T細胞におけるクロマチンの状態を評価するためにフローサイトメトリーの使用

Summary

フローサイトメトリーは、T細胞内のクロマチンの状態を評価するために利用することができます。このプロトコルは、科学者は、蛍光ヒストンH3抗体の平均蛍光強度（MFI）の増加によって実証されたT細胞活性化の間、クロマチン脱凝縮の証拠を解釈することができます

Abstract

適切な免疫応答の間、休止T細胞は、それらの抗原特異的T細胞受容体への抗原提示の際に活性化。これは、抗原を認識する受容体を負うのみT細胞のクローン増殖につながります。クロマチン脱凝縮は、T細胞活性化の顕著な特徴であり、T細胞が抗原の関与後に増殖する能力を獲得するために必要とされます。クロマチン凝縮の変化は、ヒストンタンパク質に対する抗体を用いて検出することができます。これらの抗体は、活性化T細胞でも同様に彼らができるようにナイーブT細胞でのエピトープに結合することができません。我々は、同時に固定可能死細胞染色でのT細胞特異的な表面マーカー、トラックの生存率を染色し、ヒストンH3タンパク質の細胞内染色を経て、クロマチンの状態を測定する方法について説明します。染色された細胞をフローサイトメトリーによって分析され、クロマチンの凝縮状態は、ヒストンH3の染色の平均蛍光強度（MFI）として測定されます。 ChromatT細胞活性化の間の脱凝縮にMFIの増加として示されています

Introduction

フローサイトメトリーは、細胞集団内の複数の物理的および蛍光パラメータの分析のために開発のレーザーベースの技術です。この技術は、上または細胞内の流体の出会いの流れに懸濁細胞として、レーザー、刺激的な蛍光マーカーに動作します。これらのマーカーは、その後、光電子増倍管によって検出され、定量化された光を発します。フローサイトメトリーは、伝統的に細胞の集団を同定するために使用されてきたが、それは、細胞膜の完全性などの電池特性の配列を研究、タンパク質-タンパク質相互作用およびタンパク質輸送^1-3有用な技術であることが証明されました。我々は、この技術は、それらがインビトロ⁴ で活性化されるT細胞におけるクロマチンの状態を検出するために使用されることを可能にするプロトコルを開発しました。我々はまた、T細胞⁵の活性化誘導クロマチン脱凝縮のメカニズムを調べるために、このプロトコルを使用しています。

T細胞activati​​onおよび増殖は、適切な免疫応答のために重要です。 T細胞は、免疫系内のリンパ球の特定のサブセットは、適切な免疫応答および免疫記憶の発達のために必要とされます。抗原は^、（6において概説）休止T細胞の細胞外表面上に位置するT細胞受容体（TCR）の主要な互換性複合体に関連して提示されたときに活性化が開始されます。これは、細胞内のCa2 +濃度⁷および^（8-10に概説されている）の活性化に必要な転写因子の核移行の増加に終わるT細胞内の動的および高秩序 ​​の分子の一連のイベントをトリガします。一度活性化T細胞は、インターロイキン-2（IL-2）に応答する能力、JAK（ヤヌスキナーゼ）/ STAT（シグナル伝達および転写活性化因子）活性化したTのクローン増殖を駆動するための経路を利用する強力な成長因子を得ます細胞^11。簡単に言えば、IL-2刺激STATタンパク質のリン酸化をもたらし、潜在的な細胞質の転写因子のファミリー。リン酸化されると、STATタンパク質は二量体化、核に移行し、細胞周期の進行に関与するものを含む遺伝子の発現を駆動します。 T細胞において、T細胞の増殖^12,13に必要とされるSTAT5を介してIL-2シグナル。

活性化T細胞のクローン性増殖を達成するために、抗原TCRの関与（ナイーブT細胞）を経験していないこれらの細胞は、IL-2の強力な効果を無視するメカニズムを有していなければなりません。これは、クロマチンの状態の調節を介して達成されます。ナイーブT細胞は、IL-2刺激に応答して、STAT5-DNAの係合を禁止する凝縮クロマチンを有します。活性化の際、クロマチンdecondensesおよびSTAT5は、クローン増殖^4を可能にして、標的遺伝子のプロモーターにアクセスすることができます。興味深いことに、クロマチン状態のこの変化は、ヒストンproteiのエピジェネティックな変更に依存しません我々はT細胞活性化⁴中のヒストン修飾には世界的な変化が見られなかったようNS（レビューのために^{、14を参照）。}

これらの研究を行っている間、我々は、ヒストンタンパク質に対する抗体はまた、ナイーブ細胞でそのエピトープへのアクセスの困難を持っていたことを発見したが、活性化の際に、それはより容易に彼らのエピトープ^4を結合することができます。このように、ヒストンに結合する抗体は、クロマチン凝縮状態の読み出しとなります。ここでは、この方法は、T細胞におけるクロマチンの状態を評価するために、蛍光共役ヒストンH3抗体を検出するためのフローサイトメトリーを使用することを提示します。細胞集団におけるクロマチン凝縮は、ヒストンH3の染色の平均蛍光強度（MFI）として測定されます。クロマチンの脱凝縮を意味するT細胞活性化、ヒストンH3の染色が増加するのMFIの文脈で。細胞内のヒストンH3の染色を介して、クロマチンの状態を測定することに加えて、このプロトコルは、incorporaTESは、細胞の亜集団の分析を可能にして、染色および生細胞のために固定可能な染色を表面。

Protocol

この研究は、米国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイドの推奨事項に厳密に従って行きました。動物プロトコルはファーマン大学施設内動物管理使用委員会（：A3242-01許可番号）によって承認されました。使用される緩衝液は、緩衝液および溶液の表に記載されていますしながら、このプロトコルで使用されるすべての材料および機器は、材料および装置の表に記載されています。

マウス脾臓からのリンパ球の1単一細胞懸濁液

1. CO _2窒息を経由してマウスを生け贄に捧げます。頸椎脱臼により安楽死を確認してください。
   注：同じ性別の（ 例えば、C57B / 6）は、2つの6〜8週齢の同質遺伝子のマウスから脾臓を使用してください。典型的には、2つの脾臓を処理します。
2. やたら70％エタノール溶液とヘッドが左を向いているような配向で動物をスプレー。
3. ピンセットを使用して、上方に離れトンから動物の皮膚を持ち上げます彼は体。はさみを使用して、動物の腹部近くの皮膚を通して小さなノッチを切りました。指を使用して、後ろ足の先頭に首から腹膜を露出するようにノッチの各側面を引き出します。脾臓は、腹膜のすぐ下に表示されるはずです。
4. 鉗子を使用して、腹膜を持ち上げ、脾臓を露出させるために小さな切開を行います。ピンセットで脾臓を削除し、任意の脂肪および結合組織を離れていじめるためにハサミを使用しています。
5. 2％ウシ胎児血清を補った10 mlのPBSを含む50 mlのコニカルチューブに脾臓を配置（以下、PBS + 2％程度と呼ばれます）。単一細胞懸濁液を開始する準備ができるまでチューブを氷上に保管してください。
   注意：一般的な回復が脾臓100万60〜90の間の細胞であり、典型的には2万個の細胞は、サンプルごとに必要とされています。組織培養フード内で、以下の手順のすべてを実行します。
6. 無菌の100mm組織培養皿に脾臓をデカント。
7. T 2つや消し顕微鏡スライドを入手し、保持します2粗いつや消し面が互いに向かって内側に向くように彼がスライドします。 PBS + 2％溶液中にスライドを湿潤ペトリ皿に注ぎました。
8. エッジはまだ沈んで、スライドのつや消しの表面の間に脾臓を持ち、（ 図1A）互いに対して前後にスライドを移動することで静かに脾臓を挽きます。細胞をペトリ皿に分類されます。すべてのセルがリリースされていると脾臓の遺跡が（ 図1B）、白表示されるまで研削を続けます。
9. ピペットで細胞懸濁液を描画し、新しい滅菌50mlコニカルチューブに70μmのフィルターを通してゆっくりそれをフィルタリングします。赤い果肉の小片がフィルタ（ 図2A）上に存在することになることに注意してください。
   1. フィルタが上昇する場合は、ゆっくり、必要に応じてこのプロセスを繰り返し、流体が通過排出し、50mlのコニカルチューブに戻すフィルタを配置し続けることができるように少し持ち上げます。以上5 spleを処理する場合ENSは、それが二つのバッチに分割し、それぞれのための新しいフィルタを使用する必要があるかもしれません。
10. 3ミリリットルシリンジのストッパ部を使用して静かにストレーナ（ 図2B）を介して、残りの細胞を含む赤い果肉を押してください。すべての赤い果肉がフィルタ（ 図2C）を通過したことを確認するために、フィルタ底と側面の両方を押してください。
11. 組織培養皿をPBS + 2％mlof 10を追加して、スライドを洗浄し、シリンジストッパー、これを使用し、残りの細胞を回収するために皿。 50 mLコニカルチューブに同じ70μmのセルストレーナーを介してこれを渡します。必要に応じてこの手順を繰り返します。
12. 4℃で5分間、300×gで濾過した細胞懸濁液を遠心。
13. 静かにペレットを乱さないように気をつけ、上清を除去し、廃棄します。 PBS + 2％の微量チューブに残されます。チューブに蓋をし、ペレットを完全に再懸濁されるまで、ペレットをはじきます。
14. 広告によって溶解赤血球円錐管に脾臓あたりの鼎のACK溶解緩衝液2 mLを（0.15 M _NH 4 Clで、1 mMのKHCO _3、0.1mMのEDTA、7.2にpHを、4℃で保存）し、回転していることをすべてのセルを確実にするためにチューブを反転ACK緩衝液と接触します。穏やかに室温で1分間チューブを旋回。
15. PBS + 2％ACK緩衝液を中和するためにチューブを追加することにより、50 mlの細胞懸濁液の量をもたらします。 4℃で300×gで5分間チューブを10回、遠心分離を反転。遠心分離が完了した後、ペレットは、白（ 図3）である必要があります。
16. 静かにペレットを乱さないように気をつけ、上清を除去し、廃棄します。チューブにキャップを、チューブにPBS + 2％の微量のままにして、それを再懸濁したペレットをはじきます。
17. 【FBS、10mMのHEPES（pH7.0）に、2mMのグルタ、1mMピルビン酸ナトリウム、1×非必須アミノ酸、1×ペニシリン/ストレプトマイシン、および50mMのβメルカプトエタノール10％] T細胞培地の10 mLを加え、さらに優しくによってペレットを再懸濁上下にピペッティング。次に、新しい50mlコニカルチューブに新しい70ミクロンのフィルターを通してサスペンションをフィルタリングします。
18. 元のチューブを洗浄し、濾過した細胞の残りの部分を含むチューブに70μmのフィルターを通してこれを渡すために、T細胞培地の別の5〜10ミリリットルを使用してください。二つ以上の脾臓を処理した場合、T細胞培地の容積は、回収を最大にすることができます。
19. 準備が染色されるまで細胞を氷上に保管してください。細胞を計数し、生存率がアクセスする必要があります。
    1. 細胞をカウントし、0.4％トリパンブルーのPBSの24ミリリットル+ 2％と3mlで細胞の3ミリリットルを兼ね備えています。改善されたノイバウアーの血球計数器の各チャンバーにロードし、この10mlのを。生存率は、トリパンブルー排除によって評価されるように、85から95パーセントの間であるのが典型的です。

2.生存率および表面染色

1. 4℃で300×gで10分間遠心分離して細胞をペレット化。 1×10 ⁷細胞/ mlの濃度になるようにT細胞培地中で細胞を再懸濁。 TRANSFU底96ウェル組織培養プレートのウェルに、ER 2百万細胞（100ml）で。
2. 4℃で300×gで遠心分離に10分間、96ウェルプレート。
3. （細胞ペレットを十分に残ります）流しにウェルプレート内の液体をフリックし、清潔なペーパータオル上でプレートを軽くたたくことにより、各ウェルから上清を取り除きます。 200μlのPBS中にそれらを再懸濁することにより細胞を洗浄し、4℃で10分間、300×gで遠心分離しました。特に断りのない限り、すべての洗浄をこのように実行します。
   注：それは修正可能PI染色を妨害するようPBS + 2％を使用しないでください。
4. プレートをフリックすることにより上清を除去し、各ウェルに新たに調製した商業染色（ 例えば 、固定可能な赤の死細胞染色）の100ミリリットルを追加します。
   1. PBS中で1:10希釈に続いてDMSO中の反応染料原液を1:10に希釈することによって染色を行います。光から保護して4℃で30分間プレートをインキュベートします。
5. Pを遠心後半4℃で300×gで10分間。この時点で、組織培養フードライトをオフにして、プレートにすべての作業を行います。
6. プレートをフリックすることにより上清を除去し、FCブロック溶液100mlを加えます。 PBS中100：Fcのブロック原液1に希釈したFcブロック・ソリューションを作成します。
7. PBSで表面染色（ 例えば、抗 CD4または抗CD8）に使用される抗体を希釈し、各ウェルに100 mlで加えます。光から保護して4℃で30分間、96ウェルプレートをインキュベート。
   注意：表面染色抗体は、最適なパフォーマンスのために力価を測定する必要があります。製造業者のプロトコルごとに、400倍希釈200または1：一般的に1を使用しています。

ヒストンH3 3.細胞内染色

1. 表面染色のインキュベーションの後、PBSで2回細胞を洗浄します。
2. 最後の洗浄後、各ウェルに4％パラホルムアルデヒドの100μlを添加します。 RTで5分間、96ウェルプレートをインキュベートします。 dilutで4％パラホルムアルデヒドを作りますPBS中16％のパラホルムアルデヒドをる。これは新鮮なことを確認します。
3. PBSで2回細胞を洗浄。
4. 100 mlのストックパーマ液あたりの正常ウサギ血清の2ミリリットルを組み合わせることにより、（株パーマ液をPBSで+ 0.02％トリトンX-100 + 2％、4℃で保存）パーマ/ブロック・ソリューションを作成します。 60ミリリットル/サンプルのために十分なことを確認します。
5. 各サンプルウェルに40ミリリットルパーマ/ブロックを加え、穏やかに気泡をしないように注意しながら、上下にピペッティングによりよく混ぜます。暗所で室温で45分間、プレートをインキュベートします。ステップ3.6のためのパーマ/ブロックを残り保存します。
6. ステップ3.5で予約パーマ/ブロック溶液中に蛍光共役ヒストンH3K4me1抗体を希釈し、各ウェルにこの希釈液の10μlを添加します。静かにピペッティングにより混和します。 4°Cで1時間、暗所で96ウェルプレートをインキュベートします。
   注：製造者の指示に従ってR-フィコエリトリン結合キットを使用して、コンジュゲートしH3K4me1抗体を使用してください。
7. PBS + 2％で細胞を2回洗浄します。
8. 200で細胞を再懸濁PBS + 2％μlで、フローサイトメトリー分析のためにFACSチューブに試料を移します。試料は暗所で4℃で保存することができます。最適な結果を得るために2日以内に試料を分析。単独で染色されたサンプルは、フローサイトメトリー補正コントロールとして使用することができます。

Representative Results

C57B / 6マウスからのリンパ球は、プロトコルに応じて、単一細胞懸濁液に処理し、標準的な血球計を用いて計数しました。細胞を、37℃でで3時間15 ml中のT細胞培地中の2×10 ⁶ / mlで三重にコニカルチューブを播種し、未処理のまま、または1mg / mlの可溶性抗CD3抗体（クローン4C11）で刺激しました。標準的な組織培養インキュベーター。死細胞を染色し、その後細胞は、プロトコルに従ってFITC-CD8およびAPC-CD4抗体を用いて染色に表面ました。ヒストンアクセシビリティをフローサイトメトリー（ 図4）を介して分析しました。ナイーブCD4 ⁺およびCD8 ⁺ T細胞の両方において、平均蛍光強度（MFI）は、凝縮クロマチンの状態を意味する、低いです。細胞を抗CD3で活性化されるクロマチンの脱凝縮したことを示す（p <0.001、スチューデントt検定）有意MFIが増加する抗体。

フロスト顕微鏡スライドを使用して単一細胞懸濁液に脾臓を処理するための 図1 技術（A）脾臓は、二つの顕微鏡スライドのつや消し面に押し付けられます。脾臓の遺跡が白になるまで（B）スライドを前後に互いに解放するリンパ球に対して100ミリメートルペトリ皿に移動されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

脾臓私の後に残りの70 ミリのセルストレーナーを介して残りの赤い果肉を押すように、注射器ストッパーを使用した 。図 。（A）レッドパルプ単一細胞懸濁液に処理し、70 mmのセルストレーナーに通しsです。 （B）3 mlシリンジのストッパ部を穏やかに細胞ストレーナーを通して残りの赤い果肉を押すために使用されます。 （C）注射器を使用した後、事実上、セルストレーナーに残された赤い果肉があってはならない。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

赤血球の 図3. ACK溶解。先立っACK溶解単一のマウス脾臓から生成された単一の細胞懸濁液（A）を遠心分離。 （B）赤血球をACK溶解した後、細胞ペレットは、白色であるべきです。= "_空白"を取得>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4 のプロトコルの代表的な結果。（A） は、ゲーティングスキームは、CD4 ⁺ Tリンパ球でのクロマチンの状態を分析するために使用されます。 （B及びC）T細胞は、未処理のまま、または（三連で）3時間、1 mg / mlの可溶性抗CD3抗体で活性化しました。次いで、細胞をCD4 ⁺細胞（B）およびCD8 ⁺細胞（C）におけるクロマチン凝縮を決定するために、フローサイトメトリーによって分析しました。データはH3K4me1染色の平均蛍光強度の平均±標​​準偏差です。 * P <0.001（スチューデントのt検定 ） 時間をクリックしてくださいこの図の拡大版を表示するには、ERE。

表1：トラブルシューティングガイド一般的な問題と可能な解決策へのクイックリファレンス。

Discussion

我々は、T細胞におけるクロマチン凝縮の評価を可能にするプロトコルを開発しました。これは、ヒストンH3抗体はナイーブ細胞で容易にそのエピトープにアクセスすることはできません単純な観察に依存しているが、T細胞の活性化の際に、これらの同じ抗体は、それらのエピトープに結合することが可能です。治療群間のMFIヒストンH3の染色を比較することにより、凝縮または脱凝縮の相対的な程度を決定することができます。我々は、胸腺細胞発達中およびT細胞活性化⁴中の相対的な縮合の状態を決定するために、このプロトコルを使用しています。また、脱凝縮工程^5を制御するメカニズムを調査するためにこのプロトコルを使用しています。

このプロトコルは、クロマチン凝縮の状態を検出するためのヒストンH3抗体の使用に依存しています。 T細胞活性化⁴中のヒストン修飾にはグローバルな変化がないので、我々は、クロマチンを評価するために、H3K4me1抗体を使用することができこのプロトコルでのステータス。我々は、未修飾ヒストンH3に対する抗体を使用していました。しかし、生成された信号は、全体的に非常に弱いでした。変更されていないヒストンH3に対する抗体は、ウェスタンブロットに良い仕事しながら、私たちの経験では、修正されたヒストンH3に対する抗体は、免疫蛍光法で良い仕事とサイトメトリーアッセイを流します。それは、我々はそれを試みていないが、それは、他のヒストンタンパク質に対する抗体を使用することも可能であることに留意しなければなりません。

パーマ/ブロックとヒストンH3抗体のステップは、プロトコルの中で最も重要なステップです。使用パーマ/ブロック溶液の量は、ストックのパーマ液が行われるたびに最適化する必要があります。このストック溶液の種々の希釈物の性能を比較することによって行うことができます。典型的な実験は、3時間（ 図4）のために活性化されたものとナイーブT細胞におけるクロマチンの状態を比較することを含みます。一つは、MFIの上で最大の変化を生じる希釈を選択する必要があります期間は、分析。ストック溶液は、最初のステップ3.4の後だけPBS + 2％mlの100などで細胞を再懸濁した後、ステップ3.5でパーマ/ブロックを追加することにより、パーマ/ブロックの強度を減少させるためにPBS + 2％に希釈することができます。同様のパイロット実験は、抗体の新しいバッチが標識されるたびに、蛍光共役ヒストンH3抗体の異なる希釈液を試験するために使用されるべきです。これらのステップは、（活性化の3時間以内に、例えば ）初期のT細胞活性化における凝縮差の成功検出に特に重要です。時折、透過処理されませんので、ヒストンH3抗体で染色しません細胞があります。パーマ/ブロックの追加やパーマ/ブロックが十分に強くない場合ときに細胞が十分に再懸濁されていない場合に発生することがあります。これらの細胞は、ヒストンH3染色のヒストグラムを視覚化する際に軸に押し付けイベントとして表示されます。これらのイベントは、全体のMFIを歪曲されますので、これらのイベントはgatinによる分析から除外することができますグラムヒストンH3陽性細胞の正常な分布。追加の支援はトラブルシューティングガイド（ 表1）に記載されています。

固定可能死細胞染色を含めることは、アッセイで細胞生存率の評価を可能にします。 T細胞活性化を操作するときに、特定の刺激が細胞死を誘導することができるので、これは絶対的に重要です。このような場合には、ヒストンH3抗体は、結果の誤った解釈を導く生細胞とは異なった死細胞におけるヒストンに結合することができます。

このプロトコルは、クロマチンの状態のハイスループット分析を可能にする、96ウェルプレートフォーマットでの使用のために設計されています。 6-8週齢の雌マウスの脾臓は、通常、プロトコルを使用して、百万60〜90の間の細胞が得られます。染色プロトコルは、サンプルごとに2万個の細胞を必要とするので、人は簡単に単一の96ウェルプレート上の単一の脾臓と三重で複数の治療群と時間のポイントをアッセイすることができます。それは、pすることが可能ですサンプル当たり少ない細胞を用いたプロトコルをerform。しかし、遠心分離工程の数と、これらの各ステップでの細胞の固有の損失に、それははるかにより細胞の数を低下させることはお勧めできません。私たちは、サンプルあたり100万個の細胞でプロトコルを正常に完了しました。

我々は、CD4 ⁺ Tヘルパー細胞およびCD8 ⁺細胞傷害性T細胞におけるクロマチンの状態を調べるために、このプロトコルを使用します。プロトコルは、標準的な表面染色を含むので、これが可能となります。プロトコルは、簡単に人口特異的表面マーカーに対する抗体を使用して、他のリンパ球亜集団におけるクロマチンの検査のために適合させることができます。このプロトコルは、簡単に関連する表面マーカーを認識する抗体が利用可能であり、適切である限り、固定/透過化条件が知られている他の細胞タイプに適合させることができます。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm tissue culture dish	BD Biosciences	353003
Precleaned frosted microscope slides	Fisher Scientific	12-550-343
Sterile cell strainer, 70 mm nylon mesh	Fisher Scientific	22363548
3 ml syringe, Luer-Lok tip	BD	309585
Falcon 50 ml polypropylene conical tube	Corning	352098
LIVE/DEAD fixable red dead cell stain kit	Life Technologies	L23102	Life Technologies sells versions of this kit with different colors
Fc Block	BD Biosciences	553142
16% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100
Normal rabbit serum	Sigma-Aldrich	R9133
Anti-H3K4me1 antibody	Abcam	ab8895
R-Phycoerythrin conjugation kit	Abcam	ab102919	Alternatively, the LYNX rapid RPE kit from AbD Serotec can be used