Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

استخدام التدفق الخلوي لتقييم حالة لونين في خلايا T

Published: December 17, 2015 doi: 10.3791/53533
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biology, Furman University
* These authors contributed equally

Summary

التدفق الخلوي يمكن استخدامها لتقييم حالة لونين داخل الخلايا T. هذا البروتوكول يسمح العلماء لتفسير الأدلة من لونين decondensation خلال تنشيط الخلايا T يدل على زيادة في كثافة يعني الإزهار (MFI) من الفلورسنت الأجسام المضادة هيستون H3

Abstract

خلال الاستجابة المناعية المناسبة، وخلايا T هادئة تصبح تفعيلها عند تقديم المستضد إلى الخلايا التائية مستقبلات المستضد محددة لهم. وهذا يؤدي إلى انتشار نسيلي فقط تلك الخلايا T التي تحمل مستقبلات تعترف المستضد. decondensation لونين هو السمة المميزة لتنشيط الخلايا T ومطلوب للخلايا T لاكتساب القدرة على التكاثر بعد الاشتباك المستضد. ويمكن الكشف عن هذا التغيير في التكثيف لونين باستخدام الأجسام المضادة التي أثيرت ضد البروتينات هيستون. هذه الأجسام المضادة لا يمكن ربط الحواتم في خلايا T ساذجة، فضلا عن أنها يمكن في تنشيط خلايا تي. نحن تصف كيفية صمة عار في وقت واحد T علامات سطح خلية محددة، وتتبع جدوى مع وصمة عار الخلايا الميتة يمكن حلها، وقياس وضع لونين عن طريق تلطيخ الخلايا من البروتينات هيستون H3. ويتم تحليل الخلايا الملون بواسطة التدفق الخلوي ويتم قياس وضع التكثيف لونين كما شدة متوسط ​​مضان (MFI) من وصمة عار هيستون H3. Chromatفي decondensation خلال تنشيط الخلايا T ويتجلى كزيادة في مؤسسات التمويل الأصغر

Introduction

التدفق الخلوي هي التكنولوجيا القائم على الليزر المتقدمة لتحليل العوامل الفيزيائية والفلورسنت متعددة في السكان الخلية. هذه التقنية تعمل كخلايا علقت في تيار من السوائل لقاء ليزر، علامات الفلورسنت مثيرة على أو داخل الخلايا. هذه العلامات ثم ينبعث الضوء التي يتم الكشف عنها وكميا عن طريق أنابيب مضخم. في الوقت الذي جرت العادة على استخدامها التدفق الخلوي لتحديد السكان من الخلايا، وقد ثبت أن تكون التكنولوجيا مفيدة عند دراسة مجموعة من خصائص الخلايا بما في ذلك خلايا سلامة الغشاء، تفاعلات البروتين البروتين والاتجار البروتين 1-3. قمنا بتطوير بروتوكول تسمح هذه التكنولوجيا لاستخدامها للكشف عن حالة من لونين في الخلايا T كما يتم تنشيطها في المختبر 4. وقد استخدمنا أيضا هذا البروتوكول للتحقيق في آلية الناجم عن تفعيل لونين decondensation خلايا T 5.

T خلية activatioن وانتشار حاسمة للاستجابة المناعية المناسبة. خلايا T، مجموعة فرعية معينة من الخلايا الليمفاوية داخل الجهاز المناعي، وهناك حاجة لالاستجابات المناعية المناسبة وتطوير الذاكرة المناعية. يبدأ التنشيط عند تقديم المستضد في سياق معقد التوافق كبيرا على مستقبلات الخلايا T (TCR) الموجود على سطح الخلية لخلايا T هادئة (إعادة النظر في 6). هذا يتسبب في سلسلة من الأحداث الجزيئية الحيوية وأمر غاية داخل الخلايا T التي تبلغ ذروتها في زيادة CA2 بين الخلايا + تركيز 7 والنبات النووي من عوامل النسخ المطلوبة لتفعيل (إعادة النظر في 10/8). مرة واحدة تنشيط خلايا T اكتساب القدرة على الاستجابة لانترلوكين 2 (IL-2)، وهو عامل نمو قوي أن يستخدم JAK (يانوس كيناز) / STAT (اشارة محول والمنشط من النسخ) طريقا لدفع انتشار نسيلي المنشط T الخلايا 11. لفترة وجيزة، IL-2 التحفيزالنتائج في الفسفرة من البروتينات STAT، وهي عائلة من كامنة عوامل النسخ عصاري خلوي. مرة واحدة فسفرته والبروتينات STAT dimerize، نقل من إلى النواة ومحرك التعبير عن الجينات بما فيها تلك التي تشارك في تقدم دورة الخلية. في الخلايا T، IL-2 الإشارات عبر STAT5، وهو مطلوب لT خلية انتشار 12،13.

من أجل تحقيق التوسع نسيلي خلايا T تفعيلها، يجب أن تلك الخلايا التي لم تشهد مستضد TCR المشاركة (خلايا T ساذجة)، لديها آلية لتجاهل تأثيرات قوية من IL-2. ويتحقق ذلك عن طريق تنظيم وضع لونين. خلايا T ساذجة تمتلك ونين المكثف الذي يحظر إشراك-DNA STAT5 ردا على IL-2 التحفيز. عند التنشيط، يمكن decondenses لونين وSTAT5 الوصول إلى المروجين من الجينات المستهدفة، والسماح انتشار نسيلي 4. ومن المثير للاهتمام، وهذا التغيير في الوضع ونين لا يتوقف على تعديل جينية من هيستون من البروتيننانوثانية (للمراجعة، انظر 14) كما لاحظنا أي تغيير عالمي في تعديل هيستون خلال تنشيط الخلايا T 4.

أثناء أداء هذه الدراسات، اكتشفنا أن الأجسام المضادة التي أثيرت ضد البروتينات هيستون زيارتها أيضا صعوبة في الوصول الحواتم في خلايا ساذجة، ولكن هذا على تنشيط يمكن ربط أكثر بسهولة الحواتم بها 4. وهكذا، الأجسام المضادة ملزمة لالهستونات بمثابة قراءات للحصول على مركز لونين التكثيف. هنا نقدم طريقة لاستخدام التدفق الخلوي للكشف عن الأجسام المضادة مترافق fluorescently هيستون H3 من أجل تقييم الوضع لونين في خلايا T. يتم قياس التكثيف لونين في عدد السكان من الخلايا كما كثافة يعني الإزهار (MFI) من هيستون H3 تلطيخ. في سياق T تنشيط الخلايا، ومؤسسات التمويل الأصغر من هيستون H3 زيادات تلطيخ، مما يدل على decondensation من لونين. بالإضافة إلى قياس وضع لونين عن طريق الخلايا هيستون H3 تلطيخ، incorpora هذا البروتوكول أيضاقسم التدريب والامتحانات سطح تلطيخ وصمة عار يمكن حلها عن الخلايا الحية، والسماح تحليل مجموعات سكانية فرعية من الخلايا.

Protocol

وقد أجريت هذه الدراسة بما يتفق بدقة مع التوصيات الواردة في دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية من المعاهد الوطنية للصحة. وتمت الموافقة على بروتوكول الحيوان من قبل (رقم تصريح: A3242-01) لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدم جامعة فورمان. جميع المواد والمعدات المستخدمة في هذا البروتوكول يمكن العثور عليها في جدول المواد والمعدات، في حين المخازن المستخدمة ويمكن العثور عليها في جدول المخازن المؤقتة والحلول.

1. واحد تعليق خلية من الخلايا الليمفاوية من الطحال ماوس

  1. التضحية الفئران عبر CO 2 الاختناق. تأكيد القتل الرحيم خلع عنق الرحم.
    ملاحظة: استخدم الطحال من اثنين من الفئران 6-8 اسبوع إسوي (على سبيل المثال، C57B / 6) من نفس الجنس. وعادة ما تتم معالجة اثنين من الطحال.
  2. رش الحيوانات بغزارة مع 70٪ محلول الإيثانول وتوجيه مثل أن رئيس تواجه اليسار.
  3. باستخدام ملقط، رفع جلد الحيوان صعودا وبعيدا عن ركان الجسم. باستخدام مقص، وقطع صغيرة من الدرجة الأولى من خلال الجلد بالقرب من بطن الحيوان. استخدام الأصابع، وسحب كل جانب من الشق لفضح الصفاق من الرقبة إلى بداية رجليه الخلفيتين. يجب أن يكون الطحال مرئية مباشرة تحت الصفاق.
  4. باستخدام ملقط، ورفع الصفاق وجعل شق صغير لفضح الطحال. إزالة الطحال مع ملقط ومقص لاستخدام ندف بعيدا أي الدهنية والنسيج الضام.
  5. وضع الطحال إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل تحتوي على 10 مل PBS تستكمل مع 2٪ مصل بقري جنيني (يشار إليها فيما PBS + 2٪). الحفاظ على أنبوب على الجليد حتى جاهزة للبدء في تعليق خلية واحدة.
    ملاحظة: الانتعاش نموذجي هو بين 60-90٬000٬000 الخلايا في الطحال، وعادة، هناك حاجة إلى 2000000 خلايا لكل عينة. تنفيذ كافة الخطوات التالية في نسيج الثقافة هود.
  6. صب الطحال إلى معقمة 100 ملم صحن زراعة الأنسجة.
  7. الحصول على شريحتين المجهر بلوري وعقد رانه الشرائح بحيث تواجه اثنين من السطوح بلوري الخام إلى الداخل تجاه بعضهم البعض. الرطب الشرائح في حل PBS + 2٪ تصب في طبق بتري.
  8. عقد الطحال بين السطوح بلوري الشرائح، مع حواف تزال مغمورة، وطحن الطحال برفق عن طريق تحريك الشرائح ذهابا وإيابا ضد بعضها البعض (الشكل 1A). الخلايا ستسقط في طبق بتري. يستمر طحن حتى تم إطلاق سراح جميع الخلايا وتظهر بقايا الطحال الأبيض (الشكل 1B).
  9. وضع تعليق خلية في الماصة وتصفية ببطء من خلال مرشح 70 ميكرون في العقيمة 50 مل أنبوب مخروطي الشكل الجديد. لاحظ أن قطعة صغيرة من اللب الأحمر سوف تكون موجودة على مرشح (الشكل 2A).
    1. إذا كان مرشح ترتفع، ورفع بلطف عنه قليلا لتسمح للسائل لاستنزاف من خلال ووضع مرشح مرة أخرى إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل والاستمرار، وتكرار هذه العملية حسب الضرورة. إذا تجهيز أكثر من 5 spleENS، قد يكون من الضروري أن تقسم إلى مجموعتين واستخدام فلتر جديد لكل منها.
  10. باستخدام جزء سدادة من حقنة 3 مل اضغط بلطف اللب الأحمر الذي يحتوي على الخلايا المتبقية من خلال مصفاة (الشكل 2B). تأكد من أن تضغط على حد سواء القاع والجوانب مرشح لضمان أن جميع اللب الأحمر قد مرت من خلال فلتر (الشكل 2C).
  11. إضافة 10 mlof PBS + 2٪ إلى صحن زراعة الأنسجة واستخدام هذا لغسل الشرائح، حقنة سدادة، وطبق لاسترداد أي الخلايا المتبقية. تمرير هذا من خلال نفس 70 ميكرومتر مصفاة الخلية في أنبوب مل المخروطية 50. كرر هذه الخطوة حسب الضرورة.
  12. الطرد المركزي تعليق خلية التي تمت تصفيتها في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  13. صب بلطف وتجاهل طاف، والحرص على عدم تعكير صفو بيليه. وسيتم ترك كمية ضئيلة من PBS + 2٪ في الأنبوب. غطاء الأنبوب ونفض الغبار بيليه حتى يتم معلق بيليه تماما.
  14. ليز خلايا الدم الحمراء التي كتبها adقرع 2 مل من ACK الاحتياطي تحلل (0.15 M NH 4 الكلورين، 1 ملم KHCO 3، 0.1 ملي EDTA، ودرجة الحموضة إلى 7.2، وتخزين عند 4 درجات مئوية) في الطحال إلى أنبوب مخروطي الشكل وتدوير وعكس أنبوب للتأكد من أن جميع الخلايا تتلامس مع العازلة ACK. دوامة بلطف الأنبوب لمدة 1 دقيقة في RT.
  15. تبرزي حجم لتعليق الخلية إلى 50 مل بإضافة PBS + 2٪ الأنبوب إلى تحييد العازلة ACK. عكس الأنبوب 10 مرات وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 x ج في 4 درجات مئوية. بعد اكتمال الطرد المركزي، ينبغي أن يكون بيليه الأبيض (الشكل 3).
  16. صب بلطف وتجاهل طاف، والحرص على عدم تعكير صفو بيليه. ترك كمية ضئيلة من PBS + 2٪ في الأنبوب، غطاء الأنبوب، ونفض الغبار بيليه ل resuspend ذلك.
  17. إضافة 10 مل من وسائل الاعلام الخلايا التائية [10٪ FBS، 10 ملي HEPES (7.0 درجة الحموضة)، 2 مم GlutaMAX، 1 ملي البيروفات الصوديوم، 1X الأحماض الأمينية غير الأساسية، 1X البنسلين / الستربتومايسين و 50 ملم β المركابتويثانول]، والمزيد resuspend الكرية التي كتبها بلطفpipetting صعودا وهبوطا. ثم تصفية من خلال تعليق جديد مرشح 70 ميكرون إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل الجديد.
  18. استخدام 5-10 مل أخرى من وسائل الاعلام الخلايا التائية لشطف أنبوب الأصلي وتمرير هذا من خلال تصفية 70 ميكرون في الأنبوب الذي يحتوي على بقية الخلايا التي تمت تصفيتها. إذا تجهيز أكثر من عقدين من الطحال، وحجم وسائل الاعلام الخلايا T ويمكن زيادة لتحقيق أقصى قدر من الانتعاش.
  19. تبقي الخلايا على الجليد حتى جاهزة للالملون. ينبغي أن يحسب الخلايا وقدرتها على البقاء الوصول إليها.
    1. لحساب الخلايا، والجمع بين 3 مل من الخلايا مع 24 مل من برنامج تلفزيوني + 2٪ و 3 مل من 0.4٪ التريبان الأزرق. تحميل 10 مل من هذا في كل غرفة من تحسين عدادة الكريات نويباور. الجدوى، وفقا لتقييم الاستبعاد التريبان الأزرق، هو عادة بين 85-95٪.

2. الجدوى وتلطيخ السطح

  1. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 300 x ج في 4 درجات مئوية. الخلايا resuspend في وسائل الإعلام خلية T إلى تركيز 1 × 10 7 خلية / مل. Transfإيه 2000000 الخلايا (100 مل) في بئر من القاع U-96-جيدا لوحة زراعة الأنسجة.
  2. أجهزة الطرد المركزي لوحة 96-جيدا لمدة 10 دقيقة في 300 x ج في 4 درجات مئوية.
  3. إزالة طاف من كل بئر من قبل عبها السائل داخل لوحة جيدا في بالوعة (ستبقى بيليه خلية في البئر) واللمس لوحة على منشفة ورقية نظيفة. غسل الخلايا عن طريق إعادة التعليق عليها في 200 ميكرولتر PBS تليها الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. تنفيذ كافة يغسل بهذه الطريقة ما لم يذكر خلاف ذلك.
    ملاحظة: لا تستخدم برنامج تلفزيوني + 2٪ لأنها سوف تتداخل مع PI صمة عار يمكن حلها.
  4. إزالة طاف بواسطة عبها لوحة وإضافة 100 مل من وصمة عار التجارية الطازجة (على سبيل المثال، يمكن حلها الحمراء وصمة عار الخلايا الميتة) إلى كل بئر.
    1. جعل صمة عار تمييع رد الفعل 01:10 محلول المخزون صبغ في DMSO تليها تخفيف 01:10 في برنامج تلفزيوني. احتضان لوحة عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة محمية من الضوء.
  5. أجهزة الطرد المركزي عفي وقت متأخر لمدة 10 دقيقة في 300 x ج في 4 درجات مئوية. في هذه النقطة إلى الأمام، أداء كل الأعمال مع لوحة مع غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة ضوء قبالة.
  6. إزالة طاف بواسطة عبها لوحة ثم قم بإضافة 100 مل من التيسير حل كتلة. جعل التيسير حل كتلة طريق تمييع التيسير حل الأسهم كتلة 1: 100 في برنامج تلفزيوني.
  7. تمييع الأجسام المضادة لاستخدامها في تلطيخ السطح (على سبيل المثال، ومكافحة CD4 أو CD8 المضادة لل) في برنامج تلفزيوني وإضافة 100 مل إلى كل بئر. احتضان لوحة 96-جيدا لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية محمية من الضوء.
    ملاحظة: يجب titered الأجسام المضادة وصمة عار السطحية لتحقيق الأداء الأمثل. وعادة ما تستخدم 1: 200 أو 1: 400 التخفيف، في بروتوكول الشركة المصنعة.

3. بين الخلايا تلطيخ لهيستون H3

  1. وبعد حضانة وصمة عار السطح، وغسل الخلايا مرتين في برنامج تلفزيوني.
  2. بعد غسل الماضي، إضافة 100 ميكرولتر من 4٪ لامتصاص العرق إلى كل بئر. احتضان لوحة 96-جيدا لمدة 5 دقائق على RT. جعل 4٪ لامتصاص العرق من قبل مخففجي 16٪ امتصاص العرق في برنامج تلفزيوني. جعل هذا الطازجة.
  3. غسل الخلايا مرتين في برنامج تلفزيوني.
  4. جعل بيرم / كتلة الحل (حل سهم بيرم هو برنامج تلفزيوني + 2٪ + 0.02٪ تريتون X-100، وتخزين عند 4 درجات مئوية) من خلال الجمع بين 2 مل من مصل الأرنب العادي لكل 100 مل الأسهم حل بيرم. تقديم ما يكفي لمدة 60 مل / عينة.
  5. إضافة 40 مل بيرم / بلوك لكل عينة بشكل جيد ومزيج جيد من قبل pipetting بلطف صعودا وهبوطا، مع الحرص على عدم جعل فقاعات. احتضان لوحة في RT لمدة 45 دقيقة في الظلام. حفظ المتبقية بيرم / بلوك للخطوة 3.6.
  6. تمييع fluorescently مترافق هيستون H3K4me1 الأجسام المضادة في حل بيرم / كتلة محفوظة في الخطوة 3.5 وإضافة 10 ميكرولتر من هذا التخفيف إلى كل بئر. مزيج من قبل pipetting بلطف صعودا وهبوطا. احتضان لوحة 96-جيدا في الظلام لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: استخدام الأجسام المضادة H3K4me1 مترافق استخدام عدة الاقتران R-فيكوإيريترين باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
  7. غسل الخلايا مرتين في برنامج تلفزيوني + 2٪.
  8. resuspend الخلايا في 200ميكرولتر PBS + 2٪ ونقل العينات إلى أنابيب FACS لتحليل التدفق الخلوي. ويمكن تخزين العينات في 4 درجات مئوية في الظلام. لأفضل النتائج تحليل العينات في غضون يومين. منفردة عينات الملون يمكن أن تستخدم التدفق الخلوي ضوابط التعويض.

Representative Results

تم تجهيز الخلايا الليمفاوية من C57B / 6 الماوس إلى تعليق خلية واحدة وفقا للبروتوكول وعدها باستخدام عدادة الكريات القياسية. وكانت المصنفة الخلايا في ثلاث نسخ في 2 × 10 6 / مل في وسائل الإعلام T-خلية في 15 مل أنابيب مخروطية وترك دون علاج، أو حفز مع 1 ملغ / مل القابلة للذوبان الأجسام المضادة لمكافحة CD3 (استنساخ 4C11) لمدة 3 ساعة على 37 درجة مئوية في معيار حاضنة زراعة الأنسجة. كانت ملطخة الخلايا الميتة والخلايا ثم تم بعد ذلك السطح الملون باستخدام FITC-CD8 وAPC-CD4 الأجسام المضادة وفقا للبروتوكول. تم تحليل هيستون الوصول عن طريق التدفق الخلوي (الشكل 4). في خلايا CD4 + CD8 + T وساذجة على حد سواء، وشدة الفلورسنت متوسط ​​(MFI) منخفضة، مما يدل على حالة لونين المختصرة. كما يتم تنشيط الخلايا مع مكافحة CD3 الأجسام المضادة الزيادات MFI معنويا (P <0.001، طالب اختبار t) تشير إلى أن لونين وdecondensed.

الشكل 1

الضغط الشكل 1. تقنية لمعالجة الطحال إلى تعليق خلية واحدة باستخدام شرائح المجهر بلوري. (A) والطحال ضد السطوح بلوري من شريحتين المجهر. (B) يتم نقل الشرائح ذهابا وإيابا ضد كل الخلايا الليمفاوية الإفراج أخرى إلى 100 ​​مم طبق بتري حتى ما تبقى من الطحال بيضاء. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2

الشكل 2. باستخدام سدادة حقنة للضغط المتبقية اللب الأحمر خلال 70 مم مصفاة الخلية. (A) اللب الأحمر المتبقية بعد الطحال ط ق معالجتها في تعليق خلية واحدة ومرت عبر 70 ملم مصفاة الخلية. يستخدم (B) الجزء سدادة من حقنة 3 مل بلطف اضغط المتبقية اللب الأحمر من خلال مصفاة الخلية. (C) بعد استخدام الحقنة، ينبغي أن يكون هناك عمليا أي اللب الأحمر تترك في مصفاة الخلية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)

الشكل 3. ACK تحلل خلايا الدم الحمراء. (A) الطرد المركزي من تعليق خلية واحدة ولدت من الطحال ماوس واحدة قبل ACK تحلل. (B) بعد ACK تحلل خلايا الدم الحمراء، يجب أن يكون بيليه الخلايا البيضاء.الحصول = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4

الشكل 4. ممثل النتائج البروتوكول. مخطط (A) المحاصرة تستخدم لتحليل الوضع لونين في CD4 + T الليمفاوية. (B و C) وترك الخلايا T غير المعالجة أو تفعيلها مع 1 ملغ / مل القابلة للذوبان أجسام مضادة للCD3 لمدة 3 ساعة (في ثلاث نسخ). والخلايا ثم تحليلها من قبل التدفق الخلوي لتحديد التكثيف لونين في CD4 + الخلايا (B) وCD8 + خلايا (C). البيانات هي الوسيلة ± الانحراف المعياري للمتوسط ​​كثافة مضان من H3K4me1 تلطيخ. * P <0.001 (اختبار تي الطالب) يرجى النقر حيحرث لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1

الجدول 1: دليل استكشاف الأخطاء وإصلاحها إشارة سريعة إلى القضايا المشتركة والحلول الممكنة.

Discussion

وضعنا البروتوكول الذي يسمح لتقييم التكثيف لونين في خلايا T. لأنه يعتمد على الملاحظة البسيطة أن الأجسام المضادة هيستون H3 لا يمكن الوصول لها بسهولة الحواتم في خلايا ساذجة، ولكن على تنشيط الخلايا T، هذه الأجسام المضادة نفسها قادرة على ربط الحواتم الخاصة بهم. بمقارنة مؤسسات التمويل الأصغر من هيستون H3 تلطيخ بين مجموعات العلاج، يمكن تحديد درجة نسبية من التكثيف أو decondensation. وقد استخدمنا هذا البروتوكول لتحديد حالة التكثيف النسبي خلال تطوير خلية توتية وخلال تنشيط الخلايا T 4. وقد استخدمنا أيضا هذا البروتوكول للتحقيق في الآليات التي تتحكم في عملية decondensation 5.

يعتمد هذا البروتوكول على استخدام الأجسام المضادة هيستون H3 للكشف عن وضع التكثيف لونين. لأنه ليس هناك أي تغيير عالمي في تعديل هيستون خلال T تنشيط الخلايا 4، ونحن قادرون على استخدام الأجسام المضادة H3K4me1 لتقييم لونينالوضع في هذا البروتوكول. وقد استخدمنا الأجسام المضادة التي أثيرت ضد معدلة هيستون H3؛ ومع ذلك، كانت إشارة المنتجة أضعف بكثير عموما. في تجربتنا، والأجسام المضادة التي أثيرت ضد تعديل هيستون H3 تعمل بشكل أفضل في المناعي والتدفق الخلوي المقايسات، في حين أن الأجسام المضادة ضد معدلة هيستون H3 تعمل بشكل أفضل في لطخة غربية. وتجدر الإشارة إلى أنه من الممكن أيضا استخدام الأجسام المضادة التي أثيرت ضد البروتينات هيستون أخرى، على الرغم من أننا لم يحاولوا ذلك.

بيرم / كتلة وهيستون H3 الخطوات الأجسام المضادة هي الخطوات الأكثر أهمية في البروتوكول. كمية من محلول بيرم / كتلة تستخدم يحتاج إلى أن يكون الأمثل في كل مرة يتم حل الأسهم بيرم. ويمكن أن يتم ذلك من خلال مقارنة أداء التخفيفات مختلفة من محلول المخزون. وتنطوي تجربة نموذجية مقارنة وضع لونين في خلايا T ساذجة لتلك تفعيلها لمدة 3 ساعة (الشكل 4). ينبغي للمرء أن يختار لتخفيف التي تنتج أكبر تغيير في مؤسسات التمويل الأصغر علىحللت الفترة الزمنية. يمكن تخفيفه الحل الأسهم في برنامج تلفزيوني + 2٪ لخفض بيرم / كتلة القوة عن طريق إعادة التعليق لأول مرة في خلايا بقدر 100 مل PBS + 2٪ بعد الخطوة 3.4 ثم إضافة بيرم / كتلة في الخطوة 3.5. وينبغي أن تستخدم تجربة رائدة مماثلة لاختبار التخفيفات مختلفة من fluorescently مترافق هيستون H3 الأجسام المضادة في كل مرة يتم المسمى دفعة جديدة من الأجسام المضادة. هذه الخطوات هي الحاسمة وخاصة لكشف الناجح الخلافات التكثيف في تنشيط الخلايا T في وقت مبكر (على سبيل المثال، في غضون 3 ساعات من التنشيط). في بعض الأحيان، وهناك الخلايا التي لا تحصل على permeabilized وبالتالي لن صمة عار مع الأجسام المضادة هيستون H3. قد يحدث هذا إذا لم يتم معلق الخلايا جيدا عند إضافة بيرم / كتلة أو إذا كان بيرم / كتلة ليست قوية بما فيه الكفاية. سوف تظهر هذه الخلايا عن الأحداث تضغط على محور عندما تصور رسم بياني لهيستون H3 تلطيخ. منذ هذه الأحداث سوف تحرف المؤسسة العامة، هذه الأحداث يمكن حذفها من التحليل من قبل gatinز توزيع الطبيعي للخلايا إيجابية هيستون H3. ويمكن الاطلاع على مساعدة إضافية في دليل استكشاف الأخطاء وإصلاحها (الجدول 1).

إدراج وصمة عار الخلايا الميتة يمكن حلها يسمح لتقييم جدوى خلية في الفحص. هذا هو في غاية الأهمية عند التعامل مع تنشيط الخلايا T لأن بعض المحفزات يمكن أن تحفز موت الخلايا. في مثل هذه الحالة، يمكن أن الأجسام المضادة هيستون H3 ربط الهستونات في الخلايا الميتة مختلفة من الخلايا الحية، مما يؤدي إلى سوء تفسير النتائج.

تم تصميم هذا البروتوكول للاستخدام في 96-جيدا شكل لوحة، والسماح للتحليل إنتاجية عالية من وضع لونين. وهناك الطحال من الماوس الإناث 6-8 اسبوع تسفر عادة بين 60 حتي 90000000 الخلايا باستخدام البروتوكول. منذ بروتوكول تلطيخ يتطلب 2 مليون خلية لكل عينة، يمكن للمرء بسهولة مقايسة مجموعات العلاج المتعددة ونقطة زمنية في ثلاث نسخ مع الطحال واحد على واحد لوحة 96-جيدا. فمن الممكن لصerform بروتوكول مع أقل خلايا لكل عينة. ومع ذلك، ويرجع ذلك إلى عدد من الخطوات الطرد المركزي وفقدان الكامنة في خلايا في كل خطوة من هذه الخطوات، فمن غير المستحسن لخفض عدد الخلايا بكثير. أكملنا بنجاح بروتوكول ب 1 مليون خلية لكل عينة.

استخدمنا هذا البروتوكول لدراسة وضع لونين في CD4 + T الخلايا المساعدة والخلايا CD8 + T السامة للخلايا. وقد أصبح هذا ممكنا لأن البروتوكول يتضمن تلطيخ السطح القياسية. يمكن بسهولة أن تتكيف بروتوكول لفحص لونين فى فئة اللمفاويات الأخرى باستخدام أجسام مضادة ضد علامات سطح السكان محددة. ويمكن أيضا أن تتكيف بسهولة هذا البروتوكول لأنواع الخلايا الأخرى طالما الأجسام المضادة الاعتراف علامات سطح ذات الصلة هي معروفة شروط تثبيت / permeabilization المتاحة والمناسبة.

Disclosures

تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

Acknowledgments

وقد أيد هذا المشروع من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (5 P20 RR016461 و 8 P20 GM103499)، المؤسسة الوطنية للعلوم (EPS-0903795). مزيد من الدعم المقدم من البحوث والفنية النمو جامعة فورمان والجوائز ميزة فرمان.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm tissue culture dish BD Biosciences 353003
Precleaned frosted microscope slides Fisher Scientific 12-550-343
Sterile cell strainer, 70 mm nylon mesh Fisher Scientific 22363548
3 ml syringe, Luer-Lok tip BD 309585
Falcon 50 ml polypropylene conical tube Corning 352098
LIVE/DEAD fixable red dead cell stain kit Life Technologies L23102 Life Technologies sells versions of this kit with different colors
Fc Block BD Biosciences 553142
16% paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-100
Normal rabbit serum Sigma-Aldrich R9133
Anti-H3K4me1 antibody Abcam ab8895
R-Phycoerythrin conjugation kit Abcam ab102919 Alternatively, the LYNX rapid RPE kit from AbD Serotec can be used

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bravo-Ferrada, B. M., et al. Study of surface damage on cell envelope assesed by afm and flow cytometry of lactobacillus plantarum exposed to ethanol and dehydration. J Appl Microbiol. , (2015).
  2. Agola, J. O., et al. Quantitative Bead-Based Flow Cytometry for Assaying Rab7 GTPase Interaction with the Rab-Interacting Lysosomal Protein (RILP) Effector Protein. Methods Mol Biol. 1298, 331-354 (2015).
  3. Toh, W. H., et al. Application of flow cytometry to analyze intracellular location and trafficking of cargo in cell populations. Methods Mol Biol. 1270, 227-238 (2015).
  4. Rawlings, J. S., Gatzka, M., Thomas, P. G., Ihle, J. N. Chromatin condensation via the condensin II complex is required for peripheral T-cell quiescence. EMBO J. 30, 263-276 (2011).
  5. Lee, M. D., Bingham, K. N., Mitchell, T. Y., Meredith, J. L., Rawlings, J. S. Calcium mobilization is both required and sufficient for initiating chromatin decondensation during activation of peripheral T-cells. Mol Immunol. 63, 540-549 (2015).
  6. Paul, W. E. Fundamental immunology. , 7th edn, Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins. (2013).
  7. Feske, S. Calcium signalling in lymphocyte activation and disease. Nat Rev Immunol. 7, 690-702 (2007).
  8. Isakov, N., Altman, A. Protein kinase C(theta) in T cell activation. Annu Rev Immunol. 20, 761-794 (2002).
  9. Macian, F. NFAT proteins: key regulators of T-cell development and function. Nat Rev Immunol. 5, 472-484 (2005).
  10. Hogan, P. G., Chen, L., Nardone, J., Rao, A. Transcriptional regulation by calcium, calcineurin and NFAT. Genes Dev. 17, 2205-2232 (2003).
  11. Rawlings, J. S., Rosler, K. M., Harrison, D. A. The JAK/STAT signaling pathway. J Cell Sci. 117, 1281-1283 (2004).
  12. Ihle, J. N. STATs: signal transducers and activators of transcription. Cell. 84, 331-334 (1996).
  13. Moriggl, R., et al. Stat5 is required for IL-2-induced cell cycle progression of peripheral T cells. Immunity. 10, 249-259 (1999).
  14. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).

Tags

علم المناعة، العدد 106، T-اللمفاويات، لونين، التدفق الخلوي، التدفق الخلوي، علم المناعة، T الخلية، لونين، decondensation، وتفعيل
استخدام التدفق الخلوي لتقييم حالة لونين في خلايا T
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bingham, K. N., Lee, M. D.,… More

Bingham, K. N., Lee, M. D., Rawlings, J. S. The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells. J. Vis. Exp. (106), e53533, doi:10.3791/53533 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter