Protocol
Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pela Universidade de Virginia Institutional Animal Care e do Comitê Use.
Nota: A Figura 1 mostra uma vista geral esquemática dos procedimentos experimentais.
1. Preparação de oócitos
- X. Pré-prime laevis fêmeas com 150 U de Pregnant Mare Serum gonadotrofina (PMSG) cerca de uma semana antes do isolamento do oócito. Injectar 1 ml de 150 U / ml PMSG em dorsal saco linfático com 1 cc seringa estéril com 29 g de agulhas.
- Preparar soluções para injecção de oócitos e oócito animal ensaio cap.
- Prepare de Ca ++ / Mg ++ livre de OR2 (OR2-): NaCl 82 mM, KCl 2,5 mM, 1,5 mM de Na 2 HPO 4, 50 mM de HEPES pH 7,2.
- Prepare OR2: OR2- adicionalmente 1 mM de CaCl2 e 1 mM de MgCl2.
- Prepare OCM: 60% Leibovitz L15, 0,4 mg / mL de BSA, 100? G / ml de gentamicina, pH 7,8.
- Prépare MBS 1x: NaCl 88 mM, KCl 1 mM, 0,7 mM de CaCl2, 1 mM de MgSO4, 5 mM de HEPES (pH 7,8), 2,5 mM de NaHCO3.
- Prepare a 3% de Ficoll em 1x MBS.
- Prepare NAM 1x: NaCl 110 mM, KCl 2 mM, 1 mM de Ca (NO3) 2, 1 mM de MgSO4, 0,1 mM de EDTA, 1 mM de NaHCO 3, 2 mM Na 3 PO 4, pH 7,4.
- Anestesiar a fêmea em uma solução de 0,03% de éster etílico do sal metanossulfonato de 3-aminobenzoato de metilo (MS222) em MBS 0,1x (dissolver primeiro 0,3 g MS222 em 10 ml de etanol a 95%, depois dilui-se em 1 L de MBS 0,1x) por colocação em solução de rã 10 - 15 minutos ou até que não responde.
- Verifique que a anestesia é completa, rodando sapo anestesiado sobre suas costas para garantir que ele não responde (incompletamente rãs anestesiados mover os membros ou virar corpo ao longo).
- Cirurgicamente isolar fragmentos de ovário, fazendo uma incisão abdominal através da pele e da parede do corpo com lâmina de bisturi, isolando tecido ovariano com uma pinçae tesouras. Coloque fragmentos ovarianos em OR2-. Fechar a parede do corpo com uma sutura de seda 3-0 em uma agulha curva 24 mm e feche a pele separadamente com os mesmos fios. Permitir a recuperação da fêmea no 1 g / L de sal na água do aquário.
- Usando uma pinça fina, tecido ovariano rasgo em pequenas (10 - 20 oócitos) peças e transferência para OR2- fresco.
- Fragmentos ovarianos Defolliculate em 2,0 mg / ml de colagenase A em OR2- agitando suavemente num agitador durante 1 hora, a transferência de colagenase fresco e agitação durante uma hora adicional.
- Wash ovócitos 10 vezes em OR2 [contendo Ca ++ / Mg ++], descartando oócitos menores.
- Lave oócitos em OCM duas vezes e transferir a nova OCM. Isolar oócitos Fase VI por tamanho após a inspeção visual e descartar oócitos imaturos (menores): ovócitos Fase VI são maiores do que os oócitos imaturos, mesmo com pigmentação no hemisfério animais e são cerca de 1,2-1,4 mm de diâmetro.
- Manter oócitos a 18 - 20 ° C iN OCM antes da injecção. Nota: As placas de Petri revestidas com agarose pode ser utilizado para minimizar a aderência de oócitos de prato.
2. Injecção da Biblioteca Transcrições
- Prepara-se uma biblioteca de cDNA direccional 15 utilizando ARN extraído numa fase adequada do desenvolvimento (por exemplo, placa neural fase 14 10). Comprar uma biblioteca de cDNA ou construir um usando um kit comercial acordo com a visão geral nos quatro passos abaixo.
- Isolar cerca de 5 ug de ARNm usando um produto para enriquecer para poli (A) + ARN (Ver tabela de materiais) e seguindo as instruções do fabricante. Nota: Os transcritos para ser usado para produzir a biblioteca de ADNc pode ser restrita a um tecido indução (tais como a placa neural, seguindo microdissecação do tecido desejado), ou pode ser a partir de embriões inteiros numa fase particular.
- Produção de ADNc com um kit comercial, seguindo as instruções do fabricante.
- Ligadura, aproximadamente, 20 ng de cDNA para um vector incluído com o kit comercial ou outro vector adequado. Um vector plasmídeo apropriado inclui sequências de estabilidade do ARNm, tal como 5 'β-globina e 3 poli (A) (sequências pCS2 +, PTNT, pCS105).
- Transforme ligação em células bacterianas competentes que utilizam o protocolo recomendado pelo fornecedor para a transformação de choque térmico.
Nota: Alternativamente, um conjunto de grelha de leitura aberta (ORFeome clones) está comercialmente disponível e pode ser usado para gerar transcrições para injecção.
- Preparar 10 piscinas de plasmídeos de 10 para 3 10 4 complexidade (10 4 10 5 para a complexidade total). Isto representa 10 placas com 1.000 - 10.000 colónias cada.
- Biblioteca placa de cultura em 10 placas de 15 cm LB-ampicilina, crescer 12-18 horas a 37 C, e recolher colónias de cada por uma leve pressão com um espalhador de vidro em 7 ml LB.
- Prepare um estoque de glicerol de 0,5 ml (adicionar aos 0,2 ml de glicerol e armazenar estéril a -20 &# 730; C), e utilizar os restantes 6,5 ml para preparar DNA com um padrão disponível comercialmente kit DNA miniprep seguindo as instruções do fabricante.
- Linearizar DNA plasmídeo em pool (1,0-2,0 mg) com restrição apropriada enzima digerir 16 a 37 ° C durante 1-1,5 h. Isolar o ADN linearizado com extracção com fenol / clorofórmio seguido de precipitação com etanol e ressuspensão em água de acordo com as especificações do kit de ARN-polimerase utilizada. Sintetizar RNA sentido com ARN-polimerase de um kit comercial, seguindo as instruções do fabricante.
- Prepare agulhas para microinjeção (usando um extrator de agulha com tubos capilares de vidro) de aproximadamente 20 mm de diâmetro; medir pontas de agulha em um microscópio composto com um micrômetro ocular calibrada. Nota: As configurações do extrator de agulhas deve ser determinada empiricamente para produzir uma agulha com uma ponta fina de tal forma que quando quebrado com uma pinça fina produz o tamanho da ponta desejado.
- Prepare (empurrar barro emcamada uniforme na parte inferior do prato) 35 x 10 mm placas de Petri com sulcos paralelos para manter oócitos no lugar durante a microinjeção forrada com argila; produzir sulcos com uma sonda de shopping ou pipeta Pasteur fundido na ponta em chamas. Como uma alternativa para argila, preparar pratos agarose fazendo recortes com um molde de elastômero 17. Oócitos meio de uma pipeta de todo o furo para 3% Ficoll em 1x MBS (aproximadamente 2 ml) em filas nos pratos forrado de barro.
- Usando microinjector, preencher agulha com 1 ng / nl RNA e ajustar o equilíbrio para produzir uma ligeira pressão positiva (para evitar a elaboração de citoplasma de oócitos).
- Injetar oócitos com aproximadamente 20 nl RNA na região equatorial. Permitir uma hora para oócitos injectados para permanecer em Ficoll-MBS, em seguida, transferir cuidadosamente para 1x MBS. Incubar durante 8 - 24 horas a 20 ° C antes do ensaio tampão animal.
3. animal Cap Assay
- Prepare 3 / 4x NAM e obter uma pinça fina, laço de cabelo, fragmentos lamela curvas, dis-alinhado argilahes com recortes em forma de taça para manter oócitos. Faça fragmentos lamela curvas desmembrando-lamelas de vidro em pequenos fragmentos (aproximadamente 1 - 2 mm x 2-4 mm) e passando pela chama até que as bordas polonês e inclinar-se, produzindo uma peça curvada.
- Fertilize X. laevis ovos 18 através in vitro ou do acasalamento natural e cultura para gastrula fases (10-11 horas pós-fertilização no RT) em 0,1x MBS antes da ordenação por etapa; recolher meados de gástrula (fase 11 - 11,5) 10 embriões.
- Embriões de transferência para uma placa de Petri aproximadamente meio cheio com 3 / 4x NAM. Usando dois pares de uma pinça fina, retire a fertilização (vitelline) membrana de gastrulae.
- Transferência de oócitos a 3 / 4x NAM (aproximadamente 2 ml) em placas forradas de argila e imobilizar em impressões individuais na argila, produzindo impressões para acomodar embriões individuais como ranhuras foram descritos acima.
- Embriões de transferência para os pratos forrado de barro e cortar tampas de animais fora gastrulae usando dois pares de fórceps finos. Tome cuidado para isolar animais cap ectoderma somente e não tecido equatorial 18.
- Colocar uma tampa de animal no hemisfério animal de cada oócito com a superfície interior da tampa de animais contactar o oócito. Segurar recombinantes em conjunto aplicando fragmento lamela de vidro curvo e a aplicação de pressão descendente para o vidro, achatando o ectoderme como os contactos lamela da argila (tampões animais podem permanecer aberta com a camada interior exposta à superfície do oócito para 6 - 8 h ou mais ).
Nota: Como alternativa, coloque a tampa de animais em um recuo de barro com sua superfície interna voltada para cima e coloque um oócito na tampa; fixar o recombinante com pequenas extensões de argila. - Cultura a 20 ° C até a embriões de controlo atingiram a fase desejada para o ensaio.
- Recombinante separada, removendo lamela / argila e isolando ectoderma com uma pinça e um laço de cabelo.
- Corrigir fragmentos ectodérmicas durante 1 hora em MEMFA (3,8%formaldeído em MEM [MOPS 0,1 M pH 7,4, EGTA 2 mM, e 1 mM de MgSO 4]).
- Fragmentos de transferência de embriões (e controle) de MEMFA em etanol e armazenar a -20 C.
4. Análise de Resposta na ectoderme por hibridação in situ (ISH)
- Preparar soluções para ISH.
- Prepare 1x PBS: 0,01 M de solução salina tamponada de fosfato, NaCl 0,138 M, pH 7,4
- Prepare PBS-Tween (PTW): 1x PBS, 0,1% de Tween-20
- Preparar a solução de Denhart 100x: 2% de BSA, 2% de polivinilpirrolidona, 2% de Ficoll
- Preparar tampão de hibridização: 50% formamida, 5x SSC, 1 mg / ml de ARN de levedura torula, 1 ug / ml de heparina, solução de Denhart 1x, 0,1% de CHAPS a 0,1%, EDTA 10 mM, Tween-20,, DEPC-H2O
- Preparar tampão de ácido maleico (MAB): 100 mM de ácido maleico, NaCl 150 mM, pH 7,5
- Prepare MAB + bloco: MAB, 2% reagente de bloqueio (calor a 60 ° C para dissolver)
- Prepare a fosfatase alcalina (FA) Tampão: 100 mM de TrispH 9,5, 50 mM de MgCl2, 100 mM de NaCl, 0,1% de Tween, dH2O
- Prepara-se o ARN da sonda.
- Utilizando um kit de ARN polimerase comercial e cavar-NTP mistura, adicionar a um tubo de 1,5 ml (50 reacção ul): 25,5 mL de DEPC-H2O, 10 uL de 5X de Transcrição Tampão, 2,5 ul 10x DIG-mistura de NTP, 5 ul de 100 mM DTT, 2 ul de RNAsin, 2 ul de molde de ADN linearizado (~ 1 ug / ul), 3 ul de ARN-polimerase de 37 ° C e incubar durante 90 min.
- Adicionar 2 l de ARN polimerase e incubar 37 ° C durante 60 min.
- Verifique 2 ul de reacção sobre 1% de gel de agarose.
- Adicionar 1 mL RQ1 RNase livre de DNase e incubar 37 ° C durante 20 min.
- Precipitar a sonda por adição de 50 ul de DEPC-H2O, 25 mL de 10 M de acetato de amónio e 313 mL de etanol. Armazenar a -20 C durante a noite (O / N), em seguida, recuperar o ARN por centrifugação a 13.800 xg durante 20 min. Lavar com 500 ul de etanol 75%, girar rapidamente, removaetanol e permitir pellet secar ao ar. Adicionar 50 ul de DEPC-H2O
- Adicionar tampão de hibridação a uma concentração final de ~ 0,5 ug / uL.
- Prepare tecido por hibridação. Salvo disposição em contrário, encher frascos ao topo com cada mudança de solução descritos (cerca de 4 ml).
- Remover o etanol e a partir de frascos de transferência de embriões em 75% de etanol / PTW, em seguida, 50% de etanol / PTW durante 10 min cada, horizontalmente no balancim.
- Lavar três vezes em PTW durante 5 min cada em balancim.
- Transferir para 10 ng / mL tratamento Proteinase K em PTW; tubos de rock verticalmente 15 min.
- Lavar duas vezes em cada 10 min trietanolamina 0,1 M de pH 7,8 - tubos de rocha verticalmente.
- Adicionar 12,5 ul anidrido acético para tubos e rock verticalmente 5 min. Repita com anidrido acético adicional de 12,5 ul por 5 min.
- Lavar em PTW 5 min verticalmente no balancim.
- Refix em paraformaldeído a 4% em 20 min balancim. Calor Tampão de Hibridizaçãoa 60 ° C.
- Lavar três vezes em PTW durante 5 min cada em balancim.
- Remova todos, mas ~ 1 ml de PTW de cada tubo e adicionar 250 ul Hyb tampão; Agite cuidadosamente tubos para misturar. Tubos de rocha vertical 5 min.
- Substitua com 60 ° C Hyb Buffer (0,5 ml) e agitar suavemente a 60 ° C 10 min. Substitua com frescos Hyb tampão e agitar a 60 ° C de duas a quatro horas.
- Sonda de calor (1 ml a 0,5 mg / mL em tampão de Hib) a 60 ° C (3 min). Remover Hyb tampão e adicionar sonda para tubos. Agitar suavemente O / N a 60 ° C.
- Prepare Tissue para o Anticorpo.
- Quente Hyb buffer e 2x SSC + 0,1% Tween-20 soluções a 60 C.
- Substitua solução de sonda com Hyb Buffer (sondas salvar a -20 C durante 2 - 3x reutilização). Lavar a 60 ° C durante 10 min.
- Lavar três vezes a 60 ° C em 2x SSC-Tween (20 min cada, com agitação).
- Lavar três vezes a 60 ° C em 0,2x SSC-Tween (20 min cada, com agitação).
- Lavar duas vezes em MAB (RT) durante 15 min cada horizontalmente no balancim.
- Adicione 1 ml MAB + bloco. Lave 2 horas verticalmente no balancim.
- Transferência para 1 ml MAB + bloco que contém um anti-digoxigenina-AP 1 / 2.000. Rocha verticalmente a 4 CO / N.
- Prepare tecido por reagente de cor.
- Substituir solução de anticorpo com MAB; lavar três vezes em 5 min cada MAB horizontalmente no balancim.
- Lavar três vezes em cada MAB 1 h horizontalmente no balancim.
- Lavar duas vezes em tampão de AP 10 min cada horizontalmente no balancim.
- Transferir para tecido de múltiplas bem bandeja de plástico, remover e adicionar tampão de AP BM reagente roxa (~ 1 mL). Permitir que a reacção prossiga na obscuridade 5 min a O / N.
- Quando a coloração adequada é alcançado, transferir tecido para frascos de PTW. Lavar duas vezes 10 minutos cada em PTW no balancim.
- Corrigir em solução de Bouin a 4 CO / N no balancim.
- Lave a Bouin com três de 70% de etanol / 30% PTW lavagens em temperatura ambiente. Prossiga tcaptura de imagem usando o epi-iluminação e uma câmera montada no microscópio, branqueamento, se necessário 18.
5. Sib Seleção e Clonagem
- Selecionar piscina com a maior atividade (maior resposta no tecido ectodérmica).
- Titular (diluir com LB a densidade adequada) o estoque de glicerol para a piscina com a maior atividade e placa out dez novas placas com aproximadamente um décimo das colônias da etapa anterior (usando a seção 2 em protocolo acima).
- Reduzir o tamanho da piscina até que a atividade é atribuída a única colônia.
- Obter sequência de ADN utilizando iniciadores convencionais no vector.
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Representative Results
Em resposta à expressão do ARNm injectado em oócitos, respondendo tecido tampão animal foi ensaiado quanto à expressão de OTX2 por hibridação in situ (Figura 2 e Tabela 1); OTX2 é expressa em ectoderme lente presuntivo (PLE) de fecho do tubo neural através plac�io lente espessamento 19. No entanto, uma vez que OTX2 é também expressa em ectoderme neural anterior, bem como ectoderme cabeça não neurais fora da PLE, que está associado com ambos neural e respostas placodal. O uso de foxe3 para pesquisar a biblioteca para um produto génico capaz de produzir uma resposta objectiva-indutivo na lente-competente tampão animais ectoderme permitido uma abordagem mais específica para o objectivo da clonagem de expressão, uma vez que foxe3 é expressa no PLE de placa neural estágios e formação de vesículas ao longo da lente 20, presentes em regiões adjacentes placodal mas ausentes do neuroectoder m. Usando o protocolo de clonagem de expressão e selecção de irmãos acima e injectando transcritos de piscinas da biblioteca, um gene capaz de produzir expressão foxe3 nas tampas dos animais foi isolado (Tabela 2). A seguir ao isolamento do clone, 179 Os ensaios de tampão animais adicionais utilizando oócitos injectados com transcritos de biblioteca foram rastreadas quanto à expressão de foxe3; 50 foram positivas (28%). De 140 peças cap animal colocados em oócitos não injectados, 0 foram positivas (Figura 3).
Figura 1. Oócitos animal Tampão de Ensaio Clonagem e Expressão visão geral esquemática do protocolo:. Transcrições são preparados a partir da biblioteca de clones e injectado em oócitos, tampão animais ectoderme é cultivada com oócitos e, em seguida, ensaiadas para a expressão de genes induzidos por hibridação in situ. d / 53518 / "target =" _ blank 53518fig1large.jpg "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Resultados típicos de animal Cap Ensaio seguintes Injeção mRNA e hibridização in situ para OTX2. (AB) resultado Representante de resposta indutiva para dorsalized fase 14 poli (A) + RNA em tampas de animais, ensaiado para OTX2 expressão por toda montagem in situ hibridação. (A) tampas de animais colocados em oócitos não injectados na fase de 10,5 e cultivadas para a fase 25. (B) Stage 10,5 tampas de origem animal colocados em oócitos injectados com 10 ng de RNA e cultivadas para estágio 25. OTX2 expressão observada em 6/7 casos e indicada por pontas de seta. Barra = 500 um. "Target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Resultados típicos de animal Cap Ensaio seguinte na hibridação in situ para Foxe3. (AC) tampas de animais representativos de ensaios cap oócito-animal, testadas para a expressão de foxe3 por hibridização in situ. (A) Stage 11-11,5 tampas de animais colocados em oócitos injectados com ldb1 e cultivadas para a fase 23. foxe3 expressão é indicado por setas. (B) Stage 11-11,5 tampas de animais colocados em oócitos não injectados e cultivadas para a fase 23; nenhuma expressão foxe3 detectado. (C) Seção através foxe3 -positivo induzida cap animais de uma expressão que mostra em camadas interiores e exteriores de ectoderma. Barras = 500 fim.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53518/53518fig3large.jpg" target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| RNA injetado | Os casos positivos | Gene | % |
| Fase 14 ARNm dorsalized, 10 ng | 12/24 | OTX2 | 50 |
| Biblioteca de piscinas 10 clones 5, 20 ng | 3/9 | OTX2 | 33 |
| Biblioteca de piscinas para 10 5 10 0 clon ES, 20 ng | 50/179 | foxe3 | 28 |
| Nenhum | 0/140 | foxe3 | 0 |
Tabela 1. Oocyte-Animal Cap Resultados do ensaio Os resultados do ensaio cap animais avaliadas por hibridização in situ com OTX2 e foxe3, utilizando oócitos injectados com mRNA ou com transcrições sintetizados a partir de cDNA piscinas biblioteca.; ou oócitos não injectados.
| RNA injetado | Designação Pool / seleção | Foxe3 expressão positiva |
| UMA | 2/4 | |
| B * | 4/28 | |
| C | 4/44 | |
| Piscinas Biblioteca de 10 4 clones, 20 ng | 1 | 0/11 |
| 2 | 0/10 | |
| 3 | 3/14 | |
| 4 | 0/12 | |
| 5 | 0/15 | |
| 6 | 1/20 | |
| 7 | 3/23 | |
| 8 | 0/16 | |
| 9 | 0/16 | |
| 10 * | 5/20 | |
| Piscinas Biblioteca de 5.000 clones, 20 ng | 1 | 0/7 |
| 2 * | 5/16 | |
| 3 | 1/7 | |
| 4 | 0/7 | |
| 5 | 0/7 | |
| 1 | 0/10 | |
| 2 | 0/10 | |
| 3 | 0/10 | |
| 4 | 0/10 | |
| 5 * | 8/26 | |
| 6 | 0/11 | |
| 7 | 0/10 | |
| 8 | 0/10 | |
| 9 | 0/10 | |
| 10 0/8 | ||
| Piscinas Biblioteca de 70-200 colônias, 20 ng | 1 | 0/8 |
| 2 | 0/10 | |
| 3 * | 1/10 | |
| 4 * | 1/10 | |
| 5 | 0/10 | |
| 6 | 0/9 | |
| 7 | 0/10 | |
| 8 | 0/10 | |
| Piscinas Biblioteca de 20 colónias, 20 ng | 1 | 0/10 |
| 2 | 0/10 | |
| 3 | 0/10 | |
| 4 * | 7/21 | |
| 5 | 0/10 | |
| 6 | 0/10 | |
| 7 | 0/10 | |
| 8 | 0/10 | |
| 9 | 0/10 | |
| 10 | 0/10 | |
| K2-6, L1 | 0/10 | |
| L2-6, M7 | 0/10 | |
| M8-12, N7-8 | 0/10 | |
| K5-6, L1-4 | 1/10 | |
| L5-6, M7-10 | 0/10 | |
| M11-12, N7-8, K2-4 | 0/10 | |
| K2, K5, L2, L5, M8, M11 | 0/10 | |
| K3, K6, L3 e L6, M9, M12 | 0/9 | |
| K4, L1, L4, M7, M10, N7, N8 | 1/9 | |
| Biblioteca ARN, 20 ng | K6 | 0/10 |
| L1 * | 3/10 | |
| L3 | 0/10 | |
| L4 | 0/10 | |
| Biblioteca de ARN, 20 ng | L1 (ldb1) de confirmação | 50/179 |
| * Indica pool selecionado |
Tabela 2. Sib Selection e ExpreResultados Clonagem Ssion. A piscina com o nível mais elevado de resposta em cada ensaio tampão animais (variando entre 10% e 36% positivo para a expressão foxe3) foi seleccionado para ser utilizado na experiência seguinte para diminuir a actividade de um clone. Asterisco indica pool selecionado.
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Discussion
O método aqui descrito para a clonagem de genes funcional capaz de induzir uma resposta em ectoderme competente pode ser utilizado para identificar uma grande variedade de produtos de genes. Este método expande trabalho passado, combinando ensaios de indução de tecido-com técnicas de clonagem de expressão. Nós utilizamos as vias metabólicas do oócito de Xenopus como uma fonte de produção de factores de induzir, directa ou indirectamente, após a injecção de ARN. Isto, em combinação com a utilização de métodos estabelecidos para a clonagem de um gene de interesse utilizando 6,7 expressão de transcritos gerados a partir de uma biblioteca de cADN ou outra colecção de clones, fornece uma ferramenta valiosa para os que procuram identificar genes de novo interesse envolvido na embrionário indução. A ampla aplicabilidade deste método para a identificação de novos genes funcionais é um complemento útil para novas abordagens genéticas reversa emocionantes, e também pode ser usado para funcionalmente transcrições de teste identificados usando high-throughput métodos (tais como ARN-SEQ) 21.
Controles são críticos no controlo da função metabólica de oócitos utilizados no ensaio tampão. Tanto para garantir a saúde de cada lote de ovócitos e para estabelecer a utilidade deste sistema para detectar transcritos baixa abundância, variando as concentrações de mRNA do indutor mesoderme INHBB foram testados; este gene não está relacionado com a via de lente-indução e um controlo independente é bem documentada 14. A atividade muscular de indução, ensaiados através da expressão de antigénios específicos de músculo em tampão animais ectoderme com o anticorpo 12/101, foi observada com 2 - 200 pg INHBB ARNm, mesmo na presença de 500 vezes o excesso de fase 14 de poli (A) + ARN. O sistema é, portanto, útil numa vasta gama de quantidade de ARN injectado, e os oócitos são capazes de produzir proteína de forma estável e permanecem viáveis a seguir à injecção de volumes de citoplasmática de 50 nl e superior.
Uma consideração para a uSE de uma biblioteca de cDNA no presente protocolo é a necessidade de comprimento completo ou quase clones de comprimento completo. Antes de usar no protocolo, a biblioteca deve ser examinado por análise de Northern para determinar o tamanho dos transcritos conhecidos na biblioteca e, portanto, reduzir a possibilidade de que os efeitos dominantes negativos são obtidos a partir de transcritos injectados potencialmente truncado. Uma vez que um conjunto de ADNc de comprimento total é importante, a utilização de clones de EST 22 ou optimamente, de Xenopus ORFeome 23 (que fornece um conjunto completo de clones de comprimento completo validados) são preferidos para uma biblioteca de ADNc, a menos que um tradicional stage- e tecido- fonte específica de cDNA são procurados e utilizados para a construção da biblioteca. Outra consideração é a presença de sequências no vector biblioteca destina-se a aumentar a estabilidade do mRNA em transcritos injectados β-globina e poli (A). Embora isto seja desejável aumentar a quantidade de proteína produzida a partir de ARNm sintético injectado, ele também aumenta a possibilidade de produção de um efeito dominante negativo a partir de ARNm que é superior em termos de estabilidade e de actividade in vivo. Um número mRNA low-cópia não podem exercer os mesmos efeitos que o seu homólogo endógeno no fundo de um grande conjunto de transcrições; um que é estabilizado no processo de clonagem e transcrição podem persistir para permitir a detecção no ensaio tampão. Uma terceira questão é o tamanho da piscina; redução considerável do tamanho do conjunto (10 clones ou menos) foi demonstrado ser vantajoso nos últimos ganho de função projectos de rastreio em embriões de 24 e é susceptível de fornecer resultados mais claros e mais fácil identificação de genes candidatos. Um tamanho mais pequeno do que a piscina 10 3 - 10 4 recomendado neste protocolo é viável se a complexidade total da recolha de clones é inferior a 10 4, como é o caso com o ORFeome 23; pode-se rastrear os clones ~ 9.000 começando com 10 poços de 900, embora possa ser proibitivamente trabalhoso paraprocessar mais de 10 piscinas em um experimento.
Determinação do tipo de produto do gene (por análise de sequência) feita pelo gene identificado no ecrã determina a natureza dos testes de sua função. Uma vez que um co-factor de transcrição nuclear foi identificado no nosso ecrã 8, foi necessário confirmar o papel do núcleo no processo indutivo desencadeada pela introdução de ldb1. Oócitos enucleados têm proteína em pleno funcionamento maquinaria sintética e são viáveis e capazes de produzir fatores secretados a partir de transcrições injetadas. No entanto, a ausência do núcleo vai abolir funcionamento dos factores de transcrição, cofactores ou outros produtos do gene indirectamente de acção lenta. As análises subsequentes de genes identificados no ecrã incluir a determinação do padrão de expressão de desenvolvimento por hibridização in situ e ganhar de função e testes de perda de função. A sobre-expressão por injecção de ARN em zigotos ou limitando a injecção para o SPblastómeros ecific para restringir os seus efeitos para regiões específicas do embrião pode fornecer informações, bem como knockdown da função do gene através da injecção de oligonucleótidos morfolino dirigidos contra a transcrição in vivo.
Visualização directa de um efeito indutor na tampa de responder ectoderme animais utilizando uma linha de transgénicos com um gene repórter (por exemplo, GFP) pode acelerar consideravelmente o processo de rastreio e eliminar a necessidade para a análise de expressão de RNA por hibridação in situ. Da mesma forma, a utilização de anticorpos como meios mais rápidos de triagem é desejável que um anticorpo apropriado (tal como a 12/101 para a resposta do músculo discutido acima) está disponível. Albino embriões podem ser utilizados para as tampas de animais, os quais, embora mais difíceis de encenar com precisão em fases gástrula, simplificar o processo de hibridação in situ, eliminando a necessidade de qualquer branqueamento do tipo selvagem pigmentação para visualizar melhor a prod reacção de corUCT.
Finalmente, é importante ter em conta que, por várias razões, um grande número de ensaios poderá ter de ser realizado para identificar um dado gene. Por um lado, o número de casos se pode razoavelmente processo num dado ensaio é limitada pelo desenvolvimento (e eventual perda de capacidade) que ocorre ao longo do tempo ainda dado um grande lote de embriões e uma gama de temperaturas nas quais a cultura deles, como bem como a perda que possa ocorrer de pequenos pedaços de ectoderma em processamento. Por outro lado, as taxas de sucesso de expressão de um marcador escolhido no ectoderma pode ser muito baixa e requerem muitos casos para observar um efeito estatisticamente significativo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12/101 Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 12/101 | Monoclonal antibody for detection of muscle tissue |
| 20x SSC Buffer | Sigma | S6639 | for ISH |
| Acetic anhydride | Sigma | A6404 | for ISH |
| Anti-Dig-AP | Roche | 11093274910 | for ISH |
| Aurum Plasmid Mini Kit | Bio-Rad | 732-6400 | Plasmid DNA purification |
| Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | for ISH |
| BM Purple | Roche | 11442074001 | for ISH |
| Boekel Hybridization Oven | Fisher Scientific | 13-245-121 | for ISH |
| Bouin's Solution | Sigma | HT10132 | for ISH |
| BSA | Sigma | A9647 | for OCM |
| CHAPS | Sigma | C3023 | for ISH |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | Defolliculation of oocytes |
| Cysteine | Sigma | C121800 | Dejelly embryos |
| DEPC-H2O | Fisher Scientific | BP5611 | for ISH |
| Dig-RNA Labeling Mix | Roche | 11277073910 | for ISH probes |
| Dumont #5 forceps | World Precision Instruments | 500233 | for Vitelline envelope removal |
| Ethyl 3-aminobenzoate | Sigma | A5040 | MS222 anesthetic |
| Ficoll PM 400 | Sigma | F4375 | for Injection media |
| Formamide | Sigma | F9037 | for ISH |
| Gentamicin sulfate | Sigma | G1914 | for OCM |
| Glass capillaries | World Precision Instruments | 4878 | 3.5" long, I,D, 0.530 mm |
| Glass sample vials | Fisher Scientific | 06-408B | for ISH |
| Hair loop | Hair affixed in pasteur pipette for tissue manipulation | ||
| Heparin sodium salt | Sigma | H4784 | for ISH |
| Injector Nanoliter 2010 | World Precision Instruments | Nanoliter 2010 | Microprocessor-controlled microinjector |
| Instant Ocean | Carolina | 972433 | Aquarium Salt for frog recovery |
| IRBG XGC Xenopus verified full-length cam cDNA | Source Bioscience | 989_IRBG | cDNA library |
| LB Agar plates with 100 µg/ml Ampicillin | Teknova | L5004 | 150 mm pre-poured LB-Amp plates for sib selection |
| LB Luria Broth | Teknova | L8650 | LB for collecting colonies in sib selection from plates and dilution of cultures |
| Magnetic mRNA Isolation Kit | New England BioLabs | S1550S | for isolation of poly(A)-enriched RNA |
| Maleic Acid | Sigma | M0375 | for ISH |
| Manual Microfil Micromanipulator | World Precision Instruments | M3310R | Manual micromanipulator |
| Nutating Mixer | Fisher Scientific | 22-363-152 | Rocker for ISH |
| Permoplast | Nasco | SB33495M | Clay for injection and dissection dishes |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | P5368 | for ISH |
| PMSG | Sigma | G4877 | to stimulate oocyte development |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma | PVP40 | for ISH |
| Programmable Puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | Micropipette needle puller |
| Proteinase K | Sigma | P6556 | for ISH |
| pTnT Vector | Promega | L5610 | cDNA library construction |
| Riboprobe Combination System | Promega | P1450 | in vitro transcription |
| Superscript Full Length cDNA Library Construction Kit | Life Technologies | 18248013 | kit for cDNA library construction |
| Sutures, 3-0 silk | Fisher Scientific | 19-037-516 | Suture thread and needle for post-oocyte removal |
| Torula RNA | Sigma | R3629 | for ISH |
| Triethanolamine | Sigma | T1502 | for ISH |
| Tween 20 | Sigma | P9416 | for ISH |
| Universal RiboClone cDNA Synthesis System | Promega | C4360 | alternative kit for cDNA library construction |
| Xenopus Full ORF Entry Clones - ORFeome Collaboration | Source Bioscience | 5055_XenORFeome | ORFeome Clones |
| XL2-Blue Ultracompetent Cells | Agilent Technologies | 200150 | cells for transformation of cDNA library |
References
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