Introduction
L'échange de nutriments, les gaz et les déchets produits pendant la gestation eutherian est médiée par le placenta. Dans le tractus génital féminin, les artères utérines sont les principaux conduits de sang à l'utérus. Après l'implantation, ces navires spécialisés dans la branche appelé artères spiralées que la bobine à travers les caduque basale vers l'unité foeto-placentaire. Le diamètre et l'élasticité de ces artères spiralées, qui sont entourés par les leucocytes, en particulier des cellules tueuses naturelles utérin (unk), dictent volume et la vitesse de sang disponible pour le placenta 1,2. Les changements hémodynamiques correctes, à la suite de remodelage des artères spiralées sont essentiels pour le succès de la grossesse.
Bien que les mécanismes sous-jacents diffèrent dans le détail entre l'humain et murin grossesse, le résultat final du processus de remodelage chez les deux espèces est dilaté, le système vasculaire de conductance élevée qui perd sa couche de muscle lisse. Chez la souris, UNK interféron dérivé des cellules (SIN-) γ est nécessaire pour induire ces changements à la mi-gestation 3-5. Les souris qui manquent soit des cellules ou des composants de la voie de signalisation de l'IFN-γ NK ne parviennent pas à subir ces changements, ce qui est associé à une réduction de 6,7 de croissance fœtale, soulignant l'importance d'un approvisionnement en sang adéquat pour l'unité foeto-placentaire. Au début de la grossesse humaine, l'invasion interstitielle et endovasculaire des trophoblaste extravilleux et leur interaction avec les cellules UNK sont importants pour induire des changements vasculaires et la promotion de 8-10 de la croissance du fœtus. UNK cellules peuvent orchestrer l'invasion du trophoblaste humain par des chimiokines et de cytokines 11 telles que granulocytes et de macrophages - facteur stimulant les colonies (GM-CSF) 12. L'invasion du trophoblaste faible est associé à remodelage artériel et complications de la grossesse réduits tels que la pré-éclampsie 9.
Ce protocole est basé sur le travail de pionnier de Anne Croy qui a décrit l'importanterôle du système immunitaire et l'IFN-γ particulièrement NK-dérivée pour le remodelage vasculaire succès grâce à l'immunohistochimie et de transfert élégante expériences 5,13. Nous décrivons ici un moyen rapide et économique pour évaluer l'état de remodelage des artères spiralées. Bien que notre laboratoire évalue régulièrement ce à mi-gestation (jour de gestation (gd) 9.5) 14, le processus de remodelage a lieu entre gd8.5 15 et 12,5. L'avènement des scanners de diaporamas automatiques a grandement facilité l'évaluation des zones de vaisseaux et de lumières de sections et nous avons trouvé que cela soit une approche plus reproductible que la mesure de diamètre des vaisseaux. L'addition de la détection immunohistochimique de SMA permet une simple validation des résultats obtenus à partir de l'évaluation stéréologique. Comme avec toutes les techniques stéréologiques, il est recommandé d'effectuer l'évaluation comme une expérience aveuglé par au moins deux examinateurs. À cette fin, une étape de randomisation peut être introduite lorsque couper en sérieTing les échantillons de sorte que les enquêteurs évaluent les diapositives ne savent pas de quel groupe expérimental les échantillons proviennent.
L'objectif global de ce protocole est de fournir un outil fiable d'évaluer soigneusement le remodelage des artères spiralées chez la souris avec les génotypes maternels et paternels définies, dans le contexte de modèles de souris pour des complications liées à la grossesse. Les résultats soulignent la dépendance sur les cellules UNK de ce processus, qui est essentielle pour la croissance normale du fœtus.
Protocol
Toutes les procédures décrites dans ce manuscrit sont conformes à la réglementation UK Home Office et sont approuvés par le comité d'examen éthique Cambridge.
1. Prélèvement
- Mettre en place des accouplements chronométrés en utilisant 8-12 souris C57BL / 6 souris femelles avec des mâles adultes (jusqu'à 2 femelles par mâle) dans l'après-midi. Vérifier la présence de bouchons vaginaux comme un signe de la copulation tôt le matin les jours suivants. La présence d'un bouchon dans les marques du matin gd0.5.
- Sur gd9.5, euthanasier l'animal par dislocation cervicale et ouvrir la cavité abdominale. Notez que l'euthanasie par le CO 2 peut provoquer une vasodilatation.
- Utilisation de la soie dentaire doucement pour ligaturer les artères utérines (de la figure 1, des flèches en pointillés). Attachez le fil autour des artères à l'extrémité de chaque corne utérine, proximale aux ovaires, ainsi que dans le col de l'utérus.
Note: Ne pas rompre les vaisseaux que cela peut entraîner dans les artères effondrés. <li> Disséquer l'utérus rapidement à l'aide des ciseaux de dissection, exciser toute utérus distale pour les trois points de ligature à la pointe des cornes utérines et col de l'utérus. - Placer l'utérus sur une feuille de polystyrène préparés sorte que les deux cornes sont alignées le long du même axe longitudinal dans des directions opposées à partir du col. Étirer doucement et l'épingler en place en utilisant 2-3 25 g d'aiguilles.
- Immerger le polystyrène dans un tube conique de 50 ml préparée. Compléter à 50 ml avec 10% de formol. Correction pour les 5-6 heures à la température ambiante.
- Jeter la solution de formol et de le remplacer par 50 ml 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pendant 5 min.
- Exciser les deux cornes utérines proximale au point à chaque extrémité de ligature et proximale du col dans le centre, rogner l'excédent de gras autour des sites d'implantation et laver deux fois dans du PBS pendant 5 min pour éliminer les traces de formol.
- Conserver les échantillons à 70% d'éthanol à 4 ° C (jusqu'à deux semaines) jusqu'à leur traitement.
ATTENTION: Ethanol est hautement inflammable. - Utiliser un système de traitement automatisé en utilisant les paramètres indiqués dans le tableau 1. Incorporer les cornes individuellement dans de la paraffine de sorte qu'elles peuvent être coupées le long du plan perpendiculaire à l'axe long de l'utérus. Cela garantit que la surface maximale de chaque site d'implantation sera exposé à analyser dans le milieu du bloc (figure 2A).
OPTION: Ceci est un point de moment opportun pour la randomisation des blocs, si désiré. - L'utilisation d'un microtome, couper des sections de série de 7 um d'épaisseur à partir des blocs. Colorer une section à chaque intervalle de 49 um avec hématoxyline et l'éosine (H & E, voir section 2.1). Stocker les sections restantes à la température ambiante pendant SMA coloration et d'autres applications en aval.
| Solution | Temps | Température |
| 70% d'éthanol | 1 h | 40 ° C |
| 100% Ethanol | 1 h | 40 ° C |
| 100% Ethanol | 1 h | 40 ° C |
| 100% Ethanol | 1 h | 40 ° C |
| 100% Ethanol | 1 h | 40 ° C |
| 100% Ethanol | 1 h | 40 ° C |
| 100% Ethanol | 1 h | 40 ° C |
| 1 h | 40 ° C | |
| Xylène | 1 h | 40 ° C |
| Xylène | 1 h | 40 ° C |
| Paraffine | 1 h | 63 ° C |
| Paraffine | 1 h | 63 ° C |
| Paraffine | 1 h | 63 ° C |
| Paraffine | 1 h | 63 ° C |
Tableau 1:. Réglages pour le traitement des tissus automatisé Aperçu du réglage utilisé pour le traitement de tissu utérin
2. SterÉvaluation eological
- Coloration H & E
- Déparaffiner sections par immersion de lames montées dans un porte-diapositive dans un bain de xylène à 100% pendant 10 min à température ambiante.
ATTENTION: Le xylène est inflammable et soupçonné d'être cancérigène qui est toxique par contact et inhalation. Ce travail doit être effectué dans une hotte, en utilisant un équipement de protection individuelle (EPI). - Immerger les lames dans un bain contenant xylène propre pour encore 10 min.
- Immerger séquentiellement diapositives dans des bains contenant 100% d'éthanol, 95% d'éthanol, 70% d'éthanol et de l'eau purifiée pendant 5 minutes chacun.
- Immerger les lames dans 50% Gill Aucune solution à 3 hématoxyline, dilué avec de l'eau purifiée, pendant 5 min.
ATTENTION: Hematoxylin est nocif par ingestion et par contact pour les yeux. Porter des EPI appropriés lors de la manipulation. - Laver les lames dans une cuve de coloration sous l'eau du robinet pendant 10 min.
- Immerger les lames dans une solution acide% / alcool (10% 1 M d'acide chlorhydrique dans l'éthanol 70%) pendant 10 set laver dans une cuve de coloration sous l'eau du robinet.
- Plonger les lames dans une solution de l'éosine pendant 30 secondes et se laver dans une cuve de coloration sous l'eau du robinet pendant 10 min.
- Dans une hotte, immerger séquentiellement diapositives dans des bains contenant 70% d'éthanol, 95% d'éthanol et 100% d'éthanol pendant 5 minutes chacun.
- Immerger les lames dans un bain contenant du xylène pendant 10 min.
- Mont lamelles de l'aide d'un milieu de montage à base de xylène. Sécher complètement horizontalement et dans une hotte de laboratoire avant de visualiser les lames au microscope.
- Déparaffiner sections par immersion de lames montées dans un porte-diapositive dans un bain de xylène à 100% pendant 10 min à température ambiante.
- Évaluation stéréologique la taille du navire et le remodelage Statut
- Pour chaque site d'implantation, déterminer les sections sont près du point sagittal médian. L'attachement chorioallantoïque entre le foetus et le développement du placenta sert comme un bon indicateur du point sagittal médian.
- Sélectionnez 3 sections à 49 um intervalles rapprochés au point sagittal médian pour l'analyse. Numériser des diapositives sélectionnées. Afin d'éviter incveines Luding, qui ont été montrés pour être plus située à la périphérie dans les sites d'implantation 16, restreignent l'analyse sur la centrale 2/4 de chaque site d'implantation (figure 2A).
- Pour évaluer la taille lumière, dessiner autour de l'intérieur des vaisseaux et enregistrer la zone de cette forme. Pour la taille totale de la cuve, dessiner autour de la paroi extérieure de la cuve, y compris les cellules endothéliales, les péricytes et les leucocytes intra-muros.
Remarque: Le rapport de la taille navires total de lumière est un proxy pour le statut de remodelage d'un navire. Comme les vaisseaux bobine à travers le plan que la section a été coupée le long, il peut y avoir plusieurs sections transversales de la même artère dans une diapositive. Éviter de mesurer la même artère plusieurs fois. - Inscrire les mesures des 5 navires dans chaque site d'implantation avec les plus grands et les plus ronds lumens. Mesurer chaque site d'implantation en triple (trois sections espacées de 49 pm les unes des autres). La moyenne de ces 15 mesures represeNTS le diamètre moyen des plus grands navires.
- Pour éviter la surreprésentation des grands navires dans certains échantillons, mesurer le même nombre de navires dans chaque site d'implantation.
3. Évaluation qualitative par immunohistochimie
- Déparaffinage et la réhydratation
- Déparaffiner sections en immergeant diapositives montées dans un rack résistant à la chaleur de glisser dans un bain de xylène à 100% pendant 10 min à température ambiante.
- Immerger les lames dans un bain contenant xylène propre pour encore 10 min.
- Immerger séquentiellement diapositives dans des bains contenant 100% d'éthanol, 95% d'éthanol et 70% et de l'eau purifiée pendant 5 minutes chacun.
- Antigène Retrieval
- Préparer un tampon de citrate de sodium 10 mM dans de l'eau purifiée et ajuster le pH à 6 avec de l'acide chlorhydrique 10 M.
- Remplissez un récipient résistant à la chaleur qui peut contenir 600 ml avec 400 ml de sodium citrate et placer dans un autocuiseur domestique contenant wat suffisanteer à immerger moitié du récipient. Attachez sans serrer le couvercle de la cocotte et chauffer jusqu'à ébullition.
- Lieu glisser la grille dans la mémoire tampon de citrate de sodium et bien fixer le couvercle de la cocotte-minute. Une fois sous pression, laisser bouillir pendant 3 min.
- Dépressuriser l'autocuiseur et retirer le récipient interne. Laisser refroidir lames dans le tampon de citrate de sodium pendant 10 min à température ambiante.
- Laver les lames dans un bain contenant de l'eau purifiée pendant 5 min.
- Encercler les sections à l'aide d'un stylo à barrière hydrophobe.
- Laver les lames en immergeant dans du PBS pendant 5 min.
- Blocage endogène peroxydase et la liaison non spécifique
- Incuber les coupes avec 3% de peroxyde d'hydrogène dilué dans de l'eau purifiée dans une chambre humidifiée pendant 30 minutes à température ambiante.
ATTENTION: Le peroxyde d'hydrogène est très irritant pour les yeux, la peau et par ingestion. Porter des EPI appropriés. - Tapoter solution de peroxyde d'hydrogène en excès et laver slides deux fois par immersion dans une solution saline tamponnée au Tris (TBS) pendant 2 min chacun.
- Incuber les coupes avec des immunoglobulines de souris réactif de blocage de la souris sur la souris kit préparé selon les instructions du fabricant.
- Laver les lames deux fois dans TBS pendant 2 min chacun.
- Incuber les coupes avec 3% de peroxyde d'hydrogène dilué dans de l'eau purifiée dans une chambre humidifiée pendant 30 minutes à température ambiante.
- Immunodétection de Smooth Muscle Actin
- Préparer la solution de dilution d'anticorps (fourni dans le kit) et incuber avec les sections pendant 5 minutes à la température ambiante, ou selon les instructions du fabricant.
- Diluer 1: lisse 100 souris anti-humain actine musculaire (DAKO M0851) dans une solution d'anticorps de diluant. Diluer souris d'isotype IgG2a contrôle solution dans un diluant d'anticorps, en veillant à ce que la concentration finale d'immunoglobuline est équivalente dans les deux solutions.
- Tapoter sections excès de solution d'anticorps de diluant et couvrir avec soit des solutions de contrôle d'anticorps ou isotype dilué. Incuber dans une chambre humidifiée pendant 30 minutes à température ambiante.
- Laver les lames à deux reprises dans le SCT pour2 min chacun.
- Diluer l'anticorps secondaire anti-souris biotinylé et incuber les sections pendant 10 minutes à température ambiante, ou selon les instructions du fabricant.
- Laver les lames une fois par le SCT et PBS pendant 2 min, respectivement.
- Préparer 3,3'-diaminobenzidine (DAB) solution selon les instructions du fabricant. Couvrir sections avec une solution DAB et laisser incuber jusqu'à 4 min, assurant de suivre sections pour éviter le développement de la couleur en excès.
ATTENTION: DAB est inflammable et soupçonné d'être cancérigène qui est toxique par contact et inhalation. Porter des EPI appropriés lors de la manipulation. - Immerger les lames dans de l'eau purifiée fois l'intensité de la coloration désirée est atteinte.
- Counterstain avec 50% Gill N ° 3 hématoxyline pendant 20 secondes et se laver dans une cuve de coloration sous l'eau du robinet jusqu'à ce l'eau soit claire.
- Déshydratation et montage
- Dans une hotte, immerger séquentiellement diapositives dans des bains contenant 70% ethanol, éthanol à 95% et 100% d'éthanol pendant 5 minutes chacun.
- Immerger les lames dans un bain contenant du xylène pendant 10 min.
- Mont lamelles de l'aide d'un milieu de montage à base de xylène. Sécher complètement horizontalement et dans une hotte de laboratoire avant de visualiser les lames au microscope
Representative Results
Rag2 - / - IL2RG - / - souris manquent tous les lymphocytes matures, y compris les cellules NK 17, et leurs artères utérines ne parviennent pas à subir les changements vasculaires observés dans congénique type sauvage C57BL / 6 (WT) les souris autour de la mi-gestation 5,14. A la suite de cette réduction de remodelage Rag2 - / - IL2RG - / - souris montrent nettement plus petites zones de surface luminale des vaisseaux, indiquant globalement plus petites qui peuvent être visualisés sur des coupes H & E-colorées et quantifiées stereologically (figure 2). En outre, l'épaisseur de paroi relative (taux de vaisseau à lumière) est plus élevé dans les artères spiralées chez ces souris, ce qui suggère réduit approvisionnement en sang et la vitesse du sang ultérieure.
Cette évaluation quantitative a été confirmée en utilisant la détection immunohistochimique de SMA. Il est caractéristique pour les souris WT le plus à perdre de la SMA dans les médias vasculairedes artères spiralées par mi-gestation. Si ce processus conduit de cellules NK-n'a pas lieu, SMA reste dans les médias des vaisseaux et peut être facilement détectée par immunohistochimie comme des anneaux autour des vaisseaux sanguins (Figure 3).
Figure 1: l'utérus de la souris au gd9.5, aperçu schématique Dessin montrant les positions relatives des cornes utérines, col (bleu) et les principales artères utérines (rouge).. Indiquées sont l'axe long des cornes utérines (flèches) et les points de ligature (flèches pointillées). Les sections pour l'immunohistochimie sont coupés le long du plan de vue.
Figure 2:. Évaluation stéréologique de remodelage artériel à mi-gestation (A) Exemple assessment luminale et les superficies totales des navires sur les sections H & E colorées des femelles WT dans le centre de 2/4 des caduque basale (délimitée par la noire verticale lignes pointillées) au gd9.5. Dans les navires à plus fort grossissement, la ligne pointillée rouge délimite la zone de navires total, jaune pointillés délimite la zone de lumière. Bar = 500 um (à gauche), 50 pm (à droite). Le grand axe de l'utérus est une ligne horizontale dans cette orientation. (B) Quantification des zones luminal (panneau de gauche) et le ratio de la zone luminale à la superficie totale de la cuve (panneau de droite) de WT (C57BL / 6) et Rag2 - / - IL2RG - / - la souris (sur des souris C57BL / 6 de fond). Chaque point de données représente la moyenne de 15 mesures (5 mesures par section, 3 sections par site d'implantation). Bars représentent la moyenne de n = 11-13 sites d'implantation de 4 grossesses par groupe; p-valeur à partir d'un, non apparié test de Mann-Whitney bilatéral. WT: type sauvage.
Figure 3:. La détection immunohistochimique de l'actine musculaire lisse dans les caduque basale Représentant SMA coloration sur WT (en haut) et Rag2 - / - IL2RG - / - souris (sur C57BL / 6 fond, bas) à gd9.5. Bar = 100 um. WT: type sauvage.
Discussion
Le protocole présenté ici est conçu pour fournir un procédé reproductible permettant d'évaluer les changements vasculaires qui sont nécessaires pour grossesse réussie. Critique pour le succès de l'évaluation est la qualité des coupes de tissu. Tant déterminer avec précision l'âge gestationnel des sites d'implantation ainsi que la ligature de manière fiable les artères utérines sont des étapes cruciales. Les modifications des paramètres tels que le temps de la fixation, le protocole de traitement du tissu, etc., peuvent aussi influer sur le résultat. Pour une évaluation objective stéréologique, il est important de mesurer le même nombre de vaisseaux dans chaque site d'implantation. Il est recommandé de mesurer 5 navires par site d'implantation et chaque site d'implantation en trois exemplaires. La moyenne de ces 15 mesures représente la taille moyenne des 5 plus grands navires.
En outre les données de Rag2 alymphoïde - / - IL2RG - / - souris présentés ici, nous avons trouvé cette protocol utile pour un certain nombre de modèles de la fonction immunitaire maternelle inadéquate, y compris l'une des cellules NK inhibés 14. Des défauts dans le remodelage artériel ont également été montré dans des modèles de facultés affaiblies l'invasion du trophoblaste 18 et les techniques décrites ici peuvent être utiles pour évaluer la vascularisation dans ces cas. Nous avons optimisé et validé ce protocole pour l'enquête sur le remodelage vasculaire décidual à mi-gestation chez la souris, mais il est également envisageable d'adapter ce protocole à travailler dans d'autres systèmes modèles (par exemple des rats) ou même dans d'autres organes. Alors que nous constatons que le remodelage NK-dépendante peut être solidement évalué à gd9.5, il peut être modifié pour d'autres points dans le temps tels que gd12.5, lorsque le système vasculaire maternelle est complètement remodelé. A ce point de temps, l'invasion du trophoblaste endovasculaire est plus profond 16 et ce point de temps peut être plus approprié pour les enquêtes sur le rôle de trophoblaste des changements vasculaires. Si les lectures quantitatives supplémentaires sont souhaités,les enquêteurs peuvent également augmenter le nombre de sections colorées pour SMA et d'évaluer le pourcentage de navires partiellement rénovées au sein de chaque site d'implantation.
Une limitation de ce protocole est la nature descriptive des examens histologiques. Des dosages fonctionnels, cependant, ne sont plus en lentement disponible (tel que l'échographie Doppler 19). Ces techniques nécessitent une expertise technique et des dépenses beaucoup plus élevées pour l'acquisition et l'entretien du matériel, mais ont l'avantage de fournir une lecture longitudinale in vivo de l'effet des changements qui peuvent être observées histologiquement. Un inconvénient possible de tous les examens stéréologiques est la subjectivité des enquêteurs. À cette fin, en utilisant deux examinateurs indépendants qui analysent tous les échantillons indépendamment peut aider à éviter ce problème. Alors que le protocole décrit ici donne un aperçu de la façon dont beaucoup de sang peut atteindre l'interface foeto-maternelle, il peut être avantageux de combiner avec le complementary approche de l'évaluation de la quantité totale de sang à un moment donné dans le système vasculaire à travers le plastique jette 16.
La force de ce protocole est qu'il combine deux approches indépendantes. Changement vasculaire est d'abord évaluée quantitativement par stéréologie et le résultat est ensuite validée qualitativement par immunohistochimie. La fiabilité des résultats peut être encore renforcée par randomisation des échantillons. Les échantillons préparés pour ce protocole peuvent facilement être utilisés pour étudier aussi d'autres paramètres de la grossesse tels que décidualisation, le développement de l'agrégat lymphoïde mesometrial de la grossesse (MLAP) ou immunodétection de cellules d'intérêt, à évaluer rigoureusement un phénotype de grossesse au milieu de la gestation.
Remodelage artériel est une étape cruciale pour les grossesses sans complications chez les femmes et l'échec de ces changements sous-tend les grands syndromes obstétricales (GOS), à savoir la pré-éclampsie, retard de croissance fœtale etmortinaissance. Nous présentons ici des techniques pour évaluer soigneusement un phénotype de grossesse dans des modèles de souris qui imitent certaines caractéristiques de la physiopathologie du SMO.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice (8-12 weeks old) | Charles River | ||
| Dental floss | |||
| Polystyrene | Used for holding tissue in place | ||
| Straight dissection scissors | EMS | 72940 | |
| 25 G needles | BD | 300600 | Used for holding tissue in place |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128-4L | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | P3813-10PAK | |
| Ethanol | Sigma | 32221-2.5L | |
| Paraffin | Sigma | 327204-1KG | |
| Xylene | Fisher Scientific | X/0250/17 | |
| Automated tissue processor | Sakura | 6032 | |
| Microtome | Leica | RM2245 | |
| Slide rack | Sigma | Z710989 | |
| Coplin jar | Sigma | S5891 | |
| Purified water | |||
| Hematoxylin solution, Gill No. 3 | Sigma | GHS332-1L | |
| Eosin Y solution | Sigma | HT110116-500ML | |
| Fume hood | |||
| Xylene-based mounting media | VWR | 361254D | |
| Slide scanner | Hamamatsu | NanoZoomer | |
| Slide scanner software | Hamamatsu | NDP viewer | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma | 32320 | Make 10 mM solution and adjust pH to 6 |
| Pressure cooker | Used for antigen retrieval | ||
| Heating plate | Used for antigen retrieval | ||
| Hydrophobic barrier pen | Vector | H-4000 | |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H/1800/15 | |
| Tris buffered saline | Sigma | T6664-10PAK | |
| Mouse on mouse kit | Vector | BMK-2202 | Significantly reduces background |
| Mouse anti-human smooth muscle actin | DAKO | M0851 | Cross-reacts with mouse |
| IgG2a isotype control | DAKO | X0943 | |
| Humidified chamber | Sigma | H6644 | |
| 3,3’-Diaminobenzidine solution | Sigma | D4293-5SET | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | H/1050/PB17 |
References
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