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Medicine

एक नवजात माउस रीढ़ की हड्डी संपीड़न चोट मॉडल

Published: March 27, 2016 doi: 10.3791/53498
Automatic Translation
1,2, 2,3, 2,3
1Department of Neurosurgery, Oslo University Hospital, 2Norwegian Center for Stem Cell Research, Oslo University Hospital, 3Laboratory of Neural Development and Optical Recording (NDEVOR), Department of Physiology, Institute of Basic Medical Sciences, University of Oslo

Abstract

स्पाइनल कॉर्ड चोट (एससीआई) आम तौर पर विशेष रूप से मस्तिष्क से रीढ़ की हड्डी को उतरते तंतुओं को नुकसान के माध्यम से, विनाशकारी न्यूरोलॉजिकल घाटा कारण बनता है। शोध के एक प्रमुख वर्तमान क्षेत्र अनुकूली प्लास्टिसिटी का तंत्र है कि एससीआई निम्नलिखित सहज या प्रेरित कार्यात्मक वसूली आबाद पर केंद्रित है। उठना, कार्यात्मक वसूली कैसे अनुकूली प्लास्टिसिटी परिवर्तन रीढ़ की हड्डी के रूप में विकसित के बारे में दिलचस्प सवाल उठाने जीवन में अधिक से अधिक जल्दी होने की सूचना है। इस गतिशील की जांच की सुविधा के लिए, हम नवजात माउस में एक विज्ञान मॉडल विकसित किया है। मॉडल बाल चिकित्सा एससीआई, जो बहुत कम अध्ययन किया जाता है के लिए प्रासंगिक है। क्योंकि वयस्क में तंत्रिका प्लास्टिसिटी प्रारंभिक जीवन 1 में तंत्रिका plasticity के रूप में ही तंत्र के कुछ शामिल है, इस मॉडल संभावित वयस्क एससीआई के लिए भी कुछ प्रासंगिकता हो सकती है। यहाँ हम नवजात माउस में एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य रीढ़ की हड्डी संपीड़न (एससीसी) चोट पैदा करने के लिए पूरी प्रक्रिया का वर्णनके रूप में जल्दी के रूप में प्रसव के बाद (पी) दिन 1. एससीसी एक दिया रीढ़ की हड्डी के स्तर पर एक laminectomy प्रदर्शन से हासिल की है और उसके बाद (यहाँ वक्ष के स्तर को 9-11 पर वर्णित) एक संशोधित Yasargil धमनीविस्फार मिनी क्लिप का उपयोग तेजी से सेक और रीढ़ की हड्डी दबाव हटाना । पहले से वर्णित के रूप में, घायल नवजात चूहों व्यवहार घाटे के लिए परीक्षण या electrophysiological और उच्च throughput ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग तकनीकों का उपयोग करते हुए 1 synaptic कनेक्टिविटी के पूर्व vivo शारीरिक विश्लेषण के लिए बलिदान किया जा सकता है। इससे पहले चल रही है और व्यवहार और शारीरिक आकलन का उपयोग अध्ययन hindlimb गतिशीलता का एक नाटकीय, तीव्र हानि 2 हफ्तों के भीतर एक पूरा कार्यात्मक वसूली के द्वारा पीछा किया, और पहचान synaptic कनेक्शन 1 उतरते के स्तर पर कार्यात्मक circuitry में परिवर्तन का पहला सबूत प्रदर्शन किया है।

Protocol

इस प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल नॉर्वे में राष्ट्रीय पशु अनुसंधान प्राधिकरण द्वारा अनुमोदित किया गया है (Forsøksdyrutvalget, स्थानीय प्रयोगात्मक स्वीकृति संख्या 12.4591) यूरोपीय संघ जानवरों की देखभाल के नियमों के अनुपालन में (रूस यूरोपीय प्रयोगशाला पशु विज्ञान एसोसिएशन)। प्रयासों प्रयुक्त जानवर और उनकी पीड़ा की संख्या को कम करने के लिए किए गए थे। इस लेख में प्रसव के बाद (पी) दिन 1 जंगली प्रकार आईसीआर (Imprinting नियंत्रण क्षेत्र) चूहों (जैक्सन, संयुक्त राज्य अमरीका) पर इस्तेमाल किया प्रक्रिया में वर्णित है, लेकिन एक ही दृष्टिकोण भी बाद के चरणों में इस्तेमाल किया जा सकता है।

1. नवजात चूहों के लिए एक गैस संज्ञाहरण प्रणाली के निर्माण (चित्रा 1)

  1. एक सिरिंज की नोक से एक नाक मुखौटा बनाएँ। प्लास्टिक टयूबिंग (- लाल ट्यूबिंग और चित्रा 2A1 चित्रा 1) के साथ 3 तरह पानी निकलने की टोंटी को यह कनेक्ट।
  2. नाक मुखौटा के पक्ष में एक छोटा सा छेद ड्रिल और से गैस की बाढ़ दूर करने के लिए प्लास्टिक टयूबिंग के लिए इस कनेक्टमुखौटा। ट्यूबिंग या तो एक वैक्यूम पंप एक मामूली नकारात्मक दबाव के लिए सेट पर, या एक धूआं हुड (- चमकीले हरे ट्यूबिंग चित्रा 1) में अंत।
  3. एक 150 मिमी x 25 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश (चित्रा 2A2) से एक संज्ञाहरण कक्ष बनाओ।
    1. एक तरफ, एक छेद काफी बड़े माउस के सिर और नाक मुखौटा समायोजित करने के लिए बनाते हैं।
    2. विपरीत तरफ, दो छोटे छेद के माध्यम से जो करने के लिए और नाक मुखौटा से प्लास्टिक की ट्यूब डाला जा सकता है (- लाल और चमकीले हरे रंग ट्यूबिंग, क्रमशः चित्रा 1) बनाते हैं।
    3. ढक्कन के शीर्ष पर एक तीसरे छेद बनाने के लिए और इस के लिए एक तिहाई प्लास्टिक ट्यूब है कि वैक्यूम पंप (चित्रा 1 - गहरे हरे रंग ट्यूबिंग) पर समाप्त होता देते हैं। इस तीसरे ट्यूब का उद्देश्य यह सुनिश्चित करना है कि किसी भी अतिरिक्त गैस गया है कि नाक नकाब से आउटलेट द्वारा कब्जा कर लिया गया नहीं निकाल दिया जाता है।
  4. प्रयोगशाला पकवान के किसी भी प्रकार के तल में एक छेद बनाने के द्वारा एक नींद कक्ष का निर्माण करने के लिए काफी बड़ी है कि गमाउस ontain और एक चिकनी और भी बढ़त है (डिश के उद्घाटन गैस के रिसाव को रोकने के लिए मेज के साथ फ्लश झूठ चाहिए)। प्लास्टिक टयूबिंग (- ब्राउन ट्यूबिंग चित्रा 1) के साथ 3 तरह पानी निकलने की टोंटी के लिए चैम्बर में छेद कनेक्ट करें। एक धूआं हुड के नीचे सोने चैम्बर रखें।
  5. Vaporizer (- पीले ट्यूबिंग और चित्रा 2A3 चित्रा 1) से आउटलेट ट्यूब के लिए एक 3 तरह पानी निकलने की टोंटी से कनेक्ट।
  6. ऑक्सीजन की आपूर्ति (- ब्लू ट्यूबिंग चित्रा 1) को vaporizer का इनलेट कनेक्ट करें।

(चित्रा 2 और 1 टेबल) एक Yasargil अस्थाई एन्यूरिज्म मिनी क्लिप संपीड़न उपकरण बनाने के लिए 2. संशोधन

  1. एक क्लैंप के साथ एक स्टैंड को मजबूती क्लिप प्रत्यय। , दृश्य नियंत्रण के लिए एक दूरबीन लूप का प्रयोग के बारे में 150 माइक्रोन एक sharpening पत्थर का उपयोग करने का एक अंतिम मोटाई के लिए एक क्लिप ब्लेड की नोक की बाहरी सतह के नीचे दायर एक ड्रिल (चित्रा 2 बी और सी) पर मुहिम शुरू की। एक stereomicroscope के तहत पॉलीथीन केशिका ट्यूबिंग (तालिका 1) की एक छोटी खिंचाव काटने के लिए एक सूक्ष्म चाकू (तालिका 1) का उपयोग करके क्लिप के लिए एक डाट बनाओ, और ब्लेड से एक पर इस जगह (चित्रा 2A4 और 2 बी और सी के आंकड़े)। इस क्लिप के पूर्ण बंद को रोकता है और मानकीकृत संपीड़न आयाम पैदा करता है। जब क्लिप बंद कर दिया है interblade दूरी के बारे में 230 माइक्रोन है। पॉलीथीन सामग्री प्रयोग के दौरान सेक कर सकते हैं, जो interblade अंतरिक्ष बदल जाएगा के रूप में एक प्रयोग के लिए एक नया डाट बनाओ।
    नोट: क्लिप के वसंत तनाव समय के साथ घटता है कि इस तरह के बारे में 80 compressions के बाद क्लिप नहीं रह डाट करने के लिए पूरी तरह से बंद कर देता है और जगह की जरूरत है।

3. तैयारी सर्जरी से पहले

  1. नींद कक्ष (चित्रा 1) में माउस प्लेस और 4% isoflurane के साथ संज्ञाहरण आरंभ (चित्रा 2A5 (चित्रा 2A3 और तालिका 1) का उपयोग कर।
  2. धीरे एक पतली प्लास्टिक संदंश के साथ पैर की उंगलियों के बीच की त्वचा की वेब pinching द्वारा माउस की वापसी पलटा टेस्ट। के रूप में नवजात चूहों को आसानी से घायल हुए हैं ध्यान से यह मत करो। तत्काल जोरदार में भी मुश्किल परिणाम बन्द रखो। बेहोश करने की क्रिया की शुरुआत में इस परीक्षण प्रदर्शन पलटा चलाता है और आवश्यक बल की राशि का एक अच्छा संकेत है।
  3. एक बार पलटा समाप्त कर दिया है, नींद कक्ष से माउस को हटाने और थूथन नाक मुखौटा है कि 4% isoflurane शुद्ध ऑक्सीजन (चित्रा 1) में मिश्रित की एक सतत आपूर्ति प्रदान करता है में डाला के साथ ऑपरेटिंग मेज पर एक प्रवण स्थिति में जगह है। सुनिश्चित करें कि वार्मिंग पैड सर्जरी के दौरान चालू किया और हाइपोथर्मिया के रूप में 37-38 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट कर दिया जाता घातक हो सकती है।
  4. पूरा पीड़ानाश को प्राप्त करने के लिए, subcutaneously स्थानीय संवेदनाहारी Bupivacain के 50 μl इंजेक्षन (2.5 मिलीग्राम / एमएल, चित्रा 2A7 और 1 टेबल)।
  5. 1-2% करने के लिए नाक का मुखौटा के लिए दिया isoflurane एकाग्रता में कमी।

4. पृष्ठीय Laminectomy

  1. सूक्ष्म नियंत्रण के तहत सर्जरी प्रदर्शन।
  2. कम से कम 30 सेकंड के लिए chlorhexidine gluconate (तालिका 1 # 19) के साथ सर्जरी के क्षेत्र की सफाई के बाद, T9-T11 पर एक 1-2 मिमी अनुप्रस्थ त्वचा चीरा एक microknife (चित्रा 2A8) का उपयोग करते हैं।
    नोट: आईसीआर नवजात चूहों में पेट का व्याख्यान चबूतरे वाला हिस्सा है, जब दिखाई यह दूध होता है, कशेरुकी स्तरों T12-T13 (चित्रा 3) का सामना करना पड़ रहा है। एक और मील का पत्थर वक्ष चमड़े के नीचे वसा ऊतकों कुल जो T8-9 के बारे में समाप्त होता है के व्याख्यान चबूतरे वाला हिस्सा है। इस ऐतिहासिक त्वचा चीरा के बाद ही दिखाई दे रहा है।
    3. (चित्रा 2A9 और A10) त्वचा खींच धीरे rostrally और दुमदारी (त्वचा को आसानी से आँसू, एक सहज और सीधे घाव बनाने) से 8-9 मिमी के लिए एक अनुप्रस्थ दिशा में त्वचा उद्घाटन चौड़ा करने के लिए। इस स्पाइनल कॉलम के लिए पर्याप्त पार्श्व पास हैं।
  3. Hemostatic जिलेटिन स्पंज के टुकड़े बाँझ (चित्रा 2A11 और तालिका 1) subcutaneously व्याख्यान चबूतरे और चीरा के लिए दुम डालने से अंतर्निहित संरचनाओं से त्वचा चीरा के किनारों वापस लेना। इस उद्घाटन मायनों में इजाफा होगा और retracting और सर्जरी के दौरान क्षेत्र ढक से त्वचा से बचाता है। hemostatic जिलेटिन स्पंज खारा उपयोग करने से पहले में भिगो करने की आवश्यकता नहीं है।
  4. रीढ़ की हड्डी को बेनकाब करने के लिए, पतली कैंची (चित्रा 2A12, और तालिका 1) का उपयोग paravertebral मांसपेशियों को काटना। कशेरुका स्तंभ के लिए मांसपेशियों के संलग्नक कट और पटल (चित्रा 4 ए) बेनकाब। नहींई यह भी है कि इस स्तर पर रीढ़ की प्रक्रिया अविकसित है।
  5. Midline पहचानें और दो ​​laminae (जो इस स्तर पर उपास्थि है) पतली कैंची (चित्रा 4 बी) के साथ के बीच transversely कटौती। ध्यान पटल और ड्यूरा (चित्रा 4C) के बीच एक पतली संदंश की एक ब्लेड जगह है, संदंश के साथ पटल समझ और इसे ध्यान से उठा जब तक एक टुकड़ा दूर टूट जाता है, ड्यूरा बरकरार (चित्रा 4D) को छोड़कर। एक 1-2 खंड लंबे laminectomy प्राप्त करने के लिए इस क्रिया को 2-3 बार।
  6. rongeurs के रूप में पतली संदंश का प्रयोग, पर्याप्त जगह हासिल करने के लिए कशेरुका नहर के भीतर क्लिप जगह के लिए द्विपक्षीय पहलू जोड़ों के कुछ हिस्सों को हटा दें। शल्य चिकित्सा क्षेत्र को साफ और hemostatic जिलेटिन स्पंज के छोटे टुकड़ों के साथ खून बह रहा नियंत्रित करते हैं।

5. रीढ़ की हड्डी संपीड़न चोट

  1. (चित्रा 2A13 और चित्रा 2 बी) क्लिप धारक में संशोधित धमनीविस्फार मिनी क्लिप खोलें और जगह वेंरिक्त स्थान के बीच पहलू में मिलती है और हड्डी में रीढ़ की हड्डी के दोनों तरफ ई ब्लेड। सुनिश्चित करें कि ब्लेड गहरा रीढ़ की हड्डी के उदर भाग को प्रभावित करने के लिए पर्याप्त डाला जाता है सुनिश्चित करें। यदि यह संभव नहीं है, पहलू जोड़ों के अधिक हटा दें।
  2. मिनी क्लिप तेजी से जारी है, क्लिप धारक के साथ जगह में पकड़े फिसलने से रोकने के लिए। 15 सेकंड के लिए संपीड़न बनाए रखें।
  3. मिनी क्लिप तेजी से खोलें और इसे हटा दें। एक सममित संपीड़न प्राप्त करने के लिए, मिनी क्लिप के उन्मुखीकरण रिवर्स, और आसानी से देखा एक गाइड के रूप में पहली संपीड़न से रक्तस्रावी शोफ द्वारा किए गए निशान का उपयोग करते हुए, एक दूसरे 15 सेकंड संपीड़न के लिए रिवर्स अभिविन्यास में क्लिप का स्थान बदलने (पहले प्रयोग से पता चला है कि इस सममित ऊतकीय और शारीरिक घाटे उत्पन्न करता है, जबकि एकल compressions नहीं 1) करते हैं। ड्यूरा संपीड़न से क्षतिग्रस्त नहीं किया जाना चाहिए।
  4. क्षेत्र को साफ और hemostatic जिलेटिन स्पंज के टुकड़े के साथ रक्तस्तम्भन बनाए रखें।
  5. Hemostatic जिलेटिन स्पंज के टुकड़े है कि सर्जरी के शुरू में त्वचा चीरा के किनारों के अंतर्गत रखा गया निकालें और बाँझ 6.0 सिवनी और एक सुई धारक (चित्रा 2A14 और 15) के साथ त्वचा चीरा बंद करें।
  6. subcutaneously इंजेक्षन 0.75 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन Buprenorphine (चित्रा 2A16) एक इंसुलिन सिरिंज (300 μl, 30 ग्राम) का उपयोग कर बाँझ पीबीएस में पतला।

6. पश्चात की देखभाल

  1. नाक नकाब से माउस निकालें और 30 डिग्री सेल्सियस पर एक तापमान नियंत्रित चैम्बर सेट में जगह तक संज्ञाहरण बंद पहनता है और माउस सतर्क हो जाता है (1-3 मानव संसाधन आमतौर पर पर्याप्त है)।
  2. डायजेपाम (चित्रा 2B17) इंजेक्षन intraperitoneally मां (8 ग्राम / किग्रा शरीर के वजन) में। यह एक अकर्मण्यता है कि पहली रात के दौरान नरभक्षण का खतरा घटता है, जब इस जोखिम सबसे ज्यादा है बनाता है।
  3. कूड़े को संचालित माउस लौटें।
  4. कूड़े एल हैARGE (> 12 पिल्ले), unoperated पिल्ले की कुछ रियायत के तौर पर बड़े जानवरों अगर वे आकार में भिन्न होते हैं, को हटाने के दूध के लिए प्रतिस्पर्धा कम करने के लिए। संचालित पिल्ले की मातृ देखभाल आईसीआर लाइन में सबसे अच्छा है अगर कूड़े आकार पिल्ले लगभग 9 है।
  5. दर्द प्रबंधन के लिए, एक इंसुलिन सिरिंज (300 μl, 30 ग्राम) का उपयोग कर पहली पश्चात दिनों के दौरान Buprenorphine (0.75 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन) subcutaneously एक बार एक दिन के लिए प्रशासन,। चमड़े के नीचे इंजेक्शन के लिए एक उचित मात्रा 30-50 μl है। नवजात चूहों वोकलिज़ेशन और आंदोलन में दर्द के अच्छे संकेतक हैं।
  6. एक अंक पत्र का उपयोग पोषण, शरीर के वजन, निर्जलीकरण, दर्द, घाव भरने, मूत्र प्रतिधारण और संक्रमण की स्थिति का मूल्यांकन करने के घायल चूहों के एक दैनिक परीक्षा प्रदर्शन। प्राप्त स्कोर के अनुसार, इस तरह के असामान्य पोषण के मामले में एक बाँझ बाल पोषण समाधान (तालिका 1 # 18) के इंजेक्शन के रूप में, विशेष देखभाल प्रदान करते हैं। स्कोर शीट भी0; मानवीय समापन बिंदु मानदंड परिभाषित करता है। एक माँ कि घायल पिल्ले को अस्वीकार नहीं करता है सबसे अच्छा caregiver है।
  7. मूत्राशय में शिथिलता के असामान्य मामले में, एक दिन में दो बार मूत्राशय मालिश प्रदर्शन समारोह बहाल है जब तक। यह एक हाथ में एक लापरवाह स्थिति में माउस रखने और एक उंगलियों का उपयोग कर एक rostro दुम दिशा में धीरे पेट के निचले हिस्से की मालिश द्वारा किया जाता है।

Representative Results

रीढ़ की हड्डी संपीड़न चोट और समारोह के नुकसान

पहले से वर्णित के रूप में पूर्व शल्य चिकित्सा, शल्य चिकित्सा और पश्चात की प्रक्रियाओं के अनुकूलन के द्वारा, नवजात माउस में एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य संपीड़न एससीआई मॉडल 1 प्राप्त किया जा सकता है। पॉलीथीन डाट क्लिप (चित्रा 2 बी और सी) की एक ब्लेड पर रखा क्लिप का पूरा बंद होने से रोकता है और लगभग 230 माइक्रोन में लगातार अंतर-ब्लेड दूरी रहता है। , एक सममित चोट में दो compressions परिणाम के बीच में क्लिप के उन्मुखीकरण के पीछे के रूप में ऊतकीय sequelae द्वारा न्याय (चित्रा 5 ए और 1)। इसके तत्काल बाद मिनी क्लिप हटाने, संकुचित रीढ़ की हड्डी के ऊतकों रक्तस्रावी नील और सूजन के कारण गहरा हो जाता है। घायल रीढ़ की हड्डी के धारावाहिक वर्गों Eosin और Hematoxylin पहले से ही एक दिन एक के लिए दाग का अवलोकनजब घाव केंद्र (चित्रा 5 ए) के करीब पहुंच fter चोट के ऊतकों की क्रमिक गिरावट का पता चलता है। घाव में intraspinal गुहाओं की उपस्थिति या रक्त असामान्य नहीं है।

व्यवहार मूल्यांकन, सर्जरी के बाद कुछ ही घंटों गैर वजन के तहत hindlimb प्रक्षेप पथ पर नज़र रखने के असर की स्थिति से उदाहरण के लिए, एससीसी घायल चूहों में hindlimb गतिशीलता का एक नाटकीय हानि से पता चलता नकली नियंत्रण चूहों जिसमें केवल एक laminectomy किया जाता है की तुलना में (चित्रा 5 ब और 1) । जब तक माउस अन्य व्यवहार परीक्षण है कि अपने ही बोझ 1 असर की आवश्यकता होती है प्रदर्शन करने में सक्षम है इस परीक्षा में दोहराया जा सकता है।

मृत्यु दर और वसूली सर्जरी के बाद

Intraoperative मृत्यु दर मुख्य रूप से एपनिया और isoflurane के उच्च एकाग्रता के लिए पर्याप्त anesthesi हासिल करने की जरूरत की वजह से हृदय की गिरफ्तारी की वजह से हैए। शल्य प्रोटोकॉल में स्थानीय संवेदनाहारी Bupivacaine परिचय isoflurane एकाग्रता की कमी परमिट और इस तरह घटता काफी मृत्यु दर। 20 से अधिक पशुओं सहित हाल ही में एक प्रयोगात्मक श्रृंखला में, intraoperative मृत्यु दर शून्य था। इसके विपरीत, पोस्ट ऑपरेटिव अस्तित्व मुख्य रूप से उनकी मां द्वारा संचालित चूहों की स्वीकृति से प्रभावित है। एक महत्वपूर्ण सुधार हुआ जब चिंता और आक्रामकता कूड़े 1 से संचालित चूहों लौटने से पहले डायजेपाम (आईपी 8 ग्राम / किग्रा शरीर के वजन) मां के एक इंजेक्शन देने से कम हो गया था। स्वीकृति और ऑपरेशन चूहों के पश्चात की वसूली पेट में दूध की मौजूदगी से नजर रखी जा सकती है। एक P1-P7 माउस है कि नशे में धुत दूध है के पेट स्पष्ट रूप से सफेद और पेट की त्वचा (चित्रा 3) के माध्यम से दिखाई दे रहा है। संचालित है, नकली नियंत्रण और unoperated चूहों में खिलाने की तुलना घायल के पोषण की स्थिति का आकलन करने के लिए उपयोगी हैडी चूहों। Unoperated चूहों बनाम संचालित का विकास का आकलन से पता चलता है कि पहली पोस्ट ऑपरेटिव दिन के दौरान एक छोटे से वजन घटाने के बावजूद संचालित चूहों के विकास की अवस्था में तेजी से उसके बाद normalizes (चित्रा 6)। मूत्राशय रोग या संक्रमण से संबंधित मृत्यु दर के रूप में लंबे समय के रूप में 7 सप्ताह के लिए अध्ययन चूहों में भी कभी नहीं देखा गया।

<टीडी> 10
छवि में संख्या। 2 नाम निर्माता / प्रदाता संदर्भ # संपर्क टिप्पणी
1 प्लास्टिक सिरिंज (30 या 50 मिलीलीटर)
2 प्लास्टिक पेट्री डिश (150 x 25 मिमी)
3 Fortec isoflurane vaporizer Cyprane http://www.mssmedical.co.uk/products/new-vaporisers/ हम का उपयोग करें और उत्पादन से बाहर पुराने उपकरण, नए डिवाइस के लिए लिंक की जाँच
4 ए Yasargil अस्थायी धमनीविस्फार मिनी क्लिप AESCULAP FE681K http://www.aesculapusa.com/assets/base/doc/DOC697_Rev_C-Yasargil_Aneurysm_Clip.pdf
4 बी ललित बोर पॉलीथीन केशिका ट्यूबिंग आईडी 0.58 मिमी, आयुध डिपो 0.96 मिमी स्मिथ मेडिकल 800/100/200 http://www.smiths-medical.com/industrialproducts/8/39/
5 Isoflurane (Forene) एबट GmbH & Co. http://www.life-sciences-europe.com/product/forene-abbott-gmbh-wiesbaden-group-narcotic-germany-west-2001-1858.html
6 Marcain (Bupivacain) एस्ट्राजेनेका http://www.astrazeneca.co.uk/medicines01/neuroscience/Product/marcaine
7 Insuline सिरिंज 0.3 मिलीलीटर 30 जी x 8mm VWR 80086-442 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4646138
8 अल्ट्रा ठीक माइक्रो चाकू 5 मिमी अत्याधुनिक ललित विज्ञान उपकरण 10315-12 http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp=
कैट और suchkatalog = 0019900000 और reloadmenu = 1
9 अतिरिक्त ठीक Graefe संदंश - 0.5 मिमी टिप ललित विज्ञान उपकरण 1153-10 http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp=
कैट और suchkatalog = 0055700000 और reloadmenu = 1 		वास्तव में आवश्यक नहीं है, अक्सर दांत भी बड़े हैं
संदंश SuperGrip विषमलिंगी ललित विज्ञान उपकरण 00632-11 http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp=
कैट और suchkatalog = 0053500000 और reloadmenu = 1 		दो संदंश जरूरी हैं
1 1 Spongostan स्पेशल 70 x 50 x 1 मिमी FERROSAN
12 Vannas वसंत कैंची - 2 मिमी ब्लेड विषमलिंगी ललित विज्ञान उपकरण 15000-03 http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp=
कैट और suchkatalog = 0012800000 और reloadmenu = 1
13 Vario क्लिप को लागू करने संदंश Aesculap FE502T http://www.aesculapusa.com/assets/base/doc/DOC697_Rev_C-Yasargil_Aneurysm_Clip.pdf
14 vicryl 6; 0 (Ethicon) जॉनसन और जॉनसन J105G
15 Diethrich सूक्ष्म सुई धारक 11-510-20 http://trimed-ltd.com/Products/Suture-Instruments/Micro-Needle-Holders-With-Tungsten-Carbide-Inserts/Ref-11-29.html
16 Temgesic (buprenorphine) शेरिंग प्लॉ
17 Stesolid (डायजेपाम) Actavis इसके अलावा वैलियम के रूप में जाना
18 Pedamix फ्रेसेनियस काबी http://www.helsebiblioteket.no/retningslinjer/pediatri/mage-tarm-lever-ern%C3%A6ring/parenteral-ern%C3%A6ring
19 Klorhexidinsprit (chlorhexidine gluconate) FresenIUS काबी D08A C02 http://www.felleskatalogen.no/medisin/klorhexidinsprit-fresenius-kabi-klorhexidinsprit-farget-fresenius-kabi-fresenius-kabi-560639

तालिका 1. एक नवजात माउस में एक क्लिप संचालित रीढ़ की हड्डी संपीड़न चोट पैदा करने के लिए उपकरण और उपकरणों की सूची।

आकृति 1
चित्रा 1. संज्ञाहरण सेटअप के योजनाबद्ध। यह योजनाबद्ध संज्ञाहरण नवजात माउस के लिए डिज़ाइन किया गया सेटअप, प्रारंभिक संज्ञाहरण और सर्जरी के दौरान निरंतर संज्ञाहरण के लिए एक नाक मुखौटा डिवाइस के लिए एक नींद चैम्बर के साथ प्रस्तुत करता है।

चित्र 2
चित्रा 2. प्रधानाचार्य उपकरण और संपीड़न क्लिप। (ए) प्रक्रिया के दौरान इस्तेमाल किया उपकरण। संख्या 1 टेबल। (बी और सी) प्रत्येक ब्लेड मैन्युअल के बारे में 150 माइक्रोन मोटाई के नीचे छंटनी की नोक के साथ एक Yasargil अस्थायी धमनीविस्फार मिनी क्लिप में इस्तेमाल एनोटेशन के अनुरूप हैं। पॉलीथीन ट्यूबिंग (तालिका 1) का एक टुकड़ा से बना एक डाट क्लिप का पूर्ण बंद को रोकने के लिए ब्लेड से एक पर रखा गया है। स्केल पट्टी: 2 मिमी। अनुप्रयोग: क्लिप applicator (# 12 ए में); अनुसूचित जनजाति:। डाट यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. नवजात आईसीआर माउस में रीढ़ की हड्डी के स्तर का preoperative मूल्यांकन के लिए मील का पत्थर। (ए) एस में सफेद दूध के साथ एक P1 आईसीआर माउस के पार्श्व दृश्य ले जाना। पेट के व्याख्यान चबूतरे वाला हिस्सा T12-T13 रीढ़ की हड्डी के स्तर से मेल खाती है। (बी) के एक प्रवण स्थिति में संज्ञाहरण के तहत P1 आईसीआर माउस। हालांकि अधिक कठिन (ए) की तुलना में कल्पना करने के लिए, पेट दूध से भरा पहचानने योग्य है। पेट के व्याख्यान चबूतरे वाला हिस्सा T12-T13 रीढ़ की हड्डी के स्तर को दर्शाता है। स्केल सलाखों: 0.5 सेमी।

चित्रा 4
चित्रा 4 पृष्ठीय laminectomy। (ए) paravertebral मांसपेशियों के विच्छेदन। ध्यान दें कि इस उम्र में रीढ़ की प्रक्रिया अविकसित है। (बी) पतली कैंची से पटल के आड़ा सेक्शनिंग। (सी) पटल और ड्यूरा के बीच एक पतली संदंश की एक ब्लेड का परिचय। प्रवेश बिंदु नोक से दिखाया गया है। (डी) पटल का हटाया। स्केल पट्टी: 2 मिमी।

फ़ाइलें / ftp_upload / 53498 / 53498fig5.jpg "/>
चित्रा 5. histological और P1 पर रीढ़ की हड्डी संपीड़न चोट के बाद व्यवहार परिणामों। (ए) Eosin और Hematoxylin चोट उपरिकेंद्र से अलग दूरी पर (चोट के बाद 1 दिन) एक घायल माउस से रीढ़ की हड्डी वर्गों में धुंधला हो जाना। (बी) forelimb और hindlimb trajectories के प्रतिनिधि निशान चोट के बाद या एक दिखावा नियंत्रण laminectomy के बाद 6 घंटे मनाया। शीर्ष पर निशान जानवर की एक पार्श्व दृश्य से देखा प्रक्षेप पथ का प्रतिनिधित्व करते हैं। तल पर निशान जानवर के उदर पहलू से देखा प्रक्षेप पथ का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह भी 1 देखें। स्केल पट्टी: 250 माइक्रोन। डीएच: पृष्ठीय सींग; एल, छोड़ दिया; आर: सही; एससीसी: रीढ़ की हड्डी संपीड़न; VH:। उदर सींग यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6 तुलनात्मक विकास घटता। हिस्टोग्राम वजन प्रसव के बाद 9 दिन के लिए प्रसव के बाद दिन 1 से unoperated और एससीसी घायल चूहों का लाभ दिखा।

Discussion

इस लेख में P1 चूहों में एक क्लिप जनित एससीसी की चोट के लिए प्रक्रियाओं वर्णित हैं। एक ही प्रक्रिया भी बाद के चरणों में किया जा सकता है। संपीड़न चोटों पी -5, P7, P9 और P12 (Züchner, एट अल।, तैयारी में पांडुलिपि) में सफलतापूर्वक प्रदर्शन किया गया। सभी प्रसव के बाद के चरणों में, सामान्य संज्ञाहरण शुद्ध ऑक्सीजन में वाष्पीकृत isoflurane साथ प्राप्त की है, लेकिन संवेदनाहारी परिणाम उम्र पर बहुत निर्भर करता है। P1-पी 4 में आरंभिक प्रयास में, इससे पहले स्थानीय संज्ञाहरण प्रोटोकॉल में पेश किया गया था, यह एक गहरी और लंबे समय तक बेहोश करने की क्रिया को प्राप्त करना कठिन अपर्याप्त बेहोश करने की क्रिया और अधिक मात्रा के बीच एक संकीर्ण खुराक प्रभाव खिड़की के कारण था। इसके अलावा, नवजात पशुओं में isoflurane की एक neurotoxic प्रभाव से संबंधित चिंताओं को 27-30 उठाया गया है। isoflurane की एक संयोजन और एक गहरी और अधिक स्थिर संज्ञाहरण में स्थानीय संवेदनाहारी Bupivacaine परिणाम है, जबकि 2-3 का एक पहलू से एक isoflurane खुराक में कमी की अनुमति है। anesthe के विभिन्न प्रकारएसआईए नवजात मूषक के लिए वर्णित किया गया है, 31,32 cryoanesthesia सहित, लेकिन cryoanesthesia में से एक संभावित असुविधा अपने न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव (33,34 द्वारा समीक्षा) है, जो एक कुशल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य चोट की पीढ़ी उलझा सकता है। बार्बीट्युरेट आधारित संज्ञाहरण वयस्कों 35,36 की तुलना में सीरम albumin और शरीर में वसा का स्तर कम होने के कारण नवजात चूहों में कम क्षमता है करने के लिए माना जाता है।

हालांकि काफी आक्रामक और दर्दनाक है, एक बार प्रक्रिया सर्जरी के दौरान मृत्यु दर की स्थापना की है कम है। हालांकि, वहाँ प्रक्रिया के दौरान महत्वपूर्ण कदम है कि विशेष रूप से ध्यान देने की जरूरत वसूली और ऑपरेशन चूहों के अस्तित्व में सुधार करने के लिए कर रहे हैं। एक महत्वपूर्ण मुद्दा पिल्ले कि सर्जरी के जीवित रहने के लिए सबसे अच्छा मौका होगा चयन करने के लिए है। जब कूड़े बड़ी है व्यक्ति पिल्ले के पोषण का राज्य बदलता रहता है। अपरिहार्य खून बह रहा है कि सर्जरी के दौरान होता है के अलावा, संचालित पिल्ले घंटे खर्चमां से दूर है, और वे अक्सर अगली सुबह होने से पहले दूध नहीं पीता। इस प्रकार यह एक फायदा पिल्ले पहले से ही पेट में दूध की एक निश्चित राशि है कि चयन करने के लिए है। यह पेट की त्वचा P0 से P7 के माध्यम से आसानी से दिखाई दे रहा है।

पहली रात के दौरान संचालित पिल्ला मां द्वारा की जा रही cannibalized के महान खतरे में है। संचालित चूहों की तुलना में आधे से अधिक इस मॉडल की प्रारंभिक विकास के दौरान पिंजरे में रक्त के स्पष्ट संकेत के साथ, निम्नलिखित सुबह याद कर रहे थे। Necrophagy, नरभक्षण और कृन्तकों में भ्रूण हत्या दशकों 37-40 के लिए अध्ययन किया गया है। इस अध्ययन में, नरभक्षण केवल एक बार देखा था, लेकिन necrophagy की तुलना में अधिक होने की संभावना स्पष्टीकरण माना जाता था क्योंकि पिल्ले कि पिंजरे में लौट रहे थे जैसे कि अच्छी हालत में आम तौर पर कर रहे थे कि रात के दौरान प्राकृतिक कारणों से मौत असंभव लग रहा था। इस तरह के डायजेपाम के रूप में एक प्रतिवर्ती औषधीय एजेंट का उपयोग चिंता और मैं आक्रामकता को कम करने के विचार के लिए प्रेरित कियाn मां (41 द्वारा समीक्षा)। डायजेपाम के intraperitoneal इंजेक्शन बहुत स्थिति में सुधार हुआ है, कम से कम 20% करने के लिए 60% से अधिक से पहली रात के दौरान मृत्यु दर छोड़ने।

मुर्गियों को मारने और पश्चात की वापसी के बाद कूड़े के रूप में संभव के रूप में छोटे से परेशान द्वारा कूड़े का आकार कम करने के अतिरिक्त तत्वों है कि संचालित जानवरों लाभ प्राप्त कर सकते हैं। हालांकि, मां के साथ ही संचालित पिल्ले छोड़ने फायदेमंद नहीं है। संचालित / unoperated पिल्ले का सबसे अच्छा संतुलन लाइन के अनुसार भिन्न हो सकते हैं, लेकिन 4-5 से संचालित पिल्ले (चोट या नकली) एक साथ छोड़ने 3-4 unoperated पिल्ले के साथ आईसीआर और एस.सी.आई.डी-आईसीआर चूहों के लिए सबसे अच्छा परिणाम दे दी है।

एक सामान्य अर्थ में, यह नवजात एससीआई मॉडल के मुख्य सीमा यह है कि नवजात रीढ़ की हड्डी वयस्क रीढ़ की हड्डी से कई मायनों में अलग है, और इस तरह प्रयोगात्मक परिणाम है कि वयस्क एससीआई मॉडल से प्राप्त उन लोगों के लिए तुलना कर रहे हैं प्रदान नहीं कर सकते है। इस तरह के मतभेद समग्र आकार में शामिल हैं औररीढ़ की हड्डी की मात्रा, सेल नंबर, कम प्रतिनिधित्व ऐसे oligodendrocytes, अपरिपक्व प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और अपरिपक्व neuronal सर्किट के रूप में विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं की। इस मॉडल में प्रयोगों के निष्कर्षों इसलिए ध्यान से विचार किया जाना चाहिए। दूसरी ओर, मॉडल बाल चिकित्सा एससीआई के अपेक्षाकृत कम से जांच परिदृश्य के लिए प्रासंगिक है। इसके अलावा, वयस्क एससीआई मॉडल के संबंध में स्पष्ट कमजोरी भी एक संभावित ताकत यह प्लास्टिसिटी तंत्र है कि, हालांकि वयस्क रीढ़ की हड्डी में न्यूनतम वर्तमान, एक चिकित्सकीय सब्सट्रेट का प्रतिनिधित्व कर सकता है, तो फिर से बहाल की व्याख्या की अनुमति हो सकती है। यह बोधगम्य है कि नवजात या यहां तक ​​कि भ्रूण की स्थिति की बहाली के कम विकसित कोशिकाओं या ऊतक के आरोपण के माध्यम से या अभिकर्मकों कि पहले विकास की विशेषताओं के साथ वयस्क ऊतक पैदा साथ इलाज के द्वारा लागू किया जा सकता है। Perineuronal जाल को खत्म करने एंजाइमों का उपयोग बाद दृष्टिकोण 42,43 का एक उदाहरण है।

जैसे, transection, hemisection, impactors, गुब्बारा संपीड़न, संदंश क्रश, स्थिर वजन संपीड़न, आदि उपकरणों को प्रभावित करने के लिए सम्मान के साथ, इस दिशा में प्रयास एससीआई मॉडल में में हुई है है वयस्क मूषक, जहां इस तरह की गति, बल और अवधि के रूप में प्रभाव के कई मानकों को चालाकी से किया जा सकता है (44 द्वारा समीक्षा)। एक और दृष्टिकोण, कम उपकरण शामिल है, केर-Lougheed धमनीविस्फार क्लिप 45,46 के एक संशोधन कार्यरत हैं। के रूप में impactor जबकि क्लिप mimics समवर्ती ischemia के कुछ डिग्री के साथ एक संपीड़न चोट एक contusion चोट mimics इन 2 दृष्टिकोण के पूरक हैं। क्योंकि पर्याप्त आकार की कमी और नवजात चूहों का अधिक से अधिक असुरक्षा की, उच्च मृत्यु दर अब सर्जरी के रूप में अच्छी तरह से विकसित करने की लागत के साथ जुड़ेछोटे पैमाने पर उपकरणों oping, यह एक impactor जनित नील दृष्टिकोण के बजाय एक क्लिप जनित संपीड़न विकसित करने के लिए चुना गया था। यह एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध धमनीविस्फार मिनी क्लिप आदत डाल नवजात चूहों 1 की कशेरुका स्तंभ के आकार को समायोजित करने के द्वारा पूरा किया गया। एक डाट जोड़ना एक मानकीकृत संपीड़न चौड़ाई सुनिश्चित करता है, और जब तक क्लिप के तनाव डाट की सीमा को compresses के रूप में, कम से कम चौड़ाई में स्थिर चरण के दौरान संपीड़न के बल थोड़ा भिन्न चाहिए। क्या मानकीकृत नहीं है, इसके गतिशील चरण के दौरान संपीड़न के वेग है, क्योंकि यह अपने जीवनकाल में क्लिप तनाव परिवर्तन के रूप में अलग अलग होंगे। संपीड़न के स्थिर चरण गतिशील चरण की तुलना में बहुत लंबे समय तक रहता है, और सुझाव है कि रीढ़ की हड्डी के ऊतकों मिनी क्लिप ब्लेड के खिलाफ एक जवाबी के ज्यादा डालती कम है के रूप में, यह संभावना है कि चोट की गंभीरता पर सबसे अधिक निर्भर है स्थिर चरण। यह, हालांकि, परीक्षण किया जाना बना रहता है। चोटगंभीरता को स्थिर संपीड़न बल और अवधि, संपीड़न और decompression के वेग, मिनी क्लिप की स्थिति, और एक ही स्थल पर प्रदर्शन किया compressions की संख्या सहित कई कारकों पर निर्भर होने की संभावना है। इस प्रकार, इन मानकों में मिश्रित भिन्नता कमजोर से गंभीर चोट कठोर अनुशासन की एक स्पेक्ट्रम की पीढ़ी में परिणाम सकता है। परिवर्तनशीलता के लिए क्षमता के बावजूद, हमारे पहले प्रकाशित एक अध्ययन में 1 हम ऊतकीय, शारीरिक और व्यवहार के स्तर पर अनुरूप परिणाम प्राप्त है, इसलिए वहाँ थोड़ा सुझाव है कि स्वीकार्य मानकीकरण प्राप्त करने के लिए मुश्किल है। हम ध्यान दें कि कि अध्ययन में हम हर स्तर पर मान्यता के कई तरीकों का इस्तेमाल किया, के रूप में चित्रा 5 में दिखाया गया है जैसे हवा-कदम के रूप में व्यवहार परीक्षण भी शामिल है।

इस नवजात एससीआई मॉडल में चोट एक्सोन का एक निश्चित अनुपात की जरूरत नहीं पड़ती है और इस तरह फिर से modelin के माध्यम से अनुकूली प्लास्टिसिटी जानने के लिए अनुकूल स्थिति प्रदान करता हैबख्शा कनेक्शनों की जी और नए सर्किट के गठन। इसके अलावा, के बाद से नवजात माउस अच्छी तरह से कई प्रयोगात्मक विधियों द्वारा जांच के लिए अनुकूल है, यह संभव कार्यात्मक वसूली और एक एकीकृत दृष्टिकोण के साथ अनुकूली प्लास्टिसिटी, व्यवहार परीक्षण, प्रतिगामी और अग्रगामी axonal ट्रेसिंग, immunohistochemistry, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और उच्च सहित अध्ययन करने के लिए इस मॉडल का उपयोग करने के लिए है -throughput ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग 1। एक उदाहरण के रूप में, हम ब्रेन स्टेम के पूर्व vivo wholemount तैयारियाँ और घायल रीढ़ की हड्डी 1 में उच्च throughput कैल्शियम इमेजिंग का उपयोग विशिष्ट उतरते आदानों के स्तर पर नेटवर्क फिर मॉडलिंग प्रदर्शित करने के लिए इस एकीकृत दृष्टिकोण का फायदा उठाया। इस न्यूरो optogenetic और optogenetic औषध विज्ञान उपकरण का उपयोग कर रीढ़ की हड्डी में न्यूरॉन्स की विशिष्ट उप-जनसंख्या के बीच synaptic कनेक्शन के पुनर्गठन का आकलन करने से आगे धकेल दिया जा सकता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plastic syringe (30 or 50 ml)
Plastic Petri dish (150 x 25 mm)
Fortec isoflurane vaporizer Cyprane We use and old device out of production, check the link for newer device
Yasargil temporary aneurysm mini-clip Æsculap FE681K
Fine-Bore Polyethylene tubing ID 0.58 mm, OD 0.96 mm Smiths Medical 800/100/200
Isoflurane (Forene) Abbott GmbH & Co. KG
Marcain (Bupivacain) AstraZeneca
Insuline seyringe 0.3 ml 30 G x 8 mm VWR 80086-442
Ultra Fine Micro Knife 5 mm cutting edge Fine Science Tools 10315-12
Extra Fine Graefe Forceps – 0.5 mm Tip Fine Science Tools 1153-10 Not really necessary, often the teeth are too large
Forceps SuperGrip Straight Fine Science Tools 00632-11 Two forceps are necessary
Spongostan Special 70 x 50 x 1 mm Ferrosan
Vannas Spring Scissors – 2 mm Blades Straight Fine Science Tools 15000-03
Vario Clip Applying Forceps Aesculap FE502T
Vicryl 6–0 (Ethicon) Johnson and Johnson J105G
Diethrich micro needle holder 11-510-20
Temgesic (buprenorphine) Schering-Plough
Stesolid (diazepam) Actavis Also known as Valium
Pedamix Fresenius Kabi
Klorhexidinsprit (chlorhexidine gluconate) Fresenius Kabi D08A C02

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References

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Züchner, M., Glover, J. C., Boulland, J. L. A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model. J. Vis. Exp. (109), e53498, doi:10.3791/53498 (2016).

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