Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

En Neonatal Mouse ryggmargskompresjon Injury Model

Published: March 27, 2016 doi: 10.3791/53498
Automatic Translation
1,2, 2,3, 2,3
1Department of Neurosurgery, Oslo University Hospital, 2Norwegian Center for Stem Cell Research, Oslo University Hospital, 3Laboratory of Neural Development and Optical Recording (NDEVOR), Department of Physiology, Institute of Basic Medical Sciences, University of Oslo

Abstract

Ryggmargsskade (SCI) fører vanligvis ødeleggende nevrologiske utfall, særlig gjennom skade fibrene synkende fra hjernen til ryggmargen. En stor aktuell forskningsområde er fokusert på mekanismer for adaptive plastisitet som ligger bak spontan eller indusert funksjonell restitusjon etter SCI. Spontan funksjonelle utvinning er rapportert å være større tidlig i livet, heve interessante spørsmål om hvordan adaptive plastisitet endringer som ryggmargen utvikler seg. For å lette etterforskningen av denne dynamiske, har vi utviklet en SCI modell i neonatal mus. Modellen har relevans for pediatrisk SCI, som er for lite studert. Fordi nevrale plastisitet i den voksne involverer noen av de samme mekanismene som nevral plastisitet tidlig i livet en, kan denne modellen potensielt ha noen relevans også for voksne SCI. Her beskriver vi hele prosedyren for å generere en reproduserbar ryggmargskompresjon (SCC) skade på neonatal musså tidlig som postnatal (P) dag 1. SCC oppnås ved å utføre en laminektomi på et gitt spinal nivå (her beskrevet på thorax nivå 9-11) og deretter ved hjelp av en modifisert Yasargil aneurisme mini-klipp til raskt å komprimere og dekomprimere ryggmargen . Som tidligere beskrevet, kan den skadde neonatale mus testes for adferdsmessige mangler eller ofres for ex vivo fysiologisk analyse av synaptisk tilkobling ved hjelp av elektrofysiologiske og high-throughput optisk opptak teknikker 1. Tidligere og pågående studier ved hjelp av atferdsmessige og fysiologiske vurdering har vist en dramatisk, akutt nedsatt bakben motilitet etterfulgt av en fullstendig funksjonell bedring innen 2 uker, og det første tegn på endringer i funksjonelle kretser på nivå med identifiserte synkende synaptiske forbindelser 1.

Protocol

Dette eksperimentelle protokollen er godkjent av forsøksdyrutvalget i Norge (Forsøksdyrutvalget, lokal eksperimentell godkjenningsnummer 12,4591) i samsvar med EU dyr omsorg forskrifter (Federation European Laboratory Animal Science Association). Arbeidet ble gjennomført for å redusere antall dyr som brukes og deres lidelser. I denne artikkelen fremgangsmåten anvendt på postnatal (P) dag 1 vill-type ICR (Imprinting kontrollregion) mus (Jackson, USA) er beskrevet, men den samme fremgangsmåte kan også anvendes på senere stadier.

1. Bygging av et gassanestesi System for Neonatal Mus (figur 1)

  1. Bygg en nesemaske fra spissen av en sprøyte. Koble denne til 3-veis stoppekran med plastrør (Figur 1 - rød slange og figur 2A1).
  2. Bore et lite hull i siden av nesen maske og koble denne til plastrør for å fjerne overløp av gass framaske. Ende røret, enten ved en vakuumpumpe satt for et svakt undertrykk, eller i en avtrekkshette (figur 1 - lys grønn tubing).
  3. Lag en anestesi kammer fra en 150 mm x 25 mm plast petriskål (figur 2A2).
    1. På den ene siden, lage et hull stort nok til å romme hodet av musen og nesemaske.
    2. På motsatt side, få to mindre hull hvorigjennom plastrørene til og fra nesemasken kan settes inn (figur 1 - rødt og grønt lys rør, henholdsvis).
    3. Foreta en tredje hull på oversiden av lokket og festes til denne en tredje plastrør som ender på vakuumpumpe (figur 1 - mørk grønn tubing). Hensikten med dette tredje rør er for å sikre at enhver overskytende gass som ikke har blitt fanget opp av utløpet fra nesen masken er fjernet.
  4. Bygg en søvn kammer ved å lage et hull i bunnen av enhver form for lab rett som er stor nok til contain mus og har en glatt og jevn kant (åpning av fatet må ligge i flukt med bordet for å hindre lekkasje av gass). Treffe hullet i kammeret til den tre-veis stoppekran med plastrør (figur 1 - brun tubing). Plasser søvn kammer under en avtrekkshette.
  5. Koble til en 3-veis kran til utløpsrøret fra fordamper (Figur 1 - gul slange og figur 2A3).
  6. Koble innløpet av fordamperen til oksygenforsyningen (figur 1 - blå tubing).

2. Endring av en Yasargil Midlertidig aneurisme Mini-klipp for å lage den Compression Tool (figur 2 og tabell 1)

  1. Fest klippet fast til et stativ med en klemme. Ved hjelp av en binokulær lupe for visuell kontroll, file ned den ytre overflate av tuppen av hvert klipp blad til en endelig tykkelse på ca. 150 um ved hjelp av et bryne som er montert på en bore (Fig 2B og C). Foreta en stopper for klippet ved å kutte en kort strekning av polyetylen kapillarrør (tabell 1) under et stereomikroskop ved hjelp av en mikrokniv (tabell 1), og plassere denne på en av knivene (figur 2A4 og Fig 2B og C). Dette hindrer full nedleggelse av klippet og skaper standardiserte komprimering dimensjoner. Når klippet er lukket interblade Avstanden er ca 230 mikrometer. Lag en ny stopper for hvert forsøk som polyetylen materialet kan komprimere under bruk, noe som ville endre interblade plass.
    Merk: fjærspenning av klippet avtar over tid slik at etter ca 80 kompresjoner klippet ikke lenger lukker helt til stopperen og må skiftes.

3. Forberedelse før operasjon

  1. Plasser musen i søvn kammeret (figur 1) og initiere anestesi med 4% isofluran (figur 2A5 (figur 2A3 og tabell 1).
  2. Test tilbaketrekking refleks av musen ved forsiktig klemming nettet av huden mellom tærne med en tynn plast tang. Gjør dette nøye som nyfødte mus er lett skadet. Klemming for hardt resulterer i umiddelbar blåmerker. Å utføre denne testen ved begynnelsen av sedasjon utløser refleks og gir en god indikasjon på mengden av kraft som er nødvendig.
  3. Når refleksen er avskaffet, fjerne musen fra sovekammer og legg den i en utsatt posisjon på operasjonsbordet med inn i nese maske som gir en kontinuerlig tilførsel av 4% isofluran blandet i ren oksygen (figur 1) snute. Sørg for at oppvarmingen pad er slått på og satt til 37-38 ° C som hypotermi under operasjonen kan være dødelig.
  4. For å oppnå fullstendig analgesi, injiseres subkutant 50 ul av lokalbedøvelses bupivacain (2,5 mg / ml, figur 2A7 og tabell 1) for å utføre injeksjonen.
  5. Redusere konsentrasjonen isofluran levert til nesemasken til 1-2%.

4. Dorsal laminectomy

  1. Utføre kirurgi henhold mikroskopiske kontroll.
  2. Etter rengjøring operasjonen med klorheksidinglukonat (tabell 1 # 19) i minst 30 sekunder, lage en 1-2 mm tverrgående snitt i huden på T9-T11 bruker en microknife (figur 2A8).
    Merk: I ICR neonatal mus rostral del av magen, synlig når det inneholder melk, vender ryggvirvel nivåer T12-T13 (figur 3). Et annet landemerke er rostralt del av thorax subkutant fettvev aggregat som ender på ca T8-9. Dette landemerket er bare synlig etter snitt i huden.
    3. (figur 2A9 og A10) for å utvide huden åpning i en tverrgående retning til 8-9 mm ved å trekke huden forsiktig rostrally og kaudalt (huden rives lett, som skaper en glatt og rett sår). Dette gir tilstrekkelig sideveis adgang til ryggsøylen.
  3. Trekke kantene av huden innsnitt fra underliggende strukturer ved å sette inn sterile stykker av hemostatisk svamp gelatin (fig 2A11 og tabell 1) subkutant rostralt og kaudalt for innsnitt. Dette forstørrer åpning og hindrer huden fra å trekke tilbake og skjule området under operasjonen. Den hemostatiske svampen gelatin trenger ikke å være fuktet i saltvann før bruk.
  4. Å eksponere ryggraden, dissekere paravertebral musklene ved hjelp av tynne saks (figur 2A12, og tabell 1). Skjær vedlegg av muskler til ryggsøylen og utsett lamina (figur 4A). Ikkee også at på dette stadiet rygg prosessen er lite utviklet.
  5. Identifiser midtlinjen og kuttes på tvers mellom de to lameller (som på dette stadiet er brusk) med tynne saks (figur 4B). Plassere ett blad av en tynn tang mellom lamina og dura (figur 4C) nøye, ta tak i lamina med pinsett og løft den forsiktig opp til et stykke bryter bort, forlater dura intakt (figur 4D). Gjenta dette 2-3 ganger for å få en 1-2 segment lang laminektomi.
  6. Ved hjelp av de tynne tang som Rongeurs, fjerne deler av fasett leddene bilateralt for å få nok plass til å plassere klippet i ryggmargskanalen. Rengjør kirurgiske området og kontrollere blødninger med små biter av hemostatisk gelatin svamp.

5. ryggmargskompresjon Injury

  1. Åpne den modifiserte aneurisme mini-klipp i klippet holderen (Figur 2A13 og figur 2B) og sted the blader på hver side av ryggmargen i mellomrommene mellom fasett blir med og ledningen. Kontroller at knivene er satt dypt nok til å påvirke den ventrale delen av ryggmargen. Hvis dette ikke er mulig, må du ta mer av fasett leddene.
  2. Slipp mini-klipp raskt, holder den på plass med klips holder for å hindre den i å skli. Opprettholde komprimering for 15 sek.
  3. Åpne mini-klipp raskt og fjerne det. For å oppnå en symmetrisk komprimering, reversere retningen på mini-klippet, og bruker lett sett mark gjort av hemoragisk ødem fra første kompresjon som en guide, omplassere klippet i motsatt retning for en andre 15-sek komprimering (før forsøket viste at dette genererer symmetriske histologiske og fysiologiske mangler, mens enkelt kompresjoner ikke 1). Dura bør ikke bli skadet av kompresjon.
  4. Rengjør området og opprettholde hemostase med biter av hemostatisk gelatin svamp.
  5. Fjern de stykker av hemostatisk svamp gelatin som ble plassert under kantene av huden innsnitt ved starten av operasjonen, og lukke innsnitt med steril 6,0 sutur og en nåleholder (figur 2A14 og 15).
  6. Injisere subkutant 0,75 mg / kg kroppsvekt Buprenorfin (figur 2A16) fortynnet i steril PBS ved anvendelse av en insulinsprøyte (300 ul, 30 G).

6. Postoperativ Care

  1. Fjern musen fra nese maske og legg den i et temperaturkontrollert kammer sett ved 30 ° C før anestesi slites av, og musen blir alert (1-3 timer er vanligvis tilstrekkelig).
  2. Injisere Diazepam (figur 2B17) intraperitonealt i moder (8 g / kg kroppsvekt). Dette skaper en dvale som reduserer faren for kannibalisme i løpet av den første natten, når denne risikoen er størst.
  3. Returner opererte mus til kullet.
  4. Hvis kullet er large (> 12 unger), fjerne noen av de unoperated valpene, fortrinnsvis større dyrene om de varierer i størrelse, for å redusere konkurransen for melken. Omsorg for de opererte valpene er best i ICR linje hvis den kullstørrelse er rundt ni valper.
  5. For smertebehandling, administrere buprenorfin (0,75 mg / kg kroppsvekt) subkutant en gang daglig i løpet av de første postoperative dag, ved anvendelse av en insulinsprøyte (300 ul, 30 G). En passende volum for subkutan injeksjon er 30-50 mikroliter. I neonatal mus vokalisering og uro er gode indikatorer på smerte.
  6. Utføre en daglig undersøkelse av de skadede mus ved hjelp av en poengsum ark for å evaluere ernæring, kroppsvekt, dehydrering, smerte, sårheling, urinretensjon og infeksjonsstatus. Ifølge poengsum oppnådd, gir spesiell omsorg, som for eksempel injeksjoner av en steril pediatrisk ernæring løsning (tabell 1 # 18) i tilfelle unormal ernæring. Stillingen ark også0; definerer humane endepunktkriterier. En mor som ikke avviser de skadde valpene er den beste omsorgspersonen.
  7. I uvanlig tilfelle av blæredysfunksjon, utføre blære massasje to ganger om dagen til funksjon er gjenopprettet. Dette gjøres ved å plassere musen i liggende stilling i den ene hånden og massere nedre del av magen forsiktig i en rostro-kaudal retning ved hjelp av en fingertupp.

Representative Results

Ryggmargskompresjon skade og tap av funksjon

Som beskrevet tidligere, ved å optimalisere preoperativ, kirurgiske og postoperative prosedyrer, kan en reproduserbar kompresjons SCI modell i den neonatale mus oppnås en. Den polyetylen stopperen plassert på ett blad av klippet (figur 2B og C) hindrer full nedleggelse av klippet og holder den inter-blad avstand konsekvent på ca 230 mikrometer. Reversering orienteringen av klippet i mellom de to kompresjoner resulterer i en symmetrisk skade, bedømt ved histologisk følgetilstander (figur 5A og 1). Umiddelbart etter mini-klips fjerning, blir den komprimerte ryggmarg vev mørkere på grunn av hemoragisk bloduttredelse og ødem. Observasjon av seriesnitt av den skadde ryggmargen farget for eosin og Hematoxylin allerede en dagfter skade avslører gradvis forverring av vevet når du nærmer lesjon episenteret (figur 5A). Tilstedeværelsen av intraspinal hulrom eller blod i lesjonen er ikke uvanlig.

Behavioral vurdering, for eksempel ved å spore bakben baner under ikke-vektbærende forhold noen timer etter operasjonen, viser en dramatisk svekkelse av bakben bevegeligheten i SCC skadet mus sammenlignet med sham kontroll mus der bare en laminektomi utføres (Figur 5B og 1) . Denne testen kan gjentas inntil musen er i stand til å utføre andre adferdstester som krever bærer sin egen vekt en.

Dødelighet og gjenoppretting etter operasjonen

Intraoperativ dødelighet skyldes hovedsakelig apné og hjertestans som følge av den høye konsentrasjonen av isofluran nødvendig for å oppnå tilstrekkelig Anesthesien. Vi presenterer lokalbedøvelse Bupivacaine inn i det kirurgiske protokoll tillater reduksjon av isofluran konsentrasjon og derved reduserer i betydelig grad dødeligheten. I en fersk eksperimentelle serier som mer enn 20 dyr, den intraoperativ mortalitet var null. I kontrast er postoperativ overlevelse hovedsakelig påvirket av aksept av opererte mus fra mor. En betydelig forbedring fant sted da angst og aggressivitet ble redusert ved å levere en enkel injeksjon av Diazepam (ip 8 g / kg kroppsvekt) for moren før retur opererte mus til kullet 1. Aksept og postoperativ gjenvinning av de opererte mus kan overvåkes ved nærvær av melk i magen. Magen av en P1-P7 mus som har drunken melk er klart hvit og synlig gjennom magehuden (figur 3). Sammenligning av fôring i operert, humbug kontroll og unoperated mus er nyttig for å vurdere ernæringsstatus av såretd mus. Vurderingen av veksten av opererte versus unoperated mus viser at til tross for et lite vekttap i løpet av den første postoperative dag, vekstkurven av opereres mus normaliserer hurtig deretter (figur 6). Dødelighet i forbindelse med blæredysfunksjon eller infeksjon ble aldri observert selv i mus studert så lenge som 7 uker.

<td> 10
Nummer i fig. 2 Navn Produsent / leverandør Henvisning # link Kommentar
1 Plastsprøyte (30 eller 50 ml)
2 Petriskål av plast (150 x 25 mm)
3 Fortec isofluran vaporizer Cyprane http://www.mssmedical.co.uk/products/new-vaporisers/ Vi bruker og gamle enheten ut av produksjon, sjekk linken for nyere enhet
4a Yasargil midlertidig aneurisme mini-klipp Aesculap FE681K http://www.aesculapusa.com/assets/base/doc/DOC697_Rev_C-Yasargil_Aneurysm_Clip.pdf
4b Fin boringen polyetylen kapillarrør ID 0,58 mm, OD 0,96 mm Smiths Medical 800/100/200 http://www.smiths-medical.com/industrialproducts/8/39/
5 Isofluran (Forene) Abbott GmbH & Co. KG http://www.life-sciences-europe.com/product/forene-abbott-gmbh-wiesbaden-group-narcotic-germany-west-2001-1858.html
6 Marcain (bupivacain) Astrazeneca http://www.astrazeneca.co.uk/medicines01/neuroscience/Product/marcaine
7 Insuline sprøyte 0,3 ml 30 G x 8mm VWR 80086-442 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4646138
8 Ultra Fine Micro Knife 5 mm cutting edge Fin Science Tools 10315-12 http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp=
Kat & suchkatalog = 0019900000 & reloadmenu = 1
9 Ekstra Fin Græfe tang - 0,5 mm Tip Fin Science Tools 1153-1110 http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp=
Kat & suchkatalog = 0055700000 & reloadmenu = 1 		Egentlig ikke nødvendig, ofte tennene er for store
Tang Supergrip Straight Fin Science Tools 00632-11 http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp=
Kat & suchkatalog = 0053500000 & reloadmenu = 1 		To tang er nødvendig
11 Spongostan Spesial 70 x 50 x 1 mm Ferrosan
12 Vännäs Spring Saks - 2 mm Blad Straight Fin Science Tools 15000-03 http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp=
Kat & suchkatalog = 0012800000 & reloadmenu = 1
1. 3 Vario Klipp Bruk av tang Aesculap FE502T http://www.aesculapusa.com/assets/base/doc/DOC697_Rev_C-Yasargil_Aneurysm_Clip.pdf
14 Vicryl 6-; 0 (Ethicon) Johnson og Johnson J105G
15 Diethrich mikro nål holder 11-510-20 http://trimed-ltd.com/Products/Suture-Instruments/Micro-Needle-Holders-With-Tungsten-Carbide-Inserts/Ref-11-29.html
16 Temgesic (buprenorfin) Schering-Plough
17 Stesolid (diazepam) Actavis Også kjent som Valium
18 Pedamix Fresenius Kabi http://www.helsebiblioteket.no/retningslinjer/pediatri/mage-tarm-lever-ern%C3%A6ring/parenteral-ern%C3%A6ring
19 Klorhexidinsprit (klorheksidinglukonat) Fresenius Kabi D08A C02 http://www.felleskatalogen.no/medisin/klorhexidinsprit-fresenius-kabi-klorhexidinsprit-farget-fresenius-kabi-fresenius-kabi-560639

Tabell 1. Liste over verktøy og utstyr for å generere et klipp-drevet ryggmargskompresjon skade i en neonatal mus.

Figur 1
Figur 1. Skjematisk av anestesi oppsett. Dette skjematisk presenterer anestesi oppsett utviklet for neonatal mus, med en søvn kammer for første anestesi og en nese maske enhet for fortsatt anestesi under operasjonen.

Figur 2
Figur 2. Hoved verktøy og komprimering klipp. (A) verktøy som brukes under fremgangsmåten. Tallene tilsvarer den kommentaren anvendt i tabell 1. (B og C) En Yasargil midlertidig aneurisme mini-klips med tuppen av hvert blad manuelt trimmes ned til omtrent 150 pm tykkelse. En propp laget av et stykke polyetylenrør (tabell 1) er plassert på et av bladene for å forhindre fullstendig lukning av klemmen. Skala: 2 mm. App: klipp applikator (# 12 i A); St. Stopperen Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Landmark for preoperativ vurdering av spinal nivå i neonatal ICR mus. (A) Lateral visning av en P1 ICR mus med hvit melk i s tomach. Den rostrale del av magesekken tilsvarer T12-T13 spinal nivå. (B) P1 ICR mus under narkose i en utsatt posisjon. Selv om det er vanskeligere å visualisere enn i (A), er magen er fylt med melk gjenkjennelig. Den rostrale del av magesekken indikerer T12-T13 spinal nivå. Skala barer: 0,5 cm.

Figur 4
Figur 4. Dorsal laminektomi. (A) Disseksjon av paravertebrale muskler. Legg merke til at i denne alderen rygg prosessen er underutviklet. (B) Transversal seksjonering av lamina med tynne saks. (C) Innføring av ett blad av en tynn tang mellom arket og dura. Inngangspunktet er vist ved pilspissen. (D) fjerning av arket. Skala: 2 mm.

filer / ftp_upload / 53498 / 53498fig5.jpg "/>
Figur 5. Histologisk og atferdsmessige utfall etter ryggmargskompresjon skade på P1. (A) eosin og Hematoxylin flekker i ryggmargs deler fra en skadet mus (en dag etter skade) ved forskjellig avstand fra skaden episenteret. (B) Representative spor av forbena og bakbena baner observert 6 timer etter skade eller etter en humbug kontroll laminektomi. Spor på toppen representerer baner sett fra et sideriss av dyret. Spor i bunnen representerer baner så fra den ventrale del av dyret. Se også en. Skala: 250 mikrometer. DH: dorsal horn; L, venstre; R: høyre; SCC: ryggmargskompresjon; VH:. Ventral horn Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

"Figur Figur 6. Sammenlignende vekstkurver. Histogram som viser vektøkningen av unoperated og SCC skadede mus fra postnatal dag 1 til postnatal dag 9.

Discussion

I denne artikkelen prosedyrene for et klipp generert SCC skader i P1 mus er beskrevet. De samme fremgangsmåter kan også utføres på senere stadier. Kompresjons skader ble utført med hell på P5, P7, P9 og P12 (Züchner, et al., Manuskript under forberedelse). På alle postnatal stadier, er generell anestesi oppnås med isofluran fordampet i ren oksygen, men bedøvelsen utfallet avhenger mye av alder. I innledende forsøk på P1-P4, før lokal anestesi ble innført i protokollen, var det vanskelig å oppnå en dyp og langvarig sedasjon på grunn av en smal dose-effekt vindu mellom utilstrekkelig sedasjon og overdose. I tillegg har bekymring i forbindelse med en neurotoksisk virkning av isofluran i nyfødte dyr blitt hevet 27-30. En kombinasjon av isofluran og de lokale bedøvende bupivakain gir en dypere og mer stabil anestesi mens den tillater en isofluran dosereduksjon med en faktor på 2-3. Ulike typer anesthesia har blitt beskrevet for neonatale gnagere, inkludert cryoanesthesia 31,32, men en potensiell ulempe av cryoanesthesia er dens nervecellene effekt (gjennomgått av 33,34), noe som kan komplisere generering av en effektiv og reproduserbar skade. Barbiturat-baserte anestesi antas å ha lavere effektivitet i neonatale mus på grunn av lavere nivåer av serum-albumin og kroppsfett enn hos voksne 35,36.

Selv om ganske invasiv og traumatisk, når prosedyren er etablert dødeligheten under operasjonen er lav. Det er imidlertid kritiske trinn i løpet av prosedyren som krever spesiell oppmerksomhet for å øke utvinningen og overlevelse av de opererte mus. En viktig sak er å velge unger som vil ha best sjanse til å overleve operasjonen. Når kullet er stort ernæringstilstanden til de enkelte valpene varierer. I tillegg til den uunngåelige blødning som forekommer under operasjonen, som drives pups bruke times bort fra moren, og de ofte ikke drikker melk før neste morgen. Det er således en fordel å velge unger som allerede har en viss mengde melk i magen. Dette er lett synlig gjennom abdominal hud fra P0 til P7.

Under den første natten operert valpen er i stor fare for å bli cannibalized av moren. Under første utviklingen av denne modellen mer enn halvparten av de opererte mus manglet i formiddag, med klare tegn til blod i buret. Necrophagy, kannibalisme og barnedrap i gnagere har blitt studert i flere tiår 37-40. I denne studien kannibalisme ble bare sett en gang, men ble ansett som en mer sannsynlig forklaring enn necrophagy fordi valpene som ble returnert til buret var typisk i så god form som døde av naturlige årsaker i løpet av natten virket usannsynlig. Dette fikk ideen om å bruke en reversibel farmakologisk middel som Diazepam å redusere angst og aggressivitet in mor (anmeldt av 41). Intraperitoneal injeksjon av Diazepam sterkt forbedret situasjonen, slippe dødelighet i løpet av den første natten fra mer enn 60% til mindre enn 20%.

Redusere kullstørrelse ved culling og forstyrre kullet så lite som mulig etter postoperativ avkastning er flere elementer som kan dra de opererte dyr. Men, slik at bare drives valper med moren er ikke gunstig. Den beste balansen mellom opererte / unoperated valper kan variere i henhold til linjen, men for ICR og SCID-ICR mus forlater 4-5 opererte unger (skader eller simulert) sammen med 3-4 unoperated unger ga de beste resultatene.

I en generell betydning, er den viktigste begrensning av denne neonatale SCI modellen er at den neonatale ryggmarg skiller seg på mange måter fra den voksen ryggmarg, og kan således ikke gi eksperimentelle resultater som er sammenlignbare med dem som ble oppnådd fra voksne SCI modeller. Slike forskjeller inkluderer totale størrelse ogvolum av ryggmargen, celle nummer, underrepresentasjon av spesifikke celletyper som for eksempel oligodendrocytter, umoden immunresponser og umodne nevrale kretser. Konklusjonene fra forsøkene i denne modellen må derfor vurderes nøye. På den annen side, er modellen relevant for den relativt mindre undersøkt scenario for pediatrisk SCI. Videre er tydelig svakhet i forhold til voksne SCI modeller er også en potensiell styrke som det kan gi klarlegging av plastisitet mekanismer som, selv om minimal bevart i den voksne ryggmargen, kan representere en terapeutisk underlaget hvis gjeninnsatt. Det kan tenkes at gjeninnføringen av nyfødte eller embryonale vilkår blir implementert gjennom implantering av mindre utviklede celler eller vev eller ved behandling med reagenser som skape den voksne vev med tidligere utviklingstrekk. Ved hjelp av enzymer for å eliminere perineuronal garn er et eksempel på sistnevnte tilnærming 42,43.

for eksempel tran, hemisection, impactors, ballong komprimering, tang knuse, statisk vekt komprimering, etc. Med hensyn til å påvirke enheter innsats i denne retningen har resultert i SCI modeller voksen gnagere der flere parametre av virkningen som hastighet, styrke og varighet kan manipuleres (gjennomgått av 44). En annen tilnærming, som involverer mindre utstyr, benytter en modifikasjon av Kerr-Lougheed aneurisme klippet 45,46. Disse 2 tilnærminger er komplementære som anslagsligner en kontusjon skade mens klippet etterligner en kompresjonsskade med en viss grad av samtidige iskemi. På grunn av de betydelige størrelse begrensninger og større sårbarhet for neonatale mus, jo høyere dødelighet assosiert med lengre operasjoner samt kostnader til utvikoping mindre skala utstyr, ble det valgt å utvikle et klipp generert kompresjon i stedet for en anslagsgenerert kontusjon tilnærming. Dette ble oppnådd ved å tilpasse et kommersielt tilgjengelig aneurisme mini-klips for å tilpasse størrelsen på virvelsøylen av neonatale mus 1. Tilsetning av en propp sikrer en standardisert kompresjon bredde, og så lenge som spenningen på klemmen komprimerer til grensen av stopperen, må kraften av kompresjons under statiske fasen ved minimal bredde varierer lite. Det som ikke er standardisert er hastigheten av kompresjons under dets dynamiske fase, siden dette vil variere ettersom klips spenningsendringer i løpet av levetiden. Som den statiske fasen av komprimering varer mye lenger enn den dynamiske fase, og det er lite som tyder på at ryggmargen vev utøver mye av en motkraft mot mini-klipp bladene, er det sannsynlig at alvorlighetsgraden av skaden er mest avhengig av den statiske fase. Dette er imidlertid gjenstår å bli testet. SkadeAlvorlighetsgraden vil sannsynligvis avhenge av flere faktorer, innbefattet den statiske kompresjonskraft og varighet, hastigheten av kompresjon og dekompresjon, posisjonen til den mini klippet, og antall kompresjoner som utføres på samme sted. Således kunne kombinatorisk variasjon i disse parametre resultere i generering av et spektrum av skadegradene fra svak til alvorlig. Til tross for potensialet for variasjon, i vår tidligere publisert studie en vi fått konsistente resultater på histologisk, fysiologiske og atferdsmessige nivåer, så det er lite som tyder på at akseptabelt standardisering er vanskelig å oppnå. Vi merker oss at i den undersøkelsen vi brukte flere metoder for validering på hvert nivå, blant annet atferdstester som air-stepping, som vist i figur 5.

I denne neonatale SCI modellen skaden deler en viss andel av aksoner og derved tilveiebringer en situasjon gunstig for utløsning adaptiv plastisitet gjennom re-modeling spart tilkoblinger og dannelse av nye kretser. Dessuten, siden den neonatale mus er godt egnet for undersøkelse av mange eksperimentelle metoder, er det mulig å anvende denne modell for å studere funksjonell bedring og adaptiv plastisitet med en integrerende tilnærming med adferdstester, retrograd og antero aksonal tracing, immunhistokjemi, elektrofysiologi og høy -throughput optisk innspilling 1. Som et eksempel, tok vi nytte av denne integrerende tilnærming til å demonstrere nettverk re-modellering på nivået av spesifikke synkende innganger med høy gjennomstrømming kalsium bildebehandling i ex vivo wholemount preparater av hjernestammen og skadet ryggmarg en. Dette kan skyves ytterligere ved hjelp av nevro optogenetic og optogenetic farmakologi verktøy for å vurdere ombygging av synaptiske forbindelser mellom spesifikke subpopulasjoner av spinal nevroner.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plastic syringe (30 or 50 ml)
Plastic Petri dish (150 x 25 mm)
Fortec isoflurane vaporizer Cyprane We use and old device out of production, check the link for newer device
Yasargil temporary aneurysm mini-clip Æsculap FE681K
Fine-Bore Polyethylene tubing ID 0.58 mm, OD 0.96 mm Smiths Medical 800/100/200
Isoflurane (Forene) Abbott GmbH & Co. KG
Marcain (Bupivacain) AstraZeneca
Insuline seyringe 0.3 ml 30 G x 8 mm VWR 80086-442
Ultra Fine Micro Knife 5 mm cutting edge Fine Science Tools 10315-12
Extra Fine Graefe Forceps – 0.5 mm Tip Fine Science Tools 1153-10 Not really necessary, often the teeth are too large
Forceps SuperGrip Straight Fine Science Tools 00632-11 Two forceps are necessary
Spongostan Special 70 x 50 x 1 mm Ferrosan
Vannas Spring Scissors – 2 mm Blades Straight Fine Science Tools 15000-03
Vario Clip Applying Forceps Aesculap FE502T
Vicryl 6–0 (Ethicon) Johnson and Johnson J105G
Diethrich micro needle holder 11-510-20
Temgesic (buprenorphine) Schering-Plough
Stesolid (diazepam) Actavis Also known as Valium
Pedamix Fresenius Kabi
Klorhexidinsprit (chlorhexidine gluconate) Fresenius Kabi D08A C02

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boulland, J. -L., Lambert, F. M., Züchner, M., Strom, S., Glover, J. C. A Neonatal Mouse Spinal Cord Injury Model for Assessing Post-Injury Adaptive Plasticity and Human Stem Cell Integration. PLoS ONE. 8 (8), (2013).
  2. Raineteau, O., Schwab, M. E. Plasticity of motor systems after incomplete spinal cord injury. Nat. Rev. Neurosci. 2 (4), 263-273 (2001).
  3. Edgerton, V. R., Tillakaratne, N. J. K., Bigbee, A. J., de Leon, R. D., Roy, R. R. Plasticity of the spinal neural circuitry after injury. Annu. Rev. Neurosci. 27, 145-167 (2004).
  4. Bareyre, F. M., et al. The injured spinal cord spontaneously forms a new intraspinal circuit in adult rats. Nat. Neurosci. 7 (3), 269-277 (2004).
  5. Cai, L. L., et al. Plasticity of functional connectivity in the adult spinal cord. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B., Biol. Sci. 361 (1473), 1635-1646 (2006).
  6. Courtine, G., Song, B., et al. Recovery of supraspinal control of stepping via indirect propriospinal relay connections after spinal cord injury. Nat. Med. 14 (1), 69-74 (2008).
  7. Courtine, G., et al. Transformation of nonfunctional spinal circuits into functional states after the loss of brain input. Nat. Neurosci. 12 (10), 1333-1342 (2009).
  8. Fenrich, K. K., Rose, P. K. Axons with highly branched terminal regions successfully regenerate across spinal midline transections in the adult cat. J. Comp. Neurol. 519 (16), 3240-3258 (2011).
  9. Fenrich, K. K., Rose, P. K. Spinal interneuron axons spontaneously regenerate after spinal cord injury in the adult feline. J. Neurosci. 29 (39), 12145-12158 (2009).
  10. Farrar, M. J., et al. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber. Nat. Methods. 9 (3), 297-302 (2012).
  11. Oshima, Y., et al. Intravital multiphoton fluorescence imaging and optical manipulation of spinal cord in mice, using a compact fiber laser system. Lasers Surg. Med. 46 (7), 563-572 (2014).
  12. Débarre, D., Olivier, N., Supatto, W., Beaurepaire, E. Mitigating phototoxicity during multiphoton microscopy of live Drosophila embryos in the 1.0-1.2 µm wavelength range. PloS One. 9 (8), e104250 (2014).
  13. Kasumacic, N., Glover, J. C., Perreault, M. -C. Segmental patterns of vestibular-mediated synaptic inputs to axial and limb motoneurons in the neonatal mouse assessed by optical recording. J. Physiol. 588 (Pt 24), 4905-4925 (2010).
  14. Kasumacic, N., Glover, J. C., Perreault, M. -C. Vestibular-mediated synaptic inputs and pathways to sympathetic preganglionic neurons in the neonatal mouse. J. Physiol. 590 (Pt 22), 5809-5826 (2012).
  15. Szokol, K., Glover, J. C., Perreault, M. -C. Differential origin of reticulospinal drive to motoneurons innervating trunk and hindlimb muscles in the mouse revealed by optical recording. J. Physiol. 586 (Pt 21), 5259-5276 (2008).
  16. Szokol, K., Glover, J. C., Perreault, M. -C. Organization of functional synaptic connections between medullary reticulospinal neurons and lumbar descending commissural interneurons in the neonatal mouse. J. Neurosci. 31 (12), 4731-4742 (2011).
  17. Szokol, K., Perreault, M. -C. Imaging synaptically mediated responses produced by brainstem inputs onto identified spinal neurons in the neonatal mouse. J. Neurosci. Meth. 180 (1), 1-8 (2009).
  18. Pang, D. Spinal cord injury without radiographic abnormality in children, 2 decades later. Neurosurgery. 55 (6), 1325-1342 (2004).
  19. Lee, J. H., Sung, I. Y., Kang, J. Y., Park, S. R. Characteristics of pediatric-onset spinal cord injury. Pediatr. Int. 51 (2), 254-257 (2009).
  20. Parent, S., Mac-Thiong, J. -M., Roy-Beaudry, M., Sosa, J. F., Labelle, H. Spinal cord injury in the pediatric population: a systematic review of the literature. J. Neurotrauma. 28 (8), 1515-1524 (2011).
  21. Basu, S. Spinal injuries in children. Front Neurol. 3, 96 (2012).
  22. Chien, L. -C., et al. Age, sex, and socio-economic status affect the incidence of pediatric spinal cord injury: an eleven-year national cohort study. PloS One. 7 (6), e39264 (2012).
  23. Maier, I. C., Schwab, M. E. Sprouting, regeneration and circuit formation in the injured spinal cord: factors and activity. Philos. T. R. Soc. Lond. B. 361 (1473), 1611-1634 (2006).
  24. Schwab, M. E., Strittmatter, S. M. Nogo limits neural plasticity and recovery from injury. Curr. Opin. Neurobiol. 27, 53-60 (2014).
  25. Jakeman, L. B., Hoschouer, E. L., Basso, D. M. Injured mice at the gym: review, results and considerations for combining chondroitinase and locomotor exercise to enhance recovery after spinal cord injury. Brain Res. Bull. 84 (4-5), 317-326 (2011).
  26. Rhodes, K., Fawcett, J. Chondroitin sulphate proteoglycans: preventing plasticity or protecting the CNS? J. Anat. 204 (1), 33-48 (2004).
  27. Zhu, C., et al. Isoflurane anesthesia induced persistent, progressive memory impairment, caused a loss of neural stem cells, and reduced neurogenesis in young, but not adult, rodents. J. Cereb. Blood Flow Metab. 30 (5), 1017-1030 (2010).
  28. Loepke, A. W., et al. The effects of neonatal isoflurane exposure in mice on brain cell viability, adult behavior, learning, and memory. Anesth. Analg. 108 (1), 90-104 (2009).
  29. Rothstein, S., Simkins, T., Nunez, J. L. Response to neonatal anesthesia - effect of sex on anatomical and behavioral outcome. Neuroscience. 152 (4), 959-969 (2008).
  30. Rizzi, S., Carter, L. B., Ori, C., Jevtovic-Todorovic, V. Clinical anesthesia causes permanent damage to the fetal guinea pig brain. Brain Pathol. 18 (2), (2008).
  31. Janus, C., Golde, T. The effect of brief neonatal cryoanesthesia on physical development and adult cognitive function in mice. Behav. Brain Res. 259, 253-260 (2014).
  32. Nuñez, J. L., Koss, W. A., Juraska, J. M. Hippocampal anatomy and water maze performance are affected by neonatal cryoanesthesia in rats of both sexes. Horm. Behav. 37 (3), 169-178 (2000).
  33. Batchelor, P. E., et al. Systematic review and meta-analysis of therapeutic hypothermia in animal models of spinal cord injury. PloS one. 8 (8), e71317 (2013).
  34. Kwon, B. K., et al. Hypothermia for spinal cord injury. The Spine Journal. 8 (6), 859-874 (2008).
  35. Benjamin, M. M. Outline of veterinary clinical pathology. , 3rd ed, (1978).
  36. Cunningham, M. G., McKay, R. D. G. A hypothermic miniaturized stereotaxic instrument for surgery in newborn rats. J. Neurosci. Methods. 47 (1-2), 105-114 (1993).
  37. Lane-Petter, W. Cannibalism in rats and mice. Proc. R. Soc. Med. 61 (12), 1295-1296 (1968).
  38. Gandelman, R., Simon, N. G. Spontaneous pup-killing by mice in response to large litters. Dev. Psychobiol. 11 (3), 235-241 (1978).
  39. Taylor, G. T. Urinary odors and size protect juvenile laboratory mice from adult male attack. Dev. Psychobiol. 15 (2), 171-186 (1982).
  40. Weber, E. M., Algers, B., Hultgren, J., Olsson, I. A. Pup mortality in laboratory mice -- infanticide or not? Acta Vet Scand. 55 (1), 83 (2013).
  41. Crawley, J. N. Exploratory behavior models of anxiety in mice. Neurosci. Biobehav. Rev. 9 (1), 37-44 (1985).
  42. Kwok, J. C. F., Heller, J. P., Zhao, R. -R., Fawcett, J. W. Targeting inhibitory chondroitin sulphate proteoglycans to promote plasticity after injury. Methods Mol. Biol. 1162, 127-138 (2014).
  43. Kwok, J. C. F., Afshari, F., Garcìa-Alìas, G., Fawcett, J. W. Proteoglycans in the central nervous system: plasticity, regeneration and their stimulation with chondroitinase ABC. Restor. Neurol. Neurosci. 26 (2-3), 131-145 (2008).
  44. Young, W. Spinal cord contusion models. Prog. Brain Res. 137, 231-255 (2002).
  45. Rivlin, A. S., Tator, C. H. Regional spinal cord blood flow in rats after severe cord trauma. J. Neurosurg. 49 (6), 844-853 (1978).
  46. Rivlin, A. S., Tator, C. H. Effect of duration of acute spinal cord compression in a new acute cord injury model in the rat. Surg. Neurol. 10 (1), 38-43 (1978).
  47. Joshi, M., Fehlings, M. G. Development and characterization of a novel, graded model of clip compressive spinal cord injury in the mouse: Part 1. Clip design, behavioral outcomes, and histopathology. J. Neurotrauma. 19 (2), 175-190 (2002).
  48. Joshi, M., Fehlings, M. G. Development and characterization of a novel, graded model of clip compressive spinal cord injury in the mouse: Part 2. Quantitative neuroanatomical assessment and analysis of the relationships between axonal tracts, residual tissue, and locomotor recovery. J. Neurotrauma. 19 (2), 191-203 (2002).

Tags

Medisin nevrovitenskap ryggmargsskade neonatal mus kirurgi klipp komprimering plastisitet
En Neonatal Mouse ryggmargskompresjon Injury Model
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Züchner, M., Glover, J. C.,… More

Züchner, M., Glover, J. C., Boulland, J. L. A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model. J. Vis. Exp. (109), e53498, doi:10.3791/53498 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter