Användning av flödescytometri att bedöma staten Chromatin i T-celler

Summary

Flödescytometri kan användas för att bedöma tillståndet i kromatinet i T-celler. Detta protokoll kan forskare att tolka tecken på kromatin decondensation under T-cellaktivering visas genom en ökning av den genomsnittliga blomningstid intensitet (MFI) av fluorescerande Histone H3 antikroppar

Abstract

Under en ordentlig immunsvar, vilande T-celler blir aktiverade vid antigenpresentation till deras antigenspecifika T-cellreceptor. Detta leder till klonal spridning av endast de T-celler som bär en receptor som känner igen antigenet. Kromatin decondensation är ett kännetecken för T-cellaktivering och krävs för T-celler att förvärva förmågan att föröka sig efter antigen engagemang. Denna förändring i kromatinkondensation kan detekteras med användning av antikroppar framtagna mot histonproteiner. Dessa antikroppar kan inte binda till deras epitoper i naiva T-celler såväl som de kan i aktiverade T-celler. Vi beskriver hur man samtidigt färga T-cellspecifika ytmarkörer, spår lönsamhet med en fixable död cell fläck, och mäta kromatin status via intracellulär färgning av Histon H3 proteiner. Färgade celler analyserades med flödescytometri och kromatinkondensation status mätes som den genomsnittliga fluorescensintensiteten (MFI) av Histon H3 fläcken. Chromati decondensation under T-cellaktivering demonstreras som en ökning i MFI

Introduction

Flödescytometri är en laserbaserad teknik som utvecklats för analys av flera fysiska och fluorescerande parametrar i cellpopulationer. Denna teknik fungerar som suspenderade celler i en ström av fluid möter en laser, spännande fluorescerande markörer på eller inuti cellerna. Dessa markörer avger sedan ljus som detekteras och kvantifieras genom fotomultiplikatorrör. Medan flödescytometri har traditionellt använts för att identifiera populationer av celler, har det visat sig vara en användbar teknik vid studier en array av cellegenskaper inklusive cellmembranintegritet, protein-protein interaktioner och protein trafficking ^1-3. Vi har utvecklat ett protokoll som gör att denna teknik kan användas för att detektera tillståndet för kromatin i T-celler som de aktiveras in vitro ^4. Vi har också använt detta protokoll för att undersöka mekanismen för aktiveringsinducerat kromatin decondensation av T-celler ^5.

T-cell activation och proliferation är kritiska för en korrekt immunsvar. T-celler, en särskild undergrupp av lymfocyter inom immunsystemet, krävs för korrekt immunsvar och utveckling av immunologiskt minne. Aktivering initieras när ett antigen presenteras i samband med det stora kompatibilitetskomplexet till T-cellreceptorn (TCR) som är belägen på den extracellulära ytan av vilande T-celler (översikt i ^6). Detta utlöser en serie av dynamiska och mycket ordnade molekylära händelser inom T-celler som kulminerar i en ökning av intracellulär Ca2 + -koncentration ⁷ och den nukleära translokation av transkriptionsfaktorer som krävs för aktivering (översikt i ^8-10). När aktiverad T-celler få möjlighet att svara på interleukin-2 (IL-2), en potent tillväxtfaktor som utnyttjar JAK (januskinas) / STAT (signalomvandlare och aktivator av transkription) -vägen för att driva klonal proliferation av aktiverade T ^cellerna 11. Kortfattat, IL-2-stimuleringresulterar i fosforylering av STAT-proteiner, en familj av latenta cytosoliska transkriptionsfaktorer. När fosforylerad, STAT proteiner dimeriseras, translokera till kärnan och driva uttryck av gener, inklusive de som är involverade i cellcykelprogression. I T-celler, IL-2 signaler via STAT5, som krävs för T-cellförökning ^12,13.

För att uppnå klonal expansion av aktiverade T-celler, måste dessa celler som inte har upplevt antigen TCR ingrepp (naiva T-celler), ha en mekanism för att ignorera de potenta effekterna av IL-2. Detta uppnås genom reglering av kromatin status. Naiva T-celler har en kondenserat kromatin som förbjuder STAT5-DNA-ingrepp som svar på IL-2-stimulering. Vid aktivering kan kromatin decondenses och STAT5 tillgång promotorerna målgenerna, medger klonal proliferation ^4. Intressant är inte beroende av epigenetisk modifiering av histon protei denna förändring i kromatin statusns (för granskning, se ¹⁴⁾ som vi observerat någon global förändring i histon modifiering under T-cellsaktivering ^4.

Medan dessa studier, upptäckte vi att antikroppar mot histonproteiner hade också svårt att få tillgång sina epitoper i naiva celler, men som vid aktivering kan lättare binda sina epitoper ^4. Således, antikroppsbindning till histoner fungerar som en avläsning för kromatinkondensation status. Här presenterar vi metoden att använda flödescytometri för att detektera fluorescerande konjugerade Histon H3-antikroppar för att bedöma kromatin status i T-celler. Kromatinkondensation i en population av celler mäts som genomsnittlig blomningstid intensitet (MFI) i Histon H3 färgning. I samband med T-cellsaktivering, MFI i Histone H3 färgnings ökar och att betyda decondensation av kromatin. Förutom att mäta kromatin status via intracellulär Histone H3 färgning, detta protokoll incorpora ocksåtes ytan färgning och en fastställbara fläck för levande celler, vilket möjliggör analys av subpopulationer av celler.

Protocol

Denna studie genomfördes i strikt överensstämmelse med rekommendationerna i Guide för skötsel och användning av försöksdjur i National Institutes of Health. Djuret Protokollet godkändes av Furman University Institutional Animal Care och användning kommittén (Tillståndsnummer: A3242-01). Alla material och utrustning som används i detta protokoll kan återfinnas i tabellen av material och utrustning, medan buffertar som används kan hittas i tabellen över buffertar och lösningar.

1. encellssuspension av lymfocyter från musmjältar

1. Sacrifice möss via CO ₂ kvävning. Bekräfta dödshjälp av halsdislokation.
   Obs! Använd mjältar från två 6-8 veckor gamla isogen möss (t.ex. C57B / 6) av samma kön. Typiskt är två mjältar bearbetas.
2. Spraya djuren rikligt med 70% etanollösning och orientera så att huvudet åt vänster.
3. Använd pincett, lyft huden på djuret uppåt och bort från than kropp. Med sax, skär ett litet hack genom huden nära buken hos djuret. Med fingrarna, drar varje sida av skåran för att exponera bukhinnan från halsen till början av bakbenen. Mjälten ska vara synlig direkt under bukhinnan.
4. Använd pincett, lyft bukhinnan och göra ett litet snitt för att exponera mjälten. Avlägsna mjälten med pincett och sax att retas bort eventuellt fett- och bindvävnad.
5. Placera mjälten i en 50 ml koniskt rör innehållande 10 ml PBS kompletterad med 2% fetalt bovint serum (härefter kallat PBS + 2%). Håll röret på is tills redo att börja enkelcellsuspension.
   Obs: Typisk återhämtning är mellan 60 till 90.000.000 celler per mjälte, och typiskt är 2 miljoner celler som behövs per prov. Utför alla följande steg i en vävnadsodling huva.
6. Häll mjälten i en steril 100 mm vävnadsodlingsskål.
7. Skaffa två frostade objektglas och håll tHan glider så att de två grova frostat ytor möter inåt mot varandra. Blöt bilderna i PBS + 2% lösning hälls i petriskål.
8. Håll mjälten mellan de frostade skivomas ytor, med kanterna fortfarande nedsänkta, och mala mjälten försiktigt genom att flytta sliderna och tillbaka mot varandra (Figur 1A). Cellerna kommer att falla i en petriskål. Fortsätt slipning tills alla celler har släppts och resterna av mjälten verkar vita (Figur 1B).
9. Upprätta cellsuspensionen i en pipett och filtrera den långsamt genom en 70 pm filter in i en ny steril 50 ml koniska rör. Notera att små bitar av röd massa kommer att vara närvarande på filtret (Figur 2A).
   1. Om filtret stiger upp, lyfter försiktigt upp något för att låta vätskan rinna igenom och placera tillbaka filtret i 50 ml koniska rör och fortsätta upprepa denna process vid behov. Om behandling mer än 5 spleENS, kan det vara nödvändigt att dela upp i två satser och använda ett nytt filter för varje.
10. Med användning av spärrpartiet av en 3 ml spruta försiktigt tryck på den röda massa innehållande de kvarvarande cellerna genom silen (Figur 2B). Se till att trycka både filter botten och sidor för att säkerställa att alla röda massan har passerat genom filtret (figur 2C).
11. Lägg 10 mlof PBS + 2% till vävnadsodling skålen och använda detta för att tvätta objektglas, sprutpropp och fat för att återställa eventuella kvarvarande celler. Vidarebefordra detta genom samma 70 ìm cell sil i 50 ml koniska rör. Upprepa detta steg efter behov.
12. Centrifugera den filtrerade cellsuspensionen vid 300 xg under 5 min vid 4 ° C.
13. Försiktigt dekantera och kassera supernatanten, noga med att inte störa pelleten. En spårmängd av PBS + 2% blir kvar i röret. Cap röret och bläddra pelleten tills pelleten är helt återsuspenderas.
14. Lyse röda blodkroppar från annonsending 2 ml ACK lysbuffert (0,15 M _NH4CI, 1 mM _KHCO3, 0,1 mM EDTA, pH till 7,2, förvara vid 4 ° C) per mjälte till det koniska röret och rotera och invertera röret för att säkerställa att alla celler komma i kontakt med ACK-buffert. Snurra försiktigt röret i 1 min vid RT.
15. Bringa volymen av cellsuspensionen till 50 ml genom tillsats av PBS + 2% röret för att neutralisera ACK buffert. Invertera röret 10 gånger och centrifugera i 5 min vid 300 xg vid 4 ° C. Efter centrifugeringen är klar, bör pelleten vara vit (Figur 3).
16. Försiktigt dekantera och kassera supernatanten, noga med att inte störa pelleten. Lämna en spårmängd av PBS + 2% i röret, locket röret och snärta pelleten för att återsuspendera den.
17. Tillsätt 10 ml T-cell-media [10% FBS, 10 mM HEPES (pH 7,0), 2 mM GlutaMAX, 1 mM natriumpyruvat, 1X icke-essentiella aminosyror, 1x penicillin / streptomycin och 50 mM β-merkaptoetanol], och ytterligare suspendera pelleten genom att försiktigtpipettera upp och ned. Filtrera sedan suspensionen genom en ny 70 pm filter in i en ny 50 ml koniska rör.
18. Använd ytterligare 5-10 ml av T-cell-medier för att skölja den ursprungliga röret och passera detta genom 70 um filter in i rör innehållande resten av de filtrerade cellerna. Om behandling mer än två mjältar, kan ökas volymen av T-cell medier för att maximera återvinning.
19. Håll celler på is tills redo att färgas. Celler bör räknas och lönsamhet nås.
    1. För att räkna celler, kombinera 3 ml celler med 24 ml PBS + 2% och 3 ml 0,4% trypanblått. Fylla på 10 ml av detta i varje kammare av en förbättrad Neubauer hemocytometer. Bärkraft, enligt bedömning av trypanblåttuteslutning är vanligtvis mellan 85-95%.

2. livskraft och ytfärgning

1. Pelletera celler genom centrifugering under 10 min vid 300 xg vid 4 ° C. Resuspendera celler i T-cell-mediet till en koncentration av 1 x 10 ⁷ celler / ml. ÖverfER 2 miljoner celler (100 ml) till en brunn i en U-bottnad 96-brunnars vävnadsodlingsplatta.
2. Centrifugera 96-brunnar för 10 min vid 300 xg vid 4 ° C.
3. Avlägsna supernatanten från varje brunn genom att ställa vätska i brunnar i vasken (cellpelleten förblir i brunnen) och dabbing plattan på en ren pappershandduk. Tvätta cellerna genom att återsuspendera dem i 200 | al PBS följt av centrifugering vid 300 xg under 10 min vid 4 ° C. Utför alla tvättar på detta sätt om inte annat anges.
   Obs: Använd inte PBS + 2%, eftersom det stör fastställbara PI fläcken.
4. Avlägsna supernatanten genom att ställa plattan och tillsätt 100 ml nyberedd kommersiellt fläck (t.ex. fixeras röd död cell fläck) till varje brunn.
   1. Gör fläcken genom att späda det reaktiva färgämnet stamlösningen 1:10 i DMSO följt av en 1:10 utspädning i PBS. Inkubera plattan vid 4 ° C under 30 minuter skyddade från ljus.
5. Centrifugera psent för 10 min vid 300 xg vid 4 ° C. Vid denna punkt framåt, kan utföra allt arbete med plattan med vävnadsodling huva lampan.
6. Avlägsna supernatanten genom att ställa plattan och tillsätt sedan 100 ml Fc blockera lösning. Gör Fc-block lösning genom att späda Fc-block stamlösningen 1: 100 i PBS.
7. Späd antikroppar som skall användas för ytfärgning (t ex anti-CD4 eller anti-CD8) i PBS och tillsätt 100 ml till varje brunn. Inkubera 96-brunnar under 30 min vid 4 ° C i skydd mot ljus.
   Obs: Surface fläck antikroppar bör titreras för optimal prestanda. Typiskt använder en 1: 200 eller 1: 400 spädning, per tillverkarens protokoll.

3. Intracellulär färgning för histon H3

1. Efter inkubation av ytan fläcken, tvätta cellerna två gånger i PBS.
2. Efter den sista tvättningen, tillsätt 100 pl av 4% paraformaldehyd i varje brunn. Inkubera 96-brunnar under 5 min vid RT. Gör 4% paraformaldehyd genom diluting 16% paraformaldehyd i PBS. Gör detta färska.
3. Tvätta cellerna två gånger i PBS.
4. Gör Perm / Blocklösning (stam Perm lösning är PBS + 2% + 0,02% Triton X-100, förvara vid 4 ° C) genom att kombinera 2 ml normalt kaninserum per 100 ml stam Perm lösning. Gör nog för 60 ml / prov.
5. Tillsätt 40 ml Perm / Block till varje provbrunn och blanda väl genom att försiktigt pipettera upp och ned, noga med att inte göra bubblor. Inkubera plattan vid rumstemperatur under 45 min i mörker. Spara resterande Perm / Block för steg 3.6.
6. Späd fluorescerande konjugerad Histon H3K4me1 antikropp i Perm / Block lösning reserveras i steg 3,5 och tillsätt 10 ul av denna utspädning till varje brunn. Blanda genom att försiktigt pipettera upp och ned. Inkubera 96-brunnar i mörker under 1 h vid 4 ° C.
   Obs: Använd en H3K4me1 antikropp konjugerad med hjälp av R-fykoerytrin konjugering kit enligt tillverkarens anvisningar.
7. Tvätta cellerna två gånger i PBS + 2%.
8. Resuspendera cellerna i 200pl PBS + 2% och överföra proverna till FACS rör för flödescytometrianalys. Proverna kan förvaras vid 4 ° C i mörker. För bästa resultat analysera proverna inom två dagar. Ensamma färgade prover kan användas som flödescytometri kontroller för ersättning.

Representative Results

Lymfocyter från en C57B / 6 mus bearbetades till en enda cell suspension enligt protokollet och räknades med en vanlig hemocytometer. Celler såddes i triplikat vid 2 x 10 ⁶ / ml i T-cellmedia i 15 ml koniska rör och lämnas obehandlad, eller stimulerades med 1 mg / ml lösliga anti-CD3-antikroppar (klon 4C11) under 3 h vid 37 ° C i en standardvävnadsodlingsinkubator. Döda celler färgades och sedan cellerna sedan ytbehandlas färgas med FITC-CD8 och APC-CD4-antikroppar enligt protokollet. Histon tillgänglighet analyserades via flödescytometri (Figur 4). I båda naiva ^CD4 + och ^CD8 + T-celler, är den genomsnittliga fluorescensintensiteten (MFI) låg, vilket innebär en kondenserad kromatin tillstånd. Som celler aktiveras med anti-CD3-antikroppar MFI ökar signifikant (p <0,001, Students t-test) som anger att kromatin har dekondenserad.

Figur 1. Teknik för bearbetning av mjältar i en enkelcellsuspension med användning av frostat objektglas. (A) Mjälten pressas mot de frostade ytor hos två objektglas. (B) Bilderna flyttas fram och tillbaka mot varandra släppa lymfocyter i en 100 mm petriskål tills resterna av mjälten är vita. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2. Använda en spruta propp att trycka återstående röda massan genom en 70 mm cell sil. (A) Red massa som återstår efter en mjälte i s bearbetas till en enkelcellsuspension och ledas genom 70 mm cell sil. (B) stopparti av en 3 ml spruta används för att försiktigt trycka återstående röda massan genom cellfilter. (C) Efter användning av sprutan, bör det vara praktiskt taget ingen röd massa kvar i cell sil. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3. ACK lys av röda blodkroppar. (A) Centrifugering av en enkelcellsuspension genereras från en enda mus mjälte före ACK lys. (B) Efter ACK lys av röda blodkroppar, bör cellpelleten vara vit.få = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4. Representativa resultat av protokollet. (A) gating system används för att analysera kromatin status i CD4 ⁺ T-lymfocyter. (B och C) T-celler lämnades obehandlade eller aktiverade med en mg / ml lösliga anti-CD3-antikroppar för 3 h (i triplikat). Cellerna analyserades sedan genom flödescytometri för att bestämma kromatinkondensation i CD4 ^{+ -celler} (B) och ^CD8 + -celler (C). Data är medelvärden ± standardavvikelsen för medelfluorescensintensiteten hos H3K4me1 färgning. * p <0,001 (Students t- test) Klicka here för att se en större version av denna siffra.

Tabell 1:. Felsökning En snabb hänvisning till gemensamma frågor och möjliga lösningar.

Discussion

Vi utvecklade ett protokoll som gör det möjligt att bedöma kromatinkondensation i T-celler. Det bygger på den enkla observationen att Histon H3 antikroppar inte kan komma åt sina epitoper lätt i naiva celler, men vid T-cellsaktivering, samma antikroppar kan binda till sina epitoper. Genom att jämföra MFI i Histone H3 färgning mellan behandlingsgrupperna, kan den relativa graden av kondensation eller decondensation bestämmas. Vi har använt detta protokoll för att bestämma relativ kondens status under tymocyt utveckling och under T-cellsaktivering ^4. Vi har också använt detta protokoll för att undersöka de mekanismer som styr decondensation processen ^5.

Detta protokoll förlitar sig på användningen av en Histon H3 antikropp för att detektera kromatinkondensation status. Eftersom det inte finns någon global förändring i histon modifiering under T-cellsaktivering ^4, kan vi använda en H3K4me1 antikropp för att bedöma kromatinstatus i detta protokoll. Vi har använt antikroppar mot omodifierad Histon H3; emellertid signalen som producerades var mycket svagare övergripande. Enligt vår erfarenhet, antikroppar framtagna mot modifierad Histon H3 fungerar bättre i immunofluorescens och flödescytometri analyser, medan antikroppar mot omodifierad Histon H3 fungera bättre i Western blöt. Det måste noteras att det även är möjligt att använda antikroppar riktade mot andra histonproteiner, även om vi inte har försökt det.

De Perm / Block och Histon H3 steg antikropps är de mest kritiska stegen i protokollet. Mängden Perm / block lösning som används måste optimeras varje gång beståndet Perm lösning gjorts. Detta kan göras genom att jämföra prestanda hos olika spädningar av stamlösning. Ett typiskt experiment involverar jämförelse kromatin status i naiva T-celler som de som aktiveras för 3 h (fig 4). Man bör välja den utspädning som ger den största förändringen i MFI överden tidsperiod analyseras. Förrådslösningen kan spädas i PBS + 2% för att minska Perm / block styrka genom att först återsuspendering av cellerna i så mycket som 100 ml PBS + 2% efter steg 3,4 och sedan tillsätta Perm / block i steg 3,5. Ett liknande pilotförsök bör användas för att testa olika utspädningar av fluorescerande konjugerade Histon H3 antikropp varje gång en ny sats av antikropp är märkt. Dessa steg är särskilt avgörande för framgångsrik detektering av kondenseringsskillnader i början av T-cellsaktivering (t.ex. inom 3 timmar för aktivering). Ibland finns det celler som inte får permeabiliserad och kommer sålunda inte färgas med Histon H3 antikropp. Detta kan inträffa om cellerna inte resuspenderas väl när du lägger Perm / block eller om Perm / Block är inte stark nog. Dessa celler kommer att visas som händelser pressas mot axeln när visualisera ett histogram av Histon H3 färgning. Eftersom dessa händelser kommer att skeva den totala MFI, kan dessa händelser utelämnas från analys av gating den normala fördelningen av Histone H3 positiva celler. Ytterligare stöd kan hittas i handboken Felsökning (tabell 1).

Införandet av en fixable död cell fläcken gör det möjligt att bedöma cellviabilitet i analysen. Detta är helt avgörande när manipulera T-cellsaktivering, eftersom vissa stimuli kan inducera celldöd. I ett sådant fall kan Histon H3 antikropp binda histoner i döda celler annorlunda än levande celler, vilket leder till misstolkning av resultaten.

Detta protokoll är utformad för användning i 96-brunnars plattformat, vilket medger en hög genomströmning analys av kromatin status. En mjälte från en 6-8 veckor gammal kvinnlig mus typiskt ge mellan 60 till 90.000.000 celler använder protokollet. Eftersom färgningsprotokollet kräver 2 miljoner celler per prov, kan ett enkelt analysera multipla behandlingsgrupper och tidspunkter i triplikat med en enda mjälte på ett enda 96-brunnsplatta. Det är möjligt att perform protokollet med färre celler per prov; emellertid, på grund av antalet centrifugeringssteg och den inneboende förlust av celler vid var och en av dessa steg, är det inte tillrådligt att sänka antalet celler genom att mycket. Vi har framgångsrikt genomfört protokollet med 1 miljon celler per prov.

Vi använde detta protokoll för att undersöka kromatin status i CD4 ^{+ T-hjälparceller} och CD8 ⁺ cytotoxiska T-celler. Detta är möjligt eftersom protokollet innehåller standard ytfärgning. Protokollet kan enkelt anpassas för undersökning av kromatin i andra lymfocytsubpopulationer genom användning av antikroppar mot befolkningsspecifika ytmarkörer. Detta protokoll kan också lätt anpassas till andra celltyper så länge som antikroppar som känner igen relevanta ytmarkörer är tillgängliga och lämpliga fixering / permeabilization förhållanden är kända.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm tissue culture dish	BD Biosciences	353003
Precleaned frosted microscope slides	Fisher Scientific	12-550-343
Sterile cell strainer, 70 mm nylon mesh	Fisher Scientific	22363548
3 ml syringe, Luer-Lok tip	BD	309585
Falcon 50 ml polypropylene conical tube	Corning	352098
LIVE/DEAD fixable red dead cell stain kit	Life Technologies	L23102	Life Technologies sells versions of this kit with different colors
Fc Block	BD Biosciences	553142
16% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100
Normal rabbit serum	Sigma-Aldrich	R9133
Anti-H3K4me1 antibody	Abcam	ab8895
R-Phycoerythrin conjugation kit	Abcam	ab102919	Alternatively, the LYNX rapid RPE kit from AbD Serotec can be used