Protocol
وقد تم استعراض جميع بروتوكولات البحوث التي وصفها جامعة شيكاغو المؤسسي مجلس مراجعة (IRB). تم الحصول على الموافقة المسبقة من كل مريض قبل الجراحة وتمت الموافقة على الدراسة من جامعة شيكاغو IRB. A السلامة البيولوجية نوع مجلس الوزراء (2) وقفازات وينبغي أن تستخدم عند التعامل مع الأنسجة البشرية للحماية والحد من مخاطر تلوث الخلايا.
1. العزلة والثقافة من خلايا انسجة هو دون تغيير الابتدائية
- جمع الأنسجة البشرية والتحضير.
- الحصول على عينات من الثرب البشري، 2 سم 3، وإزالتها خلال عملية جراحية في البطن، وتزج الأنسجة فورا في RT الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) (الشكل 2A). قطعة من الثرب 3 سم × 2 سم وعادة ما ينتج 1000000 الخلايا الأولية الإنسان الظهارية (HPMC) و 200،000 الخلايا الليفية الإنسان الأساسية أو الخلايا الليفية الثرب العادية (NOF).
- تدور باستمرار PBS كانت مغمورة الأنسجة في عند 0.5 x ج لمدة 3دقيقة في أقرب وقت ممكن بعد جمع (<2 ساعة في PBS) ونقل الأنسجة لالطازج 20 مل PBS في 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. تقطيع الأنسجة في 5MM 3 قطع من قبل تنميق مع المشارط في 15 سم القطر، صحن الثقافة العقيمة (الشكل 2B).
- الأولية الخلية الظهارية الإنسان العزلة 8
- عزل HPMC، ونقل الأنسجة المفروم إلى 50 مل أنابيب مخروطية وانتظر 1 دقيقة لقطع صلبة لتطفو إلى الأعلى (الشكل 2C & D). سوف HPMC وخلايا الدم الحمراء (RBC) تكون موجودة في السائل على الجزء السفلي. استخدام الماصة لإزالة السائل من أسفل الأنبوب وإلى أنبوب مخروطي الشكل الجديد. تدور السائل أسفل عند 0.5 x ج لمدة 3 دقائق ونضح طاف من بيليه HPMC / RBC.
- كرر هذه العملية ثلاث مرات: 20 مل PBS إضافة إلى الأنسجة المفروم، تسمح الأنسجة في الارتفاع، وإزالة السائل من أسفل مع ماصة وداخل الأنبوب HPMC / RBC، تدور باستمرار، وإزالةطاف. بعد الانتهاء من جميع يدور ويستنشق طاف، وبيليه تحتوي على HPMC وRBC.
- لوحة كافة الخلايا من بيليه إلى 75 سم 2 قارورة في 15 مل من وسائط النمو الكامل (DMEM مع المصل 10٪ بقري جنيني [FBS]، 1٪ الفيتامينات MEM [93 ملغ / L]، 1٪ الأحماض MEM الأمينية غير الأساسية [81.4 ملغم / لتر]، 1٪ البنسلين الستربتوميسين [القلم بكتيريا، 100 U / البنسلين مل و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين]).
- إجراء غسل PBS الثانوي لعزل HPMCs إضافي.
- ليغسل PBS الثانوي، يهز الأنسجة الصلبة المتبقية في 200 دورة في الدقيقة، 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في 20 مل من برنامج تلفزيوني، ثم انتظر 1 دقيقة للأنسجة لتطفو إلى الأعلى. إزالة السائل من أسفل الأنبوب إلى أنبوب جديد، الطرد المركزي عند 0.5 x ج لمدة 3 دقائق، ونضح طاف.
- لوحة كل HPMC / RBC من PBS الثانوي يغسل في منفصلة 75 سم 2 قارورة في 15 مل من وسائط النمو الكامل.
- لعزل أي صemaining HPMC، يهز الأنسجة المفروم في 200 دورة في الدقيقة، 37 ° درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في 20 مل من 1 1 0.25٪ التربسين 25 ملي EDTA: حل PBS من حيث الحجم. السماح للأنسجة في الارتفاع، جمع السائل في الجزء السفلي من أنبوب إلى أنبوب جديد 50 مل، وتدور باستمرار عند 0.5 GX 3 دقائق.
- نضح في وطاف لوحة كل HPMC / RBC في منفصلة 75 سم 2 قارورة في 15 مل من وسائط النمو الكامل.
- ثقافة الخلايا مطلي عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 في بيئة مرطب. تغذية الخلايا مطلي بإضافة 15 مل من وسائط النمو الكامل في أيام 3 و 5 دون إزالة وسائل الإعلام المستهلك. HPMC يمكن أن يكون مثقف لمدة 5-7 أيام قبل تقسيم.
- استخدام المنخفض مرور HPMC (حتى مرور 2) في جميع التجارب لتقليل فقد التمايز وتعديل النمط الظاهري الأصلي. استخدام المجهر واسعة المجال ويفضل مع الهدف 20X مع الفارق البلاستيك قدرات التدخل التباين أو الهدف 4-20x مع النقيض من المرحلة capabilitieالصورة (الفلاتر المرحلة على النقيض المجهر) لاتخاذ كافة الصور من الخلايا، والهدف 10X () في حقل مشرق لتحليل المناعى 3،3'-Diaminobenzidine (DAB) تلطيخ.
- تأكد من أن HPMC هي مكعبة والتعبير عن cytokeratin 8 و vimentin قبل تنفيذ المناعية 8 (الشكل 3A، C، E).
- عزل HPMC، ونقل الأنسجة المفروم إلى 50 مل أنابيب مخروطية وانتظر 1 دقيقة لقطع صلبة لتطفو إلى الأعلى (الشكل 2C & D). سوف HPMC وخلايا الدم الحمراء (RBC) تكون موجودة في السائل على الجزء السفلي. استخدام الماصة لإزالة السائل من أسفل الأنبوب وإلى أنبوب مخروطي الشكل الجديد. تدور السائل أسفل عند 0.5 x ج لمدة 3 دقائق ونضح طاف من بيليه HPMC / RBC.
- NOF العزلة 8
- إعداد 10 مل من مخزون من نوع كولاجيناز III الحل (10X) عن طريق الجمع بين 1: 1 خليط من 100X القلم بكتيريا: 1 1500 وحدة النشاط / مل من نوع كولاجيناز الثالث: النشاط 714 وحدات / مل من هيالورونيداز في برنامج تلفزيوني.
- هزة الأنسجة الثرب مفروم التي تبقى بعد HPMC العزلة في 200 دورة في الدقيقة، 37 درجة مئوية لمدة 6 ساعات في 10 مل من 10X كولاجيناز النوع الثالث محلول مخفف في مصل الدم خالية من وسائل الإعلام (DMEM مع 1٪ MEM الفيتامينات [93 ملغ / L]، 1٪ MEM الأحماض الأمينية غير الأساسية [81.4 ملغ / L]، 1٪ البنسلين الستربتوميسين [القلم بكتيريا، 100 U / البنسلين مل و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين]). سوف الأنسجة هضمها تبدو مبهمة ويمكن أن يكون بعض الحطام ليفي (الشكل 2E).
- أجهزة الطرد المركزي في محلول يحتوي على خلايا NOF في تعليق عند 0.5 x ج لمدة 3 دقائق على RT، نضح في وطاف لوحة بيليه في 75 سم 2 قارورة في 13 مل من وسائط النمو الكامل.
- إزالة وسائل الإعلام القديمة واستبدالها مع 15 مل من جديدة وسائل الاعلام النمو الكامل بعد 24 ساعة. يمكن تربيتها NOF لمدة 1-3 أيام قبل تقسيم. سوف نلاحظ انتشار وNOF تتوقف عندما تصل الخلايا confluency.
- تأكد من أن الخلايا الليفية الإنسان الأساسية هي خلايا مستطيلة مسطحة والتعبير عن vimentin ولكن ليس cytokeratin 8 قبل تنفيذ المناعية 8 (الشكل 3B، D، F). استخدام NOF المنخفض مرور للتجارب (مثالي قبل مرور 3) لتقليل فقد التمايز وتعديل النمط الظاهري الأصلي. استخدام المجهر واسعة المجال مع الهدف 20X مع البلاستيك قدرات DIC لاتخاذ جميع الصور المرحلة من الخلايا،والهدف 10X في حقل مشرق لتحليل المناعى DAB تلطيخ.
2. الطلاء وعضوي الثقافة 8
- NOF الإفراج عن 75 سم الثقافة قارورة من قبل الشطف مع 10 مل من PBS تليها 3 مل من 0.25٪ التربسين / 25 ملي EDTA لمدة لا تتجاوز 5 دقائق. تحييد التربسين مع 3 مرات على الأقل حجم وسائط النمو الكامل.
- نقل الخلايا trypsinized إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل وتدور باستمرار عند 0.5 GX 3 دقائق. إزالة طاف وجلب خلايا احتياطية في 5 مل من وسائط النمو الكامل. استخدام عداد الخلية إلى عدد الخلايا المستخرجة من قارورة الثقافة.
- تمييع الخلايا في حجم مناسب من وسائط النمو الكاملة لوحة 2،000-4،000 NOF لكل 100 ميكرولتر على لوحة سوداء، واضحة القاع، 96-جيدا. إضافة 0.5 ميكروغرام / 100 ميكرولتر من الفئران الذيل الكولاجين الأول للخليط الخلية قبل الطلاء. السماح الخلايا الجلوس عند 37 درجة مئوية في CO 2 5٪ في بيئة مرطب لمدة 4 على الأقل ساعة، أو حتى الخلاياالتمسك سطح اللوحة.
- الإفراج HPMC من القارورة ثقافة باستخدام نفس الأساليب المذكورة في الخطوات 2.1 و 2.2. تمييع الخلايا في كمية مناسبة من وسائط النمو الكامل لوحة و10،000-20،000 HPMC في 50 ميكرولتر على رأس NOF مطلي بالفعل مع الكولاجين أنا في لوحات 96-جيدا. السماح للخلايا الجلوس عند 37 درجة مئوية في CO 2 5٪ في بيئة مرطب لمدة 18 ساعة على الأقل قبل بدء التجارب.
- ثقافة البروتين الفلوري الأخضر (GFP) -expressing HeyA8 خلايا سرطان المبيض في وسائل الاعلام النمو الكامل. وصفت HeyA8 خلايا سرطان المبيض التي fluorescently التعبير عن ناقلات lentiviral معربا عن الكوبيبودا cGFP (pCDH-CMV-MCS-EF1). وينبغي أن يكون HeyA8 خلايا سرطان المبيض 80-90٪ متكدسة في يوم من الاستخدام (مرحلة النمو لوغاريتمي). الافراج عن الخلايا من لوحة الثقافة والعد باستخدام نفس الأساليب هو موضح في الخطوات 2،1-2،2 للخلايا الأولية.
- السماح خلايا سرطان المبيض للتعافي في وسائل الاعلام النمو الكامل لمدة 15-20 دقيقة عند 37 درجة مئوية فيأنبوب مخروطي الشكل مع غطاء مختومة فضفاضة.
3. التصاق الفحص 8
- بعد الشفاء، بيليه خلايا سرطان المبيض من خلال الدوران لمدة 3 دقائق عند 0.5 x ج ثم إزالة طاف وتمييع الخلايا في حجم مناسب من وسائل الإعلام خالية من المصل لتحقيق تركيز من 50000 خلية / 100 ميكرولتر.
- عكس لوحات 96-جيدا مع HPMC الثقافات عضوي النمط / نوف لإزالة وسائل الاعلام المستهلك، وإضافة 100 ميكرولتر من تعليق الخلايا السرطانية في وسائل الإعلام خالية من المصل على كل جانب. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية في CO 2 5٪ في بيئة مرطب لمدة 30 دقيقة إلى 4 ساعات.
- عكس لوحة 96-جيدا لإزالة وسائل الإعلام والخلايا غير ملتصقة. استخدام الماصة متعددة في الطاقة المنخفضة لبعناية وبلطف الماصة 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في كل بئر، وعكس لوحة مرة أخرى. كرر PBS يغسل مرة واحدة أكثر من ذلك.
- عكس لإزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 100 ميكرولتر بارافورمالدهيد 4٪ إلى كل بئر. السماح لوحة للجلوس لمدة 20 ميلن لإصلاح الخلايا. بعد 20 دقيقة، عكس لوحة وإضافة 100 ميكرولتر PBS.
- لاحظ أن مضان إجمالي عدد الآبار يمكن الإبلاغ أو عدد الخلايا يمكن كميا. لالكمي، لوحة أول منحنى القياسية في نسختين باستخدام خلايا HeyA8 بتركيز من 1 مليون خلية / مل.
- جعل منحنى القياسية من خلال الدوران بنسبة 1 مليون خلية، وإزالة وسائل الإعلام، والسماح لهم الجلوس في 1 مل 4٪ لامتصاص العرق لمدة 20 دقيقة.
- خلايا تدور مرة أخرى وتنشئة في 1 مل PBS (خلايا إعادة فرز الأصوات لتأكيد 1000000 / تركيز مل). لوحة 50000، 40000، 30000، 20000، 10000، 5000، 1000، و 0 الخلايا في كل بئر من نسختين، وإضافة PBS لالحجم الكلي النهائي من 50 ميكرولتر في كل بئر.
- أسفل قراءة لوحة الثقافة على القارئ الفلورسنت لوحة (الإثارة = 488 نانومتر، والانبعاثات = 528 نانومتر)، وتوسيع نطاق الآبار عالية (50،000 على منحنى قياسي). استخدام منحنى القياسية لحساب عدد خلايا سرطان المبيض انضمت إلى organotypثقافة جيم في كل بئر (الشكل 4A-C).
4. انتشار الفحص 10
- بعد استعادة خلايا سرطان المبيض (انظر الخطوات 2.5 و 2.6 أعلاه)، بيليه الخلايا من خلال الدوران لمدة 3 دقائق عند 0.5 x ج ثم تمييع الخلايا في حجم مناسب من 1٪ FBS وسائل الإعلام (DMEM مع 1٪ FBS، 1٪ MEM الفيتامينات [93 ملغ / L]، 1٪ MEM الأحماض الأمينية غير الأساسية [81.4 ملغ / L]، 1٪ البنسلين الستربتوميسين [القلم بكتيريا، 100 U / البنسلين مل و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين]) لتحقيق تركيز 4000 الخلايا / 150 ميكرولتر.
- عكس لوحة 96-جيدا مع HPMC / ثقافات عضوي النمط عندها لإزالة وسائل الاعلام المستهلك، وإضافة 150 ميكرولتر من تعليق الخلايا السرطانية في 1٪ FBS وسائل الإعلام إلى كل بئر. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية في CO 2 5٪ في بيئة مرطب لمدة 72 ساعة.
- أسفل قراءة لوحة الثقافة على قارئ لوحة الفلورسنت مرة واحدة يوميا (الإثارة = 488 نانومتر، والانبعاثات = 528 نانومتر) لتقييم انتشار نسبيمن الخلايا. مواصلة الفحص لمدة 96 ساعة، وتغيير وسائل الإعلام في 48 ساعة (الشكل 5A-C). يجب الحرص على عدم تعكير صفو الثقافة عند تغيير وسائل الاعلام (لوحة للقلب هو الأفضل).
5. الغزو الفحص 8
- قبل الطلاء الثقافة 3D، إضافة 7.5 ميكروغرام الفئران الذيل الكولاجين أنا في 200 ميكرولتر PBS إلى 24 جيدا لوحة الثقافة إدراج (8 ميكرون حجم المسام). السماح للO لوحة احتضان / N، ثم إزالة بعناية PBS مع الماصة على الفور قبل الطلاء ثقافة عضوي النمط HPMC / NOF على إدراج المغلفة الكولاجين (الخطوة 2 أعلاه).
- إعداد خلايا سرطان المبيض كما في الخطوة 3.1. لوحة للخلايا سرطان المبيض على الثقافات عضوي النمط على إدراج، استخدم بعناية الماصة لإزالة وسائل الاعلام الزائدة من الجزء العلوي من تدرج. إضافة 100 ميكرولتر من تعليق خلية سرطان المبيض في وسائل الإعلام خالية من المصل على كل جانب.
- إضافة 750 ميكرولتر من وسائل الاعلام النمو الكامل في البئر دون إدراج للحث على الخلايا السرطانية فيvasion في الثقافات عضوي النمط. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية في CO 2 5٪ في بيئة مرطب لمدة 24 ساعة.
ملاحظة: خلايا سرطان المبيض التي تغزو والثقافة عضوي النمط عبور إدراج ويبقى على الجانب السفلي من إدراج. - بعد 24 ساعة، فهم إدراج مع ملقط لفترة وجيزة شطفه في كوب من برنامج تلفزيوني، ثم نقل إدراج في بئر فارغة. فرك الجزء العلوي من كل إدراج مع كلا الجانبين من مسحة القطن ليصبح المجموع 1 دقيقة. المكان بسرعة إدراج في لوحة تحتوي على 750 ميكرولتر بارافورمالدهيد 4٪ في كل بئر. تسمح كل إدراج للجلوس في امتصاص العرق لمدة 10 دقيقة قبل نقل إدراج في آبار مليئة 750 ميكرولتر PBS.
- عرض الخلايا غزت (الالتزام وثابتة على الجزء السفلي من إدراج) مع المجهر في 2.5x التكبير. عندما البئر كله داخل مجال الرؤية، وضبط التكبير إلى 10x و تأخذ 5 صور، واحدة بالقرب من مركز و 1 في كل رباعي من البئر، وتجنبالتقاط الصور التي هي قريبة جدا من الحواف. تتبع نفس النمط لكل بئر.
- استخدام برنامج الشركة المصنعة لحساب عدد الخلايا في كل صورة للحصول على متوسط عدد الخلايا غزت لكل حقل في كل بئر (الشكل 6A-C) وفقا لبروتوكول الخاصة بهم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم تجميعها ثقافة عضوي النمط عن طريق خلط أولا الليفية الإنسان الأساسية مع نوع الكولاجين I ثم تتراكب هذه الثقافة مع 5 أضعاف عدد الخلايا الظهارية. وقد حضنت ثقافة لا يقل عن 18 ساعة قبل أضيفت خلايا سرطان المبيض لدراسة الالتصاق، والغزو أو الانتشار. وتكرر كل مقايسة مع متعددة (ن = 3-5) تم اختبار الثقافات 3D تم الحصول عليها من مختلف المرضى والعديد من الآبار في كل حالة للالتصاق (ن = 5)، وانتشار المقايسات (ن = 5) وغزو (ن = 3) . خلايا سرطان المبيض انضمت إلى ثقافة عضوي النمط 3D بعد 4 ساعات (الشكل 4)، انتشرت على الثقافة بعد 72 ساعة (6 مرات الخلية مضاعفة الوقت HeyA8) (الشكل 5)، وغزت بعد 24 ساعة (الشكل 6). كان التصاق والانتشار وغزو HeyA8 خلايا سرطان المبيض التي تعتمد على إنتغرين (الشكل 4-6). على وجه التحديد، الببتيد RGD ومنع antibodies إلى 5 ألفا -integrin، β 1 -integrin وα ضد β 3 -integrin تحول دون المبيض التصاق الخلايا السرطانية للثقافة عضوي النمط، في حين أن RAD الببتيد، الضد السيطرة وبيتا 4 -integrin الأجسام المضادة لم يكن (الشكل 4) 10. في مقايسة الانتشار، الببتيد RGD ومنع الأجسام المضادة لألفا 5 - وبيتا 1 -integrin تحول دون انتشار الخلايا السرطانية في المبيض على ثقافة عضوي النمط، في حين أن الببتيد RAD، والسيطرة الضد، α الخامس بيتا 3 -integrin الأجسام المضادة وبيتا 4 -integrin الأجسام المضادة لم يكن (الشكل 5). في مقايسة الغزو، الببتيد RGD والأجسام المضادة لعرقلة ألفا 5 - وبيتا 1 -integrin إعاقة، في حين أن α ضد β 3 -integrin الأجسام المضادة تعزيز المبيض غزو الخلايا السرطانية من خلال ثقافة عضوي النمط 3D. وRAD الببتيد، ومراقبة الأجسام المضادة، وβلم 4 -integrin الأجسام المضادة لن يؤثر على الغزو (الشكل 6). نادرا ما، فإن هذه المقايسات تكون الامم المتحدة والتأويل (أي α 5 -integrin منع الأجسام المضادة لن تحول دون التصاق، أو انتشار الغزو بالمقارنة مع الأجسام المضادة السيطرة). سابقا، وقد وجدنا أن بعض الثقافات عضوي النمط سوف يغسل على تغيير وسائل الإعلام أو برنامج تلفزيوني غسل خلال فحوصات. وبالإضافة إلى ذلك، إذا كانت خلايا سرطان المبيض قد لقوا حتفهم أو لم انتعشت لفترة كافية من التربسين هضم integrins لإعادة صريحة، فإن فحوصات لا تعمل. ولذلك، فمن المهم دائما أن يكون لها السيطرة الإيجابية والسلبية في كل تجربة حتى يمكن تقييم نوعية الثقافة عضوي النمط والمبيض فحص الخلايا السرطانية. كما هو موضح هنا، الببتيد RGD، ألفا وبيتا 5 -integrin 1 -integrin منع الأجسام المضادة عن تحول دون المبيض التصاق الخلايا السرطانية، والغزو وانتشار لثقافة عضوي النمط ويمكن استخدامها كما يخدع إيجابيأخر يسيطر في المقايسات في المستقبل. وبالمثل، β 4 -integrin منع الأجسام المضادة لم يؤثر على المبيض التصاق الخلايا السرطانية، والغزو وانتشار لثقافة عضوي النمط ويمكن استخدامها كوسيلة لمراقبة سلبية في المقايسات في المستقبل.
الشكل 1. الأنسجة من ورم خبيث ثربية البشري. الهيماتوكسيلين ويوزين صمة (A) الثرب البشري العادي (MC، والخلايا الظهارية، فيبوناتشي، الخلايا الليفية، عدي، الخلايا الشحمية) و (B) المبيض سرطان ورم خبيث ثربية (الأرصاد الجوية، المبيض الانبثاث سرطان). منع في لوحات = 100 ميكرون في الطول. (C) تخطيطي لنموذج عضوي النمط 3D من المبيض الانبثاث سرطان المبيض المبكر محاكاة ورم خبيث الخلايا السرطانية إلى السطح من الثرب البشري. الرجاء انقر هنا لعرض أكبر الاصدارسيون من هذا الرقم.
يتم جمع الرقم 2. عزل خلايا الثرب الإنسان الأساسية. (A) قطعة من الثرب في الجراحة في برنامج تلفزيوني ونقلها إلى المختبر. ومكعبات الأنسجة عند 0.5 xgx 3 دقائق ونقلها إلى برنامج تلفزيوني جديد. (B) يتم نقل قطعة من الثرب إلى 10 سم طبق بتري، وغسلها مع برنامج تلفزيوني، ويتم استخدام المشارط لقطع الثرب إلى قطع صغيرة (0.5 سم 3 ). (CD) يتم جمع القطع الأنسجة باستخدام 25 مل ماصة المصلية ونقل إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل لعزل HPMC. تتم إزالة PBS من الأنبوب ومكعبات HPMC من برنامج تلفزيوني لx ج 0.5 عند 37 درجة مئوية. (MC، والخلايا الظهارية، RBC، خلايا الدم الحمراء، فيبوناتشي، الخلايا الليفية) يتم عزل (E) NOF من remaini الأنسجة الثرب نانوغرام بعد الحضانة مع هيالورونيداز وكولاجيناز النوع الثالث. وتظهر الصورة على الأنسجة بعد عملية الهضم 6- إلى 12 ساعة. ومكعبات NOF من خلال الدوران عند 0.5 x ج في RT. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. توصيف HPMC وNOF معزولة عن الأنسجة الثرب الإنسان. الصور المرحلة على النقيض من (A) خلايا الظهارية (HPMC) و (ب) الخلايا الليفية (NOF) بعد العزلة من الأنسجة الثرب. HPMC الإنسان الملون ل(C) cytokeratin 8 و (E) vimentin. NOF الإنسان الملون ل(F) vimentin، ولكن لم صمة عار ل(D) cytokeratin 8. بار = 100 ميكرون، ينطبق على جميع لوحات.ftp_upload / 53541 / 53541fig3large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. التصاق الخلايا السرطانية المبيض للثقافة عضوي النمط يعتمد-إنتغرين. تم تنفيذ (A) والتصاق مقايسة مع 50،000 خلايا سرطان المبيض fluorescently المسمى، خلايا HeyA8، كما هو موضح في قسم البروتوكول. وذكرت ومضان الإجمالي في كل بئر. الأجسام المضادة السيطرة هو مفتش الماوس. يمثل كل شريط المتوسط +/- معيار الخطأ المتوسط. ممثل (B) على النقيض من المرحلة و (C) الصور الفلورسنت من المبيض التصاق الخلايا السرطانية للثقافة عضوي النمط. بار = 100 ميكرون، ينطبق على كل من لوحات. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5. انتشار الخلايا السرطانية المبيض على ثقافة عضوي النمط يعتمد-إنتغرين. تم تنفيذ (A) إن انتشار مقايسة مع 4000 خلايا سرطان المبيض fluorescently المسمى، خلايا HeyA8، كما هو موضح في قسم البروتوكول. وأفاد عدد من الخلايا. الأجسام المضادة السيطرة هو مفتش الماوس. يمثل كل شريط المتوسط +/- معيار الخطأ المتوسط. المدمج على النقيض من المرحلة والصور الفلورسنت من المبيض انتشار الخلايا السرطانية في الثقافة عضوي النمط في (B) 24 و (C) 96 ساعة. بار = 100 ميكرون، ينطبق على كل من لوحات. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
tp_upload / 53541 / 53541fig6.jpg "/>
الرقم 6. غزو سرطان المبيض من خلال ثقافة عضوي النمط يعتمد-إنتغرين. تم تنفيذ (A) وغزو مقايسة مع 40،000 خلايا سرطان المبيض fluorescently المسمى، خلايا HeyA8، كما هو موضح في قسم البروتوكول. وذكر عدد من الخلايا الغازية (انتقلت من خلال الثقافة 3D في الجزء السفلي من إدراج). الأجسام المضادة السيطرة هو مفتش الماوس. يمثل كل شريط المتوسط +/- معيار الخطأ المتوسط. (B) على النقيض من المرحلة و (C) الصور الفلورسنت من خلايا سرطان المبيض التي غزت من خلال ثقافة عضوي النمط. بار = 100 ميكرون، ينطبق على جميع لوحات. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أنشئ نموذج عضوي النمط من المكروية البريتوني لتقييم وظيفة الفردية والجماعية (ق) من كل من المكونات الخلوية والفطرية المكروية في نشر بسرطان المبيض. وتقدم بروتوكولات محددة لطلاء وتخصيص ثقافة عضوي النمط 3D للتحقيق في المبيض التصاق الخلايا السرطانية، والانتشار، والغزو. تم عزل خلايا الثرب الإنسان الأساسية الظهارية والخلايا الليفية من المرضى واستخدامها في ممر في وقت مبكر للحفاظ على التشكل الطبيعي والاختلاف المريض. في هذا النموذج، تم الطبقات الخلايا الليفية الثرب العادية وECM (نوع الكولاجين عادة I) مع أحادي الطبقة الخلية الظهارية الإنسان الأساسية. هذا تشريحيا نموذج يحاكي بطانة البريتوني، ويسمح لنا لإعادة ودراسة الأحداث الرئيسية في المبيض الانبثاث السرطان بما في ذلك التصاق الخلايا السرطانية في المبيض، وانتشار، وغزو 8،27.
سابقا، 3D نماذج محدودة لهاأنشئت للتحقيق في التفاعلات سرطان المبيض مع المكروية 13،14،21-25، في حين أن هذا النموذج عضوي النمط 3D هو الأول لإعادة بناء الظهارية-بطانة التجويف البريتوني. يتم جمع الثرب البشري من المرضى متفاوتة في العمر والصحة. صحة الأنسجة يؤثر تأثيرا مباشرا على تقنيات الخلايا والخلايا الليفية العزلة الظهارية. تظهر الأنسجة صحة أخف في اللون مع فصيصات صغيرة جدا (1-3 ملم) مقارنة مع الأنسجة التي هي أكثر البرتقالي اللون مع الفصيصات كبيرة الحالية (> 5 ملم). غالبية HPMC تنصل من في PBS الأولي كما يتم في الأنسجة من الجراحة إلى المختبر. على صحة الأنسجة، ومع ذلك، فإن أكثر مرونة وHPMC هي إلى زوال، ويغسل PBS إضافية و1: PBS 1: التربسين هضم قد يؤدي إلى ثقافة مختلطة من خلايا HPMC وNOF. في أنسجة صحية، يمكن لبعض HPMC البقاء على قيد الحياة كولاجيناز 6 ساعة هضم، وخلاصة O / N في حل كولاجيناز 1X بالكاملويوصى سائط النمو للحصول على الثقافة NOF نقية. ملاحظة يجب أن توضع في الثرب على الفور في برنامج تلفزيوني على إزالة أو سيتم استردادها لا HPMCs من الأنسجة. وعلاوة على ذلك، إذا تم تخزين الأنسجة في برنامج تلفزيوني لفترة ممتدة من الزمن (> 2 ساعة) في RT أو في الثلاجة، وتخفيض عدد HPMCs قابلة للحياة معزولة إلى حد كبير.
هو مطلي نسبة 5 الخلايا الليفية إلى خلايا الظهارية لتقليد نسبة الخلايا الليفية إلى خلايا الظهارية في الجسم الحي 8: A 1. ومن المهم أن نلاحظ أن حجم الخلايا الظهارية المعزولة يختلف من مريض لآخر، وهذا قد يتطلب تعديل لنسبة الطلاء. الخلايا الظهارية بعض المرضى هي أصغر من ذلك بكثير؛ في هذه الحالات، ونحن لوحة ضعف عدد الخلايا الظهارية (20000). وبالإضافة إلى ذلك، يتم استخدام الخلايا الأولية دائما في وقت مبكر (1-2) مرور للحفاظ على شكلها. الخلايا الظهارية يمكن أن يكون الخلايا الظهارية مكعبية أو ضعيف، ومكعبة تصبح أكثر طويل ضعيفكما و passaged هم، أو مع زيادة التعرض لوسائل الإعلام مكيفة من خلايا سرطان المبيض أو المعاملة مع TGFβ 10.
خلايا سرطان المبيض قد تلتزم وتغزو الخلايا الظهارية من خلال الوسيطة أكثر كفاءة من الخلايا الظهارية في الظهارية من نفس أو مختلفة المرضى. عادة، أنشأنا ثقافة عضوي النمط لمدة 18 ساعة قبل بدء المقايسات الفنية مع خلايا سرطان المبيض. والخلايا الظهارية والخلايا الليفية أطول يتم تربيتها معا، والمزيد من الوقت لديهم لإفراز بروتينات مختلفة بما في ذلك البروتينات ECM، والتي يمكن أن تؤثر على سلوك خلايا سرطان المبيض. عامل مهم آخر أن تأخذ في الاعتبار عند تنفيذ هذه المقايسات هو معدل انتشار الفرق والتعبير مستوى البروتينات المرتبطة مع زيادة التصاق، والغزو، و / أو الانتشار، بما في ذلك integrins، البروتياز، وعوامل النمو، في كل سطر الخلايا السرطانية أو الإنسان الأساسي أنواع الخلايا السرطانية.الوقت وعدد من الخلايا السرطانية تستخدم في كل من المقايسات الفنية مع الثقافة عضوي النمط يحتاج إلى أن يكون الأمثل لكل خط الخلايا السرطانية أو نوع من الخلايا السرطانية الأولية. على سبيل المثال، في مقايسة التصاق وصفها، يمكن أن خلايا سرطان المبيض يكون غزو الثقافة خلال هذا الوقت.
ومن الواضح أن لا يحتوي هذا النموذج عضوي جميع مكونات المكروية البريتوني العادية مثل المناعة، البطانية، والخلايا خلية شحمية. بالإضافة إلى ذلك، فإن النموذج يعتمد على سهولة الوصول وتوفر الأنسجة البشرية الأساسية، وتستخدم فقط في الخلايا الأولية داخل الممرات الثلاثة الأولى. ومع ذلك، فإن النموذج لديه العديد من المزايا في استخدامها للخلايا الإنسان الأولية وإدماج أنواع الخلايا المتعددة التي أثبتت أن تلعب أدوارا هامة في ورم خبيث. وقد استخدم هذا النموذج للتحقيق في الجينات والبروتينات التنظيم في أنواع الخلايا الفردية (أي الخلايا السرطانية، الظهارية العادية أو الخلايا الليفية) بعدشارك في الثقافة. على وجه الخصوص، وأدوار ج-MET 28، MMP-2 9،29، E-كادهيرين 30، β 1 -integrin 10، بيتا 3 -integrin 16 ألفا 5 -integrin 10،31، وفبرونيكتين 10 في الانبثاث في وقت مبكر لديها تم استكشافها. بالإضافة إلى ذلك، فإن النموذج لديه القدرة على التوسع لتشمل المزيد من أنواع الخلايا، مثل دمج الخلايا الشحمية 6. تم تعديل نموذج والمصغره لاستخدامها في فحص عالية الإنتاجية لتحديد مثبطات جزيء صغير من المبيض الخلايا السرطانية التصاق / غزو لالمكروية البريتوني 27. وسوف تشمل التطبيقات المستقبلية لهذا النموذج دمج الخلايا المناعية في الفحص، بما في ذلك الضامة للدراسات الميكانيكية وفحص عالية الإنتاجية. وباختصار، توفر زراعة الخلايا عضوي النمط نموذجا مفيدا لتقييم التفاعلات بين المكروية البريتوني الإنسان وخلايا سرطان المبيض، مع غوالتر من توضيح الآليات الجزيئية مهمة لنشر وتقدم المرض، وتحديد الأهداف العلاجية المحتملة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Isolation and culture of primary cells | |||
| PBS | Fisher Scientific | SH3001304 | |
| Single-edged razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | |
| 15 cm culture dishes | BD Biosciences | 353025 | |
| Glass flask | ? | ? | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000044_3616914956 | |
| DMEM with L-Glutamine | Corning | 10-013-CV | |
| MEM Vitamins | Corning | 25-020-Cl | |
| MEM Nonessential amino acids | Corning | 25-025-CI | |
| Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Shaker | Thermo-Fisher | MaxQ 4450 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Incubator | Thermo-Fisher | Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator Model 3100 | |
| Trypsin EDTA, 1x (0.25%) | Corning | 25-053-CI | |
| Hyaluronidase | Worthington Biochemical | LS002592 | |
| T-75 Flasks | BD Biosciences | 353136 | |
| T-175 Flasks | BD Biosciences | 353112 | |
| Pipet tips | Rainin | P2, P10, P20, P200 and P1000 | |
| Pipet tips | Corning | Filtered tips P2, P10, P20, P200 and P1000 | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 2. Plating 3D culture | |||
| Cell Counter | Invitrogen | Countess | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10313 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Collagen Type I (Rat Tail) | BD Biosciences | 354236 | |
| 96 well plate, clear bottom, black | BD Biosciences | 353219 | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 3. Adhesion assay | |||
| Multichannel pipet | Eppendorf | Xplorer 300 | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
| Plate reader | Molecular Devices | Minimax | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 5. Invasion assay | |||
| Cell Culture Inserts (8um, 24-well) | BD Biosciences | 353097 | |
| Cotton swabs | Q-tips | cotton swabs | |
| Microscope | Zeiss | Axiovert 200m | |
| Cell Profiler | public domain | ||
| 24 well plate | BD Biosciences | 353047 | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 6. Antibodies | |||
| Anti-Integrin αVβ3 Antibody, clone LM609 | EMD Millipore | MAB1976 | |
| Beta 1 | Oncosynergy | OS2966 | |
| Alpha 5 [CD49e] | ID Pharmingen | 555615 | |
| Beta 4 [CD104] | EMD Millipore | MAB 2058 |
References
- Siegel, R., Ma, J., Zou, Z., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J. Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
- Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. Am. J. Pathol. 177, 1053-1064 (2010).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat. Med. 19, 1423-1437 (2013).
- Correia, A. L., Bissell, M. J. The tumor microenvironment is a dominant force in multidrug resistance. Drug Resist Updat. 15, 39-49 (2012).
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: Functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21, 309-322 (2012).
- Nieman, K. M., et al. Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth. Nat. Med. 17, 1498-1503 (2011).
- Daya, D., McCaughy, W. T. Pathology of the peritoneum: A review of selected topics. Semin. Diagn. Pathol. 8, 277-289 (1991).
- Kenny, H. A., Krausz, T., Yamada, S. D., Lengyel, E. Use of a novel 3D culture model to elucidate the role of mesothelial cells, fibroblasts and extra-cellular matrices on adhesion and invasion of ovarian cancer cells. Int. J. Cancer. 121, 1463-1472 (2007).
- Kenny, H. A., Kaur, S., Coussens, L. M., Lengyel, E. The initial steps of ovarian cancer cell metastasis are mediated by MMP-2 cleavage of vitronectin and fibronectin. J. Clin. Invest. 118, 1367-1379 (2008).
- Kenny, H. A., et al. Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion. J. Clin. Invest. 124, 4614-4628 (2014).
- Strobel, T., Cannistra, S. A. β1-integrins partly mediate binding of ovarian cancer cells to peritoneal mesothelium in vitro. Gynecol. Oncol. 73, 362-367 (1999).
- Strobel, T., Swanson, L., Cannistra, S. A. In vivo inhibition of CD44 limits intra-abdominal spread of a human ovarian cancer xenograft in nude mice: A novel role for CD 44 in the process of peritoneal implantation. Cancer Res. 57, 1228-1232 (1997).
- Iwanicki, M., et al. Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium. Cancer Discov. 1, 144-157 (2011).
- Lessan, K., Aguiar, D., Oegema, T. R., Siebenson, L., Skubitz, A. P. CD44 and β1 integrin mediate ovarian carcinoma cell adhesion to peritoneal mesothelial cells. Am. J. Pathol. 154, 1525-1537 (1999).
- Ahmed, N., Riley, C., Rice, G., Quinn, M. Role of integrin receptors for fibronectin, collagen and laminin in the regulation of ovarian carcinoma functions in response to a matrix microenvironment. Clin. Exp. Metastasis. 22, 391-402 (2005).
- Kaur, S., et al. β3-integrin expression on tumor cells inhibits tumor progression, reduces metastasis, and is associated with a favorable prognosis in patients with ovarian cancer. Am. J. Pathol. 175, 2184-2196 (2009).
- Niedbala, M. J., Crickard, K., Bernacki, R. In vitro degradation of extracellular matrix by human ovarian carcinoma cells. Clin. Exp. Metastasis. 5, 181-197 (1987).
- Kanemoto, T., Martin, G. R., Hamilton, T. C., Fridman, R. Effects of synthetic peptides and protease inhibitors on the interaction of a human ovarian cancer cell line (NIH:OVCAR-3) with a reconstituted basement membrane (matrigel). Invasion Metastasis. 11, 84-92 (1991).
- Rieppi, M., et al. Mesothelial cells induce the motility of human ovarian carcinoma cells. Int. J. Cancer. 80, 303-307 (1999).
- Barbolina, M. V., Adley, B. P., Ariztia, E. V., Liu, Y., Stack, M. S. Microenvironmental regulation of membrane type 1 matrix metalloproteinase activity in ovarian carcinoma cells via collagen-induced EGR1 expression. J. Biol. Chem. 282, 4924-4931 (2007).
- Burleson, K. M., et al. Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers. Gynecol. Oncol. 93, 170-181 (2004).
- Suzuki, N., et al. HMOCC-1, a human monoclonal antibody that inhibits adhesion of ovarian cancer cells to human mesothelial cells. Gynecol. Oncol. 95, 290-298 (2004).
- Kishikawa, T., et al. Two distinct pattern of peritoneal involvement shown by in vitro and in vivo ovarian cancer dissemination models. Invas. Metast. 15, 11-21 (1995).
- Casey, R. C., et al. Establishment of an in vitro assay to measure the invasion of ovarian carcinoma cells through mesothelial cell monolayers. Clin. Exp. Metastasis. 20, 343-356 (2003).
- Niedbala, M. J., Crickard, K., Bernacki, R. Interactions of human ovarian tumor cells with human mesothelial cells grown on extracellular matrix. Exp. Cell Res. 160, 499-513 (1985).
- White, E. A., Kenny, H. A., Lengyel, E. Three-Dimensional modeling of ovarian cancer. Adv. Drug Deliv. Rev. 79-80, 184-192 (2014).
- Kenny, H. A., et al. Quantitative high throughput screening using a primary human three-dimensional organotypic culture predicts in vivo efficacy. Nature Comm. , (2015).
- Sawada, K., et al. c-Met overexpression is a prognostic factor in ovarian cancer and an effective target for inhibition of peritoneal dissemination and invasion. Cancer Res. 67, 1670-1680 (2007).
- Kenny, H. A., Lengyel, E. MMP-2 functions as an early response protein in ovarian cancer metastasis. Cell cycle. 8, 683-688 (2009).
- Sawada, K., et al. Loss of E-cadherin promotes ovarian cancer metastasis via alpha 5-integrin, which is a therapeutic target. Cancer Res. 68, 2329-2339 (2008).
- Mitra, A. K., et al. Ligand-independent activation of c-Met by fibronectin and α(5)β(1)-integrin regulates ovarian cancer invasion and metastasis. Oncogene. 30, 1566-1576 (2011).
