Protocol
Tüm deney prosedürleri Virginia Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
Not: Şekil 1, deneysel prosedürler şematik görünümünü gösterir.
Oosit hazırlanması 1.
- Ön asal X oosit izolasyon önceden Gebe Kısrak Serum Gonadotropin 150 U (PMSG) yaklaşık bir hafta ile kadın laevis. 29 G iğne ile 1 cc steril şırınga ile dorsal lenf kese içine 1 ml 150 U / ml PMSG enjekte edilir.
- Oosit enjeksiyonu ve oosit-hayvan kap deneyi için çözümler hazırlayın.
- Ca Hazırlama ++ / Mg ++ içermeyen OR2 (OR2-): 82 mM NaCI, 2.5 mM KCI, 1.5 mM Na 2 HPO 4, 50 mM HEPES pH 7.2.
- OR2- artı 1 mM CaCl2 ve 1 mM MgCl2: ya da 2'yi hazırlayın.
- % 60 Leibovitz L15, 0.4 mg / ml BSA, 100 ug / ml gentamisin, pH 7,8: OCM hazırlayın.
- Ön1x MBS hazırlanması: 88 mM NaCI, 1 mM KCI, 0.7 mM CaCl2, 1 mM MgSO 4, 5 mM HEPES (pH 7.8), 2.5 mM 3 NaHCO.
- 1x MBS% 3 Ficoll hazırlayın.
- 1x NAM hazırlayın: 110 mM NaCI, 2 mM KCI, 1 mM Ca (NO 3) 2, 1 mM MgSO 4, 0.1 mM EDTA, 1 mM NaHCO 3, 2 mM Na 3 PO 4, pH 7.4 ile yıkanır.
- 0.1X MBS Etil 3-aminobenzoat metansülfonat tuzunun% 0.03 çözeltisi (MS222) 'de kadın anestezisi için çözelti kurbağa yerleştirerek (ilk 10 ml% 95 etanol içinde 0.3 g MS222 çözülür, daha sonra 1 L, 0.1X MBS sulandırmak) 10-15 dakika veya tepkisiz kadar.
- Bu anestezi yanıt vermiyor sağlamak (eksik anestezi kurbağa uzuvları taşımak veya bedeni teslim) onun sırtına anestezi kurbağa çevirerek tam olup olmadığını kontrol edin.
- Cerrahi forseps ile yumurtalık dokusu izole bisturi cilt ve vücut duvarı boyunca abdominal insizyon yapılıp, yumurtalık fragmanlarını izoleve makas. OR2- içine yumurtalık parçaları yerleştirin. 24 mm'lik kavisli iğne 3-0 ipek sütür ile vücut duvarı kapatın ve aynı sütür ile ayrı ayrı cilt kapatın. Su içinde 1 g / L akvaryum tuzu kadın kurtarma izin verir.
- (- 20 oosit 10) adet ve taze OR2- transfer küçük içine ince forseps, gözyaşı yumurtalık dokusu kullanma.
- 1 saat boyunca karıştırma cihazı üzerinde, hafifçe ajite taze kolajenaz geçiş ve bir saat daha çalkalayarak OR2- 2.0 mg / ml kollajenaz A Defolliculate yumurtalık fragmanları.
- Yıkama küçük oosit atarak OR2 [Ca ++ / Mg ++ ihtiva eden] 10 kez, oositlerde.
- OCM iki kez oosit yıkayın ve taze OCM transfer. Görsel inceleme üzerine boyutuna göre Evre VI oosit izole edin ve olgunlaşmamış (küçük) oosit atın: Sahne VI oositlerin hayvan yarımkürede bile pigmentasyon ile olgunlaşmamış oositlerin büyüktür ve çapı yaklaşık 1.2-1.4 mm.
- 20 ° C i - 18 oosit koruyunenjeksiyondan önce n OCM. Not: Agaroz kaplı petri kaplarına çanak oositlerin yapışmasını en aza indirmek için de kullanılabilir.
Kütüphane Transkriptler 2. Enjeksiyon
- Gelişme uygun bir aşamada (örneğin, nöral plak aşaması 14 10) ekstre yönlü bir cDNA kütüphanesi 15 kullanarak, RNA yı hazırlamak. Bir cDNA kütüphanesi satın alın ya da aşağıda dört adımda genel başına bir ticari kit kullanılarak bir inşa.
- Poli (A) + RNA (Malzeme Tablo bakınız) için zenginleştirmek için bir ürünü kullanırken ve üreticinin yönergeleri izleyerek yaklaşık 5 ug mRNA izole edin. Not: transkript (istenilen doku mikrodiseksiyon sonra, nöral levha gibi) bir indükleme dokuya sınırlı olabilir cDNA kütüphanesini üretmek için kullanılır, ya da belirli bir aşamada bütün embriyolardan olabilir.
- Üreticinin yönergeleri izleyerek bir ticari kit ile cDNA üretin.
- Bir Vecto içine cDNA ng, yaklaşık 20 Arterr ticari kit veya uygun başka bir vektör ile birlikte. Uygun bir plazmid vektörü mRNA stabilitesi gibi 5 'β-globin ve 3 poli (A) sekansları (PCS2 +, pTnT, pCS105) için dizileri içerir.
- Isı şok dönüşümü için tedarikçinin önerdiği protokol kullanılarak yetkili bakteri hücrelerine ligasyonu Transform.
Not: Alternatif olarak, açık okuma çerçevesi (ORFeome) klonları koleksiyonu, ticari olarak mevcuttur ve enjeksiyon için transkriptleri oluşturmak için kullanılabilir.
- 10 4 karmaşıklık (10 Nisan - 10 Mayıs toplam karmaşıklığı) 10 3 Plazmidlerin 10 havuzları hazırlayın. 10.000 kolonilerin her - Bu 1000 ile 10 plakaları temsil eder.
- 37 ˚C de 18 saat ve 7 ml LB bir cam dağıtıcı ile hafif basınç her gelen koloniler toplamak - Plaka kütüphane kültürü 10 15 cm LB-ampisilin plakalar üzerine, 12 büyüyecek
- 0.5 ml bir gliserol stok hazırlayın (-20 & 0.2 ml steril gliserol ve mağaza eklemek# 730 C) ve bir standart ile, üretici firmanın talimatlarına aşağıdaki ticari olarak temin edilebilir DNA miniprep kiti DNA hazırlamak için, kalan 6.5 ml kullanılır.
- 1.5 saat - Enzim 1 için 37 ° C'da 16 sindirimi, uygun kısıtlama - (2,0 ug 1,0) havuzlanmış plazmid DNA Linearize. Kullanılan RNA polimeraz kit özelliklerine göre su içinde etanol çökeltme ve yeniden süspansiyon haline getirildi, fenol / kloroform ekstraksiyonu ile linearize DNA izole edin. Üreticinin yönergeleri izleyerek bir ticari RNA polimeraz kiti ile duyu RNA sentez.
- Yaklaşık 20 mikron çapında (cam kılcal boru ile bir iğne çektirmenin kullanarak) mikroenjeksiyon için iğne hazırlayın; kalibre oküler mikrometre ile bir bileşik mikroskop iğne uçları ölçün. Not: İğne çektirmesi ayarları ince forseps ile kırıldığı zaman istenilen uç boyutu ortaya çıkarır şekilde ince uçlu bir iğne üretmek ampirik olarak tespit edilmelidir.
- (Içine kil itin hazırlayınçanak alt) üzerine muntazam tabakalı kil astarlı 35 x 10 mm mikroenjeksiyon sırasında yerinde oosit tutmak için paralel oluklar petri yemekler; alev ucunda erimiş bir alışveriş merkezi probu veya Pasteur pipeti ile oluklar üretirler. Kil, bir alternatif olarak, bir elastomer kalıp 17, girinti yaparak agaroz yemekler hazırlamak. Kil astarlı yemekleri satırları 1X MBS% 3 Ficoll (yaklaşık 2 ml) geniş çaplı bir pipet ile Aktarım oosit.
- Mikroenjektör kullanarak, 1 ng / nl RNA ile iğne doldurup (oosit sitoplazması kadar çizim önlemek için) hafif pozitif basınç üretmek için dengesini ayarlamak.
- Ekvator bölgesinde yaklaşık 20 nl RNA ile oosit enjekte edilir. Daha sonra, Ficoll-MBS kalır 1x MBS yavaşça aktarmak için enjekte edilmiş oositlerde için 1 saat izin verin. Önceden hayvan başlık tahlili için 20 ° C'de 24 saat - 8 inkübe edin.
3. Hayvan Cap Testi
- Ince forseps, saç döngü, kavisli lamel parçaları, kil astarlı dis 3 / 4x NAM hazırlayın ve eldefincan şekilli girinti çıkıntılar ile hes oosit tutun. Kavisli parça üreten, (4 mm - - 2 mm x 2 yaklaşık 1) ve kenarları lehçe ve sarkık kadar alev geçerek küçük parçalara cam lamelleri ayrı kırarak kavisli lamel parçaları olun.
- X döller laevis yumurta in vitro veya doğal çiftleşme ve aşamaları gastrula kültürün içinden 18 - önceden aşamaya göre sıralama için 0.1x MBS (10 oda sıcaklığında 11 saat sonrası fertilizasyon); 10 embriyoların - orta gastrula (11.5 aşama 11) toplamak.
- 3 / 4x NAM yaklaşık yarısı dolu bir petri embriyolar transfer. Ince forseps iki çift kullanarak, gastrulae gelen fertilizasyon (vitellin) membran kaldırmak.
- Aktarım kil astarlı yemekleri 3 / 4x NAM (yaklaşık 2 ml) oocytes ve oluklar yukarıda açıklandığı gibi bireysel embriyolar karşılamak için gösterim üreten, kil bireysel izlenimler hareketsiz.
- Kil astarlı yemekleri embriyolar transfer ve g kapalı hayvan kesim kapaklarıastrulae ince forseps iki çift kullanarak. Değil, sadece ekvator doku 18 hayvan kap ektoderm izole etmek için özen gösterin.
- Oosit ile temas hayvan kapağın iç yüzeyi ile her bir oosite hayvan yarımkürede bir hayvan kapağını yerleştirin. 8 saat veya daha uzun - 6 oosit yüzeyine maruz iç tabaka ile açık kalabilir (lamel kontaklar olarak hayvan kapakları kil ektoderm düzleşme, bombeli cam lamel fragmanı uygulanması ve cama aşağı doğru basınç uygulayarak rekombinantlarını arada tutmak ).
Alternatif olarak, yukarı doğru bakan iç yüzeyi ile bir kil girinti hayvansal takarak ve kapağı üzerinde bir oosit yerleştirmek; Not: kil, küçük uzantıları ile rekombinant sabitleyin. - 20 ° C'de Kültür kontrol embriyolar tahlil için sahne istenen ulaştıkları kadar.
- Lamel / kil kaldırılması ve forseps ve saç döngü ile ektoderm izole ederek ayrı rekombinant.
- MEMFA 1 saat (% 3.8 için ektodermal fragmanları FixMEM [0,1 M MOPS pH 7.4, 2 mM EGTA ve 1 mM MgSO 4] formaldehit).
- -20 ˚C etanol ve mağaza MEMFA transfer fragmanları (ve kontrol embriyolar).
In situ Hibridizasyon tarafından Ektoderm içinde Yanıtın 4. Analizi (ISH)
- ISH için çözümler hazırlayın.
- 1x PBS hazırlayın: 0.01 M fosfat tamponlu tuz, NaCl 0.138 M, pH 7.4
- Hazırlama PBS-Tween (PTW): 1x PBS,% 0.1 Tween-20
- 100x Denhart solüsyonu hazırlayın: 2% BSA,% 2 polivinilpirolidon,% 2 Ficoll
- Hibridizasyon tamponu hazırlayın:% 50 formamid, 5x SSC, 1 mg / ml maya RNA Torula, 1 ug / ml heparin, 1x Denhart solüsyonu,% 0.1 Tween-20,% 0.1 CHAPS, 10 mM EDTA, DEPC H2O
- Hazırlama Maleik asit tampon (MAB): 100 mM maleik asit, 150 mM NaCI, pH 7.5
- (Çözünmesi 60 ˚C ısı) MAB,% 2 reaktifi engelleme: MAB + blok hazırlayın
- 100 mM Tris: Alkalen Fosfataz (AP) Tampon hazırlayınpH 9.5, 50 mM MgCI2, 100 mM NaCI,% 0.1 Tween, dH 2 O
- RNA Probe hazırlayın.
- 1.5 ml tüp (50 ul reaksiyon) eklemek ticari bir RNA polimeraz kit kullanılarak ve karışımı-NTP dig: 25.5 ul DEPC, H2O, 10 ul 5X Transkripsiyon tamponu, 2.5 ul 10x dig-NTP karışımı, 5 ul 100 mM DTT, 2 ul RNAsin, 2 ul doğrusallaştırılmış DNA şablonu (~ 1 ug / ul), 3 ul RNA Polimeraz ve 90 dakika için 37 ° inkübe edin.
- 2 ul RNA Polymerase ekleyin ve 60 dakika için 37 ° inkübe edin.
- % 1 agaroz jeli üzerinde reaksiyon 2 ul kontrol edin.
- 1 ul RQ1 RNase-barındırmayan DNase ilave edin ve 20 dakika boyunca 37 ° inkübe edin.
- 50 ul DEPC H2O, 25 ul 10 M amonyum asetat ve 313 ul etanolün eklenmesi ile prob Çökelme. -20 ° C'de saklayın, gece boyunca (O / N), daha sonra 20 dakika boyunca 13.800 x g'de santrifüjleme ile geri RNA. Kısaca spin 500 ul% 75 etanol ile yıkayın, kaldırmaketanol ve kuru hava pelet izin verir. Ekle 50 ul DEPC H 2 O.
- 0.5 ug / ul ~ arasında nihai bir konsantrasyona kadar Hibridizasyon Tamponu ekleyin.
- Hibridizasyon için Tissue hazırlayın. Aksi belirtilmediği sürece, her bir çözüm değişikliği tarif edildiği gibi (yaklaşık 4 mi) ile üst şişeler doldurulur.
- Yatay rocker, 10 dakika her biri için% 75 etanol / PTW, daha sonra% 50 etanol / PTW Şişelerden ve transfer embriyolar etanol çıkarın.
- 5 dakika rocker üzerinde her biri için PTW üç kez yıkayın.
- 10 ug PTW içinde / ul Proteinaz K tedavisi transfer; Kaya tüpleri dik 15 dk.
- Dikey kaya tüpleri - 0.1 M Triethanolamine pH 7.8 iki kez 10 dakika her durulayın.
- Tüplere 12.5 ul asetik anhidrit eklenir ve dikey olarak 5 dakika sallayın. 5 dakika boyunca ilave 12,5 ul asetik anhidrit ile tekrarlayın.
- Rocker dk dikey PTW 5 yıkayın.
- Rocker% 4 paraformaldehid 20 dakika içinde Refix. Isı Hibridizasyon Tampon60 ˚C ye.
- 5 dakika rocker üzerinde her biri için PTW üç kez yıkayın.
- 250 ul Hyb Buffer her tüpten PTW tüm ama ~ 1 ml çıkarın ve ekleyin; hafifçe karıştırın tüpler girdap. Kaya tüpleri dik 5 dk.
- 60 ˚C Hyb Tamponu (0.5 mi) ile değiştirin ve 60 ° C'de 10 dakika yavaşça çalkalayın. Taze Hyb Tampon ile değiştirin ve 60 ˚C iki 4 saat sonra çalkalayın.
- Isı sondası 60 ° C (3 dakika) (0.5 ug Hyb Tamponu içinde / ml 1 ml). Hyb Buffer çıkarın ve tüpler probu ekleyin. O / N 60 ° C'de yavaşça çalkalayın.
- Antikor için Tissue hazırlayın.
- 60 ° C'ye ısınmaya Hyb Tampon ve 2 x SSC +% 0.1 Tween-20 çözümler.
- (- 3x yeniden kullanım için 2 -20 ˚C de probları kaydetmek) Hyb Tampon ile prob çözümü değiştirin. 10 dakika boyunca 60 ° C'de yıkanır.
- 2x SSC-Tween 60 ° (20 dakika çalkalanarak her biri) üç kez yıkayın.
- 0.2X SSC-Tween 60 ° (20 dakika çalkalanarak her biri) üç kez yıkayın.
- Rocker üzerinde 15 dakika her yatay için MAB (RT) iki kez yıkayın.
- 1 ml MAB + bloğu ekleyin. Rocker dikey 2 saat yıkayın.
- 1 / 2.000 Anti-dioksijenin-AP içeren 1 ml MAB + blok transfer. 4 CO / N dikey sallayın.
- Renk Reaktif için Tissue hazırlayın.
- MAB ile antikor çözüm değiştirin; MAB 5 dakika her yatay rocker üç kez yıkayın.
- MAB 1 saat her yatay rocker üç kez yıkayın.
- AP Tampon 10 dakika içinde her yatay rocker iki kez yıkayın.
- Birden-iyi plastik tepsi doku aktarın AP Buffer kaldırmak ve BM Mor reaktifmi (~ 1 ml). Reaksiyon O / N karanlık 5 dakika içinde ilerlemeye izin verin.
- Uygun boyama elde edildiğinde, PTW ve şişelere doku aktarın. Rocker üzerinde PTW iki kez 10 dakika her yıkayın.
- Rocker 4 CO / N at Bouin çözeltide sabitleyin.
- RT'de Bouin üç% 70 etanol /% 30 PTW yıkar ile yıkayın. T DevamGerekli 18 ise epi-aydınlatma ve bir mikroskop monte kamera, ağartma kullanarak o görüntü yakalama.
5. Sib Seçimi ve Klonlama
- En yüksek aktivite ile seçin havuzu (ektodermal dokusunda büyük tepki).
- (Yukarıda protokol bölümü 2 kullanılarak) önceki adımda elde edilen koloniler, en yüksek etkinliği olan havuzu için gliserol stokları (uygun yoğunluğa LB ile seyreltilmiş) ile yaklaşık onda biri ile on yeni plakaları plaka titre edilir.
- Etkinlik tek koloni takip dek havuzu boyutunu azaltın.
- Vektör standart primerler kullanılarak DNA sekansı elde edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hayvan kap doku yanıt, oositler enjekte mRNA ekspresyonu yanıt olarak in situ hibridizasyon (Şekil 2 ve Tablo 1) e göre otx2 ekspresyonu için tahlil edilmiştir; otx2 göz taslakları nöral tüp kapanması ile ilgili olası lens ektoderm (PLE) cinsinden ifade edilir kalınlaşma 19. Otx2 da PLE dışındaki ön nöral ektoderm olarak nöral olmayan baş ektoderm ifade edilir Bununla birlikte, bu nöral ve placodal tepkiler, her iki ile ilişkilidir. Foxe3 nöral plakadan PLE ifade edilir çünkü foxe3 kullanımı sentezleme klonlama amacı için daha özel bir yaklaşım izin lens yetkin hayvan kap ektoderm bir lens uyarılma karşılığının üretebilen bir gen ürünü için kütüphanenin taranması için Bitişik placodal bölgelerde mevcut ama neuroectoder eksik aşamaları ve lens vezikül oluşumu 20 boyunca, m. Yukarıda klonlama ve ifade sib bir seçilim protokolü kullanarak kütüphane transkriptlerinin havuzları enjekte hayvan kaplar içine foxe3 ifade üretme yetisine sahip bir gen (Tablo 2) elde edildi. Klonun izolasyonundan sonra, kütüphane transkriptleri ile enjekte edilmiş oositlerde kullanılarak 179 ek hayvan kap deneyleri foxe3 sentezlenmesi için taranmıştır; 50 olumlu (% 28). Uninjected oosit yerleştirilen 140 hayvan kap parçaları, 0 (Şekil 3) pozitif bulunmuştur.
Şekil 1. Oosit hayvan başlık tahlili ve ifade klonlama protokol şematik gösterimi. Transkript klonu kütüphane hazırlandı ve oositleri içine enjekte edilir, hayvan kap ektoderm oositlerde kültürlendi ve sonra da in situ hibridizasyon ile uyarılan gen ifadesi için test edilir. d / 53518 / 53518fig1large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
MRNA Enjeksiyon ve Otx2 in situ Hibridizasyon aşağıdaki hayvan başlık tahlili Şekil 2. Tipik sonuçlar. (AB) endüktif yanıtın Örnek sonucu yerinde bütün montaj tarafından otx2 ifadesi için tahlil, hayvan kapaklar evre 14 poli (A) + RNA dorsalized için melezleşme. Oosit üzerinde okuyun (A) Hayvan kapaklar aşamasına aşamada 10.5 enjeksiyon yapılmamış oosit üzerine yerleştirilmiş ve kültüre 25 (B) Aşama 10.5 hayvan kapaklar 10 ng RNA ile enjekte edilmiş ve sentezleme ile 6/7 olguda ve belirtilen otx2 aşamasında 25 nolu kültürlenmiş ok uçları. Çubuk = 500 um. "Target =" _ blank "> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
In situ olarak melezleşme ile foxe3 ekspresyonu için test edilen oosit hayvan kap tahlilleri, Hayvan Deneyi Cap Foxe3 in situ Hibridizasyon, aşağıdaki Şekil 3. tipik sonuçları. (AC) Örnek hayvan kapakları. (A) 11-11,5 Aşama hayvan kapaklar aşaması 23. foxe3 ifade ldb1-enjekte edilmiş oositlerde üzerine yerleştirilmiş ve kültürlenmiş ok uçları ile belirtilir. (B) Sahne uninjected oosit ve yerleştirilen 11-11,5 hayvan kapakları 23 sahneye kültürlü; Hiçbir foxe3 ekspresyonu tespit edilmiştir. Foxe3 ila (C) Bölüm ektoderm iç ve dış tabakalar bir gösteren ifade hayvan kapağı neden pozitif. Barlar, 500 mikron =.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53518/53518fig3large.jpg" target = "_ blank"> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Enjekte RNA | Pozitif vaka | Gen | % |
| Aşama 14 dorsalized mRNA, 10 ng | 12/24 | otx2 | 50 |
| 10 5 klonların Kütüphane havuzları, 20 ng | 3/9 | otx2 | 33 |
| 10 5 klon 10 0 Kütüphane havuzları es, 20 ng | 50/179 | foxe3 | 28 |
| Hiçbiri | 0/140 | foxe3 | 0 |
Tablo 1. Oosit-Hayvan Deneyi Sonuçları Cap hayvan başlık tahlili sonuçları mRNA veya cDNA kütüphane havuzu sentezlenen transkriptleri ile enjekte edilmiş oositlerde kullanılarak otx2 ve foxe3 in situ olarak melezleşme ile değerlendirildi.; veya uninjected oosit.
| Enjekte RNA | Havuz atama / seçim | Pozitif foxe3 ifadesi |
| A | 2/4 | |
| B * | 4/28 | |
| C | 4/44 | |
| 10 4 klonların Kütüphane havuzları, 20 ng | 1 | 0/11 |
| 2 | 0/10 | |
| 3 | 3/14 | |
| 4 | 0/12 | |
| 5 | 0/15 | |
| 6 | 1/20 | |
| 7 | 3/23 | |
| 8 | 0/16 | |
| 9 | 0/16 | |
| 10 * | 5/20 | |
| 5000 klonların Kütüphane havuzları, 20 ng | 1 | 0/7 |
| 2 * | 5/16 | |
| 3 | 1/7 | |
| 4 | 0/7 | |
| 5 | 0/7 | |
| 1 | 0/10 | |
| 2 | 0/10 | |
| 3 | 0/10 | |
| 4 | 0/10 | |
| 5 * | 8/26 | |
| 6 | 0/11 | |
| 7 | 0/10 | |
| 8 | 0/10 | |
| 9 | 0/10 | |
| 10 0/8 | ||
| 70-200 koloni Kütüphane havuzları, 20 ng | 1 | 0/8 |
| 2 | 0/10 | |
| 3 * | 1/10 | |
| 4 * | 1/10 | |
| 5 | 0/10 | |
| 6 | 0/9 | |
| 7 | 0/10 | |
| 8 | 0/10 | |
| 20 koloni Kütüphane havuzları, 20 ng | 1 | 0/10 |
| 2 | 0/10 | |
| 3 | 0/10 | |
| 4 * | 7/21 | |
| 5 | 0/10 | |
| 6 | 0/10 | |
| 7 | 0/10 | |
| 8 | 0/10 | |
| 9 | 0/10 | |
| 10 | 0/10 | |
| K2-6 L1 | 0/10 | |
| L2-6, M7 | 0/10 | |
| M8-12, N7-8 | 0/10 | |
| K5-6, L1-4 | 1/10 | |
| L5-6, M7-10 | 0/10 | |
| M11-12, N7-8, K2-4 | 0/10 | |
| K2, K5, L2, L5, M8, M11 | 0/10 | |
| K3, K6, L3, L6, M9, M12 | 0/9 | |
| K4, L1, L4, M7, M10, N7, N8 | 1/9 | |
| Kütüphane RNA'lar 20 ng | K6 | 0/10 |
| L1 * | 3/10 | |
| L3 | 0/10 | |
| L4 | 0/10 | |
| Kütüphane RNA, 20 ng | L1 (ldb1) onay | 50/179 |
| * Seçilen havuz gösterir |
Tablo 2. Sib Seçimi ve Expresalgılanması klonlanması (10 ve% foxe3 ifadesi açısından pozitif% 36 arasında değişen) her bir hayvan başlık tahlili yanıtın en üst düzeyde havuz bir klon aktivitesi daraltmak için aşağıdaki deneyde kullanılmak üzere seçildi. Sonuçlar. Asterisk, seçilen havuz gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yetkili ektoderm bir yanıt indükleme yeteneğine sahip genlerin fonksiyonel klonlanması için, burada açıklanan yöntem, gen ürünlerinin geniş tanımlamak için kullanılabilir. Bu yöntem ifade klonlama teknikleri ile doku uyaran deneyleri birleştirerek geçmiş iş üzerine genişletir. Bu RNA, enjeksiyonu takiben, doğrudan veya dolaylı olarak, faktör uyarıcı üretim kaynağı olarak, Xenopus oosit metabolik yolları kullanmaktadır. Bu ilgi, bir cDNA kütüphanesi veya klonları diğer toplama elde edilen transkriptlerin ekspresyonunu kullanarak 6,7 bir genin klonlanması için kurulan yöntemlerin kullanımı ile kombinasyon halinde embriyonik katılan yeni bir ilgi genleri tanımlamak için arayan için değerli bir yaklaşım sağlar indüksiyon. Yeni genlerin fonksiyonel kimlik bu yöntemin geniş bir uygulama verici yeni ters genetik yaklaşımlar için yararlı bir tamamlayıcısıdır, ve aynı zamanda yüksek thr kullanılarak belirlenen deney transkript fonksiyonel olarak kullanılabiliroughput (örneğin, RNA-SEQ gibi) yöntem 21.
Kontroller kap Deneyde kullanılan oositlerin metabolik fonksiyonu izlenmesi büyük önem taşımaktadır. Hem INHBB test edilmiştir mezoderm uyarıcının mRNA değişken konsantrasyonları, her parti oosit ve düşük miktardaki transkriptlerini algılamak için bu sistem kullanışlılığı kurmak için sağlığını sağlamak; Bu gen lens indüksiyon yolunun ilgisi yoktur ve iyi belgelenmiş bir bağımsız denetim 14'tür. 2 ile gözlemlendi, 12/101 antikoru ile hayvan kap ektoderm kasa özgü antijenlerin ekspresyonu ile analiz, aktivitesi kas indükleyici - daha varlığında, 200 pg INHBB mRNA aşırı aşaması 14 poli (A) 500 misli + RNA,. Sistem enjekte RNA miktarı çok geniş bir aralıkta, böylece yararlıdır ve oositler, kararlı bir şekilde protein üretir ve 50 nl ve daha yüksek hacim sitoplazmik enjeksiyonu takiben canlı kalması mümkün bulunmaktadır.
U için bir gözBu protokolde bir cDNA kütüphanesinin se tam uzunluktaki veya hemen hemen tam uzunlukta klonlar için bir gerekliliktir. Protokolü içerisinde kullanım öncesinde, kütüphane kütüphane bilinen transkript boyutunu belirlemek ve bu nedenle dominant-negatif etkiler potansiyel olarak kesildi enjekte transkript elde edilir olasılığını azaltmak için Northern analizi ile kontrol edilmelidir. Tam uzunlukta bir cDNA havuzu, önemli olduğu için, EST klonlarının kullanımı 22 ve optimum bir şekilde, (doğrulanmış tam uzunluktaki klonların tam bir kümesi içerir) Xenopus ORFeome 23, geleneksel bir cDNA kütüphanesinden tercih edilir safha ve doku sürece cDNA, belirli bir kaynak talep ve kütüphane yapımı için kullanılır. Diğer bir önemli husus β-globin ve poli (A) enjekte transkript mRNA stabilitesini artırmak amacıyla tasarlanmıştır kütüphane vektöründeki dizilerin varlığıdır. Bu enjekte sentetik mRNA'dan üretilen proteinin miktarını arttırmak için arzu edilir ise, aynı zamanda possibil yükseltirin vivo olarak daha kararlılığı ve aktivitesi yüksektir mRNA'dan dominant-negatif bir etki üretme olmadığını göstermektedir. Düşük kopya numarası mRNA büyük bir havuzun arka planda endojen meslektaşı ile aynı etkilere neden olmayabilir; Klonlama ve transkripsiyon işleminde stabilize edilir, bir kap deneyinde saptanmasına olanak tanınması için devam edebilir. Üçüncü konu havuzu boyutu; Havuz boyutu önemli azalma (10 klon veya daha az) embriyolar 24 son kazanç fonksiyon-tarama projelerinde avantajlı olduğu gösterilmiş ve net sonuçlar ve aday genlerin daha kolay tanımlanmasını sağlamak muhtemeldir edilmiştir. 10 3 den daha küçük bir havuz boyutu - klonların koleksiyonunun toplam karmaşıklığı az 10 4 ise ORFeome 23 ile olduğu gibi, bu protokolde tavsiye 10 4, ulaşılabilir; o prohibitively emek-yoğun olabilir ama biri, 900 10 havuzları ile başlayan ~ 9000 klonları taramak olabilirBir deneyde fazla 10 havuzları işlem.
Olarak belirlenen gen tarafından yapılan (sekans analizi ile) gen ürününün tipinin belirlenmesi işlevi testlerinin doğasını belirler. Nükleer transkripsiyon kofaktör Ekranımıza 8'de belirtilen bu yana, ldb1 getirilmesi ile tetiklenen endüktif işlemde çekirdeğin rolünü doğrulamak için gerekliydi. Enüklee oosit tam işleyen bir protein sentetik makine ve uygulanabilir ve enjekte transkript salgılanan faktörlerin üretme yeteneğine sahiptir. Ancak, çekirdeğinin olmaması transkripsiyon faktörleri, kofaktör veya diğer dolaylı etkili gen ürünlerinin işleyişini ortadan kaldıracaktır. Ekranda belirlenen genlerin sonraki analizler in situ melezleme yoluyla gelişimsel ifade deseninin belirlenmesi dahildir ve kazanç fonksiyon-ve-kaybı fonksiyonu testlerinde. Zigot içine RNA enjeksiyonla ya da sp enjeksiyon sınırlayarak aşırı ekspresyonuecific blastomerler in vivo transkript karşı morfolino oligonükleotid enjeksiyon yoluyla anlayış, hem de gen fonksiyonu demonte sağlayabilir embriyo belirli bölgelere etkileri kısıtlamak için.
Büyük ölçüde tarama süreci hızlandırmak ve in situ melezleme RNA ifade analizi için gereksinimini ortadan kaldırabilir (GFP gibi) bir raportör gen ile bir transgenik hattı kullanarak yanıt hayvan kap ektoderm bir endüktif etki Doğrudan görselleştirme. Benzer şekilde, tarama hızlı aracı olarak antikorların kullanımı, arzu edilir ise, uygun bir antikor vardır (yukarıda ele alınan kas yanıt 12/101 gibi). Albino embriyolar daha iyi renk reaksiyonu eşya görselleştirmek için, vahşi tip pigmentasyon bir ağartma ihtiyacını ortadan kaldırarak, in situ hibridizasyon sürecini kolaylaştırmak daha zor olmasına rağmen gastrula aşamalarında doğru sahne hayvan kapaklar için kullanılabilmektedirUCT.
Son olarak, çeşitli nedenlerle, denemelerin büyük sayısı, verilen bir genin belirlenmesi için yürütülen gerekebilir dikkate alınması önemlidir. İlk olarak, bir durumda sayısı belli bir denemede uygun süreç, daha embriyo büyük toplu olan ve kültüre bunları sıcaklıklarda bir dizi verilen bir süre içinde meydana gelir gelişimi (ve yetkinlik nihai kaybı) ile sınırlıdır olabilir iyi işleme ektoderm küçük parçalar oluşabilecek kaybı. Başka için, ektoderm bir seçilmiş marker ifade başarı oranları çok düşük olması ve istatistiksel olarak anlamlı bir etkisinin gözlemlemek için birçok vaka gerektirebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12/101 Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 12/101 | Monoclonal antibody for detection of muscle tissue |
| 20x SSC Buffer | Sigma | S6639 | for ISH |
| Acetic anhydride | Sigma | A6404 | for ISH |
| Anti-Dig-AP | Roche | 11093274910 | for ISH |
| Aurum Plasmid Mini Kit | Bio-Rad | 732-6400 | Plasmid DNA purification |
| Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | for ISH |
| BM Purple | Roche | 11442074001 | for ISH |
| Boekel Hybridization Oven | Fisher Scientific | 13-245-121 | for ISH |
| Bouin's Solution | Sigma | HT10132 | for ISH |
| BSA | Sigma | A9647 | for OCM |
| CHAPS | Sigma | C3023 | for ISH |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | Defolliculation of oocytes |
| Cysteine | Sigma | C121800 | Dejelly embryos |
| DEPC-H2O | Fisher Scientific | BP5611 | for ISH |
| Dig-RNA Labeling Mix | Roche | 11277073910 | for ISH probes |
| Dumont #5 forceps | World Precision Instruments | 500233 | for Vitelline envelope removal |
| Ethyl 3-aminobenzoate | Sigma | A5040 | MS222 anesthetic |
| Ficoll PM 400 | Sigma | F4375 | for Injection media |
| Formamide | Sigma | F9037 | for ISH |
| Gentamicin sulfate | Sigma | G1914 | for OCM |
| Glass capillaries | World Precision Instruments | 4878 | 3.5" long, I,D, 0.530 mm |
| Glass sample vials | Fisher Scientific | 06-408B | for ISH |
| Hair loop | Hair affixed in pasteur pipette for tissue manipulation | ||
| Heparin sodium salt | Sigma | H4784 | for ISH |
| Injector Nanoliter 2010 | World Precision Instruments | Nanoliter 2010 | Microprocessor-controlled microinjector |
| Instant Ocean | Carolina | 972433 | Aquarium Salt for frog recovery |
| IRBG XGC Xenopus verified full-length cam cDNA | Source Bioscience | 989_IRBG | cDNA library |
| LB Agar plates with 100 µg/ml Ampicillin | Teknova | L5004 | 150 mm pre-poured LB-Amp plates for sib selection |
| LB Luria Broth | Teknova | L8650 | LB for collecting colonies in sib selection from plates and dilution of cultures |
| Magnetic mRNA Isolation Kit | New England BioLabs | S1550S | for isolation of poly(A)-enriched RNA |
| Maleic Acid | Sigma | M0375 | for ISH |
| Manual Microfil Micromanipulator | World Precision Instruments | M3310R | Manual micromanipulator |
| Nutating Mixer | Fisher Scientific | 22-363-152 | Rocker for ISH |
| Permoplast | Nasco | SB33495M | Clay for injection and dissection dishes |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | P5368 | for ISH |
| PMSG | Sigma | G4877 | to stimulate oocyte development |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma | PVP40 | for ISH |
| Programmable Puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | Micropipette needle puller |
| Proteinase K | Sigma | P6556 | for ISH |
| pTnT Vector | Promega | L5610 | cDNA library construction |
| Riboprobe Combination System | Promega | P1450 | in vitro transcription |
| Superscript Full Length cDNA Library Construction Kit | Life Technologies | 18248013 | kit for cDNA library construction |
| Sutures, 3-0 silk | Fisher Scientific | 19-037-516 | Suture thread and needle for post-oocyte removal |
| Torula RNA | Sigma | R3629 | for ISH |
| Triethanolamine | Sigma | T1502 | for ISH |
| Tween 20 | Sigma | P9416 | for ISH |
| Universal RiboClone cDNA Synthesis System | Promega | C4360 | alternative kit for cDNA library construction |
| Xenopus Full ORF Entry Clones - ORFeome Collaboration | Source Bioscience | 5055_XenORFeome | ORFeome Clones |
| XL2-Blue Ultracompetent Cells | Agilent Technologies | 200150 | cells for transformation of cDNA library |
References
- Yergeau, D., Kelley, C., Zhu, H., Kuliyev, E., Mead, P. Forward Genetic Screens in Xenopus. Using Transposon-Mediated Insertional Mutagenesis. Methods in Molecular Biology. 917, 111-127 (2012).
- Grainger, R. Xenopus tropicalis. as a Model Organism for Genetics and Genomics: Past, Present and Future. Methods in Molecular Biology. 917, 3-15 (2012).
- Nakayama, T., Fish, M., Fisher, M., Oomen-Hajagos, J., Thomsen, G., Grainger, R. Simple and Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Targeted Mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51, 835-843 (2013).
- Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis. Biology Open. 1 (12), 1273-1276 (2012).
- Zhao, Y., Ishibashi, S., Amaya, E. Reverse Genetic Studies Using Antisense Morpholino Oligonucleotides. Methods in Molecular Biology. 917, 143-154 (2012).
- Smith, W., Harland, R. Injected Xwnt-8. RNA acts early in Xenopus. embryos to promote formation of a vegetal dorsalizing center. Cell. 67, 753-765 (1991).
- Smith, W., Harland, R. Expression cloning of noggin., a new dorsalizing factor localized in the Spemann organizer in Xenopus embryos. Cell. 70, 829-840 (1992).
- Plautz, C., Zirkle, B., Deshote, M., Grainger, R. Early stages of induction of anterior head ectodermal properties in Xenopus. embryos are mediated by transcriptional cofactor ldb1. Developmental Dynamics. 243 (12), 1606-1618 (2014).
- Servetnick, M., Grainger, R. Changes in neural and lens competence in Xenopus. ectoderm: evidence for an autonomous developmental timer. Development. 112, 177-188 (1991).
- Nieuwkoop, P., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , Garland Publishing, Inc. New York and London. (1994).
- Lemaire, P., Garrett, N., Gurdon, J. Expression cloning of Siamois., a Xenopus. homeobox gene expressed in dorsal-vegetal cells of blastulae and able to induce a complete secondary axis. Cell. 81, 85-94 (1995).
- Lustig, K., Kroll, K., Sun, E., Kirschner, M. Expression cloning of a Xenopus T.-related gene (Xombi.) involved in mesodermal patterning and blastopore lip formation. Development. 122, 4001-4012 (1996).
- Hsu, D., Economides, A., Wang, X., Eimon, P., Harland, R. The Xenopus. dorsalizing factor Gremlin identifies a novel family of secreted proteins that antagonize BMP activities. Molecular Cell. 1 (5), 673-683 (1998).
- Lustig, K., Kirschner, M. Use of an oocyte expression assay to reconstitute inductive signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 6234-6238 (1995).
- Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. JoVE Science Education Database. , (2015).
- Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. JoVE Science Education Database. , (2015).
- Viczian, A., Zuber, M. Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis. J. Vis. Exp. (39), e1932 (2010).
- Sive, H., Grainger, R., Harland, R. Early development of.Xenopus laevis.: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor. New York. (2000).
- Zygar, C., Cook, T., Grainger, R. Gene activation during early stages of lens induction in Xenopus. Development. 125, 3509-3519 (1998).
- Medina-Martinez, O., Jamrich, M. Foxe view of lens development and disease. Development. 134, 1455-1463 (2007).
- Amin, N., Tandon, P., Osborne, N. E., Conlon, F. RNA-seq in the tetraploid Xenopus.laevis. enables genome-wide insight in a classic developmental biology model organism. Methods. 66, 398-409 (2014).
- Gilchrist, M., Zorn, A., Voigt, J., Smith, J., Papalopulu, N., Amaya, E. Defining a large set of full-length clones from a Xenopus tropicalis EST project. Developmental Biology. 271, 498-516 (2004).
- Karpinka, J., et al. Xenbase, the Xenopus. model organism database; new virtualized system, data types and genomes. Nucleic Acids Research. 43, D756-D763 (2015).
- Zhang, S., Li, J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signaling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis. PLoS ONE. , e79469 (2013).
