Abstract
Ruggenmergletsel (SCI) veroorzaakt meestal verwoestende neurologische stoornissen, met name door schade aan vezels afdalen van de hersenen naar het ruggenmerg. Een belangrijke huidige gebied van onderzoek is gericht op de mechanismen van adaptieve plasticiteit die spontane of geïnduceerde functioneel herstel na SCI ten grondslag liggen. Spontane functioneel herstel is gemeld grotere vroeg in het leven te zijn, het verhogen interessante vragen over hoe adaptieve plasticiteit verandert als het ruggenmerg zich ontwikkelt. Het onderzoek van deze dynamische vergemakkelijken, hebben we een SCI model in de neonatale muis ontwikkeld. Het model heeft relevantie voor pediatrisch SCI, die te weinig bestudeerd. Omdat neurale plasticiteit in het volwassen impliceert een aantal van dezelfde mechanismen als neurale plasticiteit in het begin van het leven 1, kan dit model mogelijk wel enige relevantie ook voor volwassen SCI. Hier de gehele procedure beschrijven we voor het genereren van een reproduceerbare ruggenmerg compressie (SCC) schade in de neonatale muisal postnatale (P) dag 1. SCC wordt bereikt door het uitvoeren van een laminectomie op een bepaald ruggenmergniveau (hier beschreven thoracale niveaus 9-11) en vervolgens met behulp van een gemodificeerde Yasargil aneurysma mini-clip snel comprimeren en decomprimeren van het ruggenmerg . Zoals eerder beschreven, kan de benadeelde neonatale muizen worden getest afwijkend gedrag of opgeofferd ex vivo fysiologische analyse van synaptische connectiviteit gebruik elektrofysiologische en zeer snelle optische opnametechniek 1. Eerdere en lopende onderzoeken met gedrags- en fysiologische beoordeling hebben een dramatische, acute verminderde motiliteit achterbeen gevolgd door een volledig functioneel herstel binnen 2 weken, en het eerste bewijs van veranderingen in de functionele schakelingen op het niveau herkende aflopend synaptische verbindingen 1 getoond.
Protocol
Deze experimentele protocol is goedgekeurd door de National Animal Research Authority in Noorwegen (Forsøksdyrutvalget, lokale experimentele erkenningsnummer 12,4591) in overeenstemming met de Europese Unie verzorging van dieren regelgeving (Federatie Europese Laboratory Animal Science Association). De inspanningen werden gedaan om het aantal gebruikte dieren en hun lijden te minimaliseren. In dit artikel de procedure gebruikt postnatale (P) dag 1 wildtype ICR (stempelen controlegebied) muizen (Jackson, USA) beschreven maar dezelfde benadering kan ook worden gebruikt in latere stadia.
1. De bouw van een Gas Anesthesie-systeem voor pasgeboren muizen (figuur 1)
- Bouw een neus-masker van het uiteinde van een spuit. Sluit deze aan op de 3-weg kraan met plastic buis (Figuur 1 - rode buizen en figuur 2A1).
- Boor een klein gat in de zijkant van de neus masker en sluit deze aan plastic slang aan de overloop van gas uit het verwijderenmasker. Beëindig de buis hetzij op een vacuümpomp die voor een lichte onderdruk of in een zuurkast (Figuur 1 - heldergroene tubing).
- Maak een verdoving kamer uit een 150 mm x 25 mm plastic petrischaal (figuur 2A2).
- Enerzijds een gat groot genoeg is om de kop van de muis en neusmasker tegemoet.
- Aan de andere kant erop twee kleinere gaten waardoor de kunststof buizen en uit de neus masker kan worden ingebracht (Figuur 1 - rood en helder groen slang respectievelijk).
- Voeg een derde boring aan de bovenkant van het deksel en hechten aan dit derde plastic buis die eindigt bij de vacuümpomp (Figuur 1 - donkergroen tubing). Het doel van deze derde buis zodat overtollige gas dat niet is vastgelegd door de uitlaat van de neus masker wordt verwijderd.
- Bouw een slaap kamer door een gat in de bodem van elke soort lab schaal die groot genoeg is om contain de muis en heeft een gladde en zelfs rand (de opening van de schaal moet met de tafel om lekkage van gas te voorkomen liggen). Sluit de opening in de kamer om de 3-weg kraan met kunststof buis (figuur 1 - Bruin tubing). Plaats de slaap kamer onder een zuurkast.
- Sluit een 3-weg kraan naar de uitlaatbuis van de verdamper (Figuur 1 - gele buizen en figuur 2A3).
- Sluit de inlaat van de verdamper om de zuurstoftoevoer (Figuur 1 - Blauw tubing).
2. Wijziging van een Yasargil Tijdelijke Aneurisma Mini-clip aan de Compression Tool aanmaken (figuur 2 en tabel 1)
- Bevestig de clip stevig aan een stand met een klem. Met behulp van een binoculaire loep voor visuele controle, dienen langs het buitenoppervlak van de punt van elke clip blad tot een uiteindelijke dikte van ongeveer 150 pm met behulp van een slijpsteen gemonteerd op een boormachine (Figuur 2B en C). Maak een stop voor de clip door het snijden van een stukje van polyethyleen capillaire buis (Tabel 1) onder een stereomicroscoop met een micro-mes (Tabel 1) en plaats dit op één van de schoepen (figuur 2A4 en figuren 2B en C). Dit voorkomt dat de volledige sluiting van de clip en zorgt voor gestandaardiseerde compressie dimensies. Wanneer de clip wordt sloot de ruimten tussen de afstand is ongeveer 230 urn. Nieuwe stop voor elk experiment als polyethyleen materiaal samen te drukken tijdens gebruik, waarbij de ruimten tussen de ruimte zou wijzigen.
Opmerking: De veerspanning van de clip mettertijd afneemt zodanig dat na ongeveer 80 compressies de clip niet meer volledig sluit de stop en moet worden vervangen.
3. Voorbereiding voor de operatie
- Plaats de muis in de slaapkamer (figuur 1) en initiëren anesthesie met 4% isofluraan (figuur 2A5 (figuur 2A3 en Tabel 1).
- Test de terugtrekking reflex van de muis door zachtjes knijpen het web van huid tussen de tenen met een dunne plastic pincet. Doe dit zorgvuldig pasgeboren muizen gemakkelijk gewond. Knijpen te hard tot de onmiddellijke kneuzingen. Deze test wordt uitgevoerd aan het begin van de sedatie veroorzaakt de reflex en geeft een goede indicatie van de hoeveelheid kracht nodig.
- Zodra de reflex wordt afgeschaft, verwijdert u de muis uit de slaap kamer en plaats deze in een buikligging op de operatietafel met de snuit ingevoegd in de neus masker dat een continue aanvoer van 4% isofluraan gemengd in zuivere zuurstof (figuur 1) voorziet. Zorg ervoor dat de opwarming pad is ingeschakeld en ingesteld op 37-38 ° C als onderkoeling tijdens de operatie kan fataal zijn.
- Om volledige analgesie te bereiken, subcutaan injecteren 50 ul van het lokale verdovingsmiddel Bupivacaïne (2,5 mg / ml,
- Verminder de concentratie isofluraan geleverd aan de neus masker tot 1-2%.
4. Dorsale Laminectomie
- Voer een operatie onder microscopische controle.
- Na de operatie gebied reinigen met chloorhexidine gluconaat (Tabel 1 # 19) gedurende ten minste 30 seconden, maak een 1-2 mm dwarse incisie in T9-T11 via een microknife (figuur 2A8).
Opmerking: In ICR pasgeboren muizen het rostrale deel van de maag, zichtbaar bevat melk, wordt geconfronteerd met de vertebrale niveaus T12-T13 (Figuur 3). Een andere bezienswaardigheid is de rostrale deel van de thoracale onderhuidse vetweefsel aggregaat die eindigt bij ongeveer T8-9. Deze mijlpaal is pas zichtbaar nadat incisie in de huid. - Trek de randen van de incisie van de onderliggende structuren inbrengen steriele stukken hemostatische gelatinespons (Figuur 2A11 en Tabel 1) subcutaan rostraal en caudaal van de incisie. Dit vergroot de opening en voorkomt dat de huid intrekken en het gebied verduistert tijdens de operatie. De hemostatische gelatinespons niet worden geweekt in een zoutoplossing voor gebruik.
- De ruggengraat bloot ontleden de paravertebrale spieren via dunne schaar (figuur 2A12 en Tabel 1). Snijd de bevestigingen van de spieren aan de wervelkolom en bloot de plaat (figuur 4A). Niete ook dat in dit stadium de spinale proces is onderontwikkeld.
- Identificeer de middellijn en dwars doorgesneden tussen de twee lagen (die in dit stadium is kraakbeen) met dunne schaar (figuur 4B). Plaats voorzichtig een blad van een dunne tang tussen de lamina en de dura (Figuur 4C), pak de lamina met de tang en til het voorzichtig omhoog tot een stuk breekt weg, waardoor de dura intact (figuur 4D). Herhaal dit 2-3 keer een 1-2 segment lange laminectomie te verkrijgen.
- Met behulp van de dunne tang rongeurs, verwijder delen van de facetgewrichten bilateraal om voldoende ruimte te krijgen om de clip te plaatsen binnen het wervelkanaal. Maak de chirurgische gebied en de controle bloeden met kleine stukjes hemostatische gelatine spons.
5. Spinal Cord Injury Compression
- Open de gewijzigde aneurysma mini-clip in de clip houder (Figuur 2A13 en figuur 2B) en plaats the messen aan weerszijden van het ruggenmerg in en tussen de facet verbindingen en het koord. Zorg ervoor dat de messen diep genoeg om het ventrale deel van het ruggenmerg beïnvloeden ingevoegd. Indien dit niet mogelijk is, verwijderen van de facetgewrichten.
- Maak de mini-clip snel, houdt het op zijn plaats met de clip houder om te voorkomen dat schuiven. Handhaving van de compressie voor 15 sec.
- Open de mini-clip snel en verwijderen. Om een symmetrische compressie te bereiken, omkeren van de oriëntatie van de mini-clip, en met behulp van de makkelijk te zien mark gemaakt door de hemorragische oedeem uit de eerste compressie als een gids, de positie van de clip in de omgekeerde oriëntatie voor een tweede 15-sec compressie (voorafgaande experiment toonde aan dat dit genereert symmetrische histologische en fysiologische tekorten, terwijl enkel compressies niet 1). De dura mag niet beschadigd door de compressie.
- Reinig het gebied en hemostase met stukjes hemostatische gelatine spons te handhaven.
- Verwijder de stukken hemostatische gelatinespons die onder de randen van de huid incisie aan het begin van de operatie gebracht en sluit de huidincisie met steriele 6,0 hechtdraad en een naaldhouder (Figuur 2A14 en 15).
- Injecteer subcutaan 0,75 mg / kg lichaamsgewicht buprenorfine (Figuur 2A16) verdund in steriel PBS onder gebruikmaking van een insulinespuit (300 pl, 30 G).
6. postoperatieve zorg
- Verwijder de muis uit de neus masker en plaats deze in een temperatuur-gecontroleerde kamer ingesteld op 30 ° C totdat de verdoving is uitgewerkt en de muis wordt alert (1-3 uur is meestal voldoende).
- Injecteer Diazepam (Figuur 2B17) intraperitoneaal in de moeder (8 g / kg lichaamsgewicht). Hierdoor ontstaat een verstijving die het risico van kannibalisme in de eerste nacht vermindert, wanneer dit risico het grootst.
- Zet de bediende muis om het nest.
- Als het nest is large (> 12 pups), verwijder een deel van de niet geopereerde pups, bij voorkeur de grotere dieren als ze verschillen in grootte, om de concurrentie voor de melk te verminderen. Moederlijke zorg van de geopereerde pups is het beste in de ICR lijn als de worpgrootte is ongeveer 9 pups.
- Voor pijnbestrijding, toedienen Buprenorfine (0,75 mg / kg lichaamsgewicht) subcutaan eenmaal per dag gedurende de eerste postoperatieve dagen, met een insulinespuit (300 pl, 30 G). Een geschikt volume voor onderhuidse toediening is 30-50 pl. In neonatale muizen vocalisatie en agitatie goede indicatoren van pijn.
- Voer een dagelijkse onderzoek van de gewonde muizen met behulp van een scoreblad voor voeding, lichaamsgewicht, uitdroging, pijn, wondgenezing, urineretentie en infectiestatus evalueren. Volgens de score verkregen, hebben speciale zorg, zoals injecties van een steriele pediatrische voeding-oplossing (tabel 1 # 18) in het geval van abnormale voeding. Het scoreblad ook0; definieert humaan eindpunt criteria. Een moeder die de gewonde pups niet verwerpt is de beste verzorger.
- In het uitzonderlijke geval van blaas dysfunctie, voeren de blaas massage twee keer per dag totdat functie wordt hersteld. Dit gebeurt door de muis in liggende positie in de ene hand en masseren van de onderbuik zachtjes in een rostro-caudaal vingertop.
Representative Results
Ruggenmergcompressie schade en verlies van functie
Zoals eerder beschreven, door het optimaliseren van de preoperatieve, operatieve en post-operatieve procedures, kan een reproduceerbare compressie SCI model in de neonatale muis worden verkregen 1. De polyethyleen stop geplaatst op een blad van de clip (Figuur 2B en C) voorkomt dat de volledige sluiting van de clip en houdt de inter-blade afstand constant op ongeveer 230 urn. Het omkeren van de oriëntatie van het fragment tussen de twee compressies resulteert in een symmetrische letsel, zoals beoordeeld door histologische gevolgen (figuur 5A en 1). Onmiddellijk na de mini-clip te verwijderen, de gecomprimeerde ruggenmerg weefsel wordt donkerder als gevolg van hemorragische kneuzingen en oedeem. Observatie van seriële secties van de gewonde ruggenmerg gekleurd voor Eosine en Hematoxylin al op een dag eenN a letsel onthult geleidelijke achteruitgang van het weefsel bij het naderen van de laesie epicentrum (Figuur 5A). De aanwezigheid van holten intraspinale of bloed in de laesie is niet ongebruikelijk.
Gedragsbeoordeling, bijvoorbeeld door het volgen achterbeen trajecten onder niet-gewichtdragende omstandigheden enkele uren na de operatie, toont een dramatische verslechtering van achterbeen motiliteit in SCC verwonde muizen vergeleken met sham controlemuizen waarbij slechts een laminectomie wordt uitgevoerd (Figuur 5B en 1) . Deze test kan worden herhaald tot de muis is in staat om andere gedragstesten die extra haar eigen gewicht 1 uitvoeren.
Sterfte en herstel na een operatie
Intra-operatieve sterfte is vooral te wijten aan apneu en hartstilstand als gevolg van de hoge concentratie van isofluraan die nodig is om voldoende Anesthesi bereikeneen. De invoering van de plaatselijke verdoving Bupivacaine in de chirurgische protocol maakt verlaging van de isofluraan concentratie en daardoor vermindert aanzienlijk het sterftecijfer. In een recente experimentele serie met inbegrip van meer dan 20 dieren, het intra-operatieve mortaliteit was nihil. Daarentegen wordt postoperatieve overleving vooral beïnvloed door aanvaarding van de geopereerde muizen door hun moeder. Een significante verbetering opgetreden bij angst en agressiviteit werd verminderd door het leveren van een enkele injectie van diazepam (ip 8 g / kg lichaamsgewicht) aan de moeder, voordat de werking muizen het strooisel 1. Acceptatie en postoperatief herstel van de geopereerde muizen kan worden gecontroleerd door de aanwezigheid van melk in de maag. De maag van een P1-P7 muis die dronken melk heeft duidelijk wit en zichtbaar door de buikhuid (figuur 3). Vergelijking van voeden in werking, sham controle en geopereerde muizen die nuttig is voor de beoordeling van de voedingstoestand van verwondend muizen. Beoordeling van de groei van bediende versus geopereerde muizen blijkt dat ondanks een bescheiden gewichtsverlies tijdens de eerste postoperatieve dagen, de groeicurve van muizen gebruikt normaliseert snel daarna (figuur 6). Sterfte ten gevolge blaasstoornis of infectie nooit in muizen onderzocht zolang 7 weken waargenomen.
| Nummer in Fig. 2 | Naam | Fabrikant / Provider | Referentie # | Link | Commentaar | ||
| 1 | Plastic injectiespuit (30 of 50 ml) | ||||||
| 2 | Plastic petrischaal (150 x 25 mm) | ||||||
| 3 | Fortec isofluraan vaporizer | Cyprane | http://www.mssmedical.co.uk/products/new-vaporisers/ | We gebruiken en oude apparaat uit productie, check de link voor nieuwere apparaat | |||
| 4a | Yasargil tijdelijke aneurysma mini-clip | Aesculap | FE681K | http://www.aesculapusa.com/assets/base/doc/DOC697_Rev_C-Yasargil_Aneurysm_Clip.pdf | |||
| 4b | Fijne boring polyethyleen capillaire buis ID 0,58 mm, OD 0,96 mm | Smiths Medical | 800/100/200 | http://www.smiths-medical.com/industrialproducts/8/39/ | |||
| 5 | Isofluraan (Forene) | Abbott GmbH & Co. KG | http://www.life-sciences-europe.com/product/forene-abbott-gmbh-wiesbaden-group-narcotic-germany-west-2001-1858.html | ||||
| 6 | Marcain (Bupivacaïne) | AstraZeneca | http://www.astrazeneca.co.uk/medicines01/neuroscience/Product/marcaine | ||||
| 7 | Insuline spuit 0,3 ml 30 G x 8mm | VWR | 80086-442 | https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4646138 | |||
| 8 | Ultra Fine Micro Knife 5 mm cutting edge | Fine Science Tools | 10.315-12 | http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp= Kat & suchkatalog = 0019900000 & reloadmenu = 1 | |||
| 9 | Extra Fine Graefe Forceps - 0,5 mm Tip | Fine Science Tools | 1153-1110 | http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp= Kat & suchkatalog = 0055700000 & reloadmenu = 1 | Niet echt noodzakelijk, vaak de tanden te groot | ||
| Tang SuperGrip Straight | Fine Science Tools | 00.632-11 | http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp= Kat & suchkatalog = 0053500000 & reloadmenu = 1 | Twee forceps noodzakelijk | |||
| 11 | Spongostan Special 70 x 50 x 1 mm | Ferrosan | |||||
| 12 | Vannas Spring Scissors - 2 mm Blades Straight | Fine Science Tools | 15.000-03 | http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp= Kat & suchkatalog = 0012800000 & reloadmenu = 1 | |||
| 13 | Vario Clip toepassen Forceps | Aesculap | FE502T | http://www.aesculapusa.com/assets/base/doc/DOC697_Rev_C-Yasargil_Aneurysm_Clip.pdf | |||
| 14 | Vicryl 6-, 0 (Ethicon) | Johnson en Johnson | J105G | ||||
| 15 | Diethrich micro naaldhouder | 11-510-20 | http://trimed-ltd.com/Products/Suture-Instruments/Micro-Needle-Holders-With-Tungsten-Carbide-Inserts/Ref-11-29.html | ||||
| 16 | Temgesic (buprenorfine) | Schering-Plough | |||||
| 17 | Stesolid (diazepam) | Actavis | Ook bekend als Valium | ||||
| 18 | Pedamix | Fresenius Kabi | http://www.helsebiblioteket.no/retningslinjer/pediatri/mage-tarm-lever-ern%C3%A6ring/parenteral-ern%C3%A6ring | ||||
| 19 | Klorhexidinsprit (chloorhexidine gluconaat) | Fresenius Kabi | D08A C02 | http://www.felleskatalogen.no/medisin/klorhexidinsprit-fresenius-kabi-klorhexidinsprit-farget-fresenius-kabi-fresenius-kabi-560639 | |||
Tabel 1. Lijst van apparatuur en toebehoren voor het genereren van een clip-gedreven compressie van het ruggenmerg letsel bij een neonatale muis.
Figuur 1. Schematische voorstelling van de anesthesie setup. Dit schema geeft de verdoving setup ontworpen voor de neonatale muis, met een slaap kamer voor de eerste verdoving en een neus masker apparaat voor de voortzetting van de anesthesie tijdens de operatie.
Figuur 2. Principal gereedschappen en compressie clip. (A) gereedschap gebruikt tijdens de procedure. De nummers komen overeen met de annotatie die in tabel 1. (B en C) A Yasargil tijdelijke aneurysma mini-clip met de punt van elk blad handmatig bijgesneden tot ongeveer 150 urn dik. Een stop van een stuk polyethyleen buis (tabel 1) wordt geplaatst op een van de bladen volledige sluiting van de klem te voorkomen. Schaal bar: 2 mm. App: clip applicator (# 12 in A); St:. Stopper Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Landmark voor preoperatieve beoordeling van spinale niveau neonatale ICR muis. (A) Zij mening van een P1 ICR muis met witte melk in de s tomach. Het rostrale deel van de maag komt overeen met T12-T13 spinale niveau. (B) P1 ICR muis onder narcose in een buikligging. Hoewel moeilijker te visualiseren dan (A), de maag gevuld met melk herkenbaar. De rostrale deel van de maag geeft T12-T13 spinale niveau. Schaal bars: 0,5 cm.
Figuur 4. Dorsale laminectomie. (A) Dissectie van paravertebrale spieren. Merk op dat op deze leeftijd het spinale proces is onderontwikkeld. (B) Transversale afsnijden van de lamina met dunne schaar. (C) Invoering van een blad van een dunne tang tussen de lamina en de dura. De entry point wordt weergegeven door de pijlpunt. (D) verwijderen van de lamina. Schaal bar: 2 mm.
bestanden / ftp_upload / 53498 / 53498fig5.jpg "/>
Figuur 5. Histologische en gedragsmatige uitkomsten na compressie van het ruggenmerg letsel bij P1. (A) Eosine en hematoxyline kleuring in het ruggenmerg secties van een gewonde muis (1 dag na blessure) op verschillende afstanden van de blessure epicentrum. (B) Vertegenwoordiger sporen van voorpoot en achterbeen trajecten waargenomen 6 uur na een verwonding of na een schijnvertoning controle laminectomie. Sporen op de top vertegenwoordigen trajecten vanuit een zijaanzicht van het dier. Sporen onderaan vertegenwoordigen trajecten vanuit het ventrale aspect van de dieren. Zie ook 1. Schaal bar: 250 pm. DH: dorsale hoorn; L, links; R: rechts; SCC: ruggenmergcompressie; VH:. Ventrale hoorn Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6. Vergelijkende groeicurven. Histogram toont de gewichtstoename van ongeopereerde en SCC gewond muizen van postnatale dag 1 tot postnatale dag 9.
Discussion
In dit artikel worden de procedures voor een clip-gegenereerde SCC letsel bij P1 muizen worden beschreven. Dezelfde procedure kan ook worden uitgevoerd in een latere fase. Compressie verwondingen werden met succes uitgevoerd bij P5, P7, P9 en P12 (Züchner, et al., Manuscript in voorbereiding). Bij alle postnatale fase, wordt algemene anesthesie verkregen met isofluraan verdampt in zuivere zuurstof, maar de verdoving resultaat is sterk afhankelijk van de leeftijd. In eerste pogingen tot P1-P4, voordat de plaatselijke verdoving werd in het protocol, was het moeilijk om een diepe en verlengde sedatie verkrijgen door een smalle dosis-effect window tussen onvoldoende sedatie en overdosis. Daarnaast is bezorgdheid met betrekking tot een neurotoxisch effect van isofluraan in pasgeboren dieren verhoogd 27-30. Een combinatie van isofluraan en de plaatselijke verdoving Bupivacaine resulteert in een diepere en meer stabiele anesthesie terwijl het toelaten van een isofluraan dosis reductie met een factor 2-3. Verschillende soorten anesthesia beschreven neonatale knaagdieren, waaronder cryoanesthesia 31,32, maar één potentiële ongemak van cryoanesthesia is het neuroprotectieve effect (beoordeeld door 33,34), die de vorming kan bemoeilijken van een efficiënt en reproduceerbaar letsel. -Barbituraat gebaseerde anesthesie wordt beschouwd als lagere efficiëntie in neonatale muizen hebben als gevolg van lagere niveaus van serumalbumine en lichaamsvet dan bij volwassenen 35,36.
Hoewel vrij invasief en traumatisch, zodra de procedure het sterftecijfer wordt vastgesteld tijdens de operatie is laag. Er zijn echter kritische stappen in de procedure die extra aandacht voor het herstel en de overleving van de geopereerde muizen verbeteren. Een belangrijk punt is voor pups die de beste kans om de operatie te overleven zal selecteren. Wanneer het nest groot is de voedingstoestand van de individuele pups varieert. Naast de onvermijdelijke bloeden die optreedt tijdens de operatie, uitgevoerd pups brengen uurs uit de buurt van de moeder, en ze vaak niet drinken melk voor de volgende ochtend. Het is dus een voordeel pups die reeds een bepaalde hoeveelheid melk in de maag te selecteren. Dit is direct zichtbaar door de buikhuid van P0 tot P7.
Tijdens de eerste nacht de geopereerde pup is een groot risico te worden gekannibaliseerd door de moeder. Tijdens de initiële ontwikkeling van dit model meer dan de helft van de geopereerde muizen misten de volgende ochtend, met duidelijke tekenen van bloed in de kooi. Necrophagy, kannibalisme en kindermoord bij knaagdieren zijn onderzocht tientallen jaren 37-40. In deze studie werd kannibalisme eenmaal getuige, maar werd beschouwd als een meer waarschijnlijke verklaring dan Necrophagy omdat de pups die werden aan de kooi kenmerkend waren in zo'n goede staat dat natuurlijke dood tijdens de nacht leek onwaarschijnlijk. Dit leidde tot het idee om een omkeerbare farmacologisch middel zoals Diazepam angst en agressiviteit i verminderenn de moeder (beoordeeld door 41). Intraperitoneale injectie van diazepam sterk verbeterde de situatie vallen mortaliteit gedurende de eerste nacht meer dan 60% tot minder dan 20%.
Het verminderen van worpgrootte door het ruimen en het verstoren van de kattenbak zo weinig mogelijk volgende postoperatieve terugkeer zijn bijkomende elementen die kunnen profiteren van de geopereerde dieren. Echter, waardoor alleen bediend pups met de moeder is niet gunstig. De beste balans tussen gebruikt / niet geopereerde pups kan variëren afhankelijk van de lijn, maar voor ICR en SCID-ICR-muizen verlaten 4-5 bediend pups (letsel of sham) samen met 3-4 geopereerde pups gaf de beste resultaten.
In algemene zin is de belangrijkste beperking van deze neonatale SCI model is dat de neonatale ruggenmerg verschilt in meerdere opzichten van de volwassen ruggenmerg, en kan dus niet experimentele resultaten die vergelijkbaar zijn met die verkregen uit volwassen SCI modellen leveren. Dergelijke verschillen omvatten totale omvang envolume van het ruggenmerg, celgetal, ondervertegenwoordigd specifieke celtypen zoals oligodendrocyten, onrijpe immuunsysteem en onvolwassen neuronale circuits. Conclusies uit experimenten op dit model moeten daarom zorgvuldig worden overwogen. Anderzijds is het model relevant voor de relatief minder onderzochte scenario pediatrische SCI. Bovendien is de schijnbare zwakheid met betrekking tot volwassen SCI modellen is een potentiële kracht omdat de opheldering van mechanismen die plasticiteit, hoewel minimaal bestaande in het volwassen ruggenmerg, kan een therapeutisch substraat vertegenwoordigen als hersteld kunnen toestaan. Het is denkbaar dat herstel van neonatale of embryonale voorwaarden kan worden uitgevoerd door implantatie van minder ontwikkelde cellen of weefsel of door behandeling met reagentia die de volwassen weefsel met eerdere ontwikkelingskenmerken veroorzaken. Gebruik enzymen perineuronal netten elimineren is een voorbeeld van de laatste aanpak 42,43.
bijvoorbeeld doorsnijding, hemisectie, kloppers, ballon compressie, tangen verbrijzeling, statisch gewicht compressie, enz. Met betrekking tot de invloed apparaten, de inspanningen in deze richting hebben geleid tot SCI modellen in volwassen knaagdieren waarbij meerdere parameters van het effect zoals snelheid, kracht en duur kan worden gemanipuleerd (overzicht door 44). Een andere benadering, waarbij minder apparatuur, biedt werk aan een wijziging van het Kerr-Lougheed aneurysmaclip 45,46. Deze 2 benaderingen zijn complementair als de impactor bootst een contusie letsel, terwijl de clip bootst een compressie letsel met een zekere mate van gelijktijdige ischemie. Vanwege de aanzienlijke omvang beperkingen en grotere kwetsbaarheid van neonatale muizen, de hogere sterfte langere operaties alsmede de kosten van ontoping kleinere schaal apparatuur werd gekozen om een clip-gegenereerde compressie te ontwikkelen in plaats van een-impactor gegenereerd kneuzing aanpak. Dit werd bewerkstelligd door het aanpassen van een commercieel verkrijgbare aneurysma mini-clip om de grootte van de wervelkolom van neonatale muizen 1 tegemoet. Toevoegen van een stop verzekert een gestandaardiseerde compressie breedte, en zolang de spanning van de klem comprimeert tot de grens van de stop, moet de kracht van de druk in de statische fase bij minimale breedte variëren weinig. Wat niet gestandaardiseerd is de snelheid van de druk tijdens de dynamische fase, aangezien dit zal variëren terwijl de stapel spanning verandert gedurende de levensduur. Aangezien de statische fase van de compressie veel langer dan de dynamische fase duurt en er helemaal niet zeker dat het ruggenmerg weefsel oefent veel als een tegenkracht tegen de mini-clip blades, is het waarschijnlijk dat de ernst van schade meest afhankelijk de statische fase. Dit is echter nog worden getest. Letselernst hangt waarschijnlijk af van meerdere factoren, waaronder de statische compressiekracht en duur, de snelheid van de compressie en decompressie, de positie van de mini-klem, en het aantal compressies uitgevoerd op dezelfde locatie. Zo zou combinatorische variatie van deze parameters leiden tot het genereren van een spectrum schade ernst van zwak tot ernstig. Ondanks de mogelijke variabiliteit in ons eerder gepubliceerde studie 1 verkregen we consistente resultaten op histologische, fysiologische en gedragsmatige niveaus, zodat er weinig te suggereren dat aanvaardbaar normalisatie is moeilijk te bereiken. We merken dat in deze studie gebruikte we meerdere methoden validatie op elk niveau, inclusief gedragstesten zoals lucht-stepping zie figuur 5.
In deze neonatale SCI model spaart de verwonding een bepaald deel van axonen en verschaft daardoor een gunstige situatie voor het opwekken adaptieve plasticiteit via re-modeling gespaard verbindingen en de vorming van nieuwe circuits. Aangezien de neonatale muis goed geschikt voor onderzoek door vele experimentele methoden, is het mogelijk om dit model voor functioneel herstel en adaptieve plasticiteit met een geïntegreerde benadering, zoals gedragstesten, retrograde en anterograde axonale tracing, immunohistochemie, elektrofysiologie en hoge bestuderen -throughput optische registratiemedium 1. Als voorbeeld hebben we voordeel van deze geïntegreerde benadering van netwerk hermodelleren aangetoond op het niveau van specifieke aflopend inputs met high-throughput calcium beeldvorming in ex vivo wholemount preparaten van de hersenstam en ruggemerg 1. Dit kan verder worden geduwd door het gebruik van neuro-optogenetic en optogenetic farmacologie tools om de herinrichting van synaptische verbindingen tussen specifieke subpopulaties van spinale neuronen te beoordelen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic syringe (30 or 50 ml) | |||
| Plastic Petri dish (150 x 25 mm) | |||
| Fortec isoflurane vaporizer | Cyprane | We use and old device out of production, check the link for newer device | |
| Yasargil temporary aneurysm mini-clip | Æsculap | FE681K | |
| Fine-Bore Polyethylene tubing ID 0.58 mm, OD 0.96 mm | Smiths Medical | 800/100/200 | |
| Isoflurane (Forene) | Abbott GmbH & Co. KG | ||
| Marcain (Bupivacain) | AstraZeneca | ||
| Insuline seyringe 0.3 ml 30 G x 8 mm | VWR | 80086-442 | |
| Ultra Fine Micro Knife 5 mm cutting edge | Fine Science Tools | 10315-12 | |
| Extra Fine Graefe Forceps – 0.5 mm Tip | Fine Science Tools | 1153-10 | Not really necessary, often the teeth are too large |
| Forceps SuperGrip Straight | Fine Science Tools | 00632-11 | Two forceps are necessary |
| Spongostan Special 70 x 50 x 1 mm | Ferrosan | ||
| Vannas Spring Scissors – 2 mm Blades Straight | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Vario Clip Applying Forceps | Aesculap | FE502T | |
| Vicryl 6–0 (Ethicon) | Johnson and Johnson | J105G | |
| Diethrich micro needle holder | 11-510-20 | ||
| Temgesic (buprenorphine) | Schering-Plough | ||
| Stesolid (diazepam) | Actavis | Also known as Valium | |
| Pedamix | Fresenius Kabi | ||
| Klorhexidinsprit (chlorhexidine gluconate) | Fresenius Kabi | D08A C02 |
References
- Boulland, J. -L., Lambert, F. M., Züchner, M., Strom, S., Glover, J. C. A Neonatal Mouse Spinal Cord Injury Model for Assessing Post-Injury Adaptive Plasticity and Human Stem Cell Integration. PLoS ONE. 8 (8), (2013).
- Raineteau, O., Schwab, M. E. Plasticity of motor systems after incomplete spinal cord injury. Nat. Rev. Neurosci. 2 (4), 263-273 (2001).
- Edgerton, V. R., Tillakaratne, N. J. K., Bigbee, A. J., de Leon, R. D., Roy, R. R. Plasticity of the spinal neural circuitry after injury. Annu. Rev. Neurosci. 27, 145-167 (2004).
- Bareyre, F. M., et al. The injured spinal cord spontaneously forms a new intraspinal circuit in adult rats. Nat. Neurosci. 7 (3), 269-277 (2004).
- Cai, L. L., et al. Plasticity of functional connectivity in the adult spinal cord. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B., Biol. Sci. 361 (1473), 1635-1646 (2006).
- Courtine, G., Song, B., et al. Recovery of supraspinal control of stepping via indirect propriospinal relay connections after spinal cord injury. Nat. Med. 14 (1), 69-74 (2008).
- Courtine, G., et al. Transformation of nonfunctional spinal circuits into functional states after the loss of brain input. Nat. Neurosci. 12 (10), 1333-1342 (2009).
- Fenrich, K. K., Rose, P. K. Axons with highly branched terminal regions successfully regenerate across spinal midline transections in the adult cat. J. Comp. Neurol. 519 (16), 3240-3258 (2011).
- Fenrich, K. K., Rose, P. K. Spinal interneuron axons spontaneously regenerate after spinal cord injury in the adult feline. J. Neurosci. 29 (39), 12145-12158 (2009).
- Farrar, M. J., et al. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber. Nat. Methods. 9 (3), 297-302 (2012).
- Oshima, Y., et al. Intravital multiphoton fluorescence imaging and optical manipulation of spinal cord in mice, using a compact fiber laser system. Lasers Surg. Med. 46 (7), 563-572 (2014).
- Débarre, D., Olivier, N., Supatto, W., Beaurepaire, E. Mitigating phototoxicity during multiphoton microscopy of live Drosophila embryos in the 1.0-1.2 µm wavelength range. PloS One. 9 (8), e104250 (2014).
- Kasumacic, N., Glover, J. C., Perreault, M. -C. Segmental patterns of vestibular-mediated synaptic inputs to axial and limb motoneurons in the neonatal mouse assessed by optical recording. J. Physiol. 588 (Pt 24), 4905-4925 (2010).
- Kasumacic, N., Glover, J. C., Perreault, M. -C. Vestibular-mediated synaptic inputs and pathways to sympathetic preganglionic neurons in the neonatal mouse. J. Physiol. 590 (Pt 22), 5809-5826 (2012).
- Szokol, K., Glover, J. C., Perreault, M. -C. Differential origin of reticulospinal drive to motoneurons innervating trunk and hindlimb muscles in the mouse revealed by optical recording. J. Physiol. 586 (Pt 21), 5259-5276 (2008).
- Szokol, K., Glover, J. C., Perreault, M. -C. Organization of functional synaptic connections between medullary reticulospinal neurons and lumbar descending commissural interneurons in the neonatal mouse. J. Neurosci. 31 (12), 4731-4742 (2011).
- Szokol, K., Perreault, M. -C. Imaging synaptically mediated responses produced by brainstem inputs onto identified spinal neurons in the neonatal mouse. J. Neurosci. Meth. 180 (1), 1-8 (2009).
- Pang, D. Spinal cord injury without radiographic abnormality in children, 2 decades later. Neurosurgery. 55 (6), 1325-1342 (2004).
- Lee, J. H., Sung, I. Y., Kang, J. Y., Park, S. R. Characteristics of pediatric-onset spinal cord injury. Pediatr. Int. 51 (2), 254-257 (2009).
- Parent, S., Mac-Thiong, J. -M., Roy-Beaudry, M., Sosa, J. F., Labelle, H. Spinal cord injury in the pediatric population: a systematic review of the literature. J. Neurotrauma. 28 (8), 1515-1524 (2011).
- Basu, S. Spinal injuries in children. Front Neurol. 3, 96 (2012).
- Chien, L. -C., et al. Age, sex, and socio-economic status affect the incidence of pediatric spinal cord injury: an eleven-year national cohort study. PloS One. 7 (6), e39264 (2012).
- Maier, I. C., Schwab, M. E. Sprouting, regeneration and circuit formation in the injured spinal cord: factors and activity. Philos. T. R. Soc. Lond. B. 361 (1473), 1611-1634 (2006).
- Schwab, M. E., Strittmatter, S. M. Nogo limits neural plasticity and recovery from injury. Curr. Opin. Neurobiol. 27, 53-60 (2014).
- Jakeman, L. B., Hoschouer, E. L., Basso, D. M. Injured mice at the gym: review, results and considerations for combining chondroitinase and locomotor exercise to enhance recovery after spinal cord injury. Brain Res. Bull. 84 (4-5), 317-326 (2011).
- Rhodes, K., Fawcett, J. Chondroitin sulphate proteoglycans: preventing plasticity or protecting the CNS? J. Anat. 204 (1), 33-48 (2004).
- Zhu, C., et al. Isoflurane anesthesia induced persistent, progressive memory impairment, caused a loss of neural stem cells, and reduced neurogenesis in young, but not adult, rodents. J. Cereb. Blood Flow Metab. 30 (5), 1017-1030 (2010).
- Loepke, A. W., et al. The effects of neonatal isoflurane exposure in mice on brain cell viability, adult behavior, learning, and memory. Anesth. Analg. 108 (1), 90-104 (2009).
- Rothstein, S., Simkins, T., Nunez, J. L. Response to neonatal anesthesia - effect of sex on anatomical and behavioral outcome. Neuroscience. 152 (4), 959-969 (2008).
- Rizzi, S., Carter, L. B., Ori, C., Jevtovic-Todorovic, V. Clinical anesthesia causes permanent damage to the fetal guinea pig brain. Brain Pathol. 18 (2), (2008).
- Janus, C., Golde, T. The effect of brief neonatal cryoanesthesia on physical development and adult cognitive function in mice. Behav. Brain Res. 259, 253-260 (2014).
- Nuñez, J. L., Koss, W. A., Juraska, J. M. Hippocampal anatomy and water maze performance are affected by neonatal cryoanesthesia in rats of both sexes. Horm. Behav. 37 (3), 169-178 (2000).
- Batchelor, P. E., et al. Systematic review and meta-analysis of therapeutic hypothermia in animal models of spinal cord injury. PloS one. 8 (8), e71317 (2013).
- Kwon, B. K., et al. Hypothermia for spinal cord injury. The Spine Journal. 8 (6), 859-874 (2008).
- Benjamin, M. M. Outline of veterinary clinical pathology. , 3rd ed, (1978).
- Cunningham, M. G., McKay, R. D. G. A hypothermic miniaturized stereotaxic instrument for surgery in newborn rats. J. Neurosci. Methods. 47 (1-2), 105-114 (1993).
- Lane-Petter, W. Cannibalism in rats and mice. Proc. R. Soc. Med. 61 (12), 1295-1296 (1968).
- Gandelman, R., Simon, N. G. Spontaneous pup-killing by mice in response to large litters. Dev. Psychobiol. 11 (3), 235-241 (1978).
- Taylor, G. T. Urinary odors and size protect juvenile laboratory mice from adult male attack. Dev. Psychobiol. 15 (2), 171-186 (1982).
- Weber, E. M., Algers, B., Hultgren, J., Olsson, I. A. Pup mortality in laboratory mice -- infanticide or not? Acta Vet Scand. 55 (1), 83 (2013).
- Crawley, J. N. Exploratory behavior models of anxiety in mice. Neurosci. Biobehav. Rev. 9 (1), 37-44 (1985).
- Kwok, J. C. F., Heller, J. P., Zhao, R. -R., Fawcett, J. W. Targeting inhibitory chondroitin sulphate proteoglycans to promote plasticity after injury. Methods Mol. Biol. 1162, 127-138 (2014).
- Kwok, J. C. F., Afshari, F., Garcìa-Alìas, G., Fawcett, J. W. Proteoglycans in the central nervous system: plasticity, regeneration and their stimulation with chondroitinase ABC. Restor. Neurol. Neurosci. 26 (2-3), 131-145 (2008).
- Young, W. Spinal cord contusion models. Prog. Brain Res. 137, 231-255 (2002).
- Rivlin, A. S., Tator, C. H. Regional spinal cord blood flow in rats after severe cord trauma. J. Neurosurg. 49 (6), 844-853 (1978).
- Rivlin, A. S., Tator, C. H. Effect of duration of acute spinal cord compression in a new acute cord injury model in the rat. Surg. Neurol. 10 (1), 38-43 (1978).
- Joshi, M., Fehlings, M. G. Development and characterization of a novel, graded model of clip compressive spinal cord injury in the mouse: Part 1. Clip design, behavioral outcomes, and histopathology. J. Neurotrauma. 19 (2), 175-190 (2002).
- Joshi, M., Fehlings, M. G. Development and characterization of a novel, graded model of clip compressive spinal cord injury in the mouse: Part 2. Quantitative neuroanatomical assessment and analysis of the relationships between axonal tracts, residual tissue, and locomotor recovery. J. Neurotrauma. 19 (2), 191-203 (2002).
