Abstract
エキソソームは、様々な細胞型の両方から構成的刺激の際に放出された30〜100nmのナノメートルのサイズの範囲の小さな小胞です。これらは、生物学的流体の数に見出され、タンパク質、脂質、および核酸分子の多様性を運ぶことが知られています。もともと細胞破片のための貯水池より少しであると考えられ、生物学的プロセスを調節するエキソソームのと疾患における役割がますます高く評価されています。
いくつかの方法は、細胞培養培地および生物学的流体からエキソソームを単離するために記載されています。それらの小さなサイズ、低密度、差動超遠心分離及び/または限外ろ過のエキソソームの単離のために最も一般的に使用される技術です。しかし、HIV-1感染個体の血漿は、エキソソームと大きさと密度が類似しているHIVウイルス粒子、両方が含まれています。このように、ヒト血漿中のHIVウイルス粒子からのエキソソームの効率的な分離がされています挑戦。
この制限に対処するために、我々はCantin らから変更手続きを開発しました。ら、2008ヒト血漿中HIV粒子からエキソソームを精製します。イオジキサノール速度勾配は、HIV-1陽性個体の血漿中のHIV-1粒子からエキソソームを分離するために使用されました。ウイルス粒子は、p24をELISAにより同定しました。エキソソームは、エキソソームマーカーアセチルコリンエステラーゼ（AChE）およびCD9、CD63、およびCD45抗原に基づいて同定されました。我々の勾配手順は、ウイルス粒子の自由なエキソソーム調製物を得ました。ヒト血漿からエキソソームの効率的な精製は、血漿由来のエキソソームの内容を検討し、その免疫調節の可能性やその他の生物学的機能を調査することができました。
Introduction
HIV-1の流行は、世界中で重大な影響を与え続けています。 2013年の時点で、全世界で約35万人がHIVと共に生きているし、これらの210万は、新たに感染した個人の1でした。予防戦略と抗レトロウイルス治療へのアクセスの増加は、HIVの全体的な買収を減らすのに役立っています。しかし、個々の集団は、依然として、HIV 1の取得の上昇を経験しています。したがって、この流行に対処するための継続的な努力が必要とされています。
HIV疾患進行の最も強力な予測因子の一つは、慢性免疫活性化（CIA）2-10です。 ; I型IFN 11のI）連続樹状細胞の生産：Tリンパ球の表面に検出可能なサイトカインおよび高い発現マーカーの持続的に高いレベルによって定義され、CIAはに起因していますHIVタンパク質のTat、ネフとgp120の12で駆動される（ii）の直接免疫活性化。 （ハ腸管関連する免疫細胞6における細菌タンパク質の）転。しかし、HIV感染の慢性、全身性の免疫活性化の基礎となる正確なメカニズムは完全に解明されていません。
我々の研究グループなどは、HIV病原15-18におけるエキソソームの役割を実証しました。当社グループは、Nefタンパク質がエキソソーム15に感染した細胞から分泌されることが決定しており、エキソソームネフ（exNef）はナノグラムレベル18でのHIV感染個体の血漿中に存在します。我々はまた、単球/マクロファージはexNef誘導アポトーシスに対して不応性であった。exNefにさらされたCD4 + T細胞は、CXCR4経路19、20に依存して活性化誘導細胞死をもたらしたことを傍観者を示すが、変化した細胞機能やサイトカインの発現を示しました。最近、我々のグループは、HIV感染個体の血漿から単離したエキソソームは、炎症性サイトカインの様々なが含まれて示されています。フーrther、ナイーブ及び中央記憶CD4 +及びCD8 + T細胞上のCD38の発現を誘導したHIV感染患者からの血漿由来エキソソームに露出ナイーブ末梢血単核細胞。これはおそらく、バイスタンダー細胞の活性化21を介して全身性炎症およびウイルス増殖に寄与し、エキソソームは、HIVの病因に重要な役割を果たすことを示唆しています。
HIVの病因におけるエキソソームの役割を調査するには、1つの課題は、HIV粒子から効率よく分離エキソソームエキソソームコンテンツを維持しながら、ならびにそれらの機能的な免疫調節能力に技術を開発しています。いくつかの方法は、細胞培養および生物学的流体22,23からエキソソームを単離するために記載されています。サイズが小さいため、低密度（エキソソームは、1.15の密度で浮遊する- 1.19グラム/ ml）を、差動超遠心分離及び/または限外ろ過がエキソソームの単離23のために最も一般的に使用される技術です。しかし、HIV感染細胞培養上清及び患者の血漿エキソソームおよびHIV-1ウイルス粒子の両方を含みます。エキソソームおよびHIV-1粒子は、サイズおよび密度の両方で非常に類似しています。あるいは、CD63、CD45、およびCD81のようなユニークなエキソソームのマーカーの発現を利用して、エキソソームは、免疫親和性捕捉法23を用いて、単離されています。この手順は、エキソソームからウイルスを分離することができます。しかし、この手法の欠点は、培養中のエキソソームの免疫能力の評価を妨げる可能性精製エキソソームに対する抗体のタイト結合、です。
これらの制限に対処するために、我々は、イオジキサノール速度勾配を使用してHIVのCantinから修飾されたヒト血漿中の粒子および共同研究者22からエキソソームを精製するための手順を開発しました。ウイルス粒子が高に偏析一方エキソソームは、イオジキサノール勾配の低密度/上側画分に分離することが見出されました密度/下分画。ウイルス粒子は、p24をELISAによって同定し、エキソソームは、エキソソームマーカーのAChE、CD9、CD63、およびCD45を用いて同定しました。収集上部低密度分画は、HIV-1のp24の汚染に対して陰性であったエキソソームを含んでいました。ヒト血漿中HIV粒子からエクソソームの効率的な精製および分離は、ヒト血漿、並びにそれらの免疫調節の可能性の調査とHIV-1病因におけるエキソソームの診断および予後値由来エキソソームの内容を正確に検査することができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer EDTA tubes (10ml) | Becton Dickinson | 368589 | pink top tubes |
| Lymphoprep Ficoll reagent | Cosmo Bio | AXS-1114545 | |
| Optiprep iodixanol reagent | Sigma | D1556 | |
| 14ml ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 344060 | ultraclear tubes |
| Gradient Former Model 485 | BIO-RAD | 165-4120 | |
| Acetylthiocholine iodide | Sigma | 1480 | |
| Benzoic Acid | Sigma | D8130 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Acetyl Cholinesterase | Sigma | C3389 | |
| 96-well clear microtiter plate | Medical Supply Partners | TR5003 | |
| SpectraMax 190 microplate reader | Molecular Devices | 190 | Fluorescent plate reader |
| Criterion Gel Electrophoresis Cell | BIO-RAD | 165-6001 | |
| Transblot Gel | BIO-RAD | 170-3910 | |
| Transfer Cell | |||
| Tris-HCl Criterion precast gels | BIO-RAD | 567-1093 | |
| Anti-CD45 antibody | Abcam | Ab10558 | |
| CD63 Antibody (H-193) | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-15363 | |
| CD9 Antibody (H-110) | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-9148 | |
| Rabbit pAb p24 HIV-1 | ImmunoDX, LLC | 1303 | |
| Nitrocellulose membrane | BIO-RAD | G1472430 | |
| Tris Buffered Saline | BIO-RAD | 170-6435 | |
| HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Scientific | 31460 | Goat-Anti-Rabbit |
| HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Scientific | 31430 | Goat-Anti-Mouse |
| Western Blotting Luminol Reagent | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-2048 | |
| GE LAS-4010 Imager | GE Healthcare | LAS-4010 | |
| Human Procarta Cytokine Immunoassay Kit | Affymetrix | N/A | Custom immunoassay panel |
| Bio-Plex 200 Immunobead Reader | BIO-RAD | 171-000201 | |
| Coulter Z2 Particle Counter | Beckman Coulter | 383552 | Cell counter |
| Alexa Fluor 700-labeled anti-CD3 | BD Bioscience (UCHT1) | 300424 | |
| APC/Cy7-labeled anti-CD4 | Biolegend (OKT4) | 317418 | |
| PerCP-labeled anti-CD4 | BD Bioscience (RPA-T8) | 550631 | |
| V450-labeled anti-CD8 | BD Bioscience (RPA-T8) | 560347 | |
| Biotin-labeled anti-CD45RA | BD Bioscience (HI100) | 555487 | |
| PE/Cy7-labeled anti-CD62L | Biolegend (DREG-56) | 304822 | |
| PE/Cy5-labeled anti-CD38 | Biolegend (HIT2) | 303508 | |
| APC/Cy7-labeled anti-HLADR | Biolegend (L243) | 307618 | |
| PE-Texas Red-labeled anti-streptavidin | BD Bioscience | 551487 | |
| PE/Cy5-labeled mouse IgG1K | Biolegend (MOPC-21) | 400116 | |
| APC/Cy7-labeled mouse IgG2aK | Biolegend (MOPC-173) | 400229 |
References
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