Bruk av flowcytometrisystemer å vurdere tilstanden til Chromatin i T-celler

Summary

Flowcytometri kan anvendes for å vurdere tilstanden til kromatin i T-celler. Denne protokollen tillater forskere å tolke bevis for kromatin decondensation under T-celleaktivering påvist ved en økning i den midlere florescence intensitet (MFI) av fluorescerende Histone H3-antistoffer

Abstract

Under en passende immunrespons, hvilende T-celler blir aktivert ved antigen-presentasjon til deres antigen-spesifikk T-cellereseptoren. Dette fører til klonal proliferasjon av bare de T-celler som bærer en reseptor som gjenkjenner antigenet. Chromatin decondensation er et kjennetegn på T-celleaktivering og er nødvendig for T-celler til å tilegne seg evnen til å spre seg etter antigen engasjement. Denne endringen i kromatin kondensasjon kan påvises ved hjelp av antistoffer dannet mot histonproteinene. Disse antistoffene kan ikke binde seg til sine epitoper i naive T-celler, så vel som de kan i aktiverte T-celler. Vi beskriver hvordan man samtidig flekke T-celle-spesifikke overflatemarkører, spor levedyktighet med et fikses død celle flekken, og måle kromatin status via intracellulære farging av Histone H3 proteiner. Fargede celler blir analysert ved strømningscytometri og kromatin kondensasjon status er målt som den midlere fluorescensintensitet (MFI) av Histone H3 flekken. Chromati decondensation under T-celleaktivering er vist som en økning i MFI

Introduction

Strømningscytometri er et laserbasert teknologi utviklet for analyse av flere fysiske og fluoriserende parametere i cellepopulasjoner. Denne teknologien fungerer som suspenderte celler i en strøm av væske møter en laser, spennende fluorescerende markører på eller inne i cellene. Disse markørene og deretter sende ut lys som blir detektert og kvantifisert ved hjelp av fotomultiplikatorrør. Mens flowcytometri har tradisjonelt blitt brukt for å identifisere populasjoner av celler, har det vist seg å være en nyttig teknologi når man studerer en rekke celle egenskaper inkludert cellemembranintegritet, protein-protein interaksjoner og protein handel ^1-3. Vi har utviklet en protokoll som gjør denne teknologien som skal brukes til å detektere tilstanden av kromatin i T-celler når de blir aktivert in vitro ^4. Vi har også brukt denne protokollen for å undersøke mekanismen for aktivering-indusert kromatin decondensation av T-celler ^5.

T-celle activation og spredning er avgjørende for en riktig immunrespons. T-celler, en spesifikk undergruppe av lymfocytter i immunsystemet, er nødvendig for riktig immunresponser og utvikling av immunologisk hukommelse. Aktivering blir initiert når et antigen blir presentert i sammenheng med de store kompatibilitet komplekset til T-cellereseptoren (TCR) er plassert på den ekstracellulære overflaten av hvilende T-celler (oversikt i ^6). Dette utløser en serie dynamiske og høyt organisert molekylære hendelser innen T-celler som kulminerer i en økning i intracellulær Ca2 + -konsentrasjon ⁷ og den nukleære translokasjonen av transkripsjonsfaktorer som kreves for aktivering (oversikt i ^8-10). Når aktivert, T-celler få muligheten til å svare på interleukin-2 (IL-2), en potent vekstfaktor som utnytter JAK (Janus kinase) / STAT (Signal Svinger og Activator av transkripsjon) veien til å kjøre klonal spredning av aktiverte T celler ^11. I korthet, IL-2-stimuleringresulterer i fosforylering av STAT proteiner, en familie av latent cytosoliske transkripsjonsfaktorer. Når fosforylert, STAT proteiner dimerisere, translocate til kjernen og kjøre uttrykket av gener, inkludert de som er involvert i cellesyklusprogresjon. I T-celler, IL-2 signaler via STAT5, som er nødvendig for T-celleformering ^12,13.

For å oppnå en klonal ekspansjon av aktiverte T-celler, må de celler som ikke har opplevd antigen-TCR inngreps (naive T-celler), har en mekanisme for å ignorere de potente effekter av IL-2. Dette oppnås gjennom regulering av kromatin status. Naive T-celler har en kondensert kromatin som forbyr STAT5-DNA engasjement som svar på IL-2 stimulering. Ved aktivering, kan kromatin decondenses og STAT5 tilgang arrangører av målet gener, tillater klonal spredning ^fire. Interessant, er ikke denne endringen i kromatin status avhengig epigenetisk modifikasjon av histon Proteinkonns (for oversikt, se ¹⁴⁾ som vi observerte ingen global endring i histone modifisering under T-celleaktivering ^fire.

Mens du utfører disse studiene, oppdaget vi at antistoffer dannet mot histonproteiner hadde også problemer med å få tilgang til sine epitoper i naive celler, men som ved aktivering kunne lettere binde sine epitoper ^4. Således antistoffbinding til histoner tjener som en avlesning for kromatin kondensasjon status. Her presenterer vi metoden å bruke flowcytometri å oppdage fluorescently konjugert Histone H3 antistoffer for å vurdere kromatin status i T-celler. Kromatin kondens i en populasjon av celler måles som gjennomsnittlig florescence intensiteten (MFI) av Histone H3 farging. I forbindelse med T-celleaktivering, MFI av Histone H3 flekker øker, betegner decondensation av kromatin. I tillegg til å måle kromatin status via intracellulære Histone H3 flekker, denne protokollen incorpora ogsåoverflaten tes flekker og fikses flekken for levende celler, tillater analyse av subpopulasjoner av celler.

Protocol

Denne studien ble utført i henhold til anbefalingene i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Dyret protokollen ble godkjent av Furman University Institutional Animal Care og bruk Committee (Permit Nummer: A3242-01). Alle materialer og utstyr som brukes i denne protokollen kan finnes i tabell av materialer og utstyr, mens buffere som brukes kan finnes i tabellform Buffere og løsninger.

1. Enkelt Cell Suspensjon av lymfocytter fra Muse Miltene

1. Ofre mus via CO ₂ kvelning. Bekreft dødshjelp ved halshugging.
   Merk: Bruk spleens fra to 6-8 uker gamle isogen mus (f.eks C57B / 6) av samme kjønn. Vanligvis er to milter behandles.
2. Spray dyrene voldsomt med 70% etanol løsning og orientere slik at hodet er mot venstre.
3. Ved hjelp av tang, løfte huden på dyret oppover og vekk fra than kroppen. Ved hjelp av saks, klippe et lite hakk gjennom huden nær magen av dyret. Ved hjelp av fingrene, trekker hver av side av sporet for å eksponere peritoneum fra nakken til begynnelsen av bakbena. Milten skal være synlig direkte under peritoneum.
4. Bruk pinsett, løft bukhule og lage et lite snitt for å avsløre milten. Fjern milten med pinsett og bruke saks for å erte bort noen fettvev og bindevev.
5. Plasser milten til et 50 ml konisk rør inneholdende 10 ml PBS supplert med 2% føtalt bovint serum (heretter referert til som PBS + 2%). Holde røret på is inntil de er klare til å begynne enkeltcelle-suspensjon.
   Merk: Typisk utvinning er mellom 60-90 millioner celler per milt, og vanligvis er 2 millioner celler nødvendig per prøve. Utføre alle de følgende trinnene i en vev kultur hette.
6. Dekanter miltene inn i en steril 100 mm vevskulturskål.
7. Få to frostede objektglass og holder tHan kan skyves slik at de to grove matt overflate vender inn mot hverandre. Fukt lysbildene i PBS + 2% oppløsning helles i petriskål.
8. Hold milten mellom frostede flater av lysbilder, med kantene fortsatt neddykket, og male milten forsiktig ved å flytte lysbildene frem og tilbake mot hverandre (figur 1A). Cellene vil falle ned i petriskål. Fortsett å slipe til alle cellene har blitt sluppet og restene av milten vises hvitt (figur 1B).
9. Tegn opp cellesuspensjonen i en pipette og filtrere det langsomt gjennom et 70 um filter inn i en ny steril 50 ml konisk rør. Legg merke til at små biter av røde masse vil være til stede på filteret (figur 2A).
   1. Hvis filteret stiger opp, forsiktig løfte den litt opp for å la væsken renne gjennom og plassere filteret tilbake i 50 ml konisk rør og fortsette, gjenta denne prosessen etter behov. Hvis behandlingen mer enn fem spleENS, kan det være nødvendig å dele den i to satser, og bruke et nytt filter for hver.
10. Ved hjelp av stoppepartiet av en 3 ml sprøyte forsiktig trykk på den røde masse inneholdende de gjenværende cellene gjennom silen (figur 2B). Sørge for å trykke både filter bunn og sider for å sikre at alle røde masse har passert gjennom filteret (figur 2C).
11. Legg til 10 mlof PBS + 2% til vevskulturskål og bruke dette til å vaske lysbilder, sprøyte stopper, og rett til å utvinne eventuelle gjenværende celler. Passere dette gjennom den samme 70 mikrometer celle sil inn i 50 ml konisk rør. Gjenta dette trinnet etter behov.
12. Sentrifuger filtrerte cellesuspensjonen ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
13. Forsiktig dekanter og kast supernatanten, forsiktig for ikke å forstyrre pelleten. En spormengde av PBS + 2% vil bli igjen i røret. Kork på røret og flick pelleten inntil pelleten fullstendig resuspendert.
14. Lyse røde blodlegemer etter annonseding 2 ml ACK Lysis Buffer (0,15 M _NH4CI, 1 mM KHCO _3, 0,1 mM EDTA, pH 7,2, oppbevar ved 4 ° C) per milt til den koniske røret og rotere og snu røret for å sikre at alle cellene kommer i kontakt med ACK buffer. Virvle røret i 1 min ved RT.
15. Bringe volumet av cellesuspensjon til 50 ml ved tilsetning av PBS + 2% røret for å nøytralisere ACK buffer. Snu røret 10 ganger og sentrifuger i 5 minutter ved 300 xg ved 4 ° C. Etter sentrifugeringen er fullført, bør pelleten være hvit (figur 3).
16. Forsiktig dekanter og kast supernatanten, forsiktig for ikke å forstyrre pelleten. La et spor mengden av PBS + 2% i røret, lue røret, og flick pelleten for å resuspendere den.
17. Tilsett 10 ml av T-celle-medier [10% FBS, 10 mM HEPES (pH 7,0), 2 mM Glutamax, 1 mM natrium pyruvat, 1 x ikke-essensielle aminosyrer, 1 x penicillin / streptomycin og 50 mM β-merkaptoetanol], og ytterligere resuspender pelleten forsiktigpipettering opp og ned. Deretter filtreres suspensjonen gjennom en ny 70 mikrometer filter inn i en ny 50 ml konisk rør.
18. Bruke et 5-10 ml av T-cellemateriale for å skylle det opprinnelige rør og passerer dette gjennom 70 um filter inn i rør inneholdende resten av de filtrerte celler. Ved behandling av mer enn to milter, kan volumet av T-celle-media økes for å maksimere utvinningen.
19. Hold cellene på is inntil klar til å bli farget. Cellene skal telles og levedyktighet nås.
    1. For å telle celler, kombinere 3 ml av celler med 24 ml PBS + 2% og 3 ml av 0,4% trypanblått. Belastning 10 ml av denne inn i hvert kammer i et forbedret Neubauer hemocytometer. Levedyktighet, vurdert ved trypan blå eksklusjon, er typisk mellom 85-95%.

2. Livskraftig og Surface Farging

1. Pellet-celler ved sentrifugering i 10 minutter ved 300 xg ved 4 ° C. Suspender cellene i T-celle-media til en konsentrasjon på 1 x 10 ⁷ celler / ml. Overfeh 2 millioner celler (100 ml) i en brønn i en U-bunnet 96-brønns vevskulturplate.
2. Sentrifuger 96-brønners plate i 10 minutter ved 300 xg ved 4 ° C.
3. Fjern supernatanten fra hver brønn ved å dra væske i brønnen plate i vasken (cellepelleten vil forbli i brønnen), og dabbing platen på et rent papirhåndkle. Vask cellene ved resuspendering dem i 200 ul PBS, etterfulgt av sentrifugering ved 300 xg i 10 min ved 4 ° C. Utføre alle vasker på denne måten, med mindre annet er angitt.
   Merk: Ikke bruk PBS + 2% som det vil forstyrre fikses PI flekken.
4. Fjern supernatanten ved å dra platen og tilsett 100 ml nylaget kommersiell flekken (f.eks fikses rød død celle flekk) til hver brønn.
   1. Gjør flekken ved fortynning av det reaktive fargestoffet stamløsning i DMSO 01:10 etterfulgt av en 1:10 fortynning i PBS. Platen inkuberes ved 4 ° C i 30 minutter beskyttet mot lys.
5. Sentrifuger psen i 10 minutter ved 300 xg ved 4 ° C. På dette tidspunktet, utføre alt arbeid med platen med vevskultur panseret lyset.
6. Fjern supernatanten ved å dra platen og tilsett 100 ml Fc blokk løsning. Foreta Fc blokk løsning ved fortynning Fc blokk stamløsning på 1: 100 i PBS.
7. Fortynn antistoffer som skal anvendes for overflatefarging (for eksempel, anti-CD4 og anti-CD8) i PBS og tilsett 100 ml til hver brønn. Inkuber 96-brønners plate i 30 minutter ved 4 ° C beskyttet mot lys.
   Merk: Overflateflekk antistoffer bør titered for optimal ytelse. Vanligvis bruker en 1: 200 eller 1: 400 fortynning, per produsentens protokoll.

3. Intracellulær Farging for Histone H3

1. Etter inkubering av overflaten flekken, vaskes cellene to ganger i PBS.
2. Etter den siste vaskingen, tilsett 100 ul 4% paraformaldehyd til hver brønn. Inkuber 96-brønns plate i 5 min ved RT. Gjør 4% paraformaldehyde av dilutende 16% paraformaldehyd i PBS. Gjør denne friske.
3. Vask cellene to ganger i PBS.
4. Gjør Perm / blokk-løsning (stock Perm løsningen er PBS + 2% + 0,02% Triton X-100, oppbevar ved 4 ° C) ved å kombinere 2 ml av normalt kaninserum per 100 ml stamoppløsning Perm. Gjør nok for 60 ml / prøven.
5. Legg 40 ml Perm / Block til hver prøve godt og bland godt med forsiktig pipettering opp og ned, tar seg ikke å lage bobler. Platen inkuberes ved romtemperatur i 45 min i mørket. Spar rester Perm / Block for trinn 3.6.
6. Fortynn fluorescens-konjugert Histone H3K4me1 antistoff i Perm / blokk løsning reservert i trinn 3,5 og tilsett 10 ul av denne fortynningen til hver brønn. Bland forsiktig pipettering opp og ned. Inkuber 96-brønns plate i mørket i 1 time ved 4 ° C.
   Merk: Bruk en H3K4me1 antistoff konjugert med R-Phycoerythrin konjugering kit følge produsentens instruksjoner.
7. Vask cellene to ganger i PBS + 2%.
8. Suspender cellene i 200ul PBS + 2% og overføre prøvene til FACS-rør for strømningscytometri-analyse. Prøvene kan bli lagret ved 4 ° C i mørket. For optimale resultater analysere prøvene i løpet av to dager. Enkeltvis fargede prøver kan brukes som flowcytometri kompensasjon kontroller.

Representative Results

Lymfocytter fra en C57B / 6 mus ble behandlet i en enkelt cellesuspensjon i henhold til protokollen og telt ved bruk av en standard hemocytometer. Celler ble sådd ut i triplikat i 2 x 10 ⁶ / ml i T-celle-medier i 15 ml koniske rør og forblir ubehandlet, eller stimulert med 1 mg / ml løselig anti-CD3-antistoff (klon 4C11) i 3 timer ved 37 ° C i en standard vevskulturinkubator. Døde celler ble farget og deretter celler ble så farget med FITC overflate-CD8 og APC-CD4-antistoffer i henhold til protokollen. Histone tilgjengelighet ble analysert via flowcytometri (figur 4). I begge naive CD4 ⁺ og CD8 ⁺ T-celler er gjennomsnittlig fluorescerende intensitet (MFI) lav, som betegner en kondensert kromatin tilstand. Når celler blir aktivert med anti-CD3-antistoffer MFI øker signifikant (p <0,001, Student t-test) som indikerer at kromatin har decondensed.

Figur 1. Teknikk for behandling av miltene inn i en enkeltcellesuspensjon ved bruk av mattslipt objektglass. (A) Milten blir presset mot mattslipt overflatene av to objektglass. (B) Skinnene er flyttet frem og tilbake mot hverandre frigjør lymfocytter i en 100 mm petriskål til restene av milten er hvite. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. Bruk en sprøyte stopperen til å presse gjenværende røde fruktkjøttet gjennom en 70 mm celle sil. (A) Red masse som gjenstår etter en milt jeg s behandlet i en enkelt cellesuspensjon og føres gjennom 70 mm cellefilter. (B) Et stoppepartiet av en 3 ml sprøyte og trykk forsiktig gjenværende røde masse gjennom cellen sil. (C) Etter bruk av sprøyte, bør det være nesten ingen røde masse igjen i celle sil. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3. ACK lysering av røde blodlegemer. (A) Sentrifugering av en enkelt cellesuspensjon som genereres fra en enkelt mus milt før ACK lysis. (B) Når ACK lysering av røde blodlegemer, bør cellepelleten være hvit.få = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4. Representative resultater av protokollen. (A) gating ordningen brukes til å analysere kromatin status i CD4 ⁺ T-lymfocytter. (B og C) T-celler ble etterlatt ubehandlet eller aktivert med 1 mg / ml løselig anti-CD3-antistoffer i 3 timer (in triplo). Cellene ble så analysert ved strømningscytometri for å bestemme kromatin kondensasjon i CD4 ^{+ celler} (B) og ^CD8 + celler (C). Dataene er gjennomsnitt ± standardavvik av den midlere fluorescensintensitet av H3K4me1 farging. * p <0,001 (Students t- test) Vennligst klikk here for å se en større versjon av dette tallet.

Tabell 1:. Problemløsing En rask referanse til vanlige problemer og mulige løsninger.

Discussion

Vi utviklet en protokoll som gjør det mulig for vurdering av kromatin kondens i T-celler. Det er avhengig av den enkle observasjon at Histone H3-antistoff ikke kan få tilgang til sine epitoper lett i naive celler, men ved T-celleaktivering, disse samme antistoffene er i stand til å binde seg til sine epitoper. Ved å sammenligne MFI av Histone H3 flekker mellom behandlingsgruppene, kan den relative graden av kondens eller decondensation bestemmes. Vi har brukt denne protokollen for å bestemme relativ kondens status under thymocytt utvikling og under T-celleaktivering ^fire. Vi har også brukt denne protokollen for å undersøke hvilke mekanismer som styrer decondensation prosessen ^fem.

Denne protokollen er avhengig av bruk av et Histone H3-antistoff for å påvise kromatin kondensasjon status. Siden det er ingen global endring i histone modifisering under T-celleaktivering ^4, er vi i stand til å bruke en H3K4me1 antistoff for å vurdere kromatinstatus i denne protokollen. Vi har brukt antistoffer dannet mot umodifisert Histone H3; Men det signal som frembringes var mye svakere samlet. I vår erfaring, antistoffer dannet mot modifisert Histone H3 fungere bedre i immunfluorescens og flowcytometri analyser, mens antistoffer mot umodifisert Histone H3 fungere bedre i Western blot. Det må bemerkes at det også er mulig å anvende antistoffer dannet mot andre histonproteinene, selv om vi ikke har forsøkt det.

Den Perm / Block og Histone H3 antistoff trinnene er de mest kritiske trinn i protokollen. Mengden av Perm / blokk løsning som brukes må optimaliseres hver gang lager Perm oppløsningen er gjort. Dette kan gjøres ved å sammenligne resultatene av forskjellige fortynninger av stamløsningen. Et typisk forsøk er å sammenligne kromatin status hos naive T-celler til de aktiveres i 3 timer (figur 4). Man bør velge den utvanning som produserer den største endringen i MFI løpettidsrommet analyseres. Stamløsningen kan fortynnes i PBS + 2% for å senke Perm / Block styrke ved først å resuspendere cellene i så mye som 100 ml PBS + 2% etter trinn 3.4, og deretter tilsetning av Perm / Block i trinn 3,5. En tilsvarende pilotforsøk bør brukes til å teste forskjellige fortynninger av det fluorescens-konjugert antistoff Histone H3 hver gang en ny sats av antistoff er merket. Disse trinnene er særlig avgjørende for en vellykket påvisning av kondens forskjeller tidlig i T-celleaktivering (for eksempel innen 3 timer fra aktivering). Av og til er det celler som ikke får permeabilized og dermed vil ikke flekker med Histone H3 antistoff. Dette kan skje hvis cellene ikke resuspendert godt når du legger til Perm / Block eller hvis Perm / Block er ikke sterk nok. Disse cellene vil vises som hendelser presset mot aksen når visualisere et histogram av Histone H3 farging. Siden disse hendelsene vil skew den totale MFI, kan disse hendelsene utelates fra analysen av gating normalfordeling Histone H3 positive celler. Assistanse kan bli funnet i problemløsing (tabell 1).

Inkludering av en festbar død celle flekk tillater vurdering av cellelevedyktighet i analysen. Dette er helt avgjørende ved manipulering av T-celleaktivering fordi visse stimuli kan indusere celledød. I et slikt tilfelle kan Histone H3 antistoffet binder histoner i døde celler annerledes enn levende celler, noe som fører til feiltolking av resultatene.

Denne protokollen er konstruert for bruk i 96-brønners plateformat, som tillater en høy gjennomstrømning analyse av kromatin status. En milt fra en 6-8 ukers gammel kvinnelig mus vil typisk gi mellom 60-90 millioner celler ved hjelp av protokollen. Etter farging protokollen krever 2 millioner celler per prøve, kan man lett analysere multiple behandlingsgrupper og tidspunkter i tre eksemplarer med en enkelt milt på en enkelt 96-brønners plate. Det er mulig å perform protokollen med mindre celler per prøve; imidlertid, på grunn av antallet av sentrifugeringstrinn og den iboende tap av celler i hvert av disse trinn, er det ikke tilrådelig å redusere antall celler ved mye. Vi har fullført protokollen med 1 million celler per prøve.

Vi brukte denne protokollen for å undersøke status kromatin i CD4 ⁺ T-hjelperceller og CD8 ⁺ cytotoksiske T-celler. Dette er gjort mulig ved at protokollen omfatter standard overflatefarging. Protokollen kan lett tilpasses for undersøkelse av kromatin i andre lymfocytsubpopulasjoner ved hjelp antistoffer mot befolkningsspesifikke overflatemarkører. Denne protokollen kan også lett tilpasses til andre celletyper, så lenge antistoffer som gjenkjenner relevante overflatemarkører er tilgjengelige og riktig fiksering / permeabilization betingelser er kjent.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm tissue culture dish	BD Biosciences	353003
Precleaned frosted microscope slides	Fisher Scientific	12-550-343
Sterile cell strainer, 70 mm nylon mesh	Fisher Scientific	22363548
3 ml syringe, Luer-Lok tip	BD	309585
Falcon 50 ml polypropylene conical tube	Corning	352098
LIVE/DEAD fixable red dead cell stain kit	Life Technologies	L23102	Life Technologies sells versions of this kit with different colors
Fc Block	BD Biosciences	553142
16% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100
Normal rabbit serum	Sigma-Aldrich	R9133
Anti-H3K4me1 antibody	Abcam	ab8895
R-Phycoerythrin conjugation kit	Abcam	ab102919	Alternatively, the LYNX rapid RPE kit from AbD Serotec can be used