Brug af flowcytometri at vurdere tilstanden af ​​kromatin i T-celler

Summary

Flowcytometri kan udnyttes til at vurdere tilstanden af ​​kromatin i T-celler. Denne protokol giver forskerne at fortolke bevis for chromatin dekondensering under T-celleaktivering påvises ved en stigning i den gennemsnitlige fluorescens intensitet (MFI) af fluorescerende histon H3 antistoffer

Abstract

Under et svar korrekt immunrespons, bliver hvilende T-celler aktiveres ved antigenpræsentation til deres antigen-specifik T-cellereceptor. Dette fører til klonal proliferation af kun de T-celler, som bærer en receptor, der genkender antigenet. Chromatin dekondensering er kendetegnende for T-celleaktivering og er nødvendig for T-celler at erhverve evnen til at proliferere efter antigen engagement. Denne ændring i chromatinkondensering kan detekteres under anvendelse af antistoffer rejst mod histonproteiner. Disse antistoffer kan ikke binde til deres epitoper i naive T-celler såvel som de kan i aktiverede T-celler. Vi beskriver, hvordan man samtidig plette T-celle-specifikke overflademarkører, levedygtighed spor med en fixable døde celle pletten, og måle kromatin status via intracellulær farvning af histon H3 proteiner. Farvede celler analyseres ved flowcytometri og chromatinkondensering status måles som den gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI) af histon H3 pletten. Chromati dekondensering under T-celleaktivering er påvist som en stigning i MFI

Introduction

Flowcytometri er en laserbaseret teknologi udviklet til analyse af flere fysiske og fluorescerende parametre i cellepopulationer. Denne teknologi fungerer som suspenderede celler i en strøm af fluid støder en laser, spændende fluorescerende markører på eller inden i cellerne. Disse markører derefter udsender lys, der detekteres og kvantificeres ved fotomultiplikatorrør. Mens flowcytometri traditionelt har været anvendt til at identificere populationer af celler, har det vist sig at være en nyttig teknologi, når man studerer en bred vifte af celleegenskaber, herunder cellemembranens integritet, protein-protein interaktioner og protein handel ^1-3. Vi har udviklet en protokol, der tillader denne teknologi, der skal anvendes til at detektere tilstanden af kromatin i T-celler, når de aktiveres in vitro ^4. Vi har også brugt denne protokol til at undersøge mekanismen for aktivering-induceret chromatin dekondensering af T-celler ^5.

T-celle activation og proliferation er afgørende for et svar korrekt immunrespons. T-celler, en specifik undergruppe af lymfocytter i immunsystemet, der er nødvendige for korrekt immunrespons og udvikling af immunologisk hukommelse. Aktivering initieres, når et antigen præsenteres i forbindelse med den større kompatibilitet komplekset til T-cellereceptoren (TCR) placeret på den ekstracellulære overflade af hvilende T-celler (gennemgået i ^6). Dette udløser en række dynamiske og stærkt ordnede molekylære begivenheder i T-celler, som kulminerer i en stigning i intracellulær Ca2 + -koncentration ^{7 og} nuklear translokation af transkriptionsfaktorer, der er nødvendige for aktivering (revideret i ^8-10). Når den er aktiveret, får T-celler evnen til at reagere på Interleukin-2 (IL-2), en potent vækstfaktor, som udnytter JAK (Janus kinase) / STAT (signaltransducer og aktivator af transkription) pathway at drive klonal proliferation af aktiverede T celler ^11. Kort fortalt, IL-2-stimuleringresulterer i phosphorylering af STAT-proteiner, en familie af cytosoliske latente transkriptionsfaktorer. Når phosphoryleret, STAT proteiner dimeriserer, translokere til kernen og drev ekspression af gener, herunder de involverede i cellecyklusprogression. I T-celler, IL-2 signaler via STAT5, som er nødvendig for T-celleproliferation ^12,13.

For at opnå klonal ekspansion af aktiverede T-celler, skal de celler, der ikke har oplevet antigen-TCR engagement (naive T-celler), har en mekanisme til at ignorere de potente virkninger af IL-2. Dette opnås via reguleringen af ​​kromatin status. Naive T-celler har en kondenseret kromatin, som forbyder STAT5-DNA engagement som respons på IL-2-stimulering. Ved aktivering kan kromatin decondenses og STAT5 adgang til initiativtagerne til målgener, tillader klonal proliferation ^4. Interessant denne ændring i kromatin status er ikke afhængig af epigenetisk modifikation af histon Proteins (til gennemgang, se ^14), da vi observeret nogen globale ændringer i histon modifikation under T-celle aktivering ^4.

Under udførelsen af disse undersøgelser, opdagede vi, at antistoffer rejst mod histonproteiner havde også svært ved at få adgang til deres epitoper i naive celler, men ved aktivering kunne lettere binde deres epitoper ^4. Således antistofbinding til histoner fungerer som en udlæsning for chromatinkondensation status. Her præsenterer vi den metode at anvende flowcytometri til at detektere fluorescens konjugeret histon H3 antistoffer med henblik på at vurdere kromatin status i T-celler. Chromatinkondensering i en population af celler måles som den gennemsnitlige fluorescens intensitet (MFI) på histon H3-farvning. I forbindelse med T-celleaktivering, MFI histon H3 farvning stiger, symboliserer dekondensering af kromatin. Ud over at måle kromatin status via intracellulær Histone H3 farvning, denne protokol også incorporates overflade farvning og en fixable plet for levende celler, tillader analyse af subpopulationer af celler.

Protocol

Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr i National Institutes of Health. Dyret Protokollen blev godkendt af Furman University Institutional Animal Care og brug Udvalg (Permit nummer: A3242-01). Alle materialer og udstyr, der anvendes i denne protokol, kan findes i tabellen af ​​materialer og udstyr, mens anvendte buffere kan findes i tabellen af ​​buffere og løsninger.

1. Single Cell Suspension af lymfocytter fra Mouse Milte

1. Sacrifice mus via CO ₂ kvælning. Bekræft eutanasi ved cervikal dislokation.
   Bemærk: Brug milt fra to 6-8 uger gamle isogen mus (f.eks C57B / 6) af samme køn. Typisk er to milte behandles.
2. Spray dyrene voldsomt med 70% ethanolopløsning og orient, således at hovedet er mod venstre.
3. Ved hjælp af pincet, løfte huden på dyret opad og væk fra tHan organ. Med en saks, klippe en lille hak gennem huden i nærheden af ​​maven af ​​dyret. Brug af fingrene, træk hver side af indskæringen for at blotlægge peritoneum fra halsen til begyndelsen af ​​bagbenene. Milten skal være synlig direkte under bughinden.
4. Ved hjælp af pincet, løfte peritoneum og lave et lille snit for at blotlægge milten. Fjern milten med pincet og bruge en saks til at drille væk enhver fedt og bindevæv.
5. Placer milten i en 50 ml konisk rør indeholdende 10 ml PBS suppleret med 2% kalvefosterserum (i det følgende benævnt PBS + 2%). Hold røret på is indtil klar til at begynde den enkelt celle suspension.
   Bemærk: Typisk opsving er mellem 60-90 millioner celler pr milt og typisk er der behov for 2 millioner celler pr prøve. Udfør alle de følgende trin i en vævskultur hætte.
6. Dekanteres miltene i en steril 100 mm vævskulturskål.
7. Opnå to frostede objektglas og hold than glider således at de to ru overflader matteret vende indad mod hinanden. Fugt dias i PBS + 2% opløsning hældt i petriskålen.
8. Hold milten mellem frosted overflader af objektglas, med kanterne stadig neddykkede, og male milten forsigtigt ved at bevæge slæderne frem og tilbage mod hinanden (figur 1A). Cellerne vil falde ned i petriskålen. Fortsæt med slibning, indtil alle celler er blevet frigivet, og resterne af milten forekommer hvide (figur 1B).
9. Udarbejde cellesuspensionen i en pipette og filtreres langsomt gennem en 70 um filter over i en ny steril 50 ml konisk rør. Bemærk, at små stykker af rød pulp vil være til stede på filteret (figur 2A).
   1. Hvis filteret stiger op, forsigtigt løfte det en smule op for at tillade fluid at dræne igennem og placere filteret tilbage i 50 ml konisk rør og fortsætte, at gentage denne proces som nødvendigt. Hvis forarbejdning mere end 5 spleENS, kan det være nødvendigt at opdele i to portioner og bruge et nyt filter for hver.
10. Ved hjælp af prop del af en 3 ml sprøjte forsigtigt trykke på den røde papirmasse, som indeholder de resterende celler gennem sien (figur 2B). Sørg for at trykke både filteret bund og sider for at sikre, at alle røde papirmasse er passeret gennem filteret (Figur 2C).
11. Tilsæt 10 mlof PBS + 2% til vævskulturskål og bruge denne til at vaske dias, sprøjte prop, og parabol til at inddrive eventuelle resterende celler. Videregive dette gennem samme 70 um cellefilter ind i 50 ml konisk rør. Gentag dette trin efter behov.
12. Centrifugeres den filtrerede cellesuspension ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
13. Forsigtigt dekanteres og kassér supernatanten, passe på ikke at forstyrre bundfaldet. En spormængde af PBS + 2% vil blive efterladt i røret. Cap røret og bladre pelleten indtil pellet resuspenderes fuldstændigt.
14. Lyserer røde blodlegemer ved adding 2 ml ACK Lysis Buffer (0,15 M _NH4Cl, 1 mM _KHCO3, 0,1 mM EDTA, pH til 7,2, opbevares ved 4 ° C) pr milten til konisk rør og rotere og vend røret for at sikre, at alle celler komme i kontakt med ACK buffer. Vend forsigtigt røret i 1 min ved stuetemperatur.
15. Bringe volumenet af cellesuspensionen til 50 ml ved tilsætning af PBS + 2% røret for at neutralisere ACK buffer. Vend røret 10 gange og centrifugeres i 5 minutter ved 300 xg ved 4 ° C. Efter centrifugering er færdig, skal være hvid pellet (figur 3).
16. Forsigtigt dekanteres og kassér supernatanten, passe på ikke at forstyrre bundfaldet. Efterlad et spor mængde PBS + 2% i røret, cap røret, og svirp pillen at opblande det.
17. Der tilsættes 10 ml af T-celle medier [10% FBS, 10 mM HEPES (pH 7,0), 2 mM GlutaMAX, 1 mM natriumpyruvat, 1x ikke-essentielle aminosyrer, 1x penicillin / streptomycin og 50 mM β-mercaptoethanol], og yderligere resuspender pellet ved forsigtigtpipettere op og ned. Derefter filtreres suspensionen gennem en ny 70 um filter over i en ny 50 ml konisk rør.
18. Brug en anden 5-10 ml af T-celle medier at skylle det oprindelige rør og passerer denne gennem 70 um filter i rør indeholdende resten af ​​de filtrerede celler. Hvis forarbejdning mere end to milt, kan mængden af ​​T-celle-medier øges for at maksimere inddrivelsen.
19. Hold celler på is indtil klar til at blive plettet. Cellerne skal tælles og levedygtighed adgang.
    1. At tælle celler, kombinere 3 ml celler med 24 ml PBS + 2% og 3 ml 0,4% trypanblåt. Load 10 ml af denne i hvert kammer i en forbedret Neubauer hæmocytometer. Levedygtighed som bedømt ved trypanblåt-udelukkelse, er typisk mellem 85-95%.

2. Levedygtighed og Surface Farvning

1. Pellet celler ved centrifugering i 10 minutter ved 300 xg ved 4 ° C. Resuspender celler i T-celle-medium til en koncentration på 1 x 10 ⁷ celler / ml. TransfER 2 millioner celler (100 ml) i en brønd i en U-bundede 96-brønds vævskulturplade.
2. Centrifugeres 96-brønds plade i 10 minutter ved 300 xg ved 4 ° C.
3. Fjern supernatanten fra hver brønd ved at bladre væske i brønden pladen i vasken (cellepelleten forbliver i brønden) og duppe pladen på et rent papirhåndklæde. Vask cellerne ved resuspendering dem i 200 pi PBS efterfulgt af centrifugering ved 300 xg i 10 minutter ved 4 ° C. Udfør alle vaske denne, medmindre andet er angivet.
   Bemærk: Du må ikke bruge PBS + 2%, da det vil forstyrre fixable PI pletten.
4. Fjern supernatanten ved at stille pladen, og der tilsættes 100 ml frisklavet kommercielle plet (f.eks fixable røde døde celle plet) til hver brønd.
   1. Gør pletten ved fortynding af reaktivt farvestof stamopløsning 1:10 i DMSO efterfulgt af en 1:10 fortynding i PBS. Inkubér pladen ved 4 ° C i 30 minutter beskyttet mod lys.
5. Centrifugeres psent til 10 minutter ved 300 xg ved 4 ° C. På dette punkt frem, udføre alt arbejde med pladen med vævskultur hætte lys slukket.
6. Fjern supernatanten ved at stille pladen og derefter tilsættes 100 ml Fc blok løsning. Gør Fc blok ved at fortynde Fc blok stamopløsning 1: 100 i PBS.
7. Fortyndede antistoffer, der skal anvendes til overfladefarvning (f.eks, anti-CD4 eller anti-CD8) i PBS, og der tilsættes 100 ml til hver brønd. Inkubér 96-brønds plade i 30 minutter ved 4 ° C beskyttet mod lys.
   Bemærk: Surface plet antistoffer bør titreret for optimal ydeevne. Anvender typisk en 1: 200 eller 1: 400 fortynding pr fabrikantens protokol.

3. Intracellulær farvning for histon H3

1. Efter inkubering af overfladen pletten, vaske cellerne to gange i PBS.
2. Efter den sidste vask tilsættes 100 pi 4% paraformaldehyd til hver brønd. Inkubér 96-brønds plade i 5 minutter ved stuetemperatur. Lav 4% paraformaldehyd ved diluting 16% paraformaldehyd i PBS. Gør dette friske.
3. Vask cellerne to gange i PBS.
4. Gør Perm / blokeringsopløsning (stock Perm løsning er PBS + 2% + 0,02% Triton X-100, opbevares ved 4 ° C) ved at kombinere 2 ml normalt kaninserum pr 100 ml stock Perm løsning. Lav nok til 60 ml / prøve.
5. Tilsæt 40 ​​ml Perm / Block til hver prøve, godt og bland godt ved forsigtigt at pipettere op og ned, pas på ikke at lave bobler. Inkubér pladen ved stuetemperatur i 45 minutter i mørke. Spar resterende Perm / blok til trin 3.6.
6. Fortynd fluorescens konjugeret histon H3K4me1 antistof i Perm / blokeringsopløsning reserveret i trin 3.5, og der tilsættes 10 pi af denne fortynding til hver brønd. Bland ved forsigtigt at pipettere op og ned. Inkubér 96-brønds plade i mørke i 1 time ved 4 ° C.
   Bemærk: Brug en H3K4me1 antistof konjugeret under anvendelse af R-Phycoerythrin konjugering kit ifølge producentens anvisninger.
7. Vask cellerne to gange i PBS + 2%.
8. Resuspender cellerne i 200pi PBS + 2% og overføre prøver til FACS rør til flowcytometri analyse. Prøverne kan opbevares ved 4 ° C i mørke. For at opnå optimale resultater analysere prøverne inden for to dage. Enkeltvis farvede prøver kan bruges som flowcytometri kontroller kompensation.

Representative Results

Lymfocytter fra en C57B / 6 mus blev forarbejdet til en enkelt celle suspension i overensstemmelse med protokollen og tælles ved hjælp af en standard hæmocytometer. Celler blev podet i tre eksemplarer ved 2 x 10 ⁶ / ml i T-celle-medier i 15 ml koniske rør og efterladt ubehandlet eller stimuleret med 1 mg / ml opløselige anti-CD3-antistoffer (klon 4C11) i 3 timer ved 37 ° C i en standard vævskultur inkubator. Døde celler blev farvet og derefter celler blev derefter overfladebehandlet farvet under anvendelse FITC-CD8 og APC-CD4-antistoffer i overensstemmelse med protokollen. Histon tilgængelighed blev analyseret via flowcytometri (figur 4). I begge naive CD4 ⁺ og CD8 ⁺ T-celler, var den gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI) er lav, som betyder en kondenseret kromatin tilstand. Som celler aktiveres med anti-CD3-antistoffer MFI stiger signifikant (p <0,001, Student t-test) at kromatin har dekondenseret.

Figur 1. Teknik til behandling af milten i en enkelt cellesuspension under anvendelse af matteret mikroskopobjektglas. (A) Milten presses mod matteret overflader af to mikroskopobjektglas. (B) De glider flyttes frem og tilbage mod hinanden frigive lymfocytter i en 100 mm petriskål, indtil resterne af milten er hvide. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. Ved hjælp af en sprøjte prop til at trykke resterende røde pulp gennem en 70 mm cellesigte. (A) Red pulp tilbage efter en milt i s forarbejdet til en enkelt cellesuspension og ledes gennem 70 mm cellefilter. (B) Den prop del af en 3 ml sprøjte anvendes til tryk forsigtigt resterende rødt papirmasse gennem cellen si. (C) Efter brug af sprøjten, bør der være næsten ingen røde papirmasse tilbage i cellen si. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3. ACK lysis af røde blodlegemer. (A) Centrifugering af en enkelt cellesuspension genereret fra en enkelt mus milt før ACK lysis. (B) Efter ACK lysis af røde blodlegemer, bør cellepelleten være hvidt.få = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4. Repræsentative resultater af protokollen. (A) gating ordning anvendes til at analysere kromatin status i ^CD4 + T-lymfocytter. (B og C) T-celler blev efterladt ubehandlet eller aktiveret med 1 mg / ml opløselige anti-CD3-antistoffer i 3 timer (tre gange). Cellerne blev derefter analyseret ved flowcytometri til at bestemme chromatinkondensation i CD4 ⁺ celler (B) og ^CD8 + celler (C). Data er middelværdier ± standardafvigelse på middelværdien fluorescensintensitet H3K4me1 farvning. * p <0,001 (Students t-test) Klik hførend at se en større version af dette tal.

Tabel 1:. Fejlfinding En hurtig reference til almindelige problemer og mulige løsninger.

Discussion

Vi udviklede en protokol, der giver mulighed for vurdering af chromatinkondensering i T-celler. Den er afhængig af den simple iagttagelse, at histon H3-antistoffer ikke kan få adgang til deres epitoper let i naive celler, men på T-celle aktivering, de samme antistoffer er i stand til at binde sig til deres epitoper. Ved at sammenligne MFI af histon H3 farvning mellem behandlingsgrupperne, kan bestemmes den relative grad af kondensvand eller dekondensering. Vi har brugt denne protokol til at bestemme relative kondens status under thymocyt udvikling og under T-celle aktivering ^4. Vi har også brugt denne protokol til at undersøge de mekanismer, der styrer dekondensering processen ^5.

Denne protokol bygger på anvendelsen af ​​en histon H3-antistof til påvisning chromatinkondensering status. Da der ikke er nogen global ændring i histon modifikation under T-celle-aktivering ^4, er vi i stand til at bruge en H3K4me1 antistof til at vurdere kromatinstatus i denne protokol. Vi har brugt antistoffer mod umodificeret Histone H3; imidlertid signalet produceret var meget svagere samlet. Det er vores erfaring, antistoffer mod modificeret Histone H3 fungere bedre i immunfluorescens og flowcytometri analyser, mens antistoffer mod umodificeret Histone H3 fungere bedre i Western blot. Det skal bemærkes, at det også er muligt at anvende antistoffer mod andre histonproteiner, selv om vi ikke har forsøgt det.

De Perm / Block og histon H3 antistof trin er de mest kritiske trin i protokollen. Mængden af ​​Perm / blokeringsopløsning anvendes skal optimeres hver gang bestanden Perm opløsningen er fremstillet. Dette kan gøres ved at sammenligne effektiviteten af ​​forskellige fortyndinger af stamopløsningen. Et typisk eksperiment omfatter en sammenligning kromatin status i naive T-celler til dem aktiveret i 3 timer (figur 4). Man bør vælge den fortynding, der producerer den største ændring i MFI løbettidsperioden analyseret. Stamopløsningen kan fortyndes i PBS + 2% for at mindske Perm / Block styrke ved først at resuspendering af cellerne i så meget som 100 ml PBS + 2% efter trin 3.4 og derefter tilsætte Perm / Block i trin 3.5. Et lignende pilotforsøg bør anvendes til at teste forskellige fortyndinger af fluorescens konjugeret histon H3-antistof hver gang et nyt parti af antistof er mærket. Disse trin er særligt afgørende for en vellykket påvisning af kondensationsprodukter forskelle tidligt i T-celleaktivering (f.eks indenfor 3 timer for aktivering). Indimellem er der celler, som ikke får permeabiliserede og vil således ikke farves med histon H3 antistof. Dette kan ske, hvis cellerne ikke resuspenderes godt, når tilsætning af Perm / Bloker eller hvis Perm / Block er ikke stærk nok. Disse celler vises som begivenheder presses mod aksen, når visualisere et histogram af histon H3 farvning. Da disse begivenheder vil forvrænge den samlede MFI, kan disse begivenheder udelades fra analyse af Gating den normale fordeling af histon H3-positive celler. Kan findes yderligere hjælp i Vejledning til fejlfinding (tabel 1).

Inkluderingen af ​​et fixable døde cellefarvende muliggør vurdering af cellelevedygtighed i assayet. Dette er helt afgørende, når manipulere T-celle aktivering, fordi visse stimuli kan fremkalde celledød. I et sådant tilfælde, kan histon H3 antistoffet binder histoner i døde celler anderledes end levende celler, hvilket fører til fejlfortolkninger af resultaterne.

Denne protokol er udviklet til brug i 96-brønds plade-format, tillader en høj produktion analyse af kromatin status. En milt fra en 6-8 uger gammel hunmus vil typisk give mellem 60 til 90.000.000 celler ved anvendelse af protokollen. Da farvningsprotokollen kræver 2 millioner celler pr prøven, kan man nemt analysere flere behandlingsgrupper og tidspunkter i tre eksemplarer med en enkelt milten på en enkelt plade med 96 brønde. Det er muligt at perform protokollen med mindre celler pr prøve; Men på grund af antallet af trin og centrifugeringstrin den iboende tab af celler ved hvert af disse trin, er det ikke tilrådeligt at sænke antallet af celler ved meget. Vi har med succes gennemført protokol med 1 million celler pr prøve.

Vi brugte denne protokol til at undersøge kromatin status i ^CD4 + T-hjælper celler og CD8 ⁺ cytotoksiske T-celler. Dette er gjort muligt, fordi protokollen indeholder standard overflade farvning. Protokollen kunne let tilpasses til undersøgelse af kromatin i andre lymfocytsubpopulationer ved at bruge antistoffer mod befolkningens-specifikke overflademarkører. Denne protokol kan også nemt tilpasses til andre celletyper, så længe antistoffer, der genkender relevante overflademarkører er tilgængelige og korrekt fiksering / permeabilisering betingelser er kendt.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm tissue culture dish	BD Biosciences	353003
Precleaned frosted microscope slides	Fisher Scientific	12-550-343
Sterile cell strainer, 70 mm nylon mesh	Fisher Scientific	22363548
3 ml syringe, Luer-Lok tip	BD	309585
Falcon 50 ml polypropylene conical tube	Corning	352098
LIVE/DEAD fixable red dead cell stain kit	Life Technologies	L23102	Life Technologies sells versions of this kit with different colors
Fc Block	BD Biosciences	553142
16% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100
Normal rabbit serum	Sigma-Aldrich	R9133
Anti-H3K4me1 antibody	Abcam	ab8895
R-Phycoerythrin conjugation kit	Abcam	ab102919	Alternatively, the LYNX rapid RPE kit from AbD Serotec can be used