Introduction
El intercambio de nutrientes, gases y productos de desecho durante la gestación eutherian está mediada por la placenta. En el tracto reproductor femenino, las arterias uterinas son los principales conductos de sangre al útero. Después de la implantación, éstas se ramifican en vasos especializadas llamadas arterias espirales que se enroscan a través de los decidua basal hacia la unidad fetoplacentaria. Diámetro y la elasticidad de estas arterias espirales, que están rodeados por los leucocitos, en particular células natural killer uterina (unk), dictan volumen y la velocidad de la sangre a disposición de la placenta 1,2. Alteraciones hemodinámicas correctas como resultado de la remodelación de las arterias espirales son críticos para el éxito del embarazo.
Si bien los mecanismos subyacentes difieren en detalle entre el ser humano y el embarazo murino, el resultado final del proceso de remodelación en ambas especies se dilata, de alta conductancia de la vasculatura que pierde su capa de músculo liso. En ratones, UNK interferón derivado de células (SIN-) γ es necesaria para inducir estos cambios en torno a mediados de la gestación 3-5. Los ratones que carecen de cualquiera de las células NK o componentes de la vía de señalización de IFN-γ dejar de someterse a estos cambios y esto se asocia con una reducción de 6,7 el crecimiento fetal, haciendo hincapié en la importancia de un adecuado suministro de sangre a la unidad fetoplacentaria. Durante el embarazo humano temprano, la invasión intersticial y endovascular de trofoblasto extravelloso y su interacción con las células unk son importantes para la inducción de cambios vasculares y promover el crecimiento fetal 8-10. células unk pueden orquestar la invasión del trofoblasto humano a través de quimiocinas y citocinas 11 tales como granulocitos y macrófagos - factor estimulante de colonias (GM-CSF) 12. Invasión trofoblasto superficial se asocia con la remodelación arterial y complicaciones del embarazo reducidas tales como la preeclampsia 9.
Este protocolo se basa en el trabajo pionero de Anne Croy quien describió el importantepapel del sistema inmune y en particular derivados de IFN-γ NK para la remodelación vascular a través de inmunohistoquímica éxito y transferencia elegante experimentos 5,13. Aquí se describe un modo rápido y económico para evaluar el estado remodelación de arterias espirales. Aunque nuestro laboratorio evalúa rutinariamente esto en mitad de la gestación (días de gestación (gd) 9.5) 14, el proceso de remodelación tiene lugar entre gd8.5 y 12.5 15. La llegada de los escáneres de diapositivas automáticas ha facilitado en gran medida la evaluación de las áreas de los vasos y de lumen de secciones y descubrimos que se trata de un enfoque más reproducible que la medición de diámetros de los vasos. La adición de detección inmunohistoquímica de SMA permite una sencilla validación de los resultados obtenidos de la evaluación estereológicos. Al igual que con todas las técnicas estereológicos, se recomienda llevar a cabo la evaluación como un experimento ciego por al menos dos examinadores. Con este fin, un paso aleatorización puede ser introducido cuando se corta en serieting las muestras para que los investigadores que evalúan las diapositivas no saben de qué grupo experimental las muestras provienen.
El objetivo general de este protocolo es proporcionar una herramienta fiable para evaluar cuidadosamente la remodelación de las arterias espirales en ratones con genotipos maternos y paternos definidos, en el contexto de modelos de ratón de complicaciones relacionadas con el embarazo. Los resultados subrayan la dependencia de las células UNK de este proceso, que es esencial para el crecimiento normal del feto.
Protocol
Todos los procedimientos analizados en este manuscrito están en conformidad con las regulaciones del Ministerio del Interior del Reino Unido y son aprobados por el Panel de Revisión Ética de Cambridge.
1. Recolección de Muestras
- Establecer apareamientos programados utilizando 8-12 semanas de edad Hembra C57BL / 6 ratones machos adultos (hasta 2 hembras por macho) en la tarde. Verificar la presencia de tapones vaginales como un signo de la cópula temprano en la mañana en los siguientes días. La presencia de un tapón en el gd0.5 marcas mañana.
- En gd9.5, la eutanasia a los animales por dislocación cervical y abrir la cavidad abdominal. Tenga en cuenta que la eutanasia por el CO 2 puede causar vasodilatación.
- Use hilo dental para ligar suavemente las arterias uterinas (Figura 1, flechas discontinuas). Atar el hilo alrededor de las arterias en la punta de cada cuerno uterino, proximal a los ovarios, así como alrededor del cuello uterino.
Nota: No romper los vasos ya que esto puede resultar en arterias colapsadas. <li> diseccionar el útero rápidamente usando tijeras de disección, la escisión de todo el útero distalmente a los tres puntos de ligadura en la punta de los cuernos uterinos y el cuello uterino. - Coloque el útero en un trozo de poliestireno preparan de modo que ambos cuernos están alineados a lo largo del mismo eje largo en direcciones opuestas desde el cuello uterino. Suavemente estire y el pin en su lugar con 2-3 25 G agujas.
- Sumergir el poliestireno en un tubo cónico de 50 ml preparado. Arriba hasta 50 ml con 10% de formalina. Arreglo para 6.5 horas a temperatura ambiente.
- Deseche la solución de formalina y reemplazar con 50 ml 1x tampón fosfato salino (PBS) durante 5 min.
- Extirpar los dos cuernos uterinos proximal al punto de ligadura en cada extremo y proximal al cuello uterino en el centro, recortar cualquier exceso de grasa alrededor de los lugares de implantación y lavar dos veces en PBS durante 5 minutos para eliminar los restos de formol.
- Almacene las muestras en etanol al 70% a los 4 ° C (hasta dos semanas) hasta su procesamiento.
PRECAUCIÓN: Ethanol es altamente inflamable. - Utilice un sistema de procesamiento automatizado utilizando los parámetros indicados en la Tabla 1. Insertar los cuernos individualmente en parafina de modo que puedan ser cortados a lo largo del plano perpendicular al eje largo del útero. Esto asegura que el área máxima de cada sitio de implantación será expuesta para el análisis en el medio del bloque (Figura 2A).
OPCIONAL: Este es un punto de tiempo conveniente para la aleatorización de los bloques si se desea. - El uso de un microtomo, cortar secciones de serie de 7 micras de espesor de los bloques. Mancha de una sección a cada intervalo de 49 m con hematoxilina y eosina (H & E, ver sección 2.1). Almacenar las secciones restantes a temperatura ambiente para la tinción de SMA y otras aplicaciones posteriores.
| Solución | Hora | La temperatura |
| 70% Etanol | 1 hr | 40 ° C |
| 100% Etanol | 1 hr | 40 ° C |
| 100% Etanol | 1 hr | 40 ° C |
| 100% Etanol | 1 hr | 40 ° C |
| 100% Etanol | 1 hr | 40 ° C |
| 100% Etanol | 1 hr | 40 ° C |
| 100% Etanol | 1 hr | 40 ° C |
| 1 hr | 40 ° C | |
| Xileno | 1 hr | 40 ° C |
| Xileno | 1 hr | 40 ° C |
| Parafina | 1 hr | 63 ° C |
| Parafina | 1 hr | 63 ° C |
| Parafina | 1 hr | 63 ° C |
| Parafina | 1 hr | 63 ° C |
Tabla 1:. Ajustes para el procesamiento automatizado de tejido Visión general de la configuración utilizada para el procesamiento de tejido uterino
2. SterEvaluación eological
- H & E tinción
- Desparafinar secciones por inmersión de diapositivas montadas en un bastidor de deslizamiento en un baño de xileno 100% durante 10 min a temperatura ambiente.
PRECAUCIÓN: El xileno es inflamable y un carcinógeno que es tóxico a través del contacto y la inhalación. Este trabajo debe llevarse a cabo en una campana de extracción, el uso de equipos de protección personal (EPP). - Sumergir los portaobjetos en el baño que contienen xileno limpio durante otros 10 min.
- Secuencialmente sumergir los portaobjetos en baños que contienen etanol al 100%, etanol al 95%, etanol al 70% y agua purificada durante 5 min cada uno.
- Sumergir los portaobjetos en 50% Gill No solución de 3 hematoxilina, se diluyó con agua purificada, durante 5 min.
PRECAUCIÓN: Hematoxilina es nocivo por ingestión y contacto con los ojos. Use PPE apropiado cuando maneje. - Lavar los portaobjetos en una cubeta de tinción con agua corriente durante 10 minutos.
- Sumergir los portaobjetos en 1% solución de ácido / alcohol (ácido clorhídrico 10 M 1% en etanol al 70%) durante 10 sy lavar en una cubeta de tinción bajo el chorro de agua del grifo.
- Sumergir los portaobjetos en solución de eosina durante 30 segundos y lavar en una cubeta de tinción con agua corriente durante 10 minutos.
- Dentro de una campana de humos, secuencialmente sumergir los portaobjetos en baños que contienen etanol al 70%, etanol al 95% y etanol al 100% durante 5 min cada uno.
- Sumergir los portaobjetos en baño que contiene xileno durante 10 minutos.
- Monte cubreobjetos utilizando un medio de montaje a base de xileno. Secar horizontalmente y completamente en una campana de humos antes de la visualización de las diapositivas bajo un microscopio.
- Desparafinar secciones por inmersión de diapositivas montadas en un bastidor de deslizamiento en un baño de xileno 100% durante 10 min a temperatura ambiente.
- Evaluación Estereológico del tamaño de los buques y las reformas de estado
- Para cada sitio de implantación, determinar qué secciones son cerca del punto medio sagital. El apego corioalantoica entre el feto y el desarrollo de la placenta sirve como un buen indicador del punto medio sagital.
- Seleccione 3 secciones de 49 micras intervalos cerca del punto medio sagital para el análisis. Escanear diapositivas seleccionadas. A fin de evitar incvenas Luding, que han demostrado ser más periféricamente situado en los lugares de implantación 16, restringen el análisis en el centro de 2/4 de cada sitio de implantación (Figura 2).
- Para evaluar el tamaño del lumen, dibujar por el interior de los vasos y registrar el área de esta forma. Para el tamaño total de la embarcación, dibujar alrededor de la pared exterior del recipiente, incluyendo las células endoteliales, pericitos y leucocitos intramurales.
Nota: La relación del tamaño total buque lumen es un proxy para el estado de la remodelación de un buque. Como los vasos bobina a través del plano que la sección se corta a lo largo, puede haber múltiples secciones transversales de la misma arteria en una diapositiva. Evite la medición de la misma arteria varias veces. - Registre las mediciones de los 5 buques en cada sitio de implantación con los lúmenes más grandes y redondos. Mida cada sitio de implantación por triplicado (tres secciones espaciadas 49 m uno de otro). La media de estos 15 mediciones represeNTS el diámetro medio de los vasos más grandes.
- Para evitar la sobrerrepresentación de los buques más grandes en algunas muestras, medir el mismo número de barcos en cada lugar de implantación.
3. Evaluación cualitativa mediante inmunohistoquímica
- Desparafinización y rehidratación
- Desparafinar secciones por inmersión de diapositivas montadas en un bastidor de deslizamiento resistente al calor en un baño de xileno 100% durante 10 min a temperatura ambiente.
- Sumergir los portaobjetos en el baño que contienen xileno limpio durante otros 10 min.
- Secuencialmente sumergir los portaobjetos en baños que contienen etanol al 100%, etanol al 95% y 70% y agua purificada durante 5 min cada uno.
- Antígeno recuperación
- Preparar un 10 mM de tampón de citrato de sodio en agua purificada y se ajusta a pH 6 con ácido clorhídrico 10 M.
- Llenar un recipiente resistente al calor que puede contener 600 ml con tampón citrato 400 ml de sodio y colocar en una olla a presión doméstica que contiene suficiente water sumergir medio del recipiente. Monte la tapa de la olla a presión y el calor hasta que hierva.
- Place parrilla corrediza en el tampón de citrato de sodio y fijar firmemente la tapa de la olla a presión. Una vez a presión, dejar hervir durante 3 minutos.
- Despresurizar la olla a presión y retire el recipiente interior. Permitir que las diapositivas se enfríen en el tampón de citrato de sodio durante 10 min a temperatura ambiente.
- Lavar los portaobjetos en un baño que contiene agua purificada durante 5 min.
- Rodear la secciones usando una barrera hidrofóbica pluma.
- Lave las diapositivas sumergiendo en PBS durante 5 min.
- El bloqueo de la peroxidasa endógena y la unión no específica
- Incubar las secciones con 3% de peróxido de hidrógeno diluido en agua purificada en una cámara húmeda durante 30 min a temperatura ambiente.
PRECAUCIÓN: El peróxido de hidrógeno es altamente irritante para los ojos, la piel y por ingestión. Use PPE apropiado. - Toque fuera exceso de solución de peróxido de hidrógeno y lavar slides dos veces por inmersión en solución salina tamponada con Tris (TBS) durante 2 min cada una.
- Incubar las secciones con inmunoglobulina de ratón reactivo de bloqueo del ratón en kit ratón preparado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Lavar los portaobjetos dos veces en TBS durante 2 minutos cada uno.
- Incubar las secciones con 3% de peróxido de hidrógeno diluido en agua purificada en una cámara húmeda durante 30 min a temperatura ambiente.
- Inmunodetección de actina de músculo liso
- Preparar la solución diluyente de anticuerpos (proporcionado en el kit) y se incuba con las secciones durante 5 min a temperatura ambiente, o de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
- Diluir 1: 100 actina de músculo liso de ratón anti-humano (DAKO M0851) en solución diluyente de anticuerpo. Diluir control de isotipo IgG2a de ratón en solución diluyente de anticuerpo, asegurando que la concentración de inmunoglobulina final es equivalente en ambas soluciones.
- Toque de solución diluyente de anticuerpos y la cubierta secciones exceso, ya sea con diluidas soluciones de control de anticuerpos o isotipo. Incubar en una cámara humidificada durante 30 min a temperatura ambiente.
- Lavar los portaobjetos dos veces en TBS durante2 min cada uno.
- Diluir anti-ratón biotinilado anticuerpo secundario e incubar las secciones durante 10 min a temperatura ambiente, o de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
- Lavar los portaobjetos una vez con TBS y PBS durante 2 min, respectivamente.
- Preparar 3,3'-diaminobencidina (DAB) solución de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cubrir las secciones con solución DAB e incubar durante un máximo de 4 minutos, asegurando para monitorear secciones para evitar el desarrollo de exceso de color.
PRECAUCIÓN: DAB es inflamable y un posible carcinógeno que es tóxico a través del contacto y la inhalación. Use PPE apropiado cuando maneje. - Sumergir los portaobjetos en agua purificada una vez que se alcanza la intensidad de la tinción deseada.
- De contraste con el 50% Gill Nº 3 hematoxilina durante 20 segundos y lavar en una cubeta de tinción bajo el chorro de agua del grifo hasta que el agua salga clara.
- La deshidratación y de montaje
- Dentro de una campana de humos, secuencialmente sumerja diapositivas en baños que contienen 70% ethanol, etanol 95% y etanol al 100% durante 5 min cada uno.
- Sumergir los portaobjetos en baño que contiene xileno durante 10 minutos.
- Monte cubreobjetos utilizando un medio de montaje a base de xileno. Secar horizontalmente y completamente en una campana de humos antes de la visualización de las diapositivas bajo un microscopio
Representative Results
Rag2 - / - IL2RG - / - ratones carecen de todos los linfocitos maduros, incluyendo células NK 17, y sus arterias uterinas fallan a someterse a los cambios vasculares observadas en wildtype congenic C57BL / 6 (WT) ratones alrededor mitad de la gestación 5,14. Como resultado de esta reducción de la remodelación Rag2 - / - IL2RG - / - ratones muestran áreas luminales superficiales significativamente menores, indicativas de los vasos más pequeños en general que puede visualizarse en secciones teñidas con H y E y cuantificadas estereológicamente (Figura 2). Además, el espesor relativo de la pared (vaso a la proporción de lumen) es mayor en las arterias espirales en estos ratones, lo que sugiere reducida suministro de sangre y mayor velocidad de la sangre.
Esta evaluación cuantitativa fue confirmada mediante la detección inmunohistoquímica de SMA. Es característico para los ratones WT para pierden la mayor parte de la SMA dentro de los medios vascularde las arterias espirales por mitad de la gestación. Si este proceso celular impulsada por NK no tiene lugar, SMA permanece en los medios de comunicación de los vasos y puede ser fácilmente detectado inmunohistoquímicamente como anillos alrededor de los vasos sanguíneos (Figura 3).
Figura 1: Ratón útero al gd9.5, resumen esquemático dibujo que muestra las posiciones relativas de los cuernos uterinos, cérvix (azul) y de las principales arterias uterinas (rojo).. Indicado son el eje largo de los cuernos uterinos (flechas) y los puntos de ligadura (flechas discontinuas). Las secciones para inmunohistoquímica se cortan a lo largo del plano de la vista.
Figura 2:. Estereológico evaluación de la remodelación arterial en mitad de la gestación (A) Ejemplo assessment de luminal y áreas totales de los vasos en secciones H & E manchadas de hembras WT en el centro de 2/4 de la decidua basal (delimitada por el negro vertical de líneas discontinuas) en gd9.5. En los buques en el mayor aumento, el rojo línea discontinua demarca área del vaso total línea discontinua amarilla demarca área de la luz. Bar = 500 micras (izquierda), 50 m (derecha). El eje largo del útero es una línea horizontal en esta orientación. (B) Cuantificación de las áreas luminales (panel izquierdo) y relación del área luminal a la superficie total del buque (panel derecho) de WT (ratones C57BL / 6) y Rag2 - / - IL2RG - / - ratones (en C57BL / 6 de fondo). Cada punto de datos representa la media de 15 mediciones (5 mediciones por sección, 3 secciones por lugar de implantación). Bares representan la media de n = 11-13 sitios de implantación a partir de 4 embarazos por cada grupo; p-valor de una, no apareado prueba de Mann-Whitney de dos colas. WT: de tipo salvaje.
Figura 3:. La detección inmunohistoquímica de la actina de músculo liso en la decidua basal tinción Representante SMA en WT (arriba) y Rag2 - / - IL2RG - ratones (en C57BL / 6 antecedentes, abajo) en gd9.5 - /. Bar = 100 micras. WT: de tipo salvaje.
Discussion
El protocolo que aquí se presenta está diseñado para proporcionar un método reproducible mediante el cual evaluar los cambios vasculares que son necesarias para un embarazo exitoso. Crítico para el éxito de esta evaluación es la calidad de las secciones de tejido. Tanto determinar con precisión la edad gestacional de los lugares de implantación, así como la ligadura de forma fiable las arterias uterinas son pasos cruciales. Los cambios en parámetros tales como el tiempo de la fijación, el protocolo de procesamiento de tejido, etc. también pueden afectar el resultado. Para una evaluación imparcial estereológicos, es importante para medir el mismo número de vasos en cada sitio de implantación. Se recomienda para medir 5 vasos por sitio de implantación y cada sitio de implantación por triplicado. La media de estos 15 mediciones representa el tamaño medio de los 5 buques más grandes.
En relación con los datos de Rag2 alymphoid - / - IL2RG - / - ratones muestran aquí, encontramos este protocol útil para una serie de modelos de la función inmune materna inadecuada, incluyendo una de las células NK inhibidos 14. Los defectos en la remodelación arterial también se han demostrado en modelos de invasión trofoblástica deteriorado 18 y las técnicas descritas aquí pueden ser útiles para evaluar la vasculatura en estos casos. Hemos optimizado y validado este protocolo para la investigación de la remodelación vascular decidual en mitad de la gestación en el ratón, pero también es concebible para adaptar este protocolo para trabajar en otros sistemas modelo (por ejemplo, ratas) o incluso en otros órganos. Aunque nos encontramos con que la remodelación NK-dependiente puede ser evaluado con firmeza en gd9.5, puede ser modificado para otros puntos de tiempo como gd12.5, cuando la vasculatura materna está completamente remodelado. En este punto de tiempo, la invasión del trofoblasto endovascular es más profunda 16 y este punto de tiempo puede ser más adecuado para las investigaciones sobre el papel del trofoblasto para cambios vasculares. Si se desean lecturas cuantitativas adicionales,los investigadores también pueden aumentar el número de secciones teñidas para evaluar la SMA y porcentaje de vasos parcialmente remodeladas dentro de cada sitio de implantación.
Una limitación de este protocolo es la naturaleza descriptiva de los exámenes histológicos. Los ensayos funcionales, sin embargo, sólo están convirtiendo lentamente disponibles (tales como ultrasonido Doppler 19). Estas técnicas requieren conocimientos técnicos y gastos mucho más altos para la adquisición y mantenimiento de los equipos, pero tienen la ventaja de proporcionar una lectura longitudinal en vivo para el efecto de los cambios que se pueden observar histológicamente. Un posible inconveniente de todos los exámenes estereológicas es la subjetividad de los investigadores. Para ello, el uso de dos examinadores independientes que analizan todas las muestras de forma independiente puede ayudar a evitar este problema. Mientras que el protocolo descrito aquí da una idea de la cantidad de sangre puede alcanzar la interfaz feto-materna, puede ser ventajoso combinar con el complenfoque ementary de evaluar la cantidad total de sangre en un momento dado en el sistema vascular a través del plástico arroja 16.
La fuerza de este protocolo es que combina dos enfoques independientes. Cambio vascular se evaluó por primera cuantitativamente estereología y el resultado es entonces validado cualitativamente mediante inmunohistoquímica. La fiabilidad de los resultados puede ser reforzada por aleatorización de las muestras. Las muestras preparadas para este protocolo se puede utilizar fácilmente para investigar también otros parámetros del embarazo como decidualización, el desarrollo del agregado linfoide mesometrial del embarazo (MLAP) o inmunodetección de células de interés, para evaluar rigurosamente un fenotipo de embarazo en mitad de la gestación.
Remodelación arterial es un paso crítico para los embarazos sin complicaciones en las mujeres y la falta de estos cambios sustenta los grandes síndromes obstétricos (GOS), a saber, la preeclampsia, restricción del crecimiento fetal ynacimiento de un niño muerto. Presentamos aquí las técnicas para evaluar cuidadosamente un fenotipo embarazo en modelos de ratón que imitan algunas características de la fisiopatología de la SMO.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice (8-12 weeks old) | Charles River | ||
| Dental floss | |||
| Polystyrene | Used for holding tissue in place | ||
| Straight dissection scissors | EMS | 72940 | |
| 25 G needles | BD | 300600 | Used for holding tissue in place |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128-4L | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | P3813-10PAK | |
| Ethanol | Sigma | 32221-2.5L | |
| Paraffin | Sigma | 327204-1KG | |
| Xylene | Fisher Scientific | X/0250/17 | |
| Automated tissue processor | Sakura | 6032 | |
| Microtome | Leica | RM2245 | |
| Slide rack | Sigma | Z710989 | |
| Coplin jar | Sigma | S5891 | |
| Purified water | |||
| Hematoxylin solution, Gill No. 3 | Sigma | GHS332-1L | |
| Eosin Y solution | Sigma | HT110116-500ML | |
| Fume hood | |||
| Xylene-based mounting media | VWR | 361254D | |
| Slide scanner | Hamamatsu | NanoZoomer | |
| Slide scanner software | Hamamatsu | NDP viewer | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma | 32320 | Make 10 mM solution and adjust pH to 6 |
| Pressure cooker | Used for antigen retrieval | ||
| Heating plate | Used for antigen retrieval | ||
| Hydrophobic barrier pen | Vector | H-4000 | |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H/1800/15 | |
| Tris buffered saline | Sigma | T6664-10PAK | |
| Mouse on mouse kit | Vector | BMK-2202 | Significantly reduces background |
| Mouse anti-human smooth muscle actin | DAKO | M0851 | Cross-reacts with mouse |
| IgG2a isotype control | DAKO | X0943 | |
| Humidified chamber | Sigma | H6644 | |
| 3,3’-Diaminobenzidine solution | Sigma | D4293-5SET | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | H/1050/PB17 |
References
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