Protocol
Alla experimentella procedurer godkändes av University of Virginia Institutional Animal Care och användning kommittén.
Anmärkning: Fig 1 visar en schematisk översikt av de experimentella förfarandena.
1. Framställning av oocyter
- Pre-prime X. laevis honor med 150 U Gravida Mare Serum gonadotropin (PMSG) ungefär en vecka i förväg av äggcellen isolering. Injicera en ml 150 U / ml PMSG i rygg lymfa sac med ett cc steril spruta med 29 G nål.
- Bered lösningar för oocyt injektion och oocyt-djurlock analysen.
- Bered Ca ++ / Mg ++ -fri OR2 (OR2-): 82 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,5 mM Na 2 HPO 4, 50 mM HEPES pH 7,2.
- Förbered OR2: OR2- plus 1 mM CaCl2 och 1 mM MgCl2.
- Förbered OCM: 60% Leibovitz L15, 0,4 mg / ml BSA, 100 ug / ml gentamycin, pH 7,8.
- Prepare 1x MBS: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,7 mM CaCl2, 1 mM MgSO 4, 5 mM HEPES (pH 7,8), 2,5 mM NaHCOs 3.
- Bered 3% Ficoll i 1x MBS.
- Förbered 1x NAM: 110 mM NaCI, 2 mM KCI, 1 mM Ca (NO3) 2, 1 mM MgSO 4, 0,1 mM EDTA, 1 mM NaHCOs 3, 2 mM Na 3 PO 4, pH 7,4.
- Söva honan i en 0,03% lösning av etyl-3-aminobensoat metansulfonatsaltet (MS222) i 0,1 x MBS (först upplösa 0,3 g MS222 i 10 ml 95% etanol, sedan späd i 1 L 0,1 x MBS) genom att placera groda i lösning för 10-15 min eller tills svarar.
- Kontrollera att anestesi är komplett genom att vrida sövda groda på ryggen så att den svarar inte (ofullständigt sövda grodor flytta lemmar eller vända kroppen över).
- Kirurgiskt isolera äggstocks fragment genom att göra en buken snitt genom huden och kroppsväggen med skalpellblad, isolera äggstocksvävnad med pincettoch saxar. Placera äggstocks fragment i OR2-. Stäng kroppsväggen med en 3-0 silkesutur på en 24 mm krökt nål och stäng huden separat med samma suturer. Medge framhämtning av kvinnligt i en g / L akvarium salt i vatten.
- Med fin pincett, tår äggstocksvävnad i små (10 - 20 ägg) bitar och överföring till frisk OR2-.
- Defolliculate äggstocks fragment i 2,0 mg / ml kollagenas A i OR2- genom omrörning försiktigt på shaker under 1 timme, överförs till färskt kollagenas och agiterar för ytterligare en timme.
- Tvätta oocyter 10 gånger i OR2 [innehållande Ca ++ / Mg ++] och kasta mindre ägg.
- Tvätta oocyter i OCM två gånger och överföra till frisk OCM. Isolera Steg VI-oocyter efter storlek vid visuell inspektion och kassera omogna (mindre) oocyter: Steg VI oocyter är större än omogna oocyter med ännu pigmentering i djurhalvklotet och är ungefär 1,2-1,4 mm i diameter.
- Behåll ägg på 18-20 ° C in OCM före injektion. Obs: Agarose-belagda petriskålar kan användas för att minimera vidhäftning av äggceller till maträtten.
2. Injektion av Biblioteks Avskrifter
- Förbered en riktad cDNA-bibliotek 15 med hjälp av RNA extraherat vid ett lämpligt utvecklingsstadium (t.ex. neurala plattan etapp 14 10). Köp ett cDNA-bibliotek eller konstruera en med hjälp av ett kommersiellt kit per översikten i de fyra stegen nedan.
- Isolera ca 5 | j, g mRNA genom användning av en produkt för att anrika för poly (A) + RNA (se tabell för material) och genom att följa tillverkarens instruktioner. Anm: De transkript som skall användas för att framställa cDNA-biblioteket kan begränsas till ett inducerande vävnad (såsom neurala plattan, efter microdissection av den önskade vävnaden), eller kan vara från hela embryon vid ett speciellt stadium.
- Producera cDNA med ett kommersiellt kit, enligt tillverkarens anvisningar.
- Ligera cirka 20 ng cDNA i en Vector medföljer kommersiellt kit eller annan lämplig vektor. En lämplig plasmidvektor innefattar sekvenser för mRNA-stabilitet, såsom 5 'β-globin och 3 poly (A) -sekvenser (pCS2 +, pTnT, pCS105).
- Omvandla ligering till kompetenta bakterieceller med hjälp av leverantörens rekommenderade protokoll för värmechock transformation.
Obs: Alternativt är kommersiellt tillgänglig en samling av öppen läsram (ORFeome) kloner och kan användas för att generera transkript för injektion.
- Förbered 10 pooler av plasmider av 10 Mars-10 april komplexitet (10 APRIL - 10 maj total komplexitet). Detta motsvarar 10 plattor med 1000 - 10000 kolonier vardera.
- Plate bibliotekskultur på 10 15 cm LB-ampicillinplattor, växa 12-18 timmar vid 37 ° C, och samla kolonier från varje av lätt tryck med ett glas spridare i 7 ml LB.
- Förbered en glycerol lager från 0,5 ml (lägg till 0,2 ml steril glycerol och förvara vid -20 &# 730; C), och använda de kvarvarande 6,5 ml för att framställa DNA med en standard kommersiellt tillgänglig DNA-miniprep-kit i enlighet med tillverkarens anvisningar.
- Linjärisera poolade plasmid-DNA (1,0-2,0 mikrogram) med lämpligt restriktionsenzym smälta 16 vid 37 ° C under 1-1,5 timme. Isolera linjäriserad DNA med fenol / kloroform-extraktion följt av etanolutfällning och återsuspension i vatten per specifikationerna för RNA-polymeras-kit användes. Syntetisera sens-RNA med ett kommersiellt RNA-polymeras-kit i enlighet med tillverkarens anvisningar.
- Förbered nålar för mikroinjektion (med hjälp av en nål avdragare med glas kapillärrör) om cirka 20 um diameter; mäta nål tips om en förening mikroskop med en kalibrerad okulär mikrometer. Obs: nål avdragare inställningar måste bestämmas empiriskt för att åstadkomma en nål med en fin spets så att när brutit med fin pincett ger den önskade spetsstorlek.
- Framställa (skjut lera tilljämnt skikt på botten av skålen) lera kantade 35 x 10 mm petriskålar med parallella spår för att hålla ägg på plats under mikroinjektion; producera spår med en galleria sond eller pasteurpipett smält vid spetsen i lågan. Som ett alternativ till lera, förbereda agaros rätter gör fördjupningar med en elastomer mögel 17. Överför oocyter med ett brett hål pipett till 3% Ficoll i 1X MBS (ca 2 ml) i rader i lera kantade rätter.
- Använda microinjector, fylla nålen med 1 ng / nl RNA och justera balansen för att producera svagt positivt tryck (för att förhindra utarbetandet av äggcellen cytoplasman).
- Injicera oocyter med ca 20 nl RNA i ekvatorområde. Låt en timme för injicerade oocyter att stanna kvar i Ficoll-MBS, sedan överföra försiktigt 1x MBS. Inkubera i 8 - 24 timmar vid 20 ° C före djurlock analys.
3. Animaliska Cap-analys
- Förbered 3 / 4x NAM och få fin pincett, hår slinga, böjda täckfragment, lera kantade dishes med skålformade fördjupningar för att hålla ägg. Gör böjda täckfragment genom att bryta sönder glastäck i små fragment (ca 1-2 mm x 2-4 mm) och passerar genom lågan tills kanterna polska och sloka, vilket ger en böjd bit.
- Gödsla X. laevis ägg 18 genom in vitro eller naturlig parning och kultur att gastrula stadier (10-11 timmar efter befruktning vid RT) i 0,1 x MBS före sortering av scenen; samla mitten gastrula (etapp 11-11,5) 10 embryon.
- Överför embryon till en petriskål ungefär halvfull med 3 / 4x NAM. Med hjälp av två par fina pincett, ta bort fertilisering (vitelline) membran från gastrulae.
- Överföring oocyter till 3 / 4x NAM (ca 2 ml) i lera kantade rätter och immobilisera i enskilda intryck i leran, som producerar intryck att tillgodose enskilda embryon som spår beskrevs ovan.
- Överför embryon till lera kantade rätter och skär skalltak off gastrulae med två par fina pincett. Var noga med att isolera djur cap ektoderm bara och inte ekvatorial vävnad 18.
- Placera ett djur lock på djuret hemisfär av varje oocyt med den inre ytan av djuret locket i kontakt oocyten. Håll rekombinanter tillsammans genom att applicera krökt glas täckglas fragment och applicera nedåttryck på glaset, plattas ektoderm som täckglas i kontakt med lera (skalltak kan förbli öppen med det inre skiktet exponeras till ytan av oocyten för 6 - 8 h eller längre ).
Obs! Du kan också placera djuret locket till en lera fördjupning med sin inre yta uppåt och placera en äggcellen på locket; säkra rekombinant med små förlängningar av lera. - Odling vid 20 ° C tills embryon kontroll når önskad scen för analys.
- Separat rekombinant genom att ta bort täck / lera och isolera ektoderm med pincett och en hår slinga.
- Fix ektodermala fragment för en h i MEMFA (3,8%formaldehyd i MEM [0,1 M MOPS pH 7,4, 2 mM EGTA och 1 mM MgSO 4]).
- Överför fragment (och embryon kontroll) från MEMFA till etanol och förvara vid -20 ° C.
4. Analys av svar i Ektoderm av in situ hybridisering (ISH)
- Bered lösningar för ISH.
- Förbered 1 x PBS: 0,01 M fosfatbuffrad saltlösning, NaCl 0,138 M, pH 7,4
- Förbered PBS-Tween (PTW): 1 x PBS, 0,1% Tween-20
- Förbered 100x Denharts lösning: 2% BSA, 2% Polyvinylpyrrolidon, 2% Ficoll
- Förbered Hybridiseringsbuffert: 50% formamid, 5 x SSC, 1 mg / ml Torula jäst-RNA, ett mikrogram / ml Heparin, 1x Denharts lösning, 0,1% Tween-20, 0,1% CHAPS, 10 mM EDTA, DEPC-H2O
- Förbered Maleinsyra buffert (MAB): 100 mM maleinsyra, 150 mM NaCl, pH 7,5
- Förbered MAB + block: MAB, 2% blockeringsreagens (värme till 60 C för att lösa)
- Förbered alkaliskt fosfatas (AP) buffert: 100 mM TrispH 9,5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0,1% Tween, dH 2 O
- Förbered RNA-prob.
- Med hjälp av en kommersiell RNA-polymeras kit och gräva-NTP-blandning, lägga till ett 1,5 ml rör (50 pl reaktion): 25,5 il DEPC-H2O, 10 ^ 5X Transcription Buffer, 2,5 pl 10x gräva-NTP mix, 5 pl 100 mM DTT, 2 pl RNAsin, 2 pl linjäriserad DNA-templat (~ 1 ^ g / | al), 3 | il RNA-polymeras och inkubera 37 C under 90 minuter.
- Lägg 2 ul RNA-polymeras och inkubera 37 C under 60 minuter.
- Kontroll 2 ^ il reaktion på en% agarosgel.
- Lägg ett pl RQ1 RNase-fritt DNas och inkubera 37 C under 20 minuter.
- Fällning sonden genom tillsats 50 ^ il DEPC-H2O, 25 ^ il 10 M ammoniumacetat och 313 | il etanol. Förvara vid -20 C över natten (O / N) då driva RNA genom centrifugering vid 13.800 xg under 20 minuter. Tvätta med 500 pl 75% etanol, snurra kort, ta bortetanol och tillåta pelleten lufttorka. Tillsätt 50 pl DEPC-H2O
- Lägg hybridiseringsbuffert till en slutlig koncentration av ~ 0,5 | ig / | il.
- Förbered Mjukpapper för hybridisering. Om inget annat anges, fyll flaskorna till toppen med varje lösning förändring beskrivs (ca 4 ml).
- Avlägsnande av etanol från flaskor och embryon överföring till 75% etanol / PTW, därefter 50% etanol / PTW för 10 min vardera, horisontellt på vipparmen.
- Tvätta tre gånger i PTW för 5 min vardera på rocker.
- Överföring till 10 mikrogram / l Proteinas K-behandling i PTW; berg rör vertikalt 15 min.
- Skölj två gånger 10 minuter vardera i 0,1 M Trietanolamin pH 7.8 - vagga rör vertikalt.
- Lägg 12,5 il ättiksyraanhydrid till rör och rock vertikalt 5 min. Upprepa med ytterligare 12,5 jil ättiksyraanhydrid under 5 min.
- Tvätta i PTW 5 min vertikalt på rocker.
- Refix i 4% paraformaldehyd 20 minuter på rocker. Värme Hybridiseringsbufferttill 60 C.
- Tvätta tre gånger i PTW för 5 min vardera på rocker.
- Ta bort alla utom ~ 1 ml PTW från varje rör och tillsätt 250 pl Hyb buffert; snurra försiktigt rören för att blanda. Rock rör vertikalt 5 min.
- Ersätt med 60 ˚C Hyb buffert (0,5 ml) och rör försiktigt vid 60 ° C 10 min. Ersätt med färska Hyb buffert och skaka vid 60 ° C två till fyra timmar.
- Värmesond (1 ml på 0,5 mikrogram / l i Hyb buffert) till 60 ˚C (3 min). Ta bort Hyb buffert och tillsätt sond till rör. Skaka försiktigt O / N vid 60 ˚C.
- Förbered Mjukpapper för antikropp.
- Varm Hyb-buffert och 2x SSC + 0,1% Tween-20 lösningar till 60 C.
- Byt sondlösning med Hyb buffert (spara sonder vid -20 C under 2 - 3x återanvändning). Tvätta vid 60 C under 10 minuter.
- Tvätta tre gånger vid 60 C i 2 x SSC-Tween (20 minuter vardera med omröring).
- Tvätta tre gånger vid 60 ° C i 0,2 x SSC-Tween (20 minuter vardera med omrörning).
- Tvätta två gånger i MAB (RT) under 15 min vardera horisontellt på vippa.
- Tillsätt 1 ml MAB + block. Tvätta 2 tim vertikalt på rocker.
- Överföring till en ml MAB + block med en 1/2000 Anti-digoxigenin-AP. Rock vertikalt vid 4 CO / N.
- Förbered Mjukpapper för färgreagensen.
- Ersätt antikropplösning med MAB; tvätta tre gånger i MAB 5 min vardera horisontellt på rocker.
- Tvätta tre gånger i MAB 1 timme varje horisontellt på rocker.
- Tvätta två gånger i AP-buffert 10 min varje horisontellt på rocker.
- Överför vävnaden till flera brunnar plastbricka, ta bort AP buffert och tillsätt BM Purple reagens (~ 1 ml). Tillåt reaktionen fortgå i mörker 5 min till O / N.
- När det är lämpligt färgning uppnås överföra vävnad till injektionsflaskor med tvåhjuliga motorfordon. Tvätta två gånger 10 minuter vardera i PTW på rocker.
- Fix i Bouins lösning vid 4 CO / N på rocker.
- Skölj Bouins med tre 70% etanol / 30% PTW tvättar vid RT. Fortsätt to ta bilder med hjälp av epi-belysning och ett mikroskop monterad kamera, blekning vid behov 18.
5. Sib Urval och kloning
- Välj poolen med högst aktivitet (störst respons i ektodermala vävnad).
- Titrera (späd med LB till lämplig densitet) glycerol lager för poolen med högst aktivitet och platta ut tio nya plattor med ungefär en tiondel kolonierna från föregående steg (med hjälp av avsnitt 2 i protokollet ovan).
- Minska pool storlek tills aktivitet spåras till enskild koloni.
- Erhålla DNA-sekvensen med användning av standard primrar i vektorn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som svar på uttryckning av mRNA injiceras i oocyter, svarar djurlockvävnad analyserades för expression av otx2 genom in situ-hybridisering (figur 2 och tabell 1); otx2 uttrycks i det presumtiva lins ektoderm (PLE) från neuralröret stängning genom lins placode förtjockning 19. Eftersom otx2 uttrycks också i den främre neurala ektoderm såväl som icke-neural huvud ektoderm utanför PLE, är det i samband med både neurala och placodal svar. Användningen av foxe3 att screena biblioteket för en genprodukt som kan producera ett lins induktiv svar i linsen kompetenta djur cap ektoderm tillät en mer specifik strategi till målet av uttrycket kloning, eftersom foxe3 uttrycks i PLE från neurala plattan scener och hela lins vesikelbildning 20, som finns i angränsande placodal regioner, men frånvarande från neuroectoder m. Använda uttryckskloning och sib selektionsprotokoll ovan och insprutning pooler av bibliotekstranskript framställdes en gen med förmåga att producera foxe3 uttryck i skalltak isolerades (tabell 2). Efter isolering av klonen har ytterligare 179 djur cap-analyser med hjälp av oocyter injicerade med biblioteks avskrifter screenas för uttryck av foxe3; 50 var positiva (28%). Av 140 djur cap stycken placerade på oinjicerade oocyter, 0 positiva (Figur 3).
Figur 1. Oocyte-djur Cap-analys och expressionskloning Schematisk översikt av protokoll:. Transkriptioner framställes från klonbibhoteket och injiceras i oocyter, är djurlock ektoderm odlades med oocyter och sedan analyseras med avseende på inducerat genuttryck genom hybridisering in situ. d / 53518 / 53518fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Typiska resultat av djur Cap-analys följande mRNA-Injection och in situ-hybridisering för Otx2. (AB) Representativa resultat av induktiv reaktion på dorsalized etapp 14 poly (A) + RNA i skalltak, analyserades med avseende otx2 expression genom hela montera in situ hybridisering. (A) skalltak placerade på oinjicerade oocyter vid steg 10.5 och odlade till steg 25. (B) Steg 10.5 skalltak placeras på oocyter injicerade med 10 ng RNA och odlades till steg 25. otx2 uttryck observerades i 6/7 fall och anges med pilspetsar. Bar = 500 pm. "Target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Typiska Resultat av Animal Cap-analys efter in situ hybridisering för Foxe3. (AC) Representativa skalltak från äggcellen-djur cap-analyser, testades för uttryck av foxe3 genom hybridisering in situ. (A) Etapp 11-11,5 skalltak placeras på ldb1-injicerade oocyter och odlade till steg 23. foxe3 uttryck indikeras av pilspetsar. (B) Etapp 11-11,5 skalltak placeras på oinjicerade ägg och odlas till steg 23; ingen foxe3 uttryckning detekterades. (C) Sektion genom foxe3 -positivt inducerade djurskyddet från A visar uttryck i inre och yttre skikten av ektoderm. Bars = 500 | im.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53518/53518fig3large.jpg" target = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Injicerad RNA | Positiva fall | Gen | % |
| Etapp 14 dorsalized mRNA 10 ng | 12/24 | otx2 | 50 |
| Biblioteks pooler av 10 5 kloner, 20 ng | 3/9 | otx2 | 33 |
| Biblioteks pooler av 05-10 oktober 0 Clon es, 20 ng | 50/179 | foxe3 | 28 |
| Ingen | 0/140 | foxe3 | 0 |
Tabell 1. Oocyte-Animal Cap analysresultat Resultat av animaliskt cap-analys bestämdes genom in situ hybridisering med otx2 och foxe3, med hjälp av oocyter injicerade med mRNA eller med transkript syntetiserade från cDNA bibliotekspooler. eller oinjicerade oocyter.
| Injicerad RNA | Pool beteckning / val | Positiv foxe3 uttryck |
| en | 2/4 | |
| B * | 4/28 | |
| C | 4/44 | |
| Biblioteks pooler av 10 4 kloner, 20 ng | 1 | 0/11 |
| 2 | 0/10 | |
| 3 | 3/14 | |
| 4 | 0/12 | |
| 5 | 0/15 | |
| 6 | 1/20 | |
| 7 | 3/23 | |
| 8 | 0/16 | |
| 9 | 0/16 | |
| 10 * | 5/20 | |
| Biblioteks pooler av 5000 kloner, 20 ng | 1 | 0/7 |
| 2 * | 5/16 | |
| 3 | 1/7 | |
| 4 | 0/7 | |
| 5 | 0/7 | |
| 1 | 0/10 | |
| 2 | 0/10 | |
| 3 | 0/10 | |
| 4 | 0/10 | |
| 5 * | 8/26 | |
| 6 | 0/11 | |
| 7 | 0/10 | |
| 8 | 0/10 | |
| 9 | 0/10 | |
| 10 0/8 | ||
| Biblioteks pooler av 70-200 kolonier, 20 ng | 1 | 0/8 |
| 2 | 0/10 | |
| 3 * | 1/10 | |
| 4 * | 1/10 | |
| 5 | 0/10 | |
| 6 | 0/9 | |
| 7 | 0/10 | |
| 8 | 0/10 | |
| Biblioteks pooler av 20 kolonier, 20 ng | 1 | 0/10 |
| 2 | 0/10 | |
| 3 | 0/10 | |
| 4 * | 7/21 | |
| 5 | 0/10 | |
| 6 | 0/10 | |
| 7 | 0/10 | |
| 8 | 0/10 | |
| 9 | 0/10 | |
| 10 | 0/10 | |
| K2-6, L1 | 0/10 | |
| L2-6, M7 | 0/10 | |
| M8-12, N7-8 | 0/10 | |
| K5-6, L1-4 | 1/10 | |
| L5-6, M7-10 | 0/10 | |
| M11-12, N7-8, K2-4 | 0/10 | |
| K2, K5, L2, L5, M8, M11 | 0/10 | |
| K3, K6, L3, L6, M9, M12 | 0/9 | |
| K4, L1, L4, M7, M10, N7, N8 | 1/9 | |
| Biblioteket RNA, 20 ng | K6 | 0/10 |
| L1 * | 3/10 | |
| L3 | 0/10 | |
| L4 | 0/10 | |
| Bibliotek-RNA, 20 ng | L1 (ldb1) bekräftelse | 50/179 |
| * Indikerar vald pool |
Tabell 2. Sib Urval och Expression Kloning Resultat. Poolen med den högsta nivån av respons i varje djur cap analys (mellan 10% och 36% positiva för foxe3 uttryck) valdes för användning i nästa experiment för att begränsa verksamheten till en klon. Asterisk indikerar utvalda pool.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den metod som beskrivs här för den funktionella kloning av gener med förmåga att inducera ett svar i kompetent ektoderm kan användas för att identifiera ett stort antal olika genprodukter. Detta förfarande expanderar vid tidigare arbete genom att kombinera vävnads-inducerande analyser med uttryckskloningstekniker. Vi använder de metaboliska vägarna för Xenopus oocyten som en produktionskälla inducera faktorer, direkt eller indirekt, efter RNA-injektion. Detta i kombination med användning av etablerade metoder för kloning av en gen av intresse 6,7 genom att använda uttryck av transkript som genereras från ett cDNA-bibliotek eller andra samlingen av kloner, utgör ett värdefullt tillvägagångssätt för dem som söker för att identifiera gener av nytt intresse som deltar i embryonala induktion. Den breda tillämpningen av denna metod för att funktionell identifiering av nya gener är ett bra komplement till spännande nya omvända genetiska metoder, och kan också användas för att funktionellt testa transkript identifierats med hjälp av high-throughput metoder (såsom RNA-punkter) 21.
Kontroller är kritisk vid övervakning av metabolisk funktion av oocyter som används i lock analysen. Både för att säkerställa hälsan hos varje sats av oocyter och fastställa nyttan av detta system för att upptäcka låg överflöd transkript, varierande koncentrationer av mRNA av mesoderm inducerare INHBB testades; denna gen är kopplad till linsen induktion vägen och är en väldokumenterad oberoende kontroll 14. Muskel-inducerande aktivitet, analyserades genom expression av muskelspecifika antigener i djurlock ektoderm med 12/101 antikropp, observerades med 2 - 200 pg INHBB-mRNA, även i närvaro av 500-faldigt överskott etapp 14 poly (A) ^ RNA. Systemet är således användbara inom ett mycket brett område av injicerad RNA-kvantitet och oocyter kan stabilt producera proteinet och förblir livsdugliga efter cytoplasmiska injektion av volymer av 50 nl och högre.
Ett övervägande för uSO om ett cDNA-bibliotek i detta protokoll är nödvändigheten för fullängds eller nästan fullängds-kloner. Före användning i protokollet, bör biblioteket undersökas genom Northern analys för att bestämma storleken på kända transkript i biblioteket och därmed minska risken för att dominerande-negativa effekter erhålls från potentiellt stympade injicerade avskrifter. Eftersom en fullängds-cDNA poolen är viktigt, användning av EST-kloner 22 eller optimalt, Xenopus ORFeome 23 (som ger en komplett uppsättning av validerade fullängds kloner) är att föredra framför en traditionell cDNA-bibliotek inte en Scen- och vävnads- specifik källa till cDNA inhämtade och användes för att konstruera biblioteket. Ett annat övervägande är närvaron av β-globin och poly (A) -sekvenser i biblioteket vektor avsedd att öka mRNA-stabilitet i injicerade transkript. Även om detta är önskvärt att öka mängden protein som framställs av injicerat syntetiskt mRNA, väcker den också possibillighet att producera en dominant-negativ effekt från mRNA som är högre stabilitet och aktivitet än in vivo. Ett lågt kopietal mRNA kan inte utöva samma effekter som dess endogena motsvarighet i bakgrunden av en stor pool av transkript; en som stabiliseras i kloning och transkriptionsprocessen kan kvarstå för att möjliggöra detektering i locket analysen. En tredje fråga är pool storlek; avsevärd minskning av pool storlek (10 kloner eller färre) har visat sig vara fördelaktigt under de senaste vinst-of-funktion screeningprojekt i embryon 24 och kommer sannolikt att ge tydligare resultat och enklare identifiering av kandidatgener. En mindre pool storlek än den 3 oktober-4 oktober rekommenderas i detta protokoll kan uppnås om den totala komplexiteten i samlingen av kloner är mindre än 10 4, vilket är fallet med ORFeome 23; man kunde screena ~ 9000 kloner som börjar med 10 pooler av 900, även om det kan vara oöverkomligt arbetsintensiv tillbearbeta mer än 10 pooler i ett experiment.
Bestämning av den typ av genprodukt (genom sekvensanalys) görs av den gen som identifieras i skärmen bestämmer naturen av tester av dess funktion. Eftersom en nukleär transkriptions kofaktor identifierades i vår skärmen 8, var det nödvändigt att bekräfta den roll som kärna i den induktiva processen utlöses av införande av ldb1. Enukleerade oocyter har fullt fungerande protein syntetiska maskiner och är livskraftiga och kan producera utsöndrade faktorer från injicerade transkript. Emellertid kommer frånvaron av kärnan avskaffa funktion av transkriptionsfaktorer, kofaktorer eller andra indirekt verkande genprodukter. Efterföljande analyser av gener som identifierades på skärmen inkluderar bestämning av utvecklingsuttrycksmönster genom in situ hybridisering och vinna-of-funktion och förlust av funktionstester. Överuttryck genom injektion av RNA i zygoter eller genom att begränsa injektion specific blastomeres att begränsa dess effekter på vissa regioner i embryot kan ge insikter samt knockdown av geners funktion genom injektion av morpholino oligonukleotider riktade mot in vivo transkript.
Direkt visualisering av en induktiv effekt i det svarande djuret locket ektoderm med användning av en transgen linje med en reportergen (t.ex. GFP) kan i hög grad påskynda screeningsprocessen och eliminerar behovet för analys av RNA-expression genom hybridisering in situ. På liknande sätt är det önskvärt att använda antikroppar som snabbare metod för säkerhetskontroll om en lämplig antikropp (såsom 12/101 för muskelsvar som diskuterats ovan) är tillgänglig. Albino embryon kan användas för de skalltak, som trots svårare att skede noga mot gastrula stadier, effektivisera in situ hybridisering processen genom att eliminera behovet av någon blekning av vildtyp pigmente att bättre visualisera färgreaktionen proddukt.
Slutligen är det viktigt att beakta att av flera skäl, kan ett stort antal försök måste genomföras för att identifiera en given gen. För en, kan antalet fall ett rimligt processen i en given studie begränsas av utvecklingen (med eventuell förlust av kompetens) som uppstår över tid även med tanke på en stor sats av embryon och en rad temperaturer vid vilka till kultur dem, som samt den förlust som kan uppstå i små bitar av ektoderm i bearbetningen. För det andra, kan framgångsrika av uttryck av en vald markör i ektodermet vara mycket låg och kräver många fall observera en statistiskt signifikant effekt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12/101 Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 12/101 | Monoclonal antibody for detection of muscle tissue |
| 20x SSC Buffer | Sigma | S6639 | for ISH |
| Acetic anhydride | Sigma | A6404 | for ISH |
| Anti-Dig-AP | Roche | 11093274910 | for ISH |
| Aurum Plasmid Mini Kit | Bio-Rad | 732-6400 | Plasmid DNA purification |
| Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | for ISH |
| BM Purple | Roche | 11442074001 | for ISH |
| Boekel Hybridization Oven | Fisher Scientific | 13-245-121 | for ISH |
| Bouin's Solution | Sigma | HT10132 | for ISH |
| BSA | Sigma | A9647 | for OCM |
| CHAPS | Sigma | C3023 | for ISH |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | Defolliculation of oocytes |
| Cysteine | Sigma | C121800 | Dejelly embryos |
| DEPC-H2O | Fisher Scientific | BP5611 | for ISH |
| Dig-RNA Labeling Mix | Roche | 11277073910 | for ISH probes |
| Dumont #5 forceps | World Precision Instruments | 500233 | for Vitelline envelope removal |
| Ethyl 3-aminobenzoate | Sigma | A5040 | MS222 anesthetic |
| Ficoll PM 400 | Sigma | F4375 | for Injection media |
| Formamide | Sigma | F9037 | for ISH |
| Gentamicin sulfate | Sigma | G1914 | for OCM |
| Glass capillaries | World Precision Instruments | 4878 | 3.5" long, I,D, 0.530 mm |
| Glass sample vials | Fisher Scientific | 06-408B | for ISH |
| Hair loop | Hair affixed in pasteur pipette for tissue manipulation | ||
| Heparin sodium salt | Sigma | H4784 | for ISH |
| Injector Nanoliter 2010 | World Precision Instruments | Nanoliter 2010 | Microprocessor-controlled microinjector |
| Instant Ocean | Carolina | 972433 | Aquarium Salt for frog recovery |
| IRBG XGC Xenopus verified full-length cam cDNA | Source Bioscience | 989_IRBG | cDNA library |
| LB Agar plates with 100 µg/ml Ampicillin | Teknova | L5004 | 150 mm pre-poured LB-Amp plates for sib selection |
| LB Luria Broth | Teknova | L8650 | LB for collecting colonies in sib selection from plates and dilution of cultures |
| Magnetic mRNA Isolation Kit | New England BioLabs | S1550S | for isolation of poly(A)-enriched RNA |
| Maleic Acid | Sigma | M0375 | for ISH |
| Manual Microfil Micromanipulator | World Precision Instruments | M3310R | Manual micromanipulator |
| Nutating Mixer | Fisher Scientific | 22-363-152 | Rocker for ISH |
| Permoplast | Nasco | SB33495M | Clay for injection and dissection dishes |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | P5368 | for ISH |
| PMSG | Sigma | G4877 | to stimulate oocyte development |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma | PVP40 | for ISH |
| Programmable Puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | Micropipette needle puller |
| Proteinase K | Sigma | P6556 | for ISH |
| pTnT Vector | Promega | L5610 | cDNA library construction |
| Riboprobe Combination System | Promega | P1450 | in vitro transcription |
| Superscript Full Length cDNA Library Construction Kit | Life Technologies | 18248013 | kit for cDNA library construction |
| Sutures, 3-0 silk | Fisher Scientific | 19-037-516 | Suture thread and needle for post-oocyte removal |
| Torula RNA | Sigma | R3629 | for ISH |
| Triethanolamine | Sigma | T1502 | for ISH |
| Tween 20 | Sigma | P9416 | for ISH |
| Universal RiboClone cDNA Synthesis System | Promega | C4360 | alternative kit for cDNA library construction |
| Xenopus Full ORF Entry Clones - ORFeome Collaboration | Source Bioscience | 5055_XenORFeome | ORFeome Clones |
| XL2-Blue Ultracompetent Cells | Agilent Technologies | 200150 | cells for transformation of cDNA library |
References
- Yergeau, D., Kelley, C., Zhu, H., Kuliyev, E., Mead, P. Forward Genetic Screens in Xenopus. Using Transposon-Mediated Insertional Mutagenesis. Methods in Molecular Biology. 917, 111-127 (2012).
- Grainger, R. Xenopus tropicalis. as a Model Organism for Genetics and Genomics: Past, Present and Future. Methods in Molecular Biology. 917, 3-15 (2012).
- Nakayama, T., Fish, M., Fisher, M., Oomen-Hajagos, J., Thomsen, G., Grainger, R. Simple and Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Targeted Mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51, 835-843 (2013).
- Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis. Biology Open. 1 (12), 1273-1276 (2012).
- Zhao, Y., Ishibashi, S., Amaya, E. Reverse Genetic Studies Using Antisense Morpholino Oligonucleotides. Methods in Molecular Biology. 917, 143-154 (2012).
- Smith, W., Harland, R. Injected Xwnt-8. RNA acts early in Xenopus. embryos to promote formation of a vegetal dorsalizing center. Cell. 67, 753-765 (1991).
- Smith, W., Harland, R. Expression cloning of noggin., a new dorsalizing factor localized in the Spemann organizer in Xenopus embryos. Cell. 70, 829-840 (1992).
- Plautz, C., Zirkle, B., Deshote, M., Grainger, R. Early stages of induction of anterior head ectodermal properties in Xenopus. embryos are mediated by transcriptional cofactor ldb1. Developmental Dynamics. 243 (12), 1606-1618 (2014).
- Servetnick, M., Grainger, R. Changes in neural and lens competence in Xenopus. ectoderm: evidence for an autonomous developmental timer. Development. 112, 177-188 (1991).
- Nieuwkoop, P., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , Garland Publishing, Inc. New York and London. (1994).
- Lemaire, P., Garrett, N., Gurdon, J. Expression cloning of Siamois., a Xenopus. homeobox gene expressed in dorsal-vegetal cells of blastulae and able to induce a complete secondary axis. Cell. 81, 85-94 (1995).
- Lustig, K., Kroll, K., Sun, E., Kirschner, M. Expression cloning of a Xenopus T.-related gene (Xombi.) involved in mesodermal patterning and blastopore lip formation. Development. 122, 4001-4012 (1996).
- Hsu, D., Economides, A., Wang, X., Eimon, P., Harland, R. The Xenopus. dorsalizing factor Gremlin identifies a novel family of secreted proteins that antagonize BMP activities. Molecular Cell. 1 (5), 673-683 (1998).
- Lustig, K., Kirschner, M. Use of an oocyte expression assay to reconstitute inductive signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 6234-6238 (1995).
- Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. JoVE Science Education Database. , (2015).
- Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. JoVE Science Education Database. , (2015).
- Viczian, A., Zuber, M. Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis. J. Vis. Exp. (39), e1932 (2010).
- Sive, H., Grainger, R., Harland, R. Early development of.Xenopus laevis.: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor. New York. (2000).
- Zygar, C., Cook, T., Grainger, R. Gene activation during early stages of lens induction in Xenopus. Development. 125, 3509-3519 (1998).
- Medina-Martinez, O., Jamrich, M. Foxe view of lens development and disease. Development. 134, 1455-1463 (2007).
- Amin, N., Tandon, P., Osborne, N. E., Conlon, F. RNA-seq in the tetraploid Xenopus.laevis. enables genome-wide insight in a classic developmental biology model organism. Methods. 66, 398-409 (2014).
- Gilchrist, M., Zorn, A., Voigt, J., Smith, J., Papalopulu, N., Amaya, E. Defining a large set of full-length clones from a Xenopus tropicalis EST project. Developmental Biology. 271, 498-516 (2004).
- Karpinka, J., et al. Xenbase, the Xenopus. model organism database; new virtualized system, data types and genomes. Nucleic Acids Research. 43, D756-D763 (2015).
- Zhang, S., Li, J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signaling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis. PLoS ONE. , e79469 (2013).
