Abstract
Les exosomes sont de petites vésicules dont la taille varie de 30 nm à 100 nm qui sont libérés de manière constitutive à la fois lors de la stimulation et à partir d'une variété de types de cellules. On les trouve dans un certain nombre de fluides biologiques et sont connus pour réaliser une variété de protéines, des lipides et des molécules d'acide nucléique. Initialement pensé pour être un peu plus de réservoirs pour les débris cellulaires, les rôles des exosomes régulation des processus biologiques et dans les maladies sont de plus en plus appréciés.
Plusieurs méthodes ont été décrites pour l'isolement d'exosomes à partir de milieux de culture cellulaire et des fluides biologiques. En raison de leur petite taille et de faible densité, ultracentrifugation différentielle et / ou ultrafiltration sont les techniques les plus couramment utilisées pour l'isolement du exosomes. Cependant, le plasma de VIH-1 contient à la fois des individus infectés exosomes et des particules virales de VIH, qui sont similaires en taille et en densité. Ainsi, une séparation efficace des exosomes à partir de particules virales de VIH dans le plasma humain a étéun challenge.
Pour remédier à cette limitation, nous avons développé une procédure modifiée de Cantin et. al., 2008 pour la purification des exosomes de particules de VIH dans le plasma humain. Iodixanol gradients de vitesse ont été utilisés pour séparer les exosomes à partir de particules de VIH-1 dans le plasma d'individus HIV-1 positifs. Les particules virales ont été identifiés par ELISA p24. Les exosomes ont été identifiés sur la base des marqueurs d'exosomes acétylcholinestérase (AChE), et les antigènes CD9, CD63, CD45 et. Notre méthode du gradient a abouti à des préparations d'exosomes libres de particules virales. La purification efficace des exosomes de plasma humain nous a permis d'examiner le contenu des exosomes dérivés du plasma et d'étudier leur potentiel modulateur immunitaire et d'autres fonctions biologiques.
Introduction
Le VIH-1 épidémie continue à avoir un impact significatif dans le monde entier. Dès 2013, environ 35 millions de personnes dans le monde vivaient avec le VIH, et 2,1 millions d'entre eux étaient personnes nouvellement infectées 1. Les stratégies de prévention et un accès accru au traitement antirétroviral ont été utiles dans la réduction de l'acquisition globale du VIH. Cependant, les populations individuelles connaissent encore des hausses de l'acquisition du VIH 1. Ainsi, il est nécessaire de poursuivre les efforts pour faire face à cette épidémie.
L'un des meilleurs prédicteurs de la progression de la maladie VIH est l'activation immunitaire chronique (CIA) 2-10. Défini par la persistance de niveaux élevés de cytokines et des marqueurs détectables d'expression élevées à la surface des lymphocytes T, la CIA a été attribué à: i) la production de cellules dendritiques continue d'IFN de type I 11; (ii) l'activation immunitaire directe tirée par les protéines du VIH Tat, Nef et gp120 12; (iii) Translocation des protéines bactériennes dans les cellules immunitaires de l'intestin associée 6. Cependant, le mécanisme exact (s) chronique sous-jacente, l'activation immunitaire systémique dans l'infection à VIH restent à élucider.
Notre groupe de recherche et d'autres ont démontré un rôle des exosomes dans la pathogenèse du VIH 15-18. Notre groupe a déterminé que la protéine Nef est excrété par les cellules infectées dans les exosomes 15 et exosomal Nef (exNef) est présent dans le plasma d'individus infectés par le VIH à des niveaux de l'ordre du nanogramme 18. Nous avons montré que spectateur cellules T CD4 + exposés à exNef ont abouti à la mort cellulaire induite par activation dépendant de la voie CXCR4 19, 20. En variante, des monocytes / macrophages étaient réfractaires à l'apoptose exNef induite, mais exposé fonctions cellulaires altérés et l'expression des cytokines. Exosomes Plus récemment, notre groupe a montré isolés à partir du plasma d'individus infectés par le VIH contiennent une variété de cytokines pro-inflammatoires. Fucomplémen taires, les cellules mononucléaires du sang périphérique naïfs exposés à des exosomes dérivés du plasma de patients infectés par le VIH induit l'expression de CD38 sur les cellules mémoire naïf et centrale CD4 + et CD8 +. Cela contribue probablement à l'inflammation systémique et la propagation virale par l'intermédiaire de l'activation des cellules de voisinage 21, et suggère que les exosomes jouent un rôle important dans la pathogenèse du VIH.
En enquêtant sur le rôle des exosomes dans la pathogenèse du VIH, le défi est de développer des techniques pour séparer efficacement les exosomes de particules de VIH, tout en maintenant le contenu de exosomal ainsi que leur capacité immunitaire fonctionnel modulateur. Plusieurs méthodes ont été décrites pour l'isolement d'exosomes à partir de culture de cellules et fluides biologiques 22,23. En raison de leur petite taille et de faible densité (exosomes flottent à une densité de 1.15 à 1.19 g / ml), ultracentrifugation et / ou ultrafiltration différentielle sont les techniques les plus couramment utilisées pour l'isolement du exosomes 23.Cependant, infectés par le VIH surnageants de culture de cellules et le plasma de patients exosomes contiennent à la fois HIV-1 et des particules virales. Les exosomes et le VIH-1 particules sont très similaires en taille et en densité. En variante, en profitant de l'expression de marqueurs exosomales uniques tels que CD63, CD45, CD81 et, exosomes ont été isolés en utilisant des procédés de capture 23 immunoaffinite. Cette procédure peut séparer le virus de exosomes. Cependant, l'inconvénient de cette technique est la fixation étanche d'anticorps aux exosomes purifiés, qui pourraient interférer avec évaluation du potentiel immunomodulateur des exosomes en culture.
Pour répondre à ces limitations, nous avons développé une procédure pour la purification des exosomes de particules de VIH dans le plasma humain modifiés de Cantin et collègues utilisant 22 iodixanol gradients de vitesse. Les exosomes ont été trouvés à séparer dans la faible densité / fractions supérieures des gradients de iodixanol, tandis que les particules de virus isolés dans la hautedensité / fractions inférieures. Les particules virales ont été identifiées par p24 ELISA et exosomes ont été identifiés en utilisant des marqueurs d'exosomes Ache, CD9, CD63, CD45 et. Les fractions supérieures à faible densité recueillies contenaient exosomes qui étaient négatifs pour la contamination du VIH-1 p24. La purification efficace et la séparation des exosomes à partir de particules de VIH dans le plasma humain permet l'examen précis de la teneur en exosomes issus de plasma humain ainsi que l'étude de leur potentiel de modulateur immunitaire et la valeur diagnostique et pronostique des exosomes dans le VIH-1 pathogenèse.
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Protocol
Un schéma général de la procédure d'isolement d'exosomes et la purification est fourni à la figure 1. Le sang total a été obtenu à partir de donneurs volontaires sains et de personnes séropositives ne reçoivent pas theraoy antirétroviral assister à la Hope Clinic de l'Université Emory et le Programme des maladies infectieuses du système de santé Grady à Atlanta, en Géorgie. Cette étude a été approuvée par les comités d'éthique de l'Université Emory et Morehouse School of Medicine. Toutes les personnes participant à l'étude ont donné écrites et le consentement éclairé.
1. Préparation d'exosomes à partir de plasma sanguin
- Collection de sang humain et de traitement
- Recueillir 10 ml de sang par ponction veineuse périphérique dans des tubes de collecte de sang EDTA (contenant 18 mg de potassium EDTA), et retourner doucement cinq fois pour mélanger.
- Centrifuger les tubes de collecte de sang à 1000 x g pendant 20 min à température ambiante pour obtenir un culot de globules. Utilisez une pipette stérilete pour transférer la fraction de plasma (4-5 ml) dans un tube conique de 25 ml. On dilue le plasma avec 10 ml de 1 x PBS. Jeter cellules sanguines (globules rouges et les globules blancs, appelés aussi CMSP) dans un récipient de manière appropriée marquée pour déchets biologiques dangereux.
NOTE: Dans le cas des échantillons de sang de donneurs non infectés, les PBMC peut être réservée pour une utilisation ultérieure (voir la procédure IV.2, ci-dessous). - Stocker les échantillons de plasma à 4 o C pour le court terme (2-3 jours) ou à -80 ° C pour un stockage plus long terme.
REMARQUE: Apportez tous les échantillons de plasma congelés à 4 o C avant le traitement ultérieur.
- Préparation de la fraction de plasma Exosome
- Centrifugeuse de plasma à 10 000 xg pendant 30 min à 4 ° C pour éliminer les débris cellulaires. Utiliser une pipette sérologique stérile pour transférer le surnageant de plasma autorisé à un tube de 25 ml d'ultracentrifugation propre. Jeter le culot dans le container prévu.
- Centrifuger le plasma autorisé à 100.000 g pendant 2hr à 4 ° C pour éliminer de grandes vésicules. Retirer le surnageant de 100.000 xg attentivement par pipetage, et jeter dans les déchets biologiques dangereux. Reprendre le culot de 100 000 x g dans 1 ml de PBS 1X dans un tube propre et incuber à température ambiante pendant 30 min, en agitant doucement et à déloger des particules séparées.
- Laver le 100.000 xg exosomes / virus culot en suspension en ajoutant 25 ml de PBS. Retourner doucement le tube cinq fois pour mélanger, puis centrifuger à nouveau à 100 000 xg pendant 2 h à 4 ° C. Jeter la solution de lavage PBS dans le conteneur pour déchets biologiques dangereux.
- Reprendre le culot de 100 000 x g dans 1 ml de PBS 1 X et incuber à température ambiante pendant 30 min remuant doucement pour dissoudre et déloger le culot.
NOTE: Si il est impossible de passer directement à l'étape de gradient de iodixanol, stocker le culot, contenant exosomes et des particules virales, à 4 ° C pendant 1-2 jours jusqu'à ce que l'étape de gradient de iodixanol.
2. Purification d'exosomes
- Générer 6% -18% velocgradients de Ity de iodixanol l'aide d'un double chambre gradient ancien appareil.
- Préparer 6% et 18% des solutions de réactif de l'iodixanol, fournis sous forme de solution à 60% dans l'eau, par dilution dans du PBS. Pipeter 5,5 ml de la solution de 18% dans la chambre et sous agitation, 5,5 ml de pipette la solution à 6% dans la chambre de réservoir. Tournez sur l'agitateur, ouvrez le robinet, et de permettre à chaque gradient de circuler dans un tube d'ultracentrifugation 14 ml.
REMARQUE: Soit utiliser immédiatement ou stocker gradients préparés O / N à 4 ° C avant de l'utiliser. - Superposer soigneusement 1 ml de la solution exosomes / virus sur le dessus de chaque 11 ml de gradient. Gradients de centrifugeuses à 250.000 g pendant 2 h à 4 ° C, en utilisant un seau SW40Ti balancement rotor.
- Étiqueter douze (12) 1,5 ml microtubes. Retirer 1,0 ml à partir du sommet du gradient et le transférer dans le tube n ° 1. Transférer les fractions de 1 ml restants à tubes 2-12 dans un ordre séquentiel.
NOTE: La fraction la plus élevée sera donc n ° 1, la fraction de queue, n ° 12. Store les fractions de gradient à 4 ° C. Les exosomes purifiés, qui devrait être dans les fractions 1-3 au sommet de la pente, sont stables pendant 3-4 semaines lorsqu'il est conservé à 4 ° C.
- Préparer 6% et 18% des solutions de réactif de l'iodixanol, fournis sous forme de solution à 60% dans l'eau, par dilution dans du PBS. Pipeter 5,5 ml de la solution de 18% dans la chambre et sous agitation, 5,5 ml de pipette la solution à 6% dans la chambre de réservoir. Tournez sur l'agitateur, ouvrez le robinet, et de permettre à chaque gradient de circuler dans un tube d'ultracentrifugation 14 ml.
3. Exosome Caractérisation
- Acétylcholinestérase (AChE) Dosage de l'activité
- Préparer 100 mM substrat en mélangeant acétylthiocholine iodure 28,9 mg dans 1 ml de PBS 1X. Magasin substrat stock à -20 ° C jusqu'à 1 mois.
- Préparer 10 mM indicateur de couleur en mélangeant benzoïque 39.6mg d'acide et bicarbonate de sodium 15 mg dans 10 ml de PBS 1X. Magasin indicateur de couleur stock à 4 ° C jusqu'à deux semaines.
- Préparer le réactif de dosage par mélange 1X PBS, le substrat, et un indicateur de couleur en un rapport de 100: 2: 5 (par exemple, 10 ml de PBS 1X + 200 substrat indicateur coloré + 500 ul ul).
- Transfert 50 ul de chaque fraction de gradient tube de 1,5 ml (12.01 marquée, de procédure III.3) dans les puits d'une 96 puits microtiteplaque de r. Préparer des puits en double pour chaque échantillon gradient.
- Préparer un ensemble de normes en faisant d'abord une uU / ml AChE Stock 2000 à PBS. Assurez-onze (11) 2 dilutions successives de ce stock et ajouter 50 ul de chaque dilution à un seul puits d'une plaque de microtitrage, de sorte que la norme # 1 = 2.000 uU / ml, # 2 = 1000 uU / ml, n ° 3 = 500 uU / ml, etc. jusqu'à ce que N ° 12 = 0,98 uU / ml. Les douze normes AchE seront ainsi occuper une seule rangée d'une plaque d'essai de 96 puits.
- Ajouter 200 pi de mélange de réactif de dosage à chaque puits et incuber 20 min (dans le noir) à la température ambiante pour permettre le développement du produit de réaction coloré. Mesurer l'activité AChE à une longueur d'onde de 450 nm en utilisant un lecteur de microplaques fluorescent.
NOTE: Le pourcentage de matière restante après purification d'exosomes de départ est évaluée par l'acétylcholinestérase dosage du plasma non fractionnée.
- Analyse par immunotransfert
- Séparer les protéines dans les fractions de gradient (1-12 de Procedure 2.1.3) par SDS-PAGE 4-20% en tampon Tris-HCl gels préfabriqués à 100 V x 1 h. Transfert de protéines dans le gel sur une membrane de nitrocellulose en utilisant une cellule de transfert électro-blotting selon les instructions du fabricant. Autoriser les transferts Blot pour 12-16 h (O / N) à 350V.
- Retirer la membrane de l'appareil de blotting et laver dans du Tris-solution saline tamponnée (TBS) pendant 5 minutes. Bloc avec 5% de lait écrémé en TTBS (SCT avec du Tween 20 0,1%) pendant 1 heure en agitant à la température ambiante.
- Incuber la membrane avec des anticorps primaires spécifiques pour exosomes (CD9, CD45, CD63) ou du VIH-1 protéine de capside (p24) dans 5% de lait écrémé en agitant à 4 ° C pendant 12 à 16 heures (O / N). Les dilutions d'anticorps primaires pour immunoblots vont de 1: 2000 -1: 5000.
- Laver le transfert dans du TTBS pendant 20 min, suivi d'une incubation avec une dilution 1: 2000 de la peroxydase de raifort (HRP) conjuguée à de l'IgG anti-(anticorps secondaire), dans 5% de lait écrémé pendant 1 heure à température ambiante. Lavez la tache 3 fois avec du TTBS, 10 min par lavage.
- Enregistrez les images en tant que fichiers TIFF qui peut être consulté dans Adobe Photoshop. Effectuer une analyse de densitométrie des bandes en utilisant le logiciel ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD).
- Cytokine Assay
- Avant le dosage de cytokines, perturbent les complexes immuns qui sont habituellement présents dans le plasma humain par dissociation acide et lyser les exosomes par traitement avec un détergent. Dosage des échantillons de plasma de départ et préparations d'exosomes purifiés.
- A 100 ul de plasma humain ajouter 100 ul de HCl 0,33 N et incuber à 37 ° C pendant 1 heure. Ajouter 100 pi 0,33 N NaOH pour neutraliser plasma traité à l'acide. Ajouter Triton X-100 à la fois des échantillons de plasma et neutralisé exosomes purifiés à un ficoncentration finale de 1%, pour provoquer la lyse des exosomes.
- Pour ce test (une procédure sur la base de bourrelet fluorescente), utiliser des billes magnétiques pré-revêtues d'anticorps par le fabricant. Utilisez un panneau de perles recouvertes d'anticorps de cytokines anti-humains conçus sur mesure; indiqués dans le tableau 1. Vortexer les billes magnétiques revêtues d'anticorps de la trousse de dosage de cytokines pendant 30 sec et ajouter 50 ul de billes de chaque puits d'une plaque à 96 puits à utiliser dans le dosage.
- Préparer une série de dilution des normes dans un tampon standard de plasma (tous deux contenus dans le kit de dosage de cytokines) comme décrit dans le manuel d'instructions pour le kit de dosage de cytokines, de générer une courbe standard de 8 points.
- Ajouter 150 pi de tampon de lavage 1X (dans le kit) à chaque puits et laver les perles à l'aide d'un cordon rondelle magnétique, tel que décrit dans le manuel. Ajouter 25 ul du tampon d'essai de plasma (le kit) à chaque puits. Ajouter 25 ul d'étalons et les échantillons à tous les puits utilisés dans l'essai. Ajouter 25 ul de plasmatampon à échantillon puits témoins négatifs. Sceller et agiter la plaque à 700 rpm pendant 60 min à température ambiante et incuber O / N à 4 ° C.
- Ajouter 150 pi de tampon de lavage 1X à chaque puits et laver la plaque (comme à l'étape 3.3.4, ci-dessus). Ajouter 25 ul d'anticorps de détection dans chaque puits, le joint et serrer la plaque à 700 rpm pendant 30 min à température ambiante. Répéter l'étape de lavage.
- Ajouter 50 pi de solution de streptavidine (SAPE, de kit) dans chaque puits, le joint et serrer la plaque à 700 rpm pendant 30 min à température ambiante. Lavages de la plaque répétition comme dans 3.3.4.
- Ajouter 120 pi de tampon de lecture (dans le kit) dans chaque puits et agiter sur une table agitateur de laboratoire à 700 tours par minute pendant 5 min à température ambiante pour permettre au signal fluorescent de se développer. Lire la plaque sur le lecteur de plaque selon les instructions du fabricant.
- Afin de tenir compte de la quantité d'exosomes perdus au cours de la procédure d'isolement, utiliser l'équation suivante: [(lecture volume d'origine / de plasma) x 66,6 = ajusté lecture de cytokine].
- Avant le dosage de cytokines, perturbent les complexes immuns qui sont habituellement présents dans le plasma humain par dissociation acide et lyser les exosomes par traitement avec un détergent. Dosage des échantillons de plasma de départ et préparations d'exosomes purifiés.
4. Essai de potentiel immunomodulateur
- Préparation du milieu de culture avec Exosome appauvri sérum fœtal bovin
- Centrifugeuse de 500 ml de sérum bovin fœtal (FBS) à 100 000 xg pendant 20 h à 4 ° C pour sédimenter contaminant exosomes et des microvésicules. Retirez délicatement et enregistrez le FBS surnageant de exosomes appauvri. Jeter le culot dans les déchets biologiques dangereux.
- Mélanger 20% de la FBS surnageant de exosomes appauvri avec 500 ml de Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) moyen. Filtrer le milieu à travers un filtre à membrane de 0,45 um.
- Ajouter la streptomycine (100 U / ml), de la pénicilline (100 U / ml), L-glutamine (2 mM), une solution saline tamponnée par HEPES (10 uM), et IL-2 (20 U / ml) dans le milieu filtré.
- Culture cellulaire et Exosome exposition
- Exosomes à exposer les cellules du donneur périphériques mononucléaires du sang périphérique (PBMC) obtenues à partir de volontaires en bonne santé à la clinique. Suspendre CMSP danspréparé milieu de culture et compter les cellules en utilisant un compteur de cellules / particules (selon la méthode standard du fabricant).
REMARQUE: Les PBMC sont obtenues lors de la préparation de plasma décrit ci-dessus (étape 1.2). - En utilisant le milieu préparé à partir de la procédure 4.1.3, co-culture 3,0 x 10 6 (PBMC) avec 1 ug / ml d'exosomes regroupées de trois (3) du VIH-1 séropositifs ou de trois (3) du VIH-1 dans les individus séronégatifs au total volume de 1 ml dans les puits d'une plaque de culture de 12 puits (avec couvercle). Incuber les cultures pendant 48 heures à 37 ° C.
- Préparer les cultures et les cultures de PBMC non traités traités par la Concanavaline A (Con A; 5 pg / ml) pour servir de témoins négatifs et positifs, respectivement, comme décrit ci-dessus (4.2.2). Incuber toutes les cultures PBMC pendant 48 heures à 37 ° C.
- Immédiatement avant la récolte des cellules, la préparation des dilutions des anticorps monoclonaux conjugués à un fluorochrome suivantes: Alexa Fluor 700-anticorps anti-CD3 (1: 400 dilution), allophycocyAnin (APC) / cyanine 7 (Cy7) marqué à anti-CD4 (1: 400), la protéine de chlorophylle péridinine complexe anticorps anti-CD4 (1: 400), V450-anticorps anti-CD8 (1: 400), biotine anticorps anti-CD45RA (1: 1000), la phycoérythrine (PE) / Cy7-anticorps anti-CD62L (1: 1000), PE / cyanine 5 (Cy5) anti-CD38 marqué à (1: 200), PE-Texas Red- anti-streptavidine marquée (1: 2000), et de PE / Cy5 marqué contrôle isotypique souris IgG1k (1: 200).
- Après la période d'incubation de 48 heures, la récolte des PBMC. Laver les PBMC dans du PBS pour éliminer les taches et les exosomes de cellules par incubation pendant 1 h à 4 ° C avec des anticorps marqués au fluorochrome individuels. Analyser les PBMC colorées par cytométrie de flux pour quantifier l'expression des chimiokines (telles que décrites 21).
- Exosomes à exposer les cellules du donneur périphériques mononucléaires du sang périphérique (PBMC) obtenues à partir de volontaires en bonne santé à la clinique. Suspendre CMSP danspréparé milieu de culture et compter les cellules en utilisant un compteur de cellules / particules (selon la méthode standard du fabricant).
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Representative Results
Les exosomes sont efficacement purifiés à partir de VIH-1 plasmatique humain positif. Exosomes isolés, identifiés par l'acétylcholinestérase (AChE), séparés par une baisse des fractions de densité 1-3 à la partie supérieure des gradients de iodixanol, tandis que des particules de virus, identifiées par le VIH-1 antigène p24 , séparément dans les fractions à densité plus élevée (10-12, près du fond). La présence d'exosomes a été confirmée par l'identification de marqueurs d'immunotransfert d'exosomes AChE, CD9, CD45, CD63 et, et par microscopie électronique (figure 2).
Cytokines pro-inflammatoires et des chimiokines sont associés à et significativement élevés dans les exosomes de VIH-1 individus séropositifs. Exosomes purifiés et plasma non fractionnée du VIH-1 infectées par le VIH-1 et des individus séronégatifs ont été analysés pour 21 des cytokines / chimiokines de dosage multiplex. Toutes les 21 cytokines / chimiokines ont été détectés dans les exosomes isolés du VIH-1 individus positifs. En outre, leur taux étaient significativement élevés par rapport à plasma et des exosomes à partir de VIH-1 témoins séronégatifs (tableau 1).
Expression de CD38 a été augmentée à la surface des cellules exposées à des exosomes à partir de VIH-1 individus séropositifs. PBMC provenant de donneurs humains non infectés ont été exposés pendant 48 h à exosomes regroupées de VIH-1 séropositifs ou individus séronégatifs et évalués pour les niveaux de la CD38 de marqueurs d'activation sur CD4 + et les lymphocytes T CD8 + par cytométrie de flux. Nous avons observé que de 48 heures après l'exposition, l'expression de CD38 sur la surface de mémoire naïf et central cellules CD4 + et CD8 + étaient significativement élevés dans les lymphocytes T exposés à des exosomes à partir de VIH-1 individus positifs par rapport à un traitement d'exosomes séronégatifs et non traitée contrôles (Figure 3).
Figure 1. Représentation schématique de l'isolement d'exosomes du VIH-1 plasmatique humain positif. (A) 10 ml de sang périphérique ont été collectées à partir de HIV-1 et seropositve individus séronégatifs. (B) les tubes de collecte de sang de l'EDTA ont été centrifugés à 1 000 g pendant 20 min à température ambiante. (C) le plasma séparé a été transféré dans des tubes coniques de 50 ml et on dilue avec 1 x PBS ½ et (D) centrifuge 10000 g pendant 30 min. (E) Le surnageant a été transféré dans des tubes d'ultracentrifugation et (F) centrifugé à 10.000 xg pendant 2 heures. (G, H) Le surnageant a été jeté et le culot remis en suspension exosomes et lavée dans 1 ml de PBS 1X. (I) Après la centrifugation, le surnageant a été jeté et le culot remis en suspension dans 1 ml de PBS 1x et superposée à 6-18% gradient de vitesse de l'iodixanol et (J) à 250 000 xg centrifugé pendant 2 heures. (K) Après centrifugation, 1 ml des fractions de haut en bas du gradient ont été transferred tubes de 1,5 ml et analysé pour la teneur AChE et analyse par immunotransfert. (L) Les fractions 2 et 3 ont été combinées et que dilué avec 4 ml de PBS 1X et (M) à 400 000 xg centrifugé pendant 2 heures. (N) Après centrifugation, le surnageant a été jeté et le culot remis en suspension dans 1 ml de PBS 1X pour l'analyse des cytokines et chimiokines expression pro-inflammatoire. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Les exosomes sont efficacement purifiés à partir de plasma humain. Iodixanol individuelle gradient de vitesse fractions provenant d'individus séropositifs ou séronégatifs ont été soumis à (A) dosage enzymatique pour l'acétylcholinestérase (AChE) et (B) une analyse Western blot pour les marqueurs exosomales CD9, CD45, et CD63 et la protéine p24 virale et étaient (C) avec anti-immuno-CD63 et examiné par microscopie électronique à confirmer préparation d'exosomes purifiés à (C). (Figure de Konadu et al 2014 21, utilisée par la permission). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Essai de potentiel immunomodulateur. CMSP du VIH-1 individus séronégatifs ont été exposés à des exosomes rassemblées à partir de plasma du VIH-1 séropositifs (VIH + Exo) ou séronégatifs (VIH) Exo individus, pas traitée, ou traitée avec 5 ug / ml de concanavaline A (Con A) en tant que témoin positif. Après 48 h de l'exposition, Naïve (CD45RA + / CD62L +), Central (TCM; CD45RA- / CD62L +) et effecteur (TEM; CD45RA- / CD62L-) La mémoire CD4 + et Les cellules T CD8 + ont été analysées pour l'expression de CD38 par cytométrie de flux. Exosome de concentration a été normalisée par la protéine totale et on l'ajoute à 1 ug / ml. Les barres d'erreur représentent la moyenne +/- SEM de six bailleurs de fonds indépendants. Différence entre les groupes ont été testés pour la signification statistique par le test ANOVA One. * P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, **** p <0,0001. (Figure de Konadu et al 2014 21, utilisée par la permission). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Tableau 1. Analyse des exosomes purifiés à partir de plasma total et du VIH-1 séropositifs et séronégatifs pour les individus cytokine pro-inflammatoire et l'expression de la chimiokine. * P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, **** p <0,0001. (Figure de Konadu et al 2014 21, utilisée par la permission). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
L'activation chronique immunitaire (CIA) et CD4 + déplétion des cellules T sont deux caractéristiques importantes de l'infection VIH-1. Ils ont été établis comme prédicteurs de la pathogenèse, avec la CIA étant le meilleur prédicteur. Cependant, les mécanismes sous-jacents de l'activation immunitaire systémique chronique et T CD4 + baisse de la cellule ne sont toujours pas complètement élucidé. Nous et d'autres laboratoires ont développé des preuves solides que les exosomes sécrétés par le VIH-1 des cellules infectées jouent un rôle dans les deux caractéristiques.
L'intérêt continu à la fois dans la composition et la fonction des vésicules extracellulaires a conduit à la publication de divers procédés pour l'isolement d'exosomes à partir de deux milieux de culture de cellules et fluides biologiques 24-26. Cependant, un obstacle à étudier le rôle des exosomes dans la pathogenèse du VIH-1 a été la séparation efficace des exosomes du VIH-1 particules tout en conservant la capacité d'enquêter à la fois le contenu de exosomes et l'activité fonctionnelle. Nous avons développé un protola col purification des exosomes à partir de particules de VIH-1 dans le plasma humain, en utilisant des gradients de vitesse de l'iodixanol. Les donneurs séropositifs utilisées dans cette étude avaient pas reçu un traitement antirétroviral et les échantillons de plasma utilisées pour ces expériences contenus à partir de 1500 à 400.000 particules virales / ml avec une moyenne de 206.000 particules virales / ml 21. Ainsi, nous démontrons que les exosomes dans le plasma de VIH-1 individus infectés peuvent être efficacement séparées des particules virales du VIH-1, même lorsque les charges virales sont élevés. Bien que similaire en taille et en densité, exosomes isolés dans les bas-densité / fractions supérieures des gradients de iodixanol par rapport aux particules virales, qui distincts de la haute densité / fractions inférieures. Les exosomes préparés par le procédé de gradient de iodixanol sont hautement purifiée et exempte de protéines contaminantes extracellulaires. La pureté de la population isolée des exosomes a été confirmée par ELISA de p24 et l'analyse de transfert de Western pour le VIH-1 p24 protéine de capsideainsi que l'analyse de l'Ouest pour les marqueurs exosomales, AChE, CD9, CD45, CD63 et. L'utilisation de ces marqueurs est conforme aux lignes directrices publiées récemment pour l'identification des exosomes 27.
Plus physiologiquement pertinente de l'activation immunitaire, les exosomes purifiés à partir de VIH-1 individus infectés se sont révélés contenir des cytokines / chimiokines à des concentrations significativement plus élevées que les exosomes de VIH-1 témoins séronégatifs. En outre, exosomes à partir de VIH-1 ont été infectées par des individus biologiquement active, présentant l'aptitude à induire l'augmentation du taux de marqueur d'activation, CD38, à la surface des cellules naïves et mémoire centrale CD4 + et CD8 +. Collectivement, ces données suggèrent un mécanisme qui pourrait conduire l'activation immunitaire persistante lors de l'infection VIH.
Les résultats nous ont permis d'obtenir l'aide de notre procédé de purification d'exosomes, qui combine centrifugation différentielle et gradient de vitesse séparation iodixanol montrent la valeurd'utiliser des exosomes hautement purifiés pour les essais biologiques physiologiques et fonctionnels. La procédure n'a certains écueils et les limites. Une quantité considérable des exosomes, souvent la majorité de la matière de départ telle que calculée par mesure de l'activité de l'AChE, sont perdus au cours du processus. En outre, la procédure est également consommant du temps et nécessite l'accès à un matériel coûteux. Enfin, la génération des gradients de iodixanol l'aide de l'appareil de Fromer gradient exige la pratique considérable pour assurer la reproductibilité. Un autre procédé de génération de gradient peut être de préparer une série graduée de solutions d'iodixanol, suivie par la stratification des solutions prudent dans des tubes de centrifugation et l'incubation O / N afin de permettre aux gradients de forme. Cependant, nous avons pas testé cette alternative.
Le protocole expérimental est décrit ici pour l'isolement et la séparation des exosomes à partir de particules de VIH-1 dans le plasma humain est une méthode efficace pour assurer la pureté de l'exosomes. L'utilisation de cette méthode a conduit à des avenues intéressantes pour l'avenir enquête concernant le rôle des exosomes dans la pathogenèse du VIH-1 et pourrait également être utilisé dans les enquêtes pour d'autres processus biologiques.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer EDTA tubes (10ml) | Becton Dickinson | 368589 | pink top tubes |
| Lymphoprep Ficoll reagent | Cosmo Bio | AXS-1114545 | |
| Optiprep iodixanol reagent | Sigma | D1556 | |
| 14ml ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 344060 | ultraclear tubes |
| Gradient Former Model 485 | BIO-RAD | 165-4120 | |
| Acetylthiocholine iodide | Sigma | 1480 | |
| Benzoic Acid | Sigma | D8130 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Acetyl Cholinesterase | Sigma | C3389 | |
| 96-well clear microtiter plate | Medical Supply Partners | TR5003 | |
| SpectraMax 190 microplate reader | Molecular Devices | 190 | Fluorescent plate reader |
| Criterion Gel Electrophoresis Cell | BIO-RAD | 165-6001 | |
| Transblot Gel | BIO-RAD | 170-3910 | |
| Transfer Cell | |||
| Tris-HCl Criterion precast gels | BIO-RAD | 567-1093 | |
| Anti-CD45 antibody | Abcam | Ab10558 | |
| CD63 Antibody (H-193) | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-15363 | |
| CD9 Antibody (H-110) | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-9148 | |
| Rabbit pAb p24 HIV-1 | ImmunoDX, LLC | 1303 | |
| Nitrocellulose membrane | BIO-RAD | G1472430 | |
| Tris Buffered Saline | BIO-RAD | 170-6435 | |
| HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Scientific | 31460 | Goat-Anti-Rabbit |
| HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Scientific | 31430 | Goat-Anti-Mouse |
| Western Blotting Luminol Reagent | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-2048 | |
| GE LAS-4010 Imager | GE Healthcare | LAS-4010 | |
| Human Procarta Cytokine Immunoassay Kit | Affymetrix | N/A | Custom immunoassay panel |
| Bio-Plex 200 Immunobead Reader | BIO-RAD | 171-000201 | |
| Coulter Z2 Particle Counter | Beckman Coulter | 383552 | Cell counter |
| Alexa Fluor 700-labeled anti-CD3 | BD Bioscience (UCHT1) | 300424 | |
| APC/Cy7-labeled anti-CD4 | Biolegend (OKT4) | 317418 | |
| PerCP-labeled anti-CD4 | BD Bioscience (RPA-T8) | 550631 | |
| V450-labeled anti-CD8 | BD Bioscience (RPA-T8) | 560347 | |
| Biotin-labeled anti-CD45RA | BD Bioscience (HI100) | 555487 | |
| PE/Cy7-labeled anti-CD62L | Biolegend (DREG-56) | 304822 | |
| PE/Cy5-labeled anti-CD38 | Biolegend (HIT2) | 303508 | |
| APC/Cy7-labeled anti-HLADR | Biolegend (L243) | 307618 | |
| PE-Texas Red-labeled anti-streptavidin | BD Bioscience | 551487 | |
| PE/Cy5-labeled mouse IgG1K | Biolegend (MOPC-21) | 400116 | |
| APC/Cy7-labeled mouse IgG2aK | Biolegend (MOPC-173) | 400229 |
References
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