Protocol
Alle eksperimentelle prosedyrer ble godkjent av University of Virginia Institutional Animal Care og bruk komité.
NB: Figur 1 viser en skjematisk oversikt over de eksperimentelle prosedyrer.
1. Utarbeidelse av Oocytter
- Pre-prime X. laevis hunner med 150 U of Gravid Mare Serum gonadotropin (PMSG) ca en uke i forkant av eggcelle isolasjon. Injisere en ml 150 U / ml PMSG inn rygg lymfe sac med en cc steril sprøyte med 29 G nål.
- Forberede løsninger for eggcelle injeksjon og eggcelle-dyr cap analysen.
- Forbered Ca ++ / Mg ++ -fri OR2 (OR2-): 82 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,5 mM Na 2 HPO 4, 50 mM HEPES pH 7,2.
- Forbered OR2: OR2- pluss 1 mM CaCl 2 og 1 mM MgCI2.
- Forbered OCM: 60% Leibovitz L15, 0,4 mg / ml BSA, 100 ug / ml Gentamycin, pH 7,8.
- PrePare 1x MBS: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,7 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 5 mM HEPES (pH 7,8), 2,5 mM NaHCO3.
- Forbered 3% Ficoll i 1x MBS.
- Forbered 1x NAM: 110 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM Ca (NO 3) 2, 1 mM MgSO4, 0,1 mM EDTA, 1 mM NaHCO3, 2 mM Na 3 PO 4, pH 7,4.
- Bedøve kvinnen i en 0,03% oppløsning av etyl 3-aminobenzoat metansulfonatsaltet (MS222) i 0.1x MBS (først å oppløse 0,3 g MS222 i 10 ml 95% etanol, deretter fortynnet i 1 L 0.1x MBS) ved å plassere frosk i oppløsning for 10 - 15 minutter, eller til ikke svarer.
- Sjekk at anestesi er komplett ved å slå bedøvet frosk på ryggen for å sikre at det ikke svare (ufullstendig bedøvede frosker bevege lemmer eller slå kroppen over).
- Kirurgisk isolere eggstokkene fragmenter ved å gjøre en abdominal snitt gjennom hud og kropp vegg med skalpell blad, isolere eggstokkvev med pinsettog sakser. Plasser eggstokkene fragmenter inn OR2-. Lukk kroppsveggen med en 3-0 silke sutur på en 24 mm buet nål og lukke huden separat med de samme sting. Tillate utvinning av kvinnelig i 1 g / l akvarium salt i vann.
- Bruke fin pinsett, tåre eggstokkvev i små (10 - 20 eggceller) biter og overføring til frisk OR2-.
- Defolliculate ovarian fragmenter i 2,0 mg / ml kollagenase A i OR2- ved å røre forsiktig på rysteapparat i 1 time, overføring til friskt kollagenase og omrøring i en ytterligere time.
- Vask Oocytter 10 ganger i OR2 [inneholder Ca ++ / Mg ++], forkaste mindre eggceller.
- Vask ubefruktede egg i OCM to ganger og overføre til frisk OCM. Isolere Stage VI oocytter av størrelse ved visuell inspeksjon og kast umodne (mindre) oocytter: Trinn VI oocytter som er større enn umodne oocytter med jevn pigmentering i dyret halvkule og er omtrent 1,2-1,4 mm i diameter.
- Oppretthold ubefruktede egg ved 18 - 20 ° C in OCM før injeksjon. Merk: Agarose-belagt petriskåler kan brukes til å minimere stikke av ubefruktede egg til parabolen.
2. Injeksjon av Library Avskrifter
- Tilbered en retnings cDNA-bibliotek 15 ved hjelp av RNA ekstrahert ved et passende trinn av utvikling (f.eks neural plate stadium 14 10). Kjøp en cDNA bibliotek eller konstruere man bruker et kommersielt kit per oversikten i de fire trinnene nedenfor.
- Isolere ca 5 mikrogram mRNA ved hjelp av et produkt for å berike for poly (A) + RNA (se tabell of Materials) og følge produsentens instruksjoner. Merk: transkripter som skal benyttes til å fremstille cDNA-biblioteket kan begrenses til en induserende vev (slik som det nevrale plate, etter microdissection av det ønskede vev), eller kan være fra hele embryoer på et bestemt tidspunkt.
- Produsere cDNA med et kommersielt kit, etter produsentens anvisninger.
- Ligere ca 20 ng cDNA inn en Vetco Grayr som følger med den kommersielle kit eller en annen egnet vektor. En passende plasmid vektor inneholder sekvenser for mRNA stabilitet, for eksempel 5'-β-globin og 3 poly (A) sekvenser (pCS2 +, pTnT, pCS105).
- Transform ligation inn kompetente bakterieceller ved hjelp av leverandørens anbefalte protokoll for varme sjokk transformasjon.
Merk: Alternativt er kommersielt tilgjengelig en samling av åpen leseramme (ORFeome) kloner og kan brukes til å generere transkripsjoner for injeksjon.
- Forbered 10 bassenger av plasmider av 10 mars til 10 april kompleksitet (april 10-mai 10 totalt kompleksitet). Dette representerer 10 plater med 1000 - 10 000 kolonier hver.
- Plate bibliotek kultur på 10 15 cm LB-ampicillinplater, vokse 12-18 timer ved 37 ˚C, og samle kolonier fra hver av lett trykk med et glass spreader i 7 ml LB.
- Forbered en glyserol lager fra 0,5 ml (legg til 0,2 ml steril glyserol og oppbevares ved -20 &# 730; C), og bruke de resterende 6,5 ml til å forberede DNA med en standard kommersielt tilgjengelig DNA miniprep kit følge produsentens anvisninger.
- Linearize pooled plasmid DNA (1,0 til 2,0 mikrogram) med passende restriksjonsenzym fordøye 16 ved 37 ˚C til 1 - 1,5 time. Isolere det lineariserte DNA med fenol / kloroform-ekstraksjon etterfulgt av etanolutfelling og resuspensjon i vann i henhold til spesifikasjonene for RNA-polymerase settet benyttet. Syntetisere følelse RNA med et kommersielt RNA polymerase kit følge produsentens anvisninger.
- Forbered nåler for mikroinjeksjon (ved hjelp av en nål avtrekker med glass kapillarrør) på ca 20 mikrometer i diameter; måle nål tips om en sammensatt mikroskop med en kalibrert okulær mikrometer. Merk: Needle avtrekkere innstillinger må være empirisk bestemt på å produsere en nål med en fin spiss slik at når brutt med fin pinsett gir spissen ønsket størrelse.
- Forbered (presse leire innjevnt lag på bunnen av fatet) leire-lined 35 x 10 mm petriskåler med parallelle spor å holde oocytter på plass i løpet av mikroinjeksjon; produsere grooves med et kjøpesenter sonde eller Pasteur pipette smeltet på spissen i flammer. Som et alternativ til leire, forberede agarose retter gjør fordypninger med en elastomer mold 17. Overføre ubefruktede egg med en vid boring pipette til 3% Ficoll i 1X MBS (ca 2 ml) i rader i leire-lined retter.
- Bruke microinjector, fyll nål med en ng / nl RNA og justere balansen for å produsere svakt positivt trykk (for å hindre utarbeidelse av eggcelle cytoplasma).
- Injisere ubefruktede egg med ca 20 nl RNA i ekvator regionen. Tillat en time for injisert oocytter å forbli i Ficoll-MBS, deretter overføre forsiktig til 1x MBS. Inkuber i 8 - 24 timer ved 20 ° C før dyret cap assay.
3. Animal Cap-analysen
- Forbered 3 / 4x NAM og få fin pinsett, hår sløyfe, buede dekk fragmenter, leire-lined dishes med koppformede fordypninger å holde oocytter. Gjør buede dekk fragmenter ved å bryte hverandre dekkglass i små fragmenter (ca. 1 - 2 mm x 2 - 4 mm) og passerer gjennom flammen til kantene polish og henge ned, produsere et buet stykke.
- Gjødsle X. laevis egg 18 gjennom in vitro eller naturlig parring og kultur til gastrula stadier (10 - 11 timer etter befruktning ved RT) i 0.1x MBS før sortering av scenen; samle mid-gastrula (trinnet 11 - 11,5) 10 embryoer.
- Overfør embryo til en petriskål omtrent halvfull med 3 / 4x NAM. Ved hjelp av to par fine tang, fjerne fertilisering (vitelline) membran fra gastrulae.
- Transfer Oocytter til 3 / 4x NAM (ca. 2 ml) i leire-lined retter og immobilisere i individuelle inntrykk i leire, som produserer inntrykk å imøtekomme individuelle embryoer som sporene ble beskrevet ovenfor.
- Overfør embryo til leire-lined retter og kutte dyre caps av gastrulae bruker to par fine tang. Vær nøye med å isolere dyr cap ectoderm bare og ikke ekvatoriale vev 18.
- Plassere et dyr hetten på dyret halvkule av hver eggcelle med den indre overflaten av dyret lokket kontakter oocyte. Hold rekombinanter sammen ved påføring av buet glass dekkglass fragment og påføring av trykk nedover på glasset, flatere ektoderm som dekkglass i kontakt med leire (animal caps kan forbli åpen med det indre lag eksponert på overflaten av den eggcelle i 6 - 8 timer eller lengre ).
Merk: Alternativt plassere dyret cap inn en leire innrykk med sin innside vendt oppover og plassere en eggcelle på hetten; feste det rekombinante med små utvidelser av leire. - Kultur ved 20 ° C inntil kontroll embryo kommer til ønsket scene for analysen.
- Separat rekombinant ved å fjerne dekk / leire og isolere ectoderm med pinsett og et hår sløyfe.
- Fix ectodermal fragmenter for en time i MEMFA (3,8%formaldehyd i MEM [0,1 M MOPS pH 7,4, 2 mM EGTA og 1 mM MgSO4]).
- Overføre fragmenter (og kontroll embryoer) fra MEMFA til etanol og oppbevares ved -20 ˚C.
4. Analyse av Response i ektoderm ved in situ hybridisering (ISH)
- Forberede løsninger for ISH.
- Forbered 1x PBS: 0,01 M fosfatbufret saltløsning, NaCl 0,138 M, pH 7,4
- Forbered PBS-Tween (AT): 1 x PBS, 0,1% Tween-20
- Forbered 100x Denhart løsning: 2% BSA, 2% Polyvinylpyrrolidon, 2% Ficoll
- Forbered Hybridisering Buffer: 50% formamid, 5x SSC, 1 mg / ml gjær RNA torula, 1 ug / ml heparin, 1 x Denhart oppløsning, 0,1% Tween-20, 0,1% CHAPS, 10 mM EDTA, DEPC-H 2 O
- Forbered Maleinsyre Buffer (MAB): 100 mM maleinsyre, 150 mM NaCl, pH 7.5
- Forbered MAB + blokk: MAB, 2% blokkering reagens (varme til 60 ˚C å oppløse)
- Forbered alkalisk fosfatase (AP) Buffer: 100 mm TrispH 9,5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0,1% Tween, dH 2 O
- Forbered RNA Probe.
- Ved hjelp av en kommersiell RNA polymerase kit og grave-NTP-blanding, legger til et 1,5 ml rør (50 ul reaksjon): 25,5 ul DEPC-H2O, 10 pl 5X transkripsjonsbuffer, 2,5 ul 10 x grave-NTP-blanding, 5 pl 100 mM DTT, 2 ul RNasin, 2 ul linearisert DNA-templat (~ 1 ug / ul), 3 pl RNA polymerase og inkuberes 37 ° C i 90 min.
- Tilsett 2 ul RNA-polymerase og inkuberes 37 ° C i 60 minutter.
- Sjekk 2 mL av reaksjon på 1% agarosegel.
- Tilsett 1 mL RQ1 RNase-fri DNase og inkuberes 37 ° C i 20 min.
- Utfelles sonden ved å tilsette 50 ul DEPC-H2O, 25 pl 10 M ammoniumacetat og 313 ul etanol. Oppbevar ved -20 ˚C over natten (O / N) og deretter gjenopprette RNA ved sentrifugering ved 13 800 xg i 20 min. Vask med 500 mL 75% etanol, spinne kort, må du fjerneetanol og tillate pellet å lufttørke. Tilsett 50 ul DEPC-H2O
- Legg Hybridisering buffer til en endelig konsentrasjon på ~ 0,5 ug / ul.
- Forbered Tissue for hybridisering. Med mindre annet er angitt, fylle ampuller til toppen med hver løsning endring beskrevet (ca. 4 ml).
- Fjern etanol fra ampuller og overføre embryoer til 75% etanol / Ptw, deretter 50% etanol / Ptw i 10 minutter hver, horisontalt på rocker.
- Vask tre ganger i Ptw for 5 min hver på rocker.
- Overføring til 10 ug / ul proteinase K behandling i PTW; rocke rør vertikalt 15 min.
- Skyll to ganger 10 minutter hver i 0,1 M Triethanolamine pH 7,8 - rocke rør vertikalt.
- Legg 12.5 mL eddiksyre til rør og rock vertikalt 5 min. Gjenta med 12,5 mL eddiksyre-anhydrid i 5 min.
- Vask i PTW 5 min vertikalt på rocker.
- Refix i 4% paraformaldehyde 20 min på rocker. Heat Hybridisering Buffertil 60 ˚C.
- Vask tre ganger i Ptw for 5 min hver på rocker.
- Fjern alle men ~ 1 ml Ptw fra hvert rør og tilsett 250 mL Hyb Buffer; virvle rør for å blande. Rock rør vertikalt 5 min.
- Bytt ut med 60 ˚C Hyb Buffer (0,5 ml) og rist forsiktig ved 60 ˚C 10 min. Erstatte med fersk Hyb Buffer og agitere ved 60 ˚C to til fire timer.
- Heat probe (1 ml på 0,5 mikrogram / mikroliter i Hyb Buffer) til 60 ˚C (3 min). Fjern Hyb Buffer og legge sonde til rør. Agitere forsiktig O / N ved 60 ˚C.
- Forbered Tissue for antistoff.
- Varm Hyb buffer og 2 x SSC + 0,1% Tween-20 løsninger på 60 ° C.
- Bytt probe løsning med Hyb Buffer (lagre prober ved -20 C i 2 - 3x gjenbruk). Vask ved 60 C i 10 min.
- Vask tre ganger ved 60 ˚C i 2x SSC-Tween (20 min hver med agitasjon).
- Vask tre ganger ved 60 ˚C i 0,2x SSC-Tween (20 min hver med agitasjon).
- Vask to ganger i MTB (RT) i 15 min hver horisontalt på rocker.
- Tilsett 1 ml MTB + blokk. Vask to hr vertikalt på rocker.
- Overføring til en ml MTB + blokk som inneholder en 1/2000 Anti-digoxygenin-AP. Rock vertikalt ved 4 CO / N.
- Forbered Tissue for Color Reagens.
- Erstatt antistoff løsning med MTB; vask tre ganger i MTB 5 min hver horisontalt på rocker.
- Vask tre ganger i MAB 1 time hver horisontalt på rocker.
- Vask to ganger i AP Buffer 10 min hver horisontalt på rocker.
- Overføre vev til fler vel plast skuffen, fjerne AP Buffer og legge BM Purple reagens (~ 1 ml). Tillat reaksjonen å fortsette i mørket 5 min i O / N.
- Når egnet farging er oppnådd, overføre vev til ampuller med PTW. Vask to ganger 10 min hver i Ptw på rocker.
- Fix i Bouin løsning ved 4 Co / N på rocker.
- Skyll Bouins med tre 70% etanol / 30% Ptw vasker på RT. Fortsett to bildeopptak ved hjelp av epi-belysning og et mikroskop montert kamera, bleking eventuelt 18.
5. Sib Utvalg og Cloning
- Velg basseng med høyest aktivitet (størst respons i ectodermal vev).
- Titrere (fortynne med LB til passende tetthet) glyserol lager for bassenget med høyest aktivitet og plate ut ti nye plater med omtrent en tiendedel koloniene fra forrige trinn (med punkt 2 i protokollen ovenfor).
- Reduser basseng størrelse inntil aktiviteten er sporet tilbake til enkelt koloni.
- Oppnå DNA-sekvensen ved bruk av standard primere i vektoren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som svar på ekspresjon av mRNA injisert inn i oocytter, reagerer animalsk hetten vev ble analysert for ekspresjon av otx2 ved in situ hybridisering (figur 2 og tabell 1); otx2 er uttrykt i den presumptive linsen ektoderm (PLE) fra neural røret lukke gjennom linsen placode jevning 19. Men siden otx2 kommer også til uttrykk i den fremre nevrale ektoderm så vel som ikke-nevrale hode ektoderm utenfor PLE, er det forbundet med både nevrale og placodal responser. Bruken av foxe3 å screene biblioteket for et genprodukt stand til å produsere en linse-induktiv respons i linse kompetent dyr cap ectoderm tillatt en mer spesifikk tilnærming til målet om uttrykket kloning, siden foxe3 er uttrykt i PLE fra nevrale plate stadier og gjennom linsen vesikkeldannelse 20, til stede i tilstøtende placodal regioner, men fraværende fra neuroectoder m. Ved hjelp av kloning og ekspresjon sib utvalg protokollen ovenfor og injisere bassenger av bibliotek-transkripter, ble et gen som er i stand til å produsere foxe3 ekspresjon i dyre caps isolert (tabell 2). Etter isolering av klone, ble 179 flere dyr cap analyser ved hjelp av oocytter injisert med bibliotek transkripsjoner screenet for uttrykk for foxe3; 50 var positive (28%). Av 140 dyr cap stykker plassert på uinjiserte oocytter, 0 var positive (figur 3).
Figur 1. oocytter-dyr Cap-analysen og Expression Kloning Skjematisk oversikt over protokoll:. Transkripsjoner blir fremstilt fra klonen biblioteket og injiseres i oocytter, er dyr cap ektoderm dyrket med oocytter og deretter analysert med hensyn til indusert genekspresjon ved in situ hybridisering. d / 53518 / 53518fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Typiske Resultater av Animal Cap analysen følgende mRNA Injection og in situ hybridisering for Otx2. (AB) Representant resultat av induktiv respons på dorsalized scenen 14 poly (A) + RNA i dyre caps, analysert for otx2 uttrykk ved hele mount in situ hybridisering. (A) Animal caps plassert på uinjiserte ubefruktede egg på scenen 10.5 og kultur til scenen 25. (B) Stage 10.5 dyre caps plassert på oocytter injisert med 10 ng RNA og kultivert til scenen 25. otx2 uttrykk observert i 6/7 tilfeller og angitt med pilspisser. Bar = 500 mikrometer. "Target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Typiske Resultater av Animal Cap analysen følgende in situ hybridisering for Foxe3. (AC) Representative dyre caps fra eggcelle-animalske cap analyser, testet for uttrykk for foxe3 ved in situ hybridisering. (A) Stage 11-11,5 dyre caps plassert på ldb1-injisert eggceller og kultur til scenen 23. foxe3 uttrykk indikeres av pilspisser. (B) Stage 11-11,5 dyr caps plassert på uinjiserte egg og kultivert å iscenesette 23; ingen foxe3 uttrykk oppdaget. (C) § gjennom foxe3 -positive indusert dyr cap fra A viser uttrykk i indre og ytre lag av ektoderm. Barer = 500 mikrometer.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53518/53518fig3large.jpg" target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Injisert RNA | Positive saker | Gene | % |
| Stage 14 dorsalized mRNA, 10 ng | 12/24 | otx2 | 50 |
| Bibliotek bassenger av 10 5 kloner, 20 ng | 3/9 | otx2 | 33 |
| Bibliotek bassenger av 5 til 10 oktober 0 Clon es, 20 ng | 50/179 | foxe3 | 28 |
| None | 0/140 | foxe3 | 0 |
Tabell 1. Oocyte-Animal Cap analyseresultatene Resultater av dyr cap analysen vurdert ved in situ hybridisering med otx2 og foxe3, ved hjelp av oocytter injisert med mRNA eller med transkripsjoner syntetiserte fra cDNA bibliotek bassenger.; eller uinjiserte ubefruktede egg.
| Injisert RNA | Pool betegnelse / utvalg | Positive foxe3 uttrykk |
| EN | 2/4 | |
| B * | 4/28 | |
| C | 4/44 | |
| Bibliotek bassenger av 10 fire kloner, 20 ng | 1 | 0/11 |
| 2 | 0/10 | |
| 3 | 3/14 | |
| 4 | 0/12 | |
| 5 | 0/15 | |
| 6 | 1/20 | |
| 7 | 3/23 | |
| 8 | 0/16 | |
| 9 | 0/16 | |
| 10 * | 5/20 | |
| Bibliotek bassenger av 5000 kloner, 20 ng | 1 | 0/7 |
| 2 * | 5/16 | |
| 3 | 1/7 | |
| 4 | 0/7 | |
| 5 | 0/7 | |
| 1 | 0/10 | |
| 2 | 0/10 | |
| 3 | 0/10 | |
| 4 | 0/10 | |
| 5 * | 8/26 | |
| 6 | 0/11 | |
| 7 | 0/10 | |
| 8 | 0/10 | |
| 9 | 0/10 | |
| 10 0/8 | ||
| Bibliotek bassenger av 70-200 kolonier, 20 ng | 1 | 0/8 |
| 2 | 0/10 | |
| 3 * | 1/10 | |
| 4 * | 1/10 | |
| 5 | 0/10 | |
| 6 | 0/9 | |
| 7 | 0/10 | |
| 8 | 0/10 | |
| Bibliotek bassenger av 20 kolonier, 20 ng | 1 | 0/10 |
| 2 | 0/10 | |
| 3 | 0/10 | |
| 4 * | 7/21 | |
| 5 | 0/10 | |
| 6 | 0/10 | |
| 7 | 0/10 | |
| 8 | 0/10 | |
| 9 | 0/10 | |
| 10 | 0/10 | |
| K2-6, L1 | 0/10 | |
| L2-6, M7 | 0/10 | |
| M8-12, N7-8 | 0/10 | |
| K5-6, L1-4 | 1/10 | |
| L5-6, M7-10 | 0/10 | |
| M11-12, N7-8, K2-4 | 0/10 | |
| K2, K5, L2, L5, M8, M11 | 0/10 | |
| K3, K6, L3, L6, M9, M12 | 0/9 | |
| K4, L1, L4, M7, M10, N7, N8 | 1/9 | |
| Bibliotek RNA, 20 ng | K6 | 0/10 |
| L1 * | 3/10 | |
| L3 | 0/10 | |
| L4 | 0/10 | |
| Bibliotek RNA, 20 ng | L1 (ldb1) bekreftelse | 50/179 |
| * Indikerer valgte basseng |
Tabell 2. Sib Utvalg og EXPREssion Kloning Resultater. Bassenget med den høyeste grad av respons i hvert dyr cap analysen (varierer mellom 10% og 36% positive for foxe3 uttrykk) ble valgt til bruk i neste eksperiment for å begrense aktiviteten til en klone. Stjerne indikerer valgte bassenget.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fremgangsmåten som er beskrevet her for den funksjonelle kloning av gener som er i stand til å indusere en respons i kompetent ektoderm kan brukes til å identifisere en rekke genprodukter. Denne metoden utvider på tidligere arbeid ved å kombinere vev fremkallende analyser med uttrykk kloningsteknikker. Vi bruker de metabolske baner i Xenopus oocyte som en kilde for produksjon av induserende faktorer, direkte eller indirekte, etter RNA-injeksjon. Dette, i kombinasjon med anvendelse av etablerte metoder for kloning av et gen av interesse 6,7 ved hjelp av ekspresjon av transkriptene som genereres fra et cDNA-bibliotek eller annen samling av kloner, gir en verdifull metode for de som ønsker å identifisere gener av ny interesse involvert i embryonale induksjon. Den brede anvendelighet av denne fremgangsmåte til funksjonell identifisering av nye gener som er et nyttig supplement til nye spennende reverse genetiske tilnærminger, og kan også brukes til å funksjonelt test transkripter som er identifisert ved hjelp av høy-throughput metoder (slik som RNA-seq) 21.
Kontrollene er kritisk i overvåkingen av metabolsk funksjon av oocytter som brukes i hetten analysen. Både for å sikre helsen til hvert parti av oocytter og å etablere nytten av dette systemet for å detektere lavt overflod transkripter, varierende konsentrasjoner av mRNA of mesoderm indus INHBB ble testet; dette genet er relatert til linse induksjon sti og er en veldokumentert uavhengig kontroll 14. Muskel-induserende aktivitet, ble analysert ved ekspresjon av muskel-spesifikke antigener i dyr cap ektoderm med 12/101 antistoff, ble observert med 2-200 pg INHBB mRNA, selv i nærvær av 500 gangers overskudd trinnet 14 poly (A) + RNA. Systemet er således anvendelig over et svært bredt spekter av injisert RNA mengde, og oocytter er i stand til stabilt å fremstille protein og forbli levedyktige etter cytoplasmatisk injeksjon av volumer av 50 nl og høyere.
En vurdering for use av et cDNA-bibliotek i denne protokollen er nødvendigheten av full lengde eller nesten full-lengde kloner. Før bruk i protokollen, bør biblioteket undersøkes av Nord-analyse for å bestemme størrelsen på kjente transkripsjoner i biblioteket og dermed redusere muligheten for at dominerende-negative effektene er hentet fra potensielt avkortede injisert transkripsjoner. Siden en full-lengde cDNA-pool er viktig, bruken av EST-kloner 22 eller optimalt, Xenopus ORFeome 23 (som tilveiebringer et komplett sett av validerte full-lengde kloner) foretrekkes fremfor en tradisjonell cDNA-bibliotek med mindre en scenografiske og vevs- spesifikk kilde for cDNA er søkt og anvendt for bibliotekkonstruksjon. En annen vurdering er tilstedeværelsen av β-globin og poly (A) sekvenser i biblioteket vektoren ment å øke mRNA stabilitet i injiserte transkripter. Selv om dette er ønskelig for å øke mengden av protein fremstilt fra syntetiske injisert mRNA, øker den også possibilligheten for fremstilling av en dominant-negativ effekt fra mRNA som er høyere stabilitet og aktivitet enn in vivo. En lav-kopi antall mRNA kan ikke utøve de samme effektene som sin endogene motstykke i bakgrunnen av en stor pool av vitnemål; en som er stabilisert i kloning og transkripsjonsprosessen kan vedvare å tillate deteksjon i hetten analysen. Et tredje problem er pool størrelse; betydelig reduksjon av bassengstørrelse (10 kloner eller færre) har vist seg å være fordelaktig i de senere gain-of-funksjon screening prosjekter i embryoer 24 og er egnet til å gi klarere resultater og lettere identifisering av kandidatgener. En mindre bassengstørrelse enn 10 3 - 10 4 anbefalt i denne protokollen kan oppnås hvis den totale kompleksiteten av samlingen av kloner som er mindre enn 10 4, slik tilfellet er med den ORFeome 23; man kunne skjerme de ~ 9000 kloner som begynner med 10 bassenger av 900, men det kan være uoverkommelig arbeidskrevende åbehandle mer enn 10 bassenger i et eksperiment.
Bestemmelse av den type genproduktet (ved sekvensanalyse) laget av genet identifisert i skjermen bestemmer arten av tester av dens funksjon. Siden et atom transkripsjonen kofaktor ble identifisert i vår skjerm 8, var det nødvendig å bekrefte rollen til kjernen i den induktive prosessen utløses ved innføring av ldb1. Enucleated ubefruktede egg har fullt fungerende protein syntetisk maskiner og er levedyktig og i stand til å produsere utskilt faktorer fra injisert transkripsjoner. Imidlertid vil fraværet av kjernen avskaffe funksjon av transkripsjonsfaktorer, kofaktorer eller andre indirekte virkende genprodukter. Påfølgende analyser av gener identifisert i skjermen inkluderer fastsettelse av utviklings uttrykk mønster ved in situ hybridisering og få-av-funksjon og tap-av-funksjon tester. Overekspresjon ved injeksjon av RNA til zygotes eller ved injeksjon for å begrense specific blastomeres å begrense dens effekter til bestemte regioner av embryo kan gi innsikt, samt knockdown av genfunksjon ved injeksjon av morfolino oligonukleotider rettet mot in vivo transkripsjon.
Direkte visualisering av en induktiv effekt i respons dyret hetten ektoderm ved hjelp av en transgen linje med et reporter-gen (for eksempel GFP) kan i stor grad fremskynde screening prosessen og eliminere behovet for analyse av RNA-ekspresjon ved hjelp av in situ hybridisering. Likeledes er det ønskelig å bruke antistoffer som raskere hjelp av screening hvis et passende antistoff (for eksempel 12/101 for muskelrespons omtalt ovenfor) er tilgjengelig. Albino embryoene kan bli anvendt for dyr caps, som selv om det vanskeligere å stadium nøyaktig ved gastrula trinn, effektivisere in situ hybridisering fremgangsmåte ved å eliminere behovet for eventuelle bleking av villtype pigmentering for å visualisere bedre fargereaksjonen prodtet.
Til slutt er det viktig å vurdere det av flere grunner, kan et stort antall forsøk må gjennomføres for å identifisere et gitt gen. For det første kan antallet tilfeller en rimelig prosess i en gitt studie er begrenset av utvikling (og eventuelt tap av kompetanse) som forekommer over tid og med gitt en stor gruppe med embryoer og et område av temperaturer ved hvilke til kulturen dem, så vel som tap som kan oppstå av små biter av ektoderm i behandlingen. For en annen, suksessrater på uttrykk for en utvalgt markør i ektoderm kan være svært lav, og krever mange tilfeller å observere en statistisk signifikant effekt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12/101 Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 12/101 | Monoclonal antibody for detection of muscle tissue |
| 20x SSC Buffer | Sigma | S6639 | for ISH |
| Acetic anhydride | Sigma | A6404 | for ISH |
| Anti-Dig-AP | Roche | 11093274910 | for ISH |
| Aurum Plasmid Mini Kit | Bio-Rad | 732-6400 | Plasmid DNA purification |
| Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | for ISH |
| BM Purple | Roche | 11442074001 | for ISH |
| Boekel Hybridization Oven | Fisher Scientific | 13-245-121 | for ISH |
| Bouin's Solution | Sigma | HT10132 | for ISH |
| BSA | Sigma | A9647 | for OCM |
| CHAPS | Sigma | C3023 | for ISH |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | Defolliculation of oocytes |
| Cysteine | Sigma | C121800 | Dejelly embryos |
| DEPC-H2O | Fisher Scientific | BP5611 | for ISH |
| Dig-RNA Labeling Mix | Roche | 11277073910 | for ISH probes |
| Dumont #5 forceps | World Precision Instruments | 500233 | for Vitelline envelope removal |
| Ethyl 3-aminobenzoate | Sigma | A5040 | MS222 anesthetic |
| Ficoll PM 400 | Sigma | F4375 | for Injection media |
| Formamide | Sigma | F9037 | for ISH |
| Gentamicin sulfate | Sigma | G1914 | for OCM |
| Glass capillaries | World Precision Instruments | 4878 | 3.5" long, I,D, 0.530 mm |
| Glass sample vials | Fisher Scientific | 06-408B | for ISH |
| Hair loop | Hair affixed in pasteur pipette for tissue manipulation | ||
| Heparin sodium salt | Sigma | H4784 | for ISH |
| Injector Nanoliter 2010 | World Precision Instruments | Nanoliter 2010 | Microprocessor-controlled microinjector |
| Instant Ocean | Carolina | 972433 | Aquarium Salt for frog recovery |
| IRBG XGC Xenopus verified full-length cam cDNA | Source Bioscience | 989_IRBG | cDNA library |
| LB Agar plates with 100 µg/ml Ampicillin | Teknova | L5004 | 150 mm pre-poured LB-Amp plates for sib selection |
| LB Luria Broth | Teknova | L8650 | LB for collecting colonies in sib selection from plates and dilution of cultures |
| Magnetic mRNA Isolation Kit | New England BioLabs | S1550S | for isolation of poly(A)-enriched RNA |
| Maleic Acid | Sigma | M0375 | for ISH |
| Manual Microfil Micromanipulator | World Precision Instruments | M3310R | Manual micromanipulator |
| Nutating Mixer | Fisher Scientific | 22-363-152 | Rocker for ISH |
| Permoplast | Nasco | SB33495M | Clay for injection and dissection dishes |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | P5368 | for ISH |
| PMSG | Sigma | G4877 | to stimulate oocyte development |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma | PVP40 | for ISH |
| Programmable Puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | Micropipette needle puller |
| Proteinase K | Sigma | P6556 | for ISH |
| pTnT Vector | Promega | L5610 | cDNA library construction |
| Riboprobe Combination System | Promega | P1450 | in vitro transcription |
| Superscript Full Length cDNA Library Construction Kit | Life Technologies | 18248013 | kit for cDNA library construction |
| Sutures, 3-0 silk | Fisher Scientific | 19-037-516 | Suture thread and needle for post-oocyte removal |
| Torula RNA | Sigma | R3629 | for ISH |
| Triethanolamine | Sigma | T1502 | for ISH |
| Tween 20 | Sigma | P9416 | for ISH |
| Universal RiboClone cDNA Synthesis System | Promega | C4360 | alternative kit for cDNA library construction |
| Xenopus Full ORF Entry Clones - ORFeome Collaboration | Source Bioscience | 5055_XenORFeome | ORFeome Clones |
| XL2-Blue Ultracompetent Cells | Agilent Technologies | 200150 | cells for transformation of cDNA library |
References
- Yergeau, D., Kelley, C., Zhu, H., Kuliyev, E., Mead, P. Forward Genetic Screens in Xenopus. Using Transposon-Mediated Insertional Mutagenesis. Methods in Molecular Biology. 917, 111-127 (2012).
- Grainger, R. Xenopus tropicalis. as a Model Organism for Genetics and Genomics: Past, Present and Future. Methods in Molecular Biology. 917, 3-15 (2012).
- Nakayama, T., Fish, M., Fisher, M., Oomen-Hajagos, J., Thomsen, G., Grainger, R. Simple and Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Targeted Mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51, 835-843 (2013).
- Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis. Biology Open. 1 (12), 1273-1276 (2012).
- Zhao, Y., Ishibashi, S., Amaya, E. Reverse Genetic Studies Using Antisense Morpholino Oligonucleotides. Methods in Molecular Biology. 917, 143-154 (2012).
- Smith, W., Harland, R. Injected Xwnt-8. RNA acts early in Xenopus. embryos to promote formation of a vegetal dorsalizing center. Cell. 67, 753-765 (1991).
- Smith, W., Harland, R. Expression cloning of noggin., a new dorsalizing factor localized in the Spemann organizer in Xenopus embryos. Cell. 70, 829-840 (1992).
- Plautz, C., Zirkle, B., Deshote, M., Grainger, R. Early stages of induction of anterior head ectodermal properties in Xenopus. embryos are mediated by transcriptional cofactor ldb1. Developmental Dynamics. 243 (12), 1606-1618 (2014).
- Servetnick, M., Grainger, R. Changes in neural and lens competence in Xenopus. ectoderm: evidence for an autonomous developmental timer. Development. 112, 177-188 (1991).
- Nieuwkoop, P., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , Garland Publishing, Inc. New York and London. (1994).
- Lemaire, P., Garrett, N., Gurdon, J. Expression cloning of Siamois., a Xenopus. homeobox gene expressed in dorsal-vegetal cells of blastulae and able to induce a complete secondary axis. Cell. 81, 85-94 (1995).
- Lustig, K., Kroll, K., Sun, E., Kirschner, M. Expression cloning of a Xenopus T.-related gene (Xombi.) involved in mesodermal patterning and blastopore lip formation. Development. 122, 4001-4012 (1996).
- Hsu, D., Economides, A., Wang, X., Eimon, P., Harland, R. The Xenopus. dorsalizing factor Gremlin identifies a novel family of secreted proteins that antagonize BMP activities. Molecular Cell. 1 (5), 673-683 (1998).
- Lustig, K., Kirschner, M. Use of an oocyte expression assay to reconstitute inductive signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 6234-6238 (1995).
- Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. JoVE Science Education Database. , (2015).
- Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. JoVE Science Education Database. , (2015).
- Viczian, A., Zuber, M. Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis. J. Vis. Exp. (39), e1932 (2010).
- Sive, H., Grainger, R., Harland, R. Early development of.Xenopus laevis.: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor. New York. (2000).
- Zygar, C., Cook, T., Grainger, R. Gene activation during early stages of lens induction in Xenopus. Development. 125, 3509-3519 (1998).
- Medina-Martinez, O., Jamrich, M. Foxe view of lens development and disease. Development. 134, 1455-1463 (2007).
- Amin, N., Tandon, P., Osborne, N. E., Conlon, F. RNA-seq in the tetraploid Xenopus.laevis. enables genome-wide insight in a classic developmental biology model organism. Methods. 66, 398-409 (2014).
- Gilchrist, M., Zorn, A., Voigt, J., Smith, J., Papalopulu, N., Amaya, E. Defining a large set of full-length clones from a Xenopus tropicalis EST project. Developmental Biology. 271, 498-516 (2004).
- Karpinka, J., et al. Xenbase, the Xenopus. model organism database; new virtualized system, data types and genomes. Nucleic Acids Research. 43, D756-D763 (2015).
- Zhang, S., Li, J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signaling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis. PLoS ONE. , e79469 (2013).
