Akış Sitometrinin Kullanımı T Hücrelerinde Kromatin Devleti değerlendirmek için

Summary

Akış sitometri T hücreleri içinde kromatin durumunu değerlendirmek için kullanılabilir. Bu protokol, bilim adamları, floresan Histon H3 antikorların ortalama florasan yoğunluğu (MFI) bir artış gösterdiği, T hücresi aktivasyonu sırasında kromatin yoğunlaşması kanıt yorumlama sağlar

Abstract

Uygun bir immün tepkisi sırasında hareketsiz T hücrelerinin, antijen-spesifik T hücre reseptörü antijen sunma üzerine aktive olmaktadır. Bu antijeni tanıyan bir reseptör taşıyan yalnızca T hücrelerinin klonal bir çoğalmaya neden olur. Kromatin Dekondenzasyon T hücre aktivasyonunun bir özelliğidir ve T hücreleri antijen nişan sonra çoğalmaya yeteneği kazanmak için gereklidir. Kromatin yoğunlaşması bu değişiklik, histon proteinlere karşı antikorlar kullanılarak tespit edilebilir. Bu antikorlar aktive T hücreleri yanı olabildiğince naif T hücrelerinin kendi epitoplara bağlanan olamaz. Biz aynı anda fixable ölü hücre leke T hücre-spesifik yüzey belirteçleri, parça canlılığını leke ve Histone H3 proteinlerinin hücre içi boyama yoluyla kromatin durumunu ölçmek için nasıl açıklar. Boyanmış hücreler akış sitometrisi ile analiz edilir ve kromatin kondensasyonu durumu Histon H3 leke ortalama floresan yoğunluğu (MFI) olarak ölçülür. ChromatT hücresi aktivasyonu sırasında yoğunlaşması olarak MFI bir artış olarak gösterilmiştir

Introduction

Akış sitometri hücre popülasyonlarında birden fazla fiziksel ve floresan parametre analizi için geliştirilmiş bir lazer tabanlı bir teknolojidir. Bu teknoloji ile ilgili veya hücre içindeki sıvı karşılaşma akımında süspanse hücreler olarak bir lazer, heyecan verici bir floresan markör çalışır. Bu işaretler daha sonra tespit edilir ve foto-çoklayıcı tup ile belirlenir ışık yayar. Akış sitometrisi, geleneksel hücre popülasyonları tanımlamak için kullanılmış olsa da, bu, hücre zarı bütünlüğünün, protein-protein etkileşimleri ve protein değiş ^1-3 dahil olmak üzere hücre özelliklerinin bir dizi incelenirken yararlı bir teknoloji olduğu kanıtlanmıştır. Bu teknolojisi, in vitro ^4'te aktive T hücrelerinde kromatin durumunu tespit etmek için kullanılabilir sağlayan bir protokol geliştirilmiştir. Ayrıca T hücrelerinin ⁵ aktivasyonu ile uyarılan kromatin yoğunlaşması mekanizmasını araştırmak için bu protokolü kullanılır.

T hücresi activation ve proliferasyonu uygun bir immün tepkisi için kritik öneme sahiptir. T hücreleri, bağışıklık sistemi içinde lenfositlerin belirli bir alt grubu, uygun bağışıklık tepkilerinin ve immünolojik hafızanın geliştirilmesi için gereklidir. Bir antijen ⁽⁶ gözden) hareketsiz T hücrelerinin hücre dışı yüzeyinde yer alan, T hücre reseptörünün (TCR), başlıca uyumluluk kompleksi içinde mevcut olduğunda Aktivasyon başlatılır. Bu hücre içi Ca2 + konsantrasyonu ^{7 ve (8-10} gözden) aktivasyonu için gerekli transkripsiyon faktörlerinin nükleer translokasyonunun bir artışa sonuçlanan T hücreleri içinde, dinamik ve çok düzenli moleküler olaylar dizisi tetikler. Bir kez, T hücreleri, interlökin-2 (IL-2), JAK (Janus Kinaz) / STAT kullanan güçlü bir büyüme faktörü yanıt yeteneği kazandırmak aktif (sinyal ileticisi ve bir aktivatör) yolu aktive T klonal proliferasyonunu tahrik etmek Hücreler ^11. Kısaca, IL-2 ile uyarılması,STAT proteinleri latent sitosolik transkripsiyon faktörü ailesinin bir fosforilasyon ile sonuçlanır. Fosforile sonra STAT proteinleri dimerize, nükleuslar transloke edilebilir ve hücre döngüsü ilerlemesinde yer de dahil olmak üzere gen ekspresyonunu tahrik. T hücrelerinde, T hücre çoğalması için gerekli olan ^12,13 STAT5 yoluyla, IL-2 sinyaller.

Aktive edilmiş T hücrelerinin klonal genişlemesini sağlamak için, antijen TCR nişan (naif T hücreleri) yaşamamış bu hücrelerin, IL-2 için güçlü etkileri göz ardı etmek için bir mekanizma olmalıdır. Bu kromatin durumunun düzenlenmesi yoluyla elde edilir. Saf T hücreleri, IL-2 bir uyarıya yanıt olarak STAT5 DNA nişan yasaklayan bir yoğunlaştırılmış kromatin sahiptirler. Aktivasyonu üzerine, kromatin decondenses ve STAT5 klonal proliferasyonunu ⁴ izin hedef genlerin promotörleri erişebilir. İlginç bir şekilde, kromatin durumundaki bu değişiklik histon protein, epigenetik modifikasyonu bağımlı değildirns (inceleme için, ¹⁴ bakınız) Ayrıca T-hücresi aktivasyonu sırasında ⁴ histon modifikasyonu hiçbir genel bir değişiklik görüldüğü gibi.

Bu çalışmaları gerçekleştirirken, biz histon proteinlerine karşı yükseltilmiş antikorlar da naif hücrelerde kendi epitopları erişim zorluk olduğunu keşfetti, ama aktivasyon üzerine bu daha kolay kendi epitopları ⁴ bağlamak olabilir. Bu nedenle, histon, antikor kromatin yoğunlaşması durum için bir okuma olarak hizmet vermektedir. Burada yöntem, T hücrelerinin kromatin durumunu değerlendirmek için floresan konjuge Histon H3 antikorları tespit etmek için akış sitometrisi kullanımı sunulmaktadır. Bir hücre popülasyonunda kromatin kondensasyonu Histon H3 boyama ortalama florasan yoğunluğu (MFI) olarak ölçülür. Kromatin dekondenzasyon anlamına T hücresi aktivasyonu, Histone H3 boyama artar MFI, bağlamında. Hücre içi Histon H3 boyama ile kromatin durumunu ölçülmesine ek olarak, bu protokol, aynı zamanda incorporates hücre alt popülasyonlarının analizini izin, boyama ve canlı hücreler için bir fixable leke yüzey.

Protocol

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu önerileri ile tam uyum içinde yürütülmüştür. Hayvan protokolü Furman Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (: A3242-01 İzni numarası) tarafından onaylanmıştır. Kullanılan tamponlar Tamponlar ve Çözümleri Tablo bulunabilir yaparken bu protokolde kullanılan tüm malzemeler ve ekipmanlar, Malzeme ve Ekipmanları Tablo bulunabilir.

Fare dalaklarından Lenfositler 1. Tek Hücre Süspansiyon

1. CO ₂ boğulma yoluyla fareler Kurban. Servikal dislokasyon ile ötenazi onaylayın.
   Not: Aynı cinsiyetten (örneğin / 6 C57B) iki 6-8 haftalık izojenik farelerden alınan dalak kullanın. Tipik olarak, iki dalak işlenir.
2. Bolca% 70 etanol çözeltisi ve baş sola dönük öyle ki şark hayvanları püskürtün.
3. Forseps kullanarak, yukarı ve uzağa t hayvanın derisini kaldırınO beden. Makas kullanarak, hayvanın karın yakın deri yoluyla küçük bir çentik kesti. Parmaklarınızı kullanarak, arka ayakları başından boyundan periton maruz çentik her tarafını çekin. Dalak periton altında doğrudan görünür olmalıdır.
4. Forseps kullanarak, periton kaldırın ve dalak maruz küçük bir kesi yapmak. Forseps ile dalak çıkarın ve herhangi bir yağ ve bağ dokusu uzak kızdırmak için makas kullanın.
5. % 2 fetal sığır serumu ile takviye edilmiş 10 ml PBS içeren 50 ml'lik bir konik tüp içine dalak yerleştirin (bundan sonra PBS + 2% 'si adlandırılır). Tek hücre süspansiyonu başlamak için hazır olana kadar buz üzerinde tüp tutun.
   Not: tipik geri kazanım dalak başına milyon 60-90 arasındaki hücreleri, ve tipik olarak, 2.000.000 hücre numune başına ihtiyaç vardır. Bir doku kültürü kaputu aşağıdaki tüm adımları gerçekleştirir.
6. Steril 100 mm doku kültürü çanak içine dalak süzün.
7. T iki buzlu mikroskop slaytlar elde edilir ve basılı tutuniki kaba buzlu yüzeyler birbirlerine karşı içe bakacak şekilde o slaytlar. PBS +% 2 çözeltisi içinde slaytlar Islak petri tabak içine dökülmüştür.
8. Hala batık kenarları, kızakların buzlu yüzeyleri arasındaki dalak tutun ve birbirlerine (Şekil 1A) karşı ileri ve geri slaytlar hareket ettirerek yavaşça dalak öğütmek. Hücreler Petri kabı içine düşecek. Tüm hücreleri serbest ve dalak kalıntıları (Şekil 1B) beyaz görünür edilene kadar taşlama devam edin.
9. Bir pipet hücre süspansiyonu çizin ve yeni bir steril 50 ml konik tüp içine 70 mikron filtre ile yavaşça filtre. Kırmızı hamurun küçük parçalar filtresi (Şekil 2A) üzerinde mevcut olacağını not edin.
   1. Filtre yükselir, hafifçe gerekli bu süreci tekrarlayarak, sıvı süzülmesini ve 50 ml konik tüp içine geri filtreyi yerleştirin ve devam etmesi için hafifçe yukarı kaldırın. Fazla 5 sple işleme durumundaens, bu iki grup halinde bölmek ve her biri için yeni bir filtre kullanmak gerekli olabilir.
10. 3 ml şırınga durdurucu kısmı kullanılarak yavaşça süzgeç (Şekil 2B) üzerinden kalan hücrelerin içeren kırmızı bir hamuru basın. Tüm kırmızı pulpa filtresi (Şekil 2C) geçti emin olmak için filtre alt ve yanları hem de basın emin olun.
11. Doku kültürü çanak 10 mlof PBS +% 2 ekleyin ve kalan hücrelerin kurtarmak için slaytlar, şırınga tıpa ve çanak yıkamak için kullanabilirsiniz. 50 ml konik tüp içine aynı 70 mikron hücre süzgecinden bu geçirin. Bu adımı Gerektiği kadar tekrarlayın.
12. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de filtre hücre süspansiyonu santrifüj.
13. Yavaşça süzün ve atın süpernatant dikkatli değil pelet rahatsız. PBS +% 2 eser miktarda bir tüp içinde kalır. Tüp Cap ve pelet tamamen yeniden süspanse kadar pelet fiske.
14. Reklama göre Lyse kırmızı kan hücreleriACK Liziz Tamponu Ding 2 mL (0.15 M _NH4CI, 1 mM KHCO _3, 0,1 mM EDTA, 4 ° C 'de 7.2, mağaza pH) konik tüp dalak başına döndürmek ve sağlamak için tüp ters tüm hücrelerin ACK tamponu ile temas durumuna gelir. Yavaşça oda sıcaklığında 1 dakika boyunca girdap tüp.
15. PBS +% 2 ACK tamponu nötralize etmek için tüp ekleyerek 50 ml hücre süspansiyonu hacmi getirin. 4 ° C'de 300 x g'de 5 dakika boyunca tüpü 10 kez ve santrifüj ters çevirin. Santrifüj işlemi tamamlandıktan sonra, pelet, beyaz (Şekil 3) az olmalıdır.
16. Yavaşça süzün ve atın süpernatant dikkatli değil pelet rahatsız. , Tüp içinde PBS +% 2 eser miktarda bırakın tüp kap, ve onu tekrar süspansiyon pelet fiske.
17. T hücre ortamı [% 10 FBS, 10 mM HEPES (pH 7.0), 2 mM Glutamax, 1 mM sodyum piruvat, 1 x temel olmayan amino asitler, 1 x penisilin / streptomisin ve 50 mM β-merkaptoetanol] ve ayrıca 10 ml ekleme nazikçe tarafından pelletiniYukarı ve aşağı pipetleme. Sonra yeni 50 ml konik tüp içine yeni bir 70 mikron filtre ile süspansiyon filtre.
18. Orijinal tüp durulayın ve filtre hücrelerin geri kalanını içeren tüp içine 70 mikron filtre ile bu geçmek için T hücre medya başka bir 5-10 ml kullanın. Ikiden fazla dalak işleme durumunda, T-hücresi ortamı hacmi geri kazanımı maksimize etmek arttırılabilir.
19. Hazır boyanmış olması kadar buz üzerinde hücreleri tutun. Hücreler sayıldı ve canlılığı erişilebilir olmalıdır.
    1. Hücreleri saymak için, 24 PBS +% 2 ilave edildi ve 3 ml 0.4% tripan mavisi ile hücrelerin 3 ml birleştirir. Yük, gelişmiş bir Neubauer hemasitometre Her hazne içine bu 10 mi. Tripan mavisi eksklüzyonu ile değerlendirilen Canlılık,% 85-95 arasında, tipik olarak.

2. Canlılık ve Yüzey Boyama

1. 4 ° C'de 300 x g'de 10 dakika boyunca santrifüjleme ile pellet hücreleri. 1 x 10 ⁷ hücre / ml 'lik bir konsantrasyona kadar, T hücresi ortam içinde tekrar süspansiyon hücreleri. TransfU-altlı 96-gözlü doku kültür plakasının bir oyuğuna er 2.000.000 hücreleri (100 mi).
2. 4 ° C'de 300 x g'de 10 dakika boyunca 96-kuyu plaka santrifüjleyin.
3. Iyi lavabonun içine plaka içindeki sıvıyı iterek her süpernatantı (hücre pelet kuyuda kalır) ve temiz bir kağıt havlu üzerine plakayı dabbing. 200 ul PBS içinde yeniden süspanse bunların hücreleri yıkayın 4 ° C 'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile takip etti. Aksi belirtilmedikçe tüm yıkar bu şekilde gerçekleştirin.
   Not: düzeltilebilir PI leke engel olacak şekilde PBS +% 2 kullanmayınız.
4. Plaka hafifçe vurarak Süpernatantı ve her kuyuya taze hazırlanmış ticari leke (örneğin, düzeltilebilir kırmızı ölü hücre leke) 100 ml ekleyin.
   1. PBS içinde 1:10 seyreltilmiştir DMSO içinde reaktif boya stok çözeltisi 1:10 seyreltilmesiyle leke sağlayın. Işıktan koruyarak 30 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin plaka.
5. P santrifüjGeç 4 ° C'de 300 x g'de 10 dakika süre ile. Ileri Bu noktada, kapalı doku kültürü kaput ışığı ile plaka ile tüm çalışmaları gerçekleştirmek.
6. Plaka hafifçe vurarak Süpernatantı ve sonra Fc blok çözeltisi 100 ml ekleyin. Fc blok stok çözelti 1 seyreltilmesi ile Fc blok çözüm olun: PBS içinde 100.
7. Seyreltik antikorlar, PBS içinde yüzeyi boyama (örneğin, anti-CD4 veya anti-CD8) kullanılmış ve her bir oyuğa 100 ml ilave edilmesi. Işıktan korunan 4 ° C 'de 30 dakika süre ile 96 oyuklu plaka inkübe edin.
   Not: Yüzey leke antikorları en iyi performans için titre edilmelidir. Üreticinin protokolü, 400 seyreltme: 200 ya da 1: Tipik haliyle, bir 1 kullanılır.

Histon H3 3. Hücre içi Boyama

1. Yüzey leke inkübe edildikten sonra, PBS içinde iki kere yıkama hücreleri.
2. Son yıkamadan sonra, her bir göze% 4 paraformaldehit içinde 100 ul ilave edin. Oda sıcaklığında 5 dakika için 96 oyuklu plaka inkübe edin. Olduğu zaman dilüe olabilme tarafından% 4 paraformaldehid olunPBS içinde% 16 paraformaldehit ing. Bu taze olun.
3. PBS içinde iki kere hücreleri yıkayın.
4. Perm / blokaj çözeltisi Yap (stok Perm çözeltisi PBS +% 2 civarında,% 0.02 Triton X-100, mağaza, 4 ° C) 100 ml stok Perm solüsyonu için normal tavşan serumu 2 ml karıştırılarak hazırlanır. 60 ml / numune için yeterli olun.
5. Hafifçe kabarcıklar yapmamaya özen, aşağı yukarı pipetleme iyi de her bir örnek için 40 ml Perm / Blok ekleyin ve karıştırın. Karanlıkta 45 dakika boyunca oda sıcaklığında plaka inkübe edin. Adım 3.6 Perm / Blok kalan kaydedin.
6. Aşama 3.5 ayrılmış Perm / Blok çözeltisi içinde floresan konjuge Histon H3K4me1 antikor seyreltilir ve her oyuğa, bu seyreltme 10 ul ekle. Hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın. 4 ° C'de 1 saat boyunca karanlıkta 96 oyuklu plaka inkübe edin.
   Not: Üreticinin talimatları izleyerek R-Fikoeritrin çekimi kiti kullanılarak konjuge bir H3K4me1 antikor kullanın.
7. Iki kez PBS +% 2 hücreleri yıkayın.
8. 200 hücrelerin yeniden süspansePBS +% 2 ul akış sitometri analizi için FACS tüpler örnekleri aktarın. Numuneler, karanlıkta 4 ° C'de saklanabilir. Optimal sonuçlar için iki gün içinde numuneleri analiz. Tekli boyanan numuneler tazminat kontrol akış sitometrisi olarak kullanılabilir.

Representative Results

Bir C57B / 6 fare lenfositler protokole göre tek bir hücre süspansiyonu içine işlenmiş ve standart bir hemasitometre kullanılarak sayıldı. Hücreler 2 x 10 T-hücresi ^ortamında, 6 / ml 15 ml'lik üç kopya halinde konik tüpler tohumlandı ve tedavi edilmezse, ya da 37 ° C 'de 3 saat boyunca 1 mg / ml çözünür anti-CD3 antikorları (klon 4C11) ile uyarıldı standart bir doku kültürü kuluçka makinesine kondu. Ölü hücreler boyandı ve daha sonra hücreler, daha sonra protokole göre FITC CD8 ve CD4 APC-antikorları kullanılarak boyandı sathı edildi. Histone erişilebilirlik akış sitometri (Şekil 4) ile analiz edilmiştir. Her iki naif ^CD4 + ve CD8 ^{+ T hücreleri,} ortalama floresan yoğunluğu (MFI) bir yoğunlaştırılmış kromatin durumunu gösteren, düşüktür. Hücreler, anti-CD3 ile aktif hale zamanda kromatin yoğunluğu azaltılmış olduğunu göstermektedir (p <0.001, Student t-testi) belirgin bir MFI artar antikorlar.

Buzlu mikroskop slaytlar kullanarak tek bir hücre süspansiyonu içine dalak işlemek için Şekil 1. Tekniği. (A) dalak iki mikroskop slaytlar buzlu yüzeylerde bastırılır. (B) slaytlar dalak kalıntıları beyaz olana kadar 100 mm Petri kabı içine ileri geri birbirlerine serbest lenfositler karşı taşınır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Bir dalak sonra kalan 70 mm'lik hücre süzgecinden kırmızı hamuru kalan basın bir şırınga tıpa kullanılması Şekil 2. (A). Kırmızı hamuru i tek bir hücre süspansiyonu içine işlenir ve 70 mm'lik bir hücre süzgecinden geçirildi s. (B) 3 ml'lik şırınga durdurucu kısmı hafifçe hücre süzgecinden kırmızı hamuru kalan basın için kullanılır. (C) şırınga kullandıktan sonra, neredeyse hücre süzgecinden sol hiçbir kırmızı hamuru olmamalıdır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Kırmızı kan hücrelerinin Şekil 3. ACK lisiz. Lizizi ACK önce tek bir fare dalak oluşturulan tek bir hücre süspansiyonu (A) Santrifüj. (B), kırmızı kan hücrelerinin lize ACK sonra hücre topağı beyaz olmalıdır.= "_ blank" olsun> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil protokolünün 4. Temsilcisi sonuçları. (A) Ayırıcı şeması ^CD4 + T lenfositleri kromatin durumunu analiz etmek için kullanılır. (B ve C) T hücreleri tedavi edilmediği ya da (üç kopya halinde), 3 saat boyunca 1 mg / ml çözünebilir anti-CD3 antikorları ile aktive edildi. Hücreler daha sonra CD4 ^{+ hücreleri} (B) ve ^CD8 + hücreleri (C) kromatin yoğunlaşması belirlemek için akış sitometrisi ile analiz edilmiştir. Veri H3K4me1 boyamanın ortalama floresan yoğunluğu Standart Sapma ± araçlardır. * p <0.001 (Öğrenci t testi) h tıklayınızere bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için.

Tablo 1:. Sorun Giderme Kılavuzu ortak sorunları ve olası çözümleri hızlı bir başvuru.

Discussion

Biz T hücrelerinde kromatin yoğunlaşması değerlendirilmesi için izin veren bir protokol geliştirmiştir. Bu Histon H3 antikorlar saf hücrelerde kolaylıkla kendi epitoplarını erişemez basit bir gözleme dayanır fakat T hücresi aktivasyonu üzerine, bu aynı antikorlar epitoplara bağlanan edebiliyoruz. Tedavi grupları arasında MFI Histon H3 lekelenmesini karşılaştırarak, yoğunlaşma veya yoğunlaşması nispi derecede tespit edilebilir. Biz timosit geliştirme sırasında ve T hücre aktivasyonu ⁴ sırasında göreceli yoğunlaşma durumunu belirlemek için bu protokolü kullanılır. Biz de Dekondenzasyon sürecini ⁵ kontrol mekanizmaları araştırmak için bu protokolü kullanılır.

Bu protokol, kromatin kondensasyonu durumunu tespit etmek için bir histon H3 antikoru kullanımına dayanır. T hücresi aktivasyonu ⁴ boyunca histon modifikasyon hiçbir genel değişiklik olduğundan, kromatin değerlendirmek için H3K4me1 antikor kullanabilmektedirlerBu protokolde durum. Biz değiştirilmemiş histon H3 karşı ortaya antikorlar kullandık; Ancak, üretilen sinyal çok daha zayıf genel oldu. Değiştirilmemiş histon H3 karşı antikorlar Western blot daha iyi çalışırken bizim deneyim, modifiye Histone H3 karşı yükseltilmiş antikorlar, immünofloresan daha iyi çalışması ve sitometri deneyleri akış. Biz bu teşebbüs değil, her ne kadar diğer histon proteinlere karşı antikorların kullanımı mümkün olduğuna dikkat edilmelidir.

Perm / Blok ve Histone H3 antikor adımlar protokolde en kritik adımlar. Kullanılan Perm / Blok çözeltisi miktarı hazır Perm çözeltisi yapılan her optimize edilmesi gerekmektedir. Bu stok çözeltinin farklı yoğunluktaki performansının karşılaştırılması ile yapılabilir. Tipik bir deneyde, 3 saat (Şekil 4) aktive kişilerce naiv T hücrelerinde kromatin durumunu karşılaştırılmasını içerir. Bir aşkın MFI en büyük değişiklik üreten seyreltme seçmelisinizsüre analiz. Stok çözeltisi, birinci aşamada 3,5 Perm / Block ilave o zaman adım 3,4 sonrasında kadar 100 ml olarak PBS +% 2 içinde yeniden süspansiyona tarafından Perm / Blok gücünü azaltmak için PBS +% 2 seyreltilebilir. Benzer bir deney, bir pilot floresan konjuge Histon H3 antikoru, antikorun, bir yeni bir parti etiketli her defasında farklı bir dilüsyonları test etmek için kullanılır. Bu adımlar (aktivasyon 3 saat içerisinde, örneğin) ilk T hücresi aktivasyonunda kondansasyon farklılıkların başarılı bir şekilde saptanması için özellikle kritiktir. Bazen, Histon H3 antikoru ile leke yapmaz dolayısıyla permeabilize olsun ve do not hücreler vardır. Bu Perm / Blok eklerken hücreleri de yeniden süspanse değilse ne ya edebilir Perm / Blok yeterince güçlü değilse. Bu hücreler histon H3 boyanma bir histogram görüntülenmesi sırasında eksene karşı bastırdı olaylar gibi görünecektir. Genel MFI çarpık olacak bu olaylar bu yana, bu olaylar gatin tarafından analiz ihmal edilebilirg histon H3 pozitif hücrelerin normal dağılım. Ek destek Sorun Giderme Kılavuzu (Tablo 1) bulunabilir.

Bir tamir edilebilir ölü hücre leke dahil tahlilinde hücre canlılığının değerlendirmesi için olanak sağlar. Bazı uyaranlara hücre ölümüne neden olabilir, çünkü T hücresi aktivasyonunu manipüle bu derece önemlidir. Böyle bir durumda, histon H3 antikoru sonuçlarının yanlış yorumlanmasına yol canlı hücrelere göre farklı ölü hücreleri histonlar bağlanabilir.

Bu protokol, kromatin durum yüksek bir verim analizine izin, 96 kuyucuklu bir plaka biçiminde kullanım için tasarlanmıştır. 6-8 haftalık dişi fareden bir dalak genellikle protokolü kullanılarak milyon 60-90 arası hücreleri verecektir. Boyama protokolü örnek başına 2.000.000 hücre gerektirdiğinden, kolayca tek bir 96-çukurlu plaka tek bir dalak üç kopya halinde birden fazla tedavi grupları ve zaman noktaları test edilebilir. Bu p mümkündürörnek başına daha az hücreleri ile protokol ERFORM; Bununla birlikte, bağlı santrifüj adımları sayısı ve bu adımların her biri hücrelerin doğal kaybı, çok hücrelerin sayısını azaltmak için tavsiye edilmez. Biz başarıyla numune başına 1.000.000 hücreleri ile protokol tamamladık.

Bu ^CD4 + T yardımcı hücreleri ve CD8 ^{+ sitotoksik} T-hücrelerinde, kromatin durumunu incelemek için bu protokolü kullanılır. Protokol standardı bir yüzey boyama dahildir, bu mümkün olmaktadır. Protokolü kolay popülasyon spesifik yüzey belirteçleri karşı antikorlar kullanılarak, diğer lenfosit alt bölgesindeki kromatin incelenmesi için adapte edilebilir. Bu protokol, aynı zamanda kolayca ilgili yüzey belirteçleri tanıyan antikorlar sürece diğer hücre türleri için kullanılabilir ve uygun sabitleme / permeabilizasyon koşulları bilinmektedir olan uyarlanabilir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm tissue culture dish	BD Biosciences	353003
Precleaned frosted microscope slides	Fisher Scientific	12-550-343
Sterile cell strainer, 70 mm nylon mesh	Fisher Scientific	22363548
3 ml syringe, Luer-Lok tip	BD	309585
Falcon 50 ml polypropylene conical tube	Corning	352098
LIVE/DEAD fixable red dead cell stain kit	Life Technologies	L23102	Life Technologies sells versions of this kit with different colors
Fc Block	BD Biosciences	553142
16% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100
Normal rabbit serum	Sigma-Aldrich	R9133
Anti-H3K4me1 antibody	Abcam	ab8895
R-Phycoerythrin conjugation kit	Abcam	ab102919	Alternatively, the LYNX rapid RPE kit from AbD Serotec can be used