy5-labeled anti-CD38 | Biolegend (HIT2) | 303508 | |
| APC/Cy7-labeled anti-HLADR | Biolegend (L243) | 307618 | |
| PE-Texas Red-labeled anti-streptavidin | BD Bioscience | 551487 | |
| PE/Cy5-labeled mouse IgG1K | Biolegend (MOPC-21) | 400116 | |
| APC/Cy7-labeled mouse IgG2aK | Biolegend (MOPC-173) | 400229 |
References
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