Protocol
記載されている全ての研究プロトコルは、シカゴ施設内倫理委員会の大学（IRB）によって検討されています。インフォームドコンセントは、手術前に各患者から得られたものであり、この研究は、シカゴ大学IRBによって承認されました。生物学的安全キャビネットタイプ2との手袋は、保護のためにヒト組織を取り扱う際に使用されるべきであり、細胞の汚染のリスクを低減します。
一次形質転換されていない間質細胞の単離および培養1。
- ヒト組織収集と準備。
- 腹部手術の間に除去さヒト大網、2 cm 3での標本を取得し、直ちにRTリン酸緩衝生理食塩水（PBS）（ 図2A）の組織を浸します。 X 2センチメートル大網3センチメートルの作品は、一般的に100万初代ヒト中皮細胞（HPMC）20万の一次ヒト線維芽細胞または正常大網線維芽細胞（NOF）が得られます。
- 組織が3用0.5×gで中に浸漬したPBSをスピンダウン分できるだけ早く採取後（PBS中<2時間）、50mlのコニカルチューブに新鮮な20ミリリットルのPBSに組織を移します。直径15cm、無菌培養皿（ 図2B）にメスで切り刻むことによって5ミリメートル3個に組織をカット。
- 初代ヒト中皮細胞の単離8
- HPMCを単離するために、50mlコニカルチューブにみじん切りの組織を転送し、固体片がトップ（ 図2C＆D）に浮動するために1分を待ちます。 HPMCおよび赤血球（RBC）は、底部に液体中に存在するであろう。チューブの底から、新しいコニカルチューブに液体を除去するために、ピペットを使用してください。 3分間0.5×gで液体をスピンダウンし、HPMC / RBCペレットから上清を吸引除去します。
- プロセスを3回繰り返します。組織は、上昇ピペットでおよびHPMC / RBC管に底から液体を除去、スピンダウン、および削除することができ、みじん切り組織に20ミリリットルのPBSを追加上清。すべてのスピンが完了し、上清を吸引した後、ペレットは、HPMCおよびRBCを含みます。
- プレート10％ウシ胎児血清[FBS]、1％MEMビタミン[93ミリグラム/ L]、1％MEM非必須アミノ酸[81.4との完全成長培地15mlの（DMEM中で75cm 2のフラスコ中に、ペレットから全セルMG / L]、1％のペニシリンストレプトマイシン[ペニシリン - ストレプトマイシン、100U / mlペニシリンおよび100μg/ mlストレプトマイシン]）。
- 追加のHPMCを分離するために、二次PBS洗浄を行ってください。
- 組織はトップにフロートするために二PBS洗浄のため、200 rpmで、20mlのPBSで10分間、37℃で、残りの固形組織を振る、その後、1分待ちます。 、新しいチューブに、チューブの底部から液体を除去する3分間の0.5×gで遠心分離し、上清を吸引除去します。
- 二PBSのプレートのすべてのHPMC / RBCが完全増殖培地15ml中の別々の75cm 2のフラスコ中で洗います。
- 任意のRを単離するために、ボリュームによってPBS溶液：1、0.25％トリプシンの25mM EDTA：HPMCをemaining、1 20mlに10分間、200 rpmで37℃の度を細分化した組織を横に振ります。組織が上昇することを許可する、新しい50mlチューブにチューブの底に液体を収集し、0.5 GX 3分でスピンダウン。
- 上清を吸引除去し、完全増殖培地15mlに別々の75cm 2のフラスコ内のすべてのHPMC / RBCをめっき。
- 培養メッキ37℃で細胞を加湿環境下で5％CO 2。フィードは、使用済み培地を除去せずに3日目および5に完全成長培地を15mlを加えることによって、細胞を播種しました。 HPMCは、分割前に5〜7日間培養することができます。
- 元の表現型の脱分化および変更を最小限に抑えるために、すべての実験で（継代2まで）の低継代HPMCを使用してください。位相コントラストcapabilitieプラスチック微分干渉コントラスト機能や4-20x目的とした20倍目的で、好ましくは広視野顕微鏡を使用して、S細胞のすべての画像を撮影する（顕微鏡の位相コントラストフィルタ）、および3,3'-ジアミノベンジジン（DAB）染色を免疫組織化学的に分析する明視野で10倍対物レンズ（）。
- HPMCは立方形であり、免疫組織化学8（ 図3A、C、E）を行うことにより 、サイトケラチン8およびビメンチンを発現することを確認します。
- HPMCを単離するために、50mlコニカルチューブにみじん切りの組織を転送し、固体片がトップ（ 図2C＆D）に浮動するために1分を待ちます。 HPMCおよび赤血球（RBC）は、底部に液体中に存在するであろう。チューブの底から、新しいコニカルチューブに液体を除去するために、ピペットを使用してください。 3分間0.5×gで液体をスピンダウンし、HPMC / RBCペレットから上清を吸引除去します。
- NOF分離8
- 1：100Xペニシリン - ストレプトマイシンの1：1混合物をPBS中のヒアルロニダーゼの714単位の活動/ mlのコラゲナーゼタイプIIIの1500単位の活動/ mlの1を組み合わせることにより、コラゲナーゼタイプIII溶液（10倍）の株式の10ミリリットルを準備します。
- 1％MEMビタミン[93ミリグラム/ L]で無血清培地で希釈10倍コラゲナーゼタイプIII溶液10ml（DMEM中で6時間、200 rpmでHPMC分離後に残るみじん切り大網組織、37℃を振って、 1％MEM非必須アミノ酸[81.4 mg / Lで]、1％のペニシリンストレプトマイシン[ペニシリン - ストレプトマイシン、100U / mlペニシリンおよび100μg/ mlストレプトマイシン]）。消化された組織は、不透明になりますし、いくつかの繊維の破片（ 図2E）を有することができます 。
- NOF細胞を含有する溶液を遠心 室温で3分間0.5×gで懸濁液中で、上清を吸引し、完全増殖培地13ミ リリットルで75cm 2のフラスコ中でペレットをプレート。
- 古いメディアを削除し、24時間後に、新鮮な完全増殖培地15mlで交換してください。 NOFは、分割前に1-3日間培養することができます。細胞がコンフルエントに達したときにNOFの注意増殖が停止します。
- 一次ヒト線維芽細胞は平坦であることを確認し、細長い細胞およびビメンチンを発現するが、免疫組織化学8（ 図3B、D、F）を行うことにより 8サイトケラチンありません。脱分化を最小限にするために（理想的に継代3前）の実験のための低通路NOFを使用します そして、元の表現型の修正。細胞の全ての位相画像を撮影するためのプラスチック製のDIC機能を搭載した20倍目的で広視野顕微鏡を使用して、と明視野で10倍の目的は、免疫組織化学的DAB染色を分析します。
2.メッキ器官培養8
- わずか5分3ミリリットル0.25％のトリプシン/ 25mMのEDTAに続いて10mlのPBSですすいで75センチ培養フラスコからリリースNOF。完全増殖培地の少なくとも3倍のボリュームで、トリプシンを中和します。
- 50mlコニカルチューブにトリプシン処理した細胞を移し、0.5 GX 3分でスピンダウン。上清を除去し、完全増殖培地5mlにまで戻って細胞をもたらします。培養フラスコから回収した細胞をカウントするセルカウンタを使用してください。
- 黒、透明底、96ウェルプレートに100μlのあたり2,000〜4,000 NOFをプレートに完全増殖培地の適切な量で細胞を希釈します。メッキ前に、細胞混合物をラット尾コラーゲンI0.5μgの/ 100μLを加えます。細胞は、少なくとも4時間、加湿環境において、または細胞になるまで5％CO 2中で37℃で放置プレート表面に付着します。
- ステップ2.1および2.2に記載したのと同じ方法を用いて培養フラスコからHPMCを解除してください。すでに96ウェルプレート中のI型コラーゲンでメッキNOFの上に50μlのあたり10,000〜20,000 HPMCをプレートに完全増殖培地の適切な量で細胞を希釈します。細胞は、実験を開始する前に、少なくとも18時間、加湿環境で、5％CO 2中、37℃で座ってみましょう。
- 完全な増殖培地でHeyA8卵巣癌細胞を発現性培養緑色蛍光タンパク質（GFP）。 HeyA8卵巣癌細胞を蛍光カイアシ類CGFP（pCDH-CMV-MCS-EF1）を発現するレンチウイルスベクターの発現によって標識されています。 HeyA8卵巣癌細胞は、使用日の80〜90％コンフルエント（対数増殖期）でなければなりません。培養プレートから細胞を離し、初代培養細胞のためのステップ2.1から2.2に記載したのと同じ方法を使用してカウントします。
- 卵巣癌細胞を、37℃で15〜20分間、完全増殖培地中で回復させます緩く密封された蓋付きの円錐管。
3.接着アッセイ8
- 回収後、0.5×gで3分間回転させることにより卵巣癌細胞をペレット化し、上清を除去し、50,000細胞/ 100μlの濃度を達成するために、無血清培地の適切な量で細胞を希釈します。
- 使用済み培地を除去し、各ウェルに無血清培地中の癌細胞懸濁液100μlを追加するHPMC / NOF器官培養物を96ウェルプレートを反転します。 4時間30分間、加湿環境中、5％CO 2中37℃でプレートをインキュベートします。
- 培地および非接着細胞を除去するために、96ウェルプレートを反転させます。慎重に、ゆっくりと各ウェルに100μlのPBSをピペット、再度プレートを反転させるために、低電力でマルチチャンネルピペットを使用してください。 PBSで一回以上の洗浄を繰り返します。
- PBSを除去し、各ウェルに100μlの4％パラホルムアルデヒドを添加することが反転します。プレートは、20マイルのために座ってできるようにします細胞を固定する場合は、N。 20分後、プレートを反転し、100μlのPBSを追加します。
- ウェルの総蛍光を報告することができるか、細胞の数を定量することができることに留意されたいです。定量化のために、100万細胞/ mlの濃度でHeyA8細胞を用いて、重複の最初のプレートの標準曲線。
- 、ダウン100万個の細胞をスピン培地を除去し、それらを20分間1ミリリットルの4％パラホルムアルデヒド中で座ってできるようにすることで、標準曲線を作成します。
- 再び細胞をスピンし、1mlのPBS（再集計セルが100万/ mlの濃度を確認するために）で起動します。連でプレートそれぞれに50,000、40,000、30,000 20,000 10,000 5000 1000、および0細胞だけでなく、各ウェルに50μlの最終総容量をPBSを追加します。
- ボトムは高いウェル（標準曲線上で50,000）をスケーリング、蛍光プレートリーダー（励起= 488nmで、放射= 528 nm）の上で培養プレートをお読みください。 organotypに付着何卵巣癌細胞を計算するために、標準曲線を使用して各ウェル（ 図4A-C）におけるIC文化。
4.増殖アッセイ10
- 卵巣癌細胞を、0.5×gで3分間回転させることによって細胞をペレット化（工程2.5および上記2.6を参照）を回収した後、1％のFBS、1％MEMと1％FBS培地の適切な量（DMEMで細胞を希釈した後に4000細胞の濃度を達成するために、ビタミン[93ミリグラム/ L]、1％MEM非必須アミノ酸、[81.4ミリグラム/ L]、1％のペニシリンストレプトマイシン[ペニシリン - ストレプトマイシン、100 U / mlペニシリンおよび100μg/ mlストレプトマイシン]） / 150μL。
- 使用済み培地を除去し、各ウェルに1％FBS培地中の癌細胞懸濁液の150μlを添加するHPMC / NOF器官培養物を96ウェルプレートを反転します。 72時間加湿環境で、5％CO 2中、37℃でプレートをインキュベートします。
- ボトムは、相対的な増殖を評価するために、一日一回（励起= 488nmで、= 528 nmの発光）蛍光プレートリーダー上で培養プレートを読みます細胞の。 48時間（ 図5A-C）でメディアを変え、96時間アッセイを続行します。 （プレートが望ましい反転）のメディアを変更する際の文化を乱さないように注意してください。
5.浸潤アッセイ8
- 3D培養をメッキする前に、24ウェル培養プレートインサート（8μmの孔径）に200μlのPBS中7.5μgのラット尾コラーゲンIを追加します。プレートをインキュベートするO / Nが、その後慎重にすぐにコラーゲン被覆インサート（上記のステップ2）にHPMC / NOFの器官培養液をメッキする前にピペットでPBSを削除してみましょう。
- ステップ3.1のように卵巣癌細胞を準備します。インサートの器官培養物に卵巣癌細胞をプレートに、慎重にインサートの上部から余分なメディアを削除するには、ピペットを使用しています。各ウェルに無血清培地中で卵巣癌細胞懸濁液100μlを加えます。
- で癌細胞を誘導するために十分に挿入下に完全成長培地750μlのを追加器官培養物にvasion。 24時間加湿環境で、5％CO 2中、37℃でプレートをインキュベートします。
注意：器官培養物が挿入を渡り、インサートの底面に残る侵入卵巣癌細胞を。 - 空のウェルに挿入を移動した後、24時間後、トングと挿入を把握し、簡単に、PBSのビーカーでそれをすすいでください。 1分の合計のための綿棒の両側に各インサートの上部をスクラブ。すばやく各ウェル中の750μlの4％パラホルムアルデヒドを含むプレートにカバーを置きます。各インサートは750μlのPBSで満たされたウェルへの挿入を転送する前に、10分間パラホルムアルデヒド中で座ってできるようにします。
- 2.5倍の倍率で顕微鏡で浸潤した細胞（インサートの底部に接着固定）を表示します。ウェル全体が視野内にある場合、回避、10倍に倍率を調整し、5写真、ウェルの各象限における中央付近の1と1を取りますエッジに近すぎる画像を撮影します。各ウェルについての同じパターンに従ってください。
- そのプロトコルに従って、各ウェル内のフィールドごとに浸潤した細胞の平均数（ 図6A-C）を取得するには、各画像内のセルの数をカウントするために、製造元のプログラムを使用します。
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Representative Results
器官培養物を、最初にI型コラーゲンと初代ヒト線維芽細胞を混合した後、中皮細胞の5倍の数でこの文化を重ねることによって組み立てました。卵巣癌細胞の接着、浸潤または増殖を研究するために追加された前培養物を少なくとも18時間インキュベートしました。各アッセイは、複数を繰り返した（N = 5）及び浸潤アッセイ（N = 3）（N = 3~5）の異なる患者及び多数のウェルから得られた三次元培養を接着するための各条件で試験した（n = 5）を、増殖。 4時間（ 図4）の後に3次元器官培養物に付着した卵巣癌細胞は、72時間（6回HeyA8細胞倍加時間）（ 図5）の後に文化に増殖し、24時間（ 図6）の後に侵入しました。 HeyA8卵巣癌細胞の接着、増殖および浸潤は、インテグリン依存性（ 図4-6）でした。具体的には、RGDペプチド、ブロッキングantib5 -インテグリン、β1インテグリンとの αvβ3インテグリンは、器官培養物に卵巣癌細胞の接着を阻害し、RADペプチドが、抗体-インテグリン抗体とβ4を制御 αにodiesは（ 図4）10なかったです。増殖アッセイでは、RGDペプチドおよび5を αに対する抗体を遮断する-と器官培養物に対する阻害した卵巣癌細胞の増殖-インテグリンβ1、RADペプチドは、抗体およびβ4インテグリン-インテグリン抗体、αVβ3とを制御しながら、抗体は、（ 図5）しませんでした。浸潤アッセイでは、RGDペプチドおよび5を αに対する抗体を遮断する- 、β1インテグリン阻害し、3次元器官培養による卵巣癌細胞の浸潤を強化抗体-インテグリンαVβ3としています。 RADペプチド、対照抗体、およびβ4インテグリン抗体が侵入（ 図6）には影響しませんでした。まれに、これらのアッセイは、未解釈できなくなります（ すなわち 、対照抗体と比較した場合、接着、増殖または侵入を阻害しない抗体をブロック-インテグリンα5）。以前、我々は、特定の器官培養物は、アッセイ中にメディアまたはPBS洗浄の変更時に洗い流すということを発見しました。再急行インテグリンにダイジェスト卵巣癌細胞が死んでいるまたはトリプシンから十分に長い回復していない場合はさらに、アッセイは動作しません。したがって、器官培養および卵巣癌細胞アッセイの品質を評価することができるように、各アッセイにおいてポジティブとネガティブコントロールを有することが常に重要です。ここに示されるように、RGDペプチド、器官型培養物へのすべてを阻害し、卵巣癌細胞の接着、浸潤および増殖を遮断抗体インテグリンα5β1インテグリンとし、正の詐欺として使用することができます将来アッセイでントロール。同様に、抗体をブロッキングインテグリンβ4は 、器官型培養物への浸潤および増殖を卵巣癌細胞の接着に影響を及ぼさず、将来のアッセイで陰性対照として使用することができます。
人間の大網転移の図1.組織学。ヘマトキシリン及び（A）正常ヒト大網（MC、中皮細胞、のFib、線維芽細胞、アディ、脂肪細胞）と（B）と卵巣癌大網転移（メット、卵巣癌転移）のエオシン染色。パネル内のバー=長さは100μmです。 （C）は、ヒト大網の表面に早期卵巣癌細胞の転移を模倣卵巣癌転移の3次元器官モデルの模式図。 大きな版を表示するには、こちらをクリックしてくださいこの図のシオン。
初代ヒト大網細胞の単離図2（A）網の部分は、PBS中で外科手術において採取し、研究室に輸送されます。組織は0.5 xgx 3分でペレット化し、新鮮なPBSに転送される。（B）大網の片を、10センチメートルペトリ皿に移し、PBSで洗浄し、メスを小片に大網を切断するために使用されている（0.5 cm 3の）。 （CD） 組織片を、25 mlの血清学的ピペットを用いて収集し、HPMCの単離のために50 mlのコニカルチューブに移します。 PBSをチューブから除去し、そしてHPMCをPBSで37℃で0.5×gでペレット化されています。 （MC、中皮細胞、RBC、赤血球、のFib、線維芽細胞）、（E）NOF remainiから単離されますヒアルロニダーゼおよびコラゲナーゼタイプIIIとのインキュベーション後にNG大網組織。画像は6〜12時間の消化後の組織を示しています。 NOFは室温で0.5×gで回転させてペレット化されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
HPMCおよびNOFの図3特徴付けヒト大網組織から単離した。（A）中皮細胞（HPMC）及び（B）繊維芽細胞（NOF）の位相コントラスト画像を大網組織から単離後。ヒトHPMCは、（C）、サイトケラチン8、（E）ビメンチンについて染色しました。ヒトNOFは、（F）ビメンチンについて染色したが、（D）サイトケラチン8バー= 100μmのために染色されなかった、すべてのパネルに適用されます。ftp_upload / 53541 / 53541fig3large.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
器官型培養物への図4卵巣癌細胞の接着は、インテグリン依存性である。プロトコルセクションに記載のように（A）接着アッセイは、50,000蛍光標識された卵巣癌細胞、HeyA8細胞を用いて行きました。各ウェル中の全蛍光が報告されています。対照抗体は、マウスIgGです。各バーは、平均値+/-標準誤差の平均を表します。代表的な（B）位相差および器官培養の卵巣癌細胞接着の（C）蛍光像。 =100μmのバーでは、両方のパネルに適用されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
器官培養の図5卵巣癌細胞の増殖は、インテグリン依存性である。プロトコルセクションに記載のように（A）増殖アッセイは、4000蛍光標識された卵巣癌細胞、HeyA8細胞を用いて行きました。細胞の合計数が報告されています。対照抗体は、マウスIgGです。各バーは、平均値+/-標準誤差の平均を表します。 （B）24、および（C）96時間で、マージされた位相差および器官培養における、卵巣癌細胞増殖の蛍光画像。 =100μmのバーでは、両方のパネルに適用されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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器官培養による図6卵巣癌浸潤は、インテグリン依存性である。プロトコルセクションに記載のように（A）浸潤アッセイは、40,000蛍光標識された卵巣癌細胞、HeyA8細胞を用いて行きました。 （インサートの底部に3D培養を移動）浸潤細胞の数が報告されています。対照抗体は、マウスIgGです。各バーは、平均値+/-標準誤差の平均を表します。 （B）位相差及び（C）器官培養を通して侵入した卵巣癌細胞の蛍光画像。 =100μmのバーでは、すべてのパネルに適用されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
腹膜微小環境の器官モデルは、卵巣癌の普及における微小環境の細胞と生来のコンポーネントの両方の個人や集団の機能（複数可）を評価するために設立されました。卵巣癌細胞の接着、増殖、および浸潤を調べるために、3次元器官型培養物をプレーティングし、カスタマイズするための特定のプロトコルが提供されます。初代ヒト大網中皮細胞及び線維芽細胞は、患者から単離し、正常な形態および患者の変化を維持するために初期の継代で使用しました。このモデルでは、通常の大網線維芽細胞とECM（一般的にコラーゲンタイプI）は、一次ヒト中皮細胞単層を積層しました。このモデルは組織学的には、腹膜ライニングを模倣し、私たちは再作成および卵巣癌細胞の接着、増殖、および浸潤8,27を含む卵巣癌転移における重要なイベントを調べることができます。
以前は、限定された3Dモデルを持っていますこの3D器官モデルは腹膜腔の中皮ライニングの建設を再現する最初のものですが、微小環境13,14,21-25と卵巣癌と の相互作用を調査するために確立されて。人間の大網は、年齢や健康状態に変化患者から採取されます。組織の健康は直接中皮細胞および線維芽細胞分離技術に影響を及ぼします。健康な組織が存在大きな小葉（> 5ミリメートル）とカラーでよりオレンジがある組織に比べて非常に小さい小葉（1-3 mm）のと色が薄く表示されます。組織が研究室に手術から運ばれているように、HPMCの大半は最初のPBS中に剥がれ落ちます。 1 PBS：組織より健康な、しかし、より弾力性HPMCを除去し、追加のPBS洗浄および1にあるトリプシン消化物はHPMCおよびNOF細胞の混合培養することがあります。健康な組織では、いくつかのHPMCは6時間のコラゲナーゼダイジェスト生き残ることができる、フルで1×コラゲナーゼ溶液中で消化O / N増殖培地は、純粋なNOF文化を取得することをお勧めします。大網は除去時にPBSにすぐに配置する必要があります、または全くのHPMCが、組織から回収されません注意してください。組織を室温で、または冷蔵庫に時間（> 2時間）の長期間PBSに格納されている場合はさらに、単離された生存のHPMCの数が大幅に低減されます。
1：セルを中皮する線維芽細胞の5比は 、インビボで細胞を 8中皮する線維芽細胞の比率を模倣するためにメッキされます。それは、単離された中皮細胞の大きさは患者によって異なり、これがめっき比の調整を必要とするかもしれないことに留意することが重要です。一部の患者の中皮細胞は、はるかに小さいです。これらのケースでは、我々は、中皮細胞（2万）の二重数をプレート。加えて、初代細胞は常に形態を維持するために初期の（1-2）継代で使用されます。中皮細胞は立方またはひょろっとし、立方中皮細胞がより細長くなることができそれらは、10またはTGFβと卵巣癌細胞または処置からの馴化培地に大きく露出して継代されます。
卵巣癌細胞は、に付着し、同一または異なる患者由来の上皮中皮細胞よりも効率的に間葉中皮細胞を介して侵入することができます。一般的に、我々は、卵巣癌細胞で機能的アッセイを開始する前に18時間器官培養を設定します。もう中皮細胞および線維芽細胞は、共に、それらが卵巣癌細胞の挙動に影響を与えることができるECMタンパク質を含む種々のタンパク質を分泌しなければならない多くの時間培養されます。これらのアッセイを行う際に考慮すべきもう一つの重要な要因は、各癌細胞株又は初代ヒトにおけるインテグリン、プロテアーゼ、および成長因子などの増加接着、浸潤、および/または増殖に関連するタンパク質の示差増殖率と発現レベルであります癌細胞タイプ。器官培養物を機能的アッセイのそれぞれにおいて使用される癌細胞の時間及び数は、各癌細胞株または原発性癌細胞のタイプのために最適化される必要があります。例えば、記載接着アッセイにおいて、卵巣癌細胞は、この時間の間に培養物に侵入することができました。
明らかに、この器官モデルは、免疫、内皮細胞、および脂肪細胞などの正常腹膜微小環境のすべてのコンポーネントが含まれていません。初代細胞は、最初の3の通路内で使用されるように加えて、モデルは、初代ヒト組織のアクセスと可用性に依存します。しかし、モデルは、一次ヒト細胞および転移に重要な役割を果たすことが実証されている複数の細胞型の組み込みの使用に多くの利点を有します。このモデルは、後に個々の細胞型における遺伝子および調節タンパク質（ すなわち 、癌細胞、正常中皮または線維芽細胞）を調査するために使用されています共培養。特に、初期の転移でのc-Met 28、MMP-2 9,29、E-カドヘリン30、β1インテグリン10、β3 -インテグリン16、10,31 -インテグリンα5、およびフィブロネクチン10の役割は持っています検討されて。さらに、モデルは、脂肪細胞の取り込み6として複数の細胞型を含むように拡大する可能性を有します。モデルは、腹膜微小環境27に卵巣癌細胞接着/浸潤の小分子阻害剤を同定するためのハイスループットスクリーニングに使用するために修正され、小型化されています。このモデルの将来のアプリケーションは機構的研究およびハイスループットスクリーニングのためにマクロファージを含むアッセイへの免疫細胞の取り込みが含まれます。要約すると、器官の細胞培養は、ゴアと人間の腹膜の微小環境と卵巣癌細胞との間の相互作用を評価するための有用なモデルを提供します播種および疾患進行の重要な分子機構を解明し、潜在的な治療標的を同定するL。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Isolation and culture of primary cells | |||
| PBS | Fisher Scientific | SH3001304 | |
| Single-edged razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | |
| 15 cm culture dishes | BD Biosciences | 353025 | |
| Glass flask | ? | ? | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000044_3616914956 | |
| DMEM with L-Glutamine | Corning | 10-013-CV | |
| MEM Vitamins | Corning | 25-020-Cl | |
| MEM Nonessential amino acids | Corning | 25-025-CI | |
| Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Shaker | Thermo-Fisher | MaxQ 4450 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Incubator | Thermo-Fisher | Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator Model 3100 | |
| Trypsin EDTA, 1x (0.25%) | Corning | 25-053-CI | |
| Hyaluronidase | Worthington Biochemical | LS002592 | |
| T-75 Flasks | BD Biosciences | 353136 | |
| T-175 Flasks | BD Biosciences | 353112 | |
| Pipet tips | Rainin | P2, P10, P20, P200 and P1000 | |
| Pipet tips | Corning | Filtered tips P2, P10, P20, P200 and P1000 | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 2. Plating 3D culture | |||
| Cell Counter | Invitrogen | Countess | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10313 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Collagen Type I (Rat Tail) | BD Biosciences | 354236 | |
| 96 well plate, clear bottom, black | BD Biosciences | 353219 | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 3. Adhesion assay | |||
| Multichannel pipet | Eppendorf | Xplorer 300 | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
| Plate reader | Molecular Devices | Minimax | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 5. Invasion assay | |||
| Cell Culture Inserts (8um, 24-well) | BD Biosciences | 353097 | |
| Cotton swabs | Q-tips | cotton swabs | |
| Microscope | Zeiss | Axiovert 200m | |
| Cell Profiler | public domain | ||
| 24 well plate | BD Biosciences | 353047 | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 6. Antibodies | |||
| Anti-Integrin αVβ3 Antibody, clone LM609 | EMD Millipore | MAB1976 | |
| Beta 1 | Oncosynergy | OS2966 | |
| Alpha 5 [CD49e] | ID Pharmingen | 555615 | |
| Beta 4 [CD104] | EMD Millipore | MAB 2058 |
References
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