Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

השימוש בcytometry הזרימה מנת להעריך את המצב של הכרומטין בתאי T

Published: December 17, 2015 doi: 10.3791/53533
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biology, Furman University
* These authors contributed equally

Summary

Cytometry זרימה יכול להיות מנוצל כדי להעריך את מצב הכרומטין בתוך תאי T. פרוטוקול זה מאפשר למדענים להבין את העדות של decondensation הכרומטין במהלך הפעלת תא T הפגינה על ידי עלייה בעוצמת הפריחה הממוצעת (MFI) של נוגדני היסטון H3 ניאון

Abstract

במהלך תגובה חיסונית תקינה, תאי T שקטים להיות מופעלים בהצגת אנטיגן לקולטן תא T אנטיגן הספציפי שלהם. זה מוביל לשגשוג משובט של רק אלה תאי T הנושאים קולט שמזהה את האנטיגן. decondensation הכרומטין הוא סימן היכר של הפעלת תא T, ודורש לתאי T לרכוש את היכולת להתרבות לאחר האירוסין אנטיגן. שינוי בעיבוי הכרומטין זה ניתן להבחין באמצעות נוגדנים שהועלו נגד חלבוני היסטון. נוגדנים אלה לא יכולים להיקשר לאפיטופים בתאי T נאיביים, כמו גם שהם יכולים בתאי T מופעלים. אנו מתארים כיצד להכתים בו זמנית סמני T תא ספציפי משטח, כדאיות מסלול עם כתם תאים מת ניתן לתקן, ולמדוד מצב הכרומטין באמצעות צביעה תאית של חלבוני היסטון H3. תאים ויטראז מנותחים על ידי cytometry זרימה ומעמד עיבוי הכרומטין נמדד כעוצמת הקרינה הממוצעת (MFI) של כתם היסטון H3. Chromatבdecondensation במהלך הפעלת תא T בא לידי ביטוי בגידול בMFI

Introduction

Cytometry זרימה היא טכנולוגיה מבוססת לייזר שפותחה עבור הניתוח של פרמטרים פיזיים וניאון מרובים באוכלוסיות תאים. טכנולוגיה זו פועלת כתאים תלויים בזרם של מפגש נוזל לייזר, סמני ניאון מרגשים על או בתוך התאים. סמנים אלה ולאחר מכן פולטים אור שהוא זוהה ולכמת ידי צינורות מכפיל. בעוד cytometry הזרימה באופן מסורתי משמש לזיהוי אוכלוסיות של תאים, זה הוכיח להיות טכנולוגיה שימושית כאשר לומד מערך של מאפייני תא כוללים שלמות תא קרום, אינטראקציות חלבון-חלבון וסחר חלבון 1-3. פיתחנו פרוטוקול המאפשר טכנולוגיה זו כדי לשמש כדי לזהות המצב של הכרומטין בתאי T כפי שהם מופעלים במבחנה 4. גם אנחנו השתמשנו בפרוטוקול זה כדי לחקור את המנגנון של decondensation הכרומטין מושרה הפעלת תאי טי 5.

activatio תא Tn ושגשוג הם קריטיים לתגובה חיסונית תקינה. תאי T, תת-קבוצה מסוימת של לימפוציטים במערכת החיסונית, הנדרשים לתגובה חיסונית תקינה והפיתוח של זיכרון חיסוני. הפעלה היא יזם כאשר אנטיגן מוצג בהקשר של מתחם התאימות העיקרי לקולט תא T (TCR) ממוקם על פני השטח תאיים של תאי T שקטים (שנסקרו ב6). זה מעורר שורה של אירועים מולקולריים דינמיים והורה מאוד בתוך תאי T שיגיעו לשיא בעלייה בCa 2 + ריכוז תאיים 7 וטרנסלוקציה הגרעינית של גורמי שעתוק הנדרשים להפעלה (שנסקרה ב8-10). ברגע שהופעלו, תאי T להשיג את היכולת להגיב לאינטרלויקין -2 (IL-2), גורם גדילה חזק שמנצל את JAK (יאנוס קינאז) / STAT (איתותים מתמר וActivator של תמלול) מסלול לנהוג התפשטות משובט של T מופעל תאים 11. בקצרה, IL-2 גירויתוצאות בזירחון של חלבוני STAT, משפחה של גורמי שעתוק cytosolic סמויים. ברגע שפוספורילציה, חלבוני STAT dimerize, translocate לגרעין ולנהוג ביטוי של גנים כולל אלו מעורבים בהתקדמות מחזור התא. בתאי T, IL-2 אותות באמצעות STAT5, אשר נדרש להתפשטות תאי T 12,13.

על מנת להשיג התרחבות משובט של תאי T מופעלים, אלה תאים שלא חוו אירוסין אנטיגן-TCR (תאי T נאיביים), חייבים להיות מנגנון להתעלם מההשפעות החזקות של IL-2. זו מושגת באמצעות הסדרת מעמד הכרומטין. תאי T נאיביים להחזיק הכרומטין תמצית האוסר אירוסין STAT5-DNA בתגובה לIL-2 גירוי. עם ההפעלה, decondenses הכרומטין וSTAT5 יכולים לגשת ליזמים של גני המטרה, המאפשרים ריבוי משובט 4. מעניין לציין, שינוי זה במעמד הכרומטין אינו תלוי בשינוי אפיגנטיים של protei היסטוןNS (לסקירה, ראה 14) כפי שאנו לא הבחנו בשינוי עולמי בשינוי היסטון במהלך הפעלת תא T 4.

בעת ביצוע מחקרים אלה, גילו שהנוגדנים שהועלו נגד חלבוני היסטון גם התקשו הגישה epitopes בתאים נאיביים, אבל זה על הפעלה בקלות רבה יותר יכול לקשור epitopes 4. לפיכך, נוגדנים מחייבים ההיסטונים משמש כקריאת נתונים למצב עיבוי הכרומטין. כאן אנו מציגים את השיטה לשימוש cytometry זרימה לזהות נוגדני היסטון H3 מצומדות fluorescently כדי להעריך את מצב הכרומטין בתאי T. עיבוי הכרומטין באוכלוסייה של תאים נמדד כעוצמת הפריחה הממוצעת (MFI) של מכתים היסטון H3. בהקשר של הפעלת תא T, MFI של עליות צביעת היסטון H3, המסמלת את decondensation של הכרומטין. בנוסף למדידת מצב הכרומטין באמצעות הכתמת היסטון H3 תאית, פרוטוקול זה גם incorporaTES המשטח מכתים וכתם ניתן לתקן לתאים חיים, המאפשר ניתוח של תת-אוכלוסיות של תאים.

Protocol

מחקר זה בוצע בהתאם קפדן עם ההמלצות במדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה של המכון הלאומי לבריאות. פרוטוקול בעלי החיים אושר על ידי (מספר ההיתר: A3242-01) הוועדה מוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת פורמן. ניתן למצוא את כל החומרים והציוד המשמשים בפרוטוקול זה בטבלה של חומרים וציוד, ואילו ניתן למצוא מאגרים משמשים בטבלה של חוצצים ופתרונות.

1. השעיה תא בודדת של ימפוציטים מטחול העכבר

  1. להקריב עכברים באמצעות CO 2 מחנק. לאשר המתת חסד על ידי נקע בצוואר הרחם.
    הערה: השתמש בטחולים משני עכברים 6-8 שבוע ישנים isogenic (למשל, C57B / 6) מאותו המין. בדרך כלל, שני טחולים מעובדים.
  2. לרסס את בעלי החיים למכביר עם 70% אתנול ופתרון אוריינט כך שהראש פונה שמאלה.
  3. בעזרת מלקחיים, להרים את העור של החיה כלפי מעלה והרחק מtהוא הגוף. בעזרת מספריים, לחתוך חריץ קטן דרך העור ליד הבטן של החיה. שימוש באצבעות, למשוך כל צד של החריץ לחשוף את הצפק מהצוואר ועד לתחילת הרגליים האחוריות. הטחול צריך להיות גלוי ישירות מתחת לצפק.
  4. בעזרת מלקחיים, להרים את הצפק ולעשות חתך קטן כדי לחשוף את הטחול. הסר את הטחול עם מלקחיים ולהשתמש במספריים כדי להקניט משם כל שומן ורקמת חיבור.
  5. מניחים את הטחול לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר PBS בתוספת 2% בסרום שור עוברי (להלן כPBS + 2%). שמור את הצינור על קרח עד מוכן להתחיל ההשעיה התא בודדת.
    הערה: התאוששות אופיינית היא 60-90 מיליון תאים לטחול, ובדרך כלל, 2 מיליון תאים דרושים לדגימה. לבצע את כל השלבים הבאים במכסת מנוע בתרבית רקמה.
  6. למזוג הטחולים לתוך צלחת תרבית רקמת 100 מ"מ סטרילי.
  7. להשיג שתי שקופיות מיקרוסקופ חלבית ולהחזיק tהוא מחליק כך ששני המשטחים החלבית מחוספס פנים פנימה לכיוון אחד לשני. להרטיב את השקופיות בפתרון + 2% PBS שפך לתוך צלחת פטרי.
  8. החזק את הטחול בין המשטחים החלבית של השקופיות, עם הקצוות עדיין שקועים, ולטחון את הטחול בעדינות על ידי העברת השקופיות קדימה ואחורה אחד נגד השני (איור 1 א). התאים ייפלו לתוך צלחת פטרי. המשך שחיקה עד שכל התאים שוחררו והשרידים של הטחול להופיע לבנים (איור 1).
  9. צייר את ההשעיה התא בpipet ולסנן אותה באיטיות דרך מסנן 70 מיקרומטר לתוך צינור סטרילי חדש 50 מיליליטר חרוטי. שים לב שחתיכות קטנות של עיסה אדומה תהיה נוכחת במסנן (איור 2 א).
    1. אם המסנן עולה, בעדינות להרים אותו מעט כדי לאפשר לנוזל להתנקז דרך ולמקם את המסנן בחזרה לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר ולהמשיך, לחזור על תהליך זה במידת צורך. אם עיבוד יותר מ -5 spleENS, ייתכן שיהיה צורך לחלק לשתי קבוצות ולהשתמש במסנן חדש עבור כל אחד.
  10. שימוש בחלק הפקק של מזרק 3 מיליליטר לחץ בעדינות את העיסה האדומה המכילה את התאים שנותרו במסננת (איור 2). הקפד ללחוץ שתי תחתית המסנן וצדדים כדי להבטיח שכל העיסה האדומה עברה דרך המסנן (איור 2 ג).
  11. הוסף 10 mlof + 2% PBS לצלחת תרבית הרקמה ולהשתמש בזה כדי לשטוף את השקופיות, פקק מזרק, ומנה לשחזר את כל תאים שנותרו. להעביר את זה דרך אותה מסננת תא 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל. חזור על שלב זה במידת הצורך.
  12. צנטריפוגה ההשעיה התא המסוננת ב XG 300 במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס.
  13. בעדינות למזוג וזורקים supernatant, נזהר שלא להפריע את הכדור. עקבות סכום של 2% PBS + יישאר בצינור. שווי הצינור וקפיצי גלולה עד גלולה היא resuspended לחלוטין.
  14. תאי דם אדום Lyse ידי מודעהדינג 2 מ"ל של ACK תמוגה מאגר (0.15 מ 'NH 4 Cl, 1 מ"מ KHCO 3, 0.1 מ"מ EDTA, pH 7.2, חנות ב 4 ° C) לטחול לצינור חרוטי ולסובב ולהפוך את הצינור כדי להבטיח שכל התאים באים במגע עם חיץ ACK. מערבולת בעדינות את צינור דקות 1 ב RT.
  15. תביא את הנפח של ההשעיה תא 50 מיליליטר על ידי הוספת PBS + 2% הצינור לנטרל את חיץ ACK. להפוך את הצינור 10 פעמים וצנטריפוגות במשך 5 דקות ב 300 XG ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה היא מוחלטת, גלולה צריכה להיות לבן (איור 3).
  16. בעדינות למזוג וזורקים supernatant, נזהר שלא להפריע את הכדור. השאר עקבות סכום של PBS + 2% בצינור, מכסה את הצינור, וקפיצי גלולה לresuspend זה.
  17. הוסף 10 מיליליטר של תקשורת T תא [10% FBS, 10 מ"מ HEPES (pH 7.0), 2 מ"מ Glutamax, פירובט 1 מ"מ נתרן, חומצות אמינו לא חיוניות 1X, 1x פניצילין / סטרפטומיצין ו -50 מ"מ β-mercaptoethanol], ועוד resuspend גלולה ידי בעדינותpipetting למעלה ולמטה. אז לסנן את ההשעיה דרך מסנן 70 מיקרומטר חדש לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר חדש.
  18. שימוש נוסף 5-10 מיליליטר של תקשורת תא T לשטוף את הצינור המקורי ולהעביר את זה דרך המסנן 70 מיקרומטר לתוך הצינור המכיל את שאר התאים המסוננים. אם עיבוד יותר משני טחולים, הנפח של תקשורת תא T יכול להיות מוגבר על מנת למקסם את ההתאוששות.
  19. שמור את התאים על קרח עד מוכן להיות מוכתמים. יש לספור תאים וכדאיות גישה.
    1. לספור תאים, לשלב 3 מיליליטר של תאים עם 24 מיליליטר של PBS + 2% ו- 3 מיליליטר של 0.4% trypan כחולים. טען 10 מיליליטר של זה לכל תא של hemocytometer נויבאואר השתפר. כדאיות, כפי שהוערך על ידי הרחקת trypan הכחולה, היא בדרך כלל בין 85-95%.

2. יכולת הקיום והכתמת Surface

  1. תאים גלולה על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 300 XG ב 4 מעלות צלזיוס. Resuspend תאים בתקשורת תא T לריכוז של 1 x 10 7 תאים / מיליליטר. Transfאה 2 מיליון תאים (100 מיליליטר) לתוך באר של צלחת תרבית רקמת 96-גם תחתית-U.
  2. צנטריפוגה הצלחת 96-היטב במשך 10 דקות ב 300 XG ב 4 מעלות צלזיוס.
  3. הסר את supernatant מכל טוב ידי מצליף נוזל בתוך הצלחת גם לכיור (התא גלולה יישאר בבאר) ומספיג את הצלחת על מגבת נייר נקייה. לשטוף את התאים על ידי resuspending אותם ב200 μl PBS ואחריו צנטריפוגה XG ב 300 במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לבצע את כל שטיפות בדרך זו, אלא אם כן צוין אחרת.
    הערה: אל תשתמש בPBS + 2% כפי שיפריע לכתם PI ניתן לתקן.
  4. הסר את supernatant ידי מצליף הצלחת ולהוסיף כתם של מוכן טרי מסחרי (למשל, כתם תא ניתן לתקן אדום מת) לכל 100 מיליליטר היטב.
    1. הפוך את הכתם על ידי דילול 01:10 פתרון מניות צבע תגובתי בDMSO אחרי דילול 1:10 ב PBS. דגירה את הצלחת על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות מוגנות מפני אור.
  5. צנטריפוגה עמ 'מאוחר במשך 10 דקות ב 300 XG ב 4 מעלות צלזיוס. בנקודה זו קדימה, לבצע את כל העבודה עם הצלחת עם מכסה המנוע אור תרבית רקמה מ.
  6. הסר את supernatant ידי מצליף הצלחת ולאחר מכן להוסיף לפתרון בלוק Fc 100 מיליליטר. הפוך פתרון בלוק Fc על ידי דילול מניות פתרון בלוק Fc 1: 100 ב- PBS.
  7. נוגדנים לדלל לשמש לצביעת משטח (למשל, אנטי CD4 או אנטי CD8) בPBS ולהוסיף 100 מיליליטר לכל טוב. דגירה צלחת 96-היטב במשך 30 דקות ב 4 ° C המוגנים מפני אור.
    הערה: נוגדני כתם משטח צריכים להיות titered לביצועים אופטימליים. בדרך כלל משתמש בדילול 1: 400, לפרוטוקול של היצרן: 200 או 1.

3. תאיים מכתים להיסטון H3

  1. לאחר דגירה של כתם המשטח, לשטוף את התאים פעמים PBS.
  2. לאחר השטיפה האחרונה, להוסיף של paraformaldehyde 4% 100 μl היטב כל אחד. דגירה צלחת 96-היטב במשך 5 דקות על RT. הפוך paraformaldehyde 4% על ידי diluting paraformaldehyde 16% ב- PBS. להפוך את זה טרי.
  3. לשטוף את התאים פעמים PBS.
  4. הפוך פתרון פרם / חסום (פתרון פר המניה הוא PBS + 2% + 0.02% Triton X-100, לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס) על ידי שילוב של 2 מיליליטר של סרום ארנבת רגיל לכל 100 מיליליטר פתרון פר מניה. לעשות מספיק עבור 60 מיליליטר / מדגם.
  5. הוסף 40 מיליליטר פר / חסום לכל דגימה היטב ומערבבים היטב בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה, נזהר שלא לעשות בועות. דגירה את הצלחת על RT במשך 45 דקות בחושך. להציל את שנותר פרם / חסום לצעד 3.6.
  6. לדלל נוגדן היסטון H3K4me1 fluorescently מצומדות בפתרון פרם / חסום שמורות בשלב 3.5 ולהוסיף 10 μl של דילול זה לכל אחד. מערבבים בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה. דגירה צלחת 96-היטב בחושך במשך שעה 1 ב 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: השתמש בנוגדן H3K4me1 מצומדת באמצעות ערכת נטיית R-Phycoerythrin הבא הוראות היצרן.
  7. לשטוף את התאים פעמים PBS + 2%.
  8. Resuspend התאים 200μl PBS + 2% ולהעביר את הדגימות לצינורות FACS לניתוח cytometry זרימה. ניתן לאחסן הדגימות ב 4 מעלות צלזיוס בחושך. לקבלת תוצאות אופטימליות לנתח הדגימות בתוך יומיים. ביחידים דגימות מוכתמות יכולות לשמש כcytometry זרימת בקרות פיצוי.

Representative Results

לימפוציטים מעכבר C57B / 6 עובדו להשעית תא בודדת על פי הפרוטוקול ונספרו באמצעות hemocytometer סטנדרטי. תאי זרע בשלושה עותקים ב2 x 10 6 / מיליליטר בתקשורת T-cell ב 15 מיליליטר צינורות חרוטי ואינם מטופל, או מגורה עם 1 מ"ג / נוגדנים אנטי CD3 מסיסים מ"ל (4C11 שיבוט) במשך 3 שעות על 37 מעלות צלזיוס ב תרבות תקן רקמות חממה. תאים מתים היו מוכתמים ולאחר מכן תאים היו אז משטח מוכתם באמצעות FITC-CD8 וAPC-CD4 נוגדנים על פי הפרוטוקול. נגישות היסטון נותחה באמצעות cytometry זרימה (איור 4). בשני תאי CD4 + CD8 + T והנאיביים, העצמה הממוצעת הניאון (MFI) היא נמוכה, המסמל מדינת הכרומטין מרוכזת. כתאים מופעלים עם אנטי CD3 נוגדני עליות MFI באופן משמעותי (p <0.001, מבחן t סטודנטים) מצביע על כך שיש הכרומטין decondensed.

איור 1

איור 1. טכניקה לעיבוד טחולים להשעית תא בודדת באמצעות שקופיות מיקרוסקופ חלבית. () הטחול הוא נלחצה המשטחים החלבית של שתי שקופיות מיקרוסקופ. (ב) השקופיות נעו הלוך ושוב אחד נגד ימפוציטים שחרור אחרים לתוך צלחת פטרי 100 מ"מ עד השרידים של הטחול הם לבנים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2

איור 2. שימוש בפקק מזרק ללחוץ נותר עיסה אדומה דרך מסננת תא 70 מ"מ. () עיסה אדומה שנותרה לאחר טחול אני שעות מעובדים להשעית תא בודדת ועבר דרך מסננת תא 70 מ"מ. חלק הפקק של מזרק 3 מיליליטר (ב) משמש ללחץ בעדינות שנותרה עיסה אדומה דרך מסננת התא. (ג) לאחר השימוש במזרק, לא צריך להיות כמעט שום עיסה אדומה שנשארה במסננת התא. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3

איור 3. תמוגה ACK של תאי דם אדומים. צנטריפוגה (א) להשעית תא בודדת שנוצרה מטחול עכבר אחת לפני Ack תמוגה. (ב) לאחר תמוגה ACK של תאי דם אדומים, התא גלולה צריכים להיות לבן.תקבל = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4

איור 4. נציגי תוצאות של הפרוטוקול. תכנית () gating משמשת לניתוח מצב הכרומטין בלימפוציטים מסוג CD4 + T. (B ו- C) תאי T היו מטופל או הופעלו עם 1 מ"ג / נוגדנים-CD3 אנטי מיליליטר מסיסים לשעה 3 (בשלושה עותקים). תאים נותחו לאחר מכן על ידי הזרימה cytometry כדי לקבוע עיבוי הכרומטין בתאי CD4 + (B) ותאי CD8 + (ג). הנתונים הם אמצעי ± סטיית תקן של עוצמת הקרינה הממוצעת של מכתים H3K4me1. * P <0.001 (מבחן T- של סטודנטים) אנא לחץ על here כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

שולחן 1

טבלת 1:. מדריך לאיתור תקלות התייחסות מהירה לבעיות נפוצות ופתרונות אפשריים.

Discussion

פיתחנו פרוטוקול המאפשר להערכת עיבוי הכרומטין בתאי T. היא מסתמכת על התצפית הפשוטה שנוגדני היסטון H3 לא יכולים לגשת epitopes בקלות בתאים נאיביים, אבל על הפעלת תאי T, אותו נוגדנים אלה יכולים להיקשר לאפיטופים. על ידי השוואת צביעת MFI של היסטון H3 בין קבוצות טיפול, קרוב המשפחה מהדרגה של עיבוי או decondensation ניתן לקבוע. אנחנו השתמשנו בפרוטוקול זה כדי לקבוע את מצב עיבוי יחסי בפיתוח thymocyte ובמהלך הפעלת תא T 4. גם אנחנו השתמשנו בפרוטוקול זה כדי לחקור את המנגנונים ששולטים בתהליך decondensation 5.

פרוטוקול זה מסתמך על השימוש בנוגדן היסטון H3 כדי לזהות מצב עיבוי הכרומטין. מכיוון שאין שינוי הגלובלי בשינוי היסטון במהלך הפעלת תא T 4, אנו יכולים להשתמש בנוגדן H3K4me1 להעריך הכרומטיןמעמד בפרוטוקול זה. השתמשנו נוגדנים שהועלו נגד ללא שינוי היסטון H3; עם זאת, את האות מיוצרת הייתה כללית הרבה יותר חלשה. מניסיוננו, נוגדנים שהועלו נגד היסטון H3 שונה לעבוד טוב יותר בimmunofluorescence וcytometry זרימת מבחני, ואילו נוגדנים נגד ללא שינוי היסטון H3 לעבוד טוב יותר בכתם מערבי. יש לציין שזה גם אפשרי להשתמש נוגדנים שהועלו נגד חלבוני היסטון אחרים, למרות שיש לנו לא ניסינו את זה.

צעדי הנוגדן פרם / הבלוק והיסטון H3 הם השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול. הסכום של פתרון פרם / בלוק משמש צריך להיות מותאם בכל פעם פתרון פר המניה עשוי. ניתן לעשות זאת על ידי השוואת הביצועים של דילולים שונים של פתרון מניות. ניסוי טיפוסי כרוך השוואת מעמד הכרומטין בתאי T נאיביים לאלה הופעלו במשך 3 שעות (איור 4). יש לבחור הדילול שמייצר את השינוי הגדול ביותר בMFI מעלתקופת הזמן ניתחה. פתרון המניות יכול להיות מדולל ב 2% PBS + כדי להקטין את כוח הפר / חסום על ידי resuspending הראשון תאים בככל 100 מיליליטר PBS + 2% לאחר שלב 3.4 ולאחר מכן להוסיף את פרם / חסום בשלב 3.5. יש להשתמש בניסוי פיילוט דומה כדי לבדוק דילולים שונים של נוגדן היסטון H3 fluorescently מצומדות בכל פעם קבוצה חדשה של נוגדן שכותרתו. צעדים אלה הם קריטיים במיוחד לזיהוי מוצלח של הבדלי עיבוי מוקדם בהפעלת תא T (למשל, בתוך 3 שעות של הפעלה). מדי פעם, יש תאים שלא מקבלים permeabilized וכך לא יהיה כתם עם נוגדני היסטון H3. זה יכול לקרות אם התאים אינם resuspended גם בעת הוספה פרם / חסום או אם הפר / הבלוק הוא לא מספיק חזק. תאים אלה יופיעו כאירועים נלחצו הציר כאשר חזותי היסטוגרמה של מכתים היסטון H3. מאז אירועים אלה להטות את MFI הכולל, ניתן להשמיט את האירועים הללו מניתוח על ידי gatinז ההתפלגות הנורמלית של תאים חיוביים היסטון H3. ניתן למצוא סיוע נוסף במדריך לאיתור תקלות (הטבלה 1).

הכללת כתם תאים מת ניתן לתקן מאפשרת ההערכה של כדאיות תא בassay. זה קריטי לחלוטין כאשר המניפולציה הפעלת תא T כי גירויים מסוימים יכולים לגרום למוות של תאים. במקרה כזה, נוגדני היסטון H3 יכולים להיקשר ההיסטונים בתאים מתים באופן שונה מאשר בתאים חיים, שמוביל לפירוש לא נכון של התוצאות.

פרוטוקול זה מיועד לשימוש בפורמט צלחת 96-היטב, המאפשר ניתוח תפוקה גבוה של מצב הכרומטין. טחול מעכבר נקבת 6-8 שבוע ישן בדרך כלל יניב 60-90 מיליון תאים באמצעות הפרוטוקול. מאז הפרוטוקול מכתים דורש 2 מיליון תאים לדגימה, אפשר בקלות assay קבוצות מרובות טיפול ונקודות זמן בשלושה עותקים עם טחול בודד על צלחת 96-היטב יחידה. אפשר עמ 'erform הפרוטוקול עם פחות תאים לדגימה; עם זאת, בשל מספר צעדי צנטריפוגה וההפסד הגלום של תאים בכל אחת מהפעולות הבאות, זה לא מומלץ להפחית את מספר התאים בהרבה. יש לנו הושלם בהצלחה הפרוטוקול עם 1 מיליון תאים לדגימה.

אנחנו השתמשנו בפרוטוקול זה כדי לבחון את מעמד הכרומטין בתאי עוזר CD4 + T ותאי T ציטוטוקסי CD8 +. זה מתאפשר כי הפרוטוקול כולל צביעת משטח סטנדרטית. הפרוטוקול יכול בקלות להיות מותאם לבחינה של הכרומטין בתת אוכלוסיות לימפוציטים אחרות באמצעות נוגדנים כנגד סמני משטח אוכלוסייה ספציפית. פרוטוקול זה יכול גם בקלות להיות מותאם לסוגי תאים אחרים, כל עוד נוגדני הכרת סמני משטח רלוונטיים הם ידועים תנאי הקיבעון / permeabilization זמינות ונכון.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

פרויקט זה נתמך על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות (5 P20 RR016461 ו -8 P20 GM103499), הקרן הלאומית למדע (EPS-0,903,795). תמיכה נוספת מסופקת על ידי המחקר ומקצועי הצמיחה של אוניברסיטת פורמן ופרסים יתרון פורמן.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm tissue culture dish BD Biosciences 353003
Precleaned frosted microscope slides Fisher Scientific 12-550-343
Sterile cell strainer, 70 mm nylon mesh Fisher Scientific 22363548
3 ml syringe, Luer-Lok tip BD 309585
Falcon 50 ml polypropylene conical tube Corning 352098
LIVE/DEAD fixable red dead cell stain kit Life Technologies L23102 Life Technologies sells versions of this kit with different colors
Fc Block BD Biosciences 553142
16% paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-100
Normal rabbit serum Sigma-Aldrich R9133
Anti-H3K4me1 antibody Abcam ab8895
R-Phycoerythrin conjugation kit Abcam ab102919 Alternatively, the LYNX rapid RPE kit from AbD Serotec can be used

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bravo-Ferrada, B. M., et al. Study of surface damage on cell envelope assesed by afm and flow cytometry of lactobacillus plantarum exposed to ethanol and dehydration. J Appl Microbiol. , (2015).
  2. Agola, J. O., et al. Quantitative Bead-Based Flow Cytometry for Assaying Rab7 GTPase Interaction with the Rab-Interacting Lysosomal Protein (RILP) Effector Protein. Methods Mol Biol. 1298, 331-354 (2015).
  3. Toh, W. H., et al. Application of flow cytometry to analyze intracellular location and trafficking of cargo in cell populations. Methods Mol Biol. 1270, 227-238 (2015).
  4. Rawlings, J. S., Gatzka, M., Thomas, P. G., Ihle, J. N. Chromatin condensation via the condensin II complex is required for peripheral T-cell quiescence. EMBO J. 30, 263-276 (2011).
  5. Lee, M. D., Bingham, K. N., Mitchell, T. Y., Meredith, J. L., Rawlings, J. S. Calcium mobilization is both required and sufficient for initiating chromatin decondensation during activation of peripheral T-cells. Mol Immunol. 63, 540-549 (2015).
  6. Paul, W. E. Fundamental immunology. , 7th edn, Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins. (2013).
  7. Feske, S. Calcium signalling in lymphocyte activation and disease. Nat Rev Immunol. 7, 690-702 (2007).
  8. Isakov, N., Altman, A. Protein kinase C(theta) in T cell activation. Annu Rev Immunol. 20, 761-794 (2002).
  9. Macian, F. NFAT proteins: key regulators of T-cell development and function. Nat Rev Immunol. 5, 472-484 (2005).
  10. Hogan, P. G., Chen, L., Nardone, J., Rao, A. Transcriptional regulation by calcium, calcineurin and NFAT. Genes Dev. 17, 2205-2232 (2003).
  11. Rawlings, J. S., Rosler, K. M., Harrison, D. A. The JAK/STAT signaling pathway. J Cell Sci. 117, 1281-1283 (2004).
  12. Ihle, J. N. STATs: signal transducers and activators of transcription. Cell. 84, 331-334 (1996).
  13. Moriggl, R., et al. Stat5 is required for IL-2-induced cell cycle progression of peripheral T cells. Immunity. 10, 249-259 (1999).
  14. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).

Tags

אימונולוגיה גיליון 106 לימפוציטים מסוג T הכרומטין cytometry הזרימה cytometry הזרימה אימונולוגיה תאי T הכרומטין decondensation הפעלה
השימוש בcytometry הזרימה מנת להעריך את המצב של הכרומטין בתאי T
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bingham, K. N., Lee, M. D.,… More

Bingham, K. N., Lee, M. D., Rawlings, J. S. The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells. J. Vis. Exp. (106), e53533, doi:10.3791/53533 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter