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Medicine

Modellierung der frühen Schritte der Eierstockkrebs Verbreitung in einer organotypischen Kultur der Menschen Peritonealhöhle

doi: 10.3791/53541 Published: December 31, 2015

Protocol

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Alle beschriebenen Forschungsprotokolle wurden von der University of Chicago Institutional Review Board (IRB) überprüft worden. Einverständniserklärung wurde von jedem Patienten vor der Operation erhalten, und die Studie wurde von der University of Chicago IRB zugelassen. Einem biologischen Sicherheitsschrank Typ 2 und Handschuhe sollten beim Umgang mit menschlichem Gewebe zum Schutz und zur Gefahr der Kontamination Zellen zu reduzieren.

1. Isolierung und Kultur der Primär Nicht transformierte Stromazellen

  1. Menschliches Gewebe Entnahme und Vorbereitung.
    1. Erhalten Proben menschlicher Omentum 2 cm 3, während einer Bauchoperation entfernt wird, und unmittelbar eint Gewebe in RT Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) (2A). Ein Stück Omentum 3 cm x 2 cm in der Regel ergibt 1 Million primären humanen Mesothelzellen (HPMC) und 200.000 primäre menschliche Fibroblasten oder normale omentalis Fibroblasten (NOF).
    2. Spin down die PBS wurde das Gewebe in 0,5 × g für 3 eingetauchtmin so bald wie möglich nach der Entnahme (<2 h in PBS) und übertragen das Gewebe frischen 20 ml PBS in einem 50 ml konischen Röhrchen. Cut up Gewebe in 5 mm 3 Stück durch Zerkleinern mit Skalpellen in einem Durchmesser von 15 cm, sterile Kulturschale (2B).
  2. Primäre humane Mesothelzellen Zellisolierung 8
    1. Um HPMC zu isolieren, übertragen Sie die zerkleinerte Gewebe in 50 ml konische Röhrchen und warten Sie 1 min für die festen Stücke, an die Spitze (2C & D) zu schweben. HPMC und rote Blutzellen (RBC) in der Flüssigkeit auf dem Boden vorhanden sein. Verwenden einer Pipette, um die Flüssigkeit vom Boden des Rohres und in ein neues konisches Rohr zu entfernen. Drehen Sie die Flüssigkeit nach unten bei 0,5 × g für 3 min und saugen Sie den Überstand aus der HPMC / RBC-Pellet.
      1. Wiederholen Sie den Vorgang drei Mal: ​​20 ml PBS zu dem zerkleinerten Gewebes ermöglichen Gewebe zu steigen, zu entfernen Flüssigkeit vom Boden mit einer Pipette und in die HPMC / RBC Rohr, Spin-down, und entfernen Sie dieÜberstand. Nachdem alle Spins abgeschlossen und der Überstand wird abgesaugt, wird das Pellet HPMC und RBC enthalten.
    2. Platte alle Zellen aus dem Pellet in einen 75 cm 2 -Kolben in 15 ml Vollwachstumsmedium (DMEM mit 10% fötalem Rinderserum [FBS], 1% MEM-Vitamine [93 mg / L], 1% MEM nichtessentiellen Aminosäuren [81,4 mg / L], 1% Penicillin-Streptomycin [Pen-Strep, 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin]).
    3. Führen Sie eine sekundäre PBS zu waschen, um zusätzliche HPMCs isolieren.
      1. Für die Sekundär PBS waschen, schütteln Sie die verbleibende feste Gewebe mit 200 Upm, 37 ° C für 10 min in 20 ml PBS, dann warten 1 min für das Gewebe, um nach oben zu schweben. Entfernen der Flüssigkeit aus dem Boden des Rohrs in ein neues Gefäß, Zentrifuge bei 0,5 × g für 3 min, und den Überstand aspirieren.
      2. Teller alle HPMC / RBC aus der Sekundär PBS waschen in einem separaten 75 cm 2-Kolben in 15 ml Vollwachstumsmedium.
    4. Um jede r isolierenemaining HPMC, Schütteln des zerkleinerten Gewebes mit 200 Upm, 37 ° C Grad für 10 min in 20 ml einer 1: 1 0,25% Trypsin 25 mM EDTA: PBS-Lösung, bezogen auf das Volumen. Lassen Sie das Gewebe zu erheben, sammeln die Flüssigkeit am Boden des Röhrchens in eine neue 50-ml-Tube und Spin-down bei 0,5 gx 3 min.
      1. Saugen Sie den Überstand und die Platte alle HPMC / RBC in einem separaten 75 cm 2-Kolben in 15 ml Vollwachstumsmedium.
    5. Kultur die plattierten Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 in einer feuchten Umgebung. Vorschub plattierten Zellen durch Zugabe von 15 ml Vollwachstumsmedium an den Tagen 3 und 5 ohne Entfernen der verbrauchten Medien. HPMC kann für 5-7 Tage vor der Spaltung kultiviert werden.
      1. Verwenden Niedergang HPMC (bis Durchgang 2) bei allen Versuchen zur Entdifferenzierung und Änderung der ursprünglichen Phänotyp zu minimieren. Verwenden Sie ein Weitfeldmikroskop vorzugsweise mit einem 20x-Objektiv mit Kunststoff-Differential-Interferenz-Kontrast-Funktionen oder 4-20x Ziel mit Phasenkontrast capabilities (Phasenkontrastfilter auf Mikroskop) für die Aufnahme aller Bilder von Zellen und eine 10-fach Objektiv () in Hellfeld zu analysieren immunhistochemischen 3,3'-Diaminobenzidin (DAB) Färbung.
    6. Bestätigen, dass die HPMC sind quaderförmig und Express Cytokeratin 8 und Vimentin, indem Immunhistochemie 8 (3A, C, E).
  3. NOF Isolierung 8
    1. Bereiten Sie 10 ml des Vorrates des Collagenase Typ III-Lösung (10x) durch die Kombination einer 1: 1: 1-Mischung von 100x Pen-Strep: 1.500 Einheiten Aktivität / ml Collagenase Typ III: 714 Units Aktivität / ml Hyaluronidase in PBS.
    2. Schütteln des zerkleinerten Omentum Gewebe, nachdem HPMC Isolation bleibt bei 200 rpm, 37 ° C für 6 Stunden in 10 ml des 10x Collagenase Typ III-Lösung in einem serumfreien Medium verdünnt (DMEM mit 1% MEM-Vitamine [93 mg / L], 1% MEM nichtessentiellen Aminosäuren [81,4 mg / L], 1% Penicillin-Streptomycin [Pen-Strep, 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin]). Verdauten Gewebe undurchsichtigen schauen und kann einige faserige Ablagerungen (2E) haben.
    3. Zentrifugieren Sie die Lösung, die NOF-Zellen in Suspension bei 0,5 × g für 3 min bei RT, saugen Sie den Überstand und die Platte des Pellets in einem 75 cm 2-Kolben in 13 ml Vollwachstumsmedium.
    4. Entfernen Sie alte Medien und ersetzen Sie sie durch 15 ml frisches Vollwachstumsmedium nach 24 Stunden. NOF können für 1-3 Tage vor der Spaltung kultiviert werden. Hinweis Proliferation des NOF wird aufhören, wenn die Zellen Konfluenz erreichen.
    5. Bestätigen Sie, dass die primären menschlichen Fibroblasten sind flache, langgestreckte Zellen und exprimieren Vimentin aber nicht Cytokeratin-8 durch Ausführen Immunhistochemie 8 (3B, D, F). Verwenden Niedergang NOF für Experimente (im Idealfall vor dem Durchgang 3) Entdifferenzierung zu minimieren und Änderung der ursprünglichen Phänotyp. Verwenden Sie ein Weitfeld-Mikroskop mit einem 20x-Objektiv mit Kunststoff-DIC-Fähigkeiten dafür verantwortlich, alle Phasenbilder von Zellen,und eine 10-fach Objektiv in Hellfeld zu analysieren immunhistochemischen DAB-Färbung.

2. Überzug die organotypische Kultur 8

  1. Release NOF vom 75 cm Kulturkolben durch Spülen mit 10 ml PBS, gefolgt von 3 ml 0,25% Trypsin / 25 mM EDTA für nicht mehr als 5 min. Neutralisieren Trypsin mit mindestens 3-fache des Volumens der Vollwachstumsmedium.
  2. Übertragen Sie mit Trypsin-Zellen in einem 50 ml konischen Rohr und Spin-down bei 0,5 gx 3 min. Überstand entfernen und bringen Zellen wieder in 5 ml Vollwachstumsmedium. Verwenden Sie einen Zellenzähler, um die Zellen von der Kulturflasche gewonnen zu zählen.
  3. Verdünnte Zellen in dem entsprechenden Volumen der vollen Wachstumsmedien zu 2.000-4.000 NOF pro 100 & mgr; l auf eine schwarze, klarem Boden, 96-Well-Platte Platte. Mit 0,5 ug / 100 ul Rattenschwanzkollagen I zu dem Zellgemisch vor dem Plattieren. Lassen Zellen sitzen bei 37 ° C in 5% CO 2 in einer feuchten Umgebung für mindestens 4 Stunden, oder bis die Zellenan der Plattenoberfläche haftet.
  4. Lassen HPMC von der Kulturflasche mit den gleichen Schritten in 2.1 und 2.2 beschriebenen Methoden. Verdünnte Zellen in der entsprechenden Menge an Vollwachstumsmedium auf 10.000-20.000 HPMC pro 50 & mgr; l auf der Oberseite der NOF in 96-Well-Platten bereits mit Kollagen I überzogene Platte. Lassen Sie die Zellen sitzen bei 37 ° C in 5% CO 2 in einer feuchten Umgebung für mindestens 18 Stunden vor Beginn der Experimente.
  5. Kultur grün fluoreszierende Protein (GFP) exprimierenden HeyA8 Eierstockkrebszellen in vollem Wachstum Medien. HeyA8 Ovarkrebszellen fluoreszenz durch Expression von einem lentiviralen Vektor, der copepod CGFP (pcdh-CMV-MCS-EF1) markiert. HeyA8 Ovarkrebszellen sollte 80-90% konfluent waren am Tag der Verwendung (logarithmischen Phase) sein. Lassen Zellen von der Kulturplatte und zählen mit den gleichen in Schritten von 2,1 bis 2,2 für die Primärzellen beschriebenen Methoden.
  6. Lassen Sie Eierstockkrebszellen in Vollwachstumsmedium für 15-20 Minuten bei 37 ° C in eine erholenkonischen Röhrchen mit dem Deckel lose verschlossen.

3. Adhäsionsassay 8

  1. Nach der Wiederherstellung zu pelletieren, die Eierstockkrebszellen durch Spinnen für 3 min bei 0,5 xg und entfernen Sie den Überstand und verdünnt, die Zellen in das entsprechende Volumen von serumfreien Medien, um eine Konzentration von 50.000 Zellen / 100 ul zu erreichen.
  2. Kehren Sie die 96-Well-Platten mit den HPMC / NOF organotypischen Kulturen zu verbrauchten Medien zu entfernen, und fügen Sie 100 ul der Krebszellsuspension in Serum-freiem Medium in jede Vertiefung. Inkubieren der Platte bei 37 ° C in 5% CO 2 in einer feuchten Umgebung für 30 min bis 4 h.
  3. Kehren Sie die Platte mit 96 Vertiefungen, um Medien und nicht-anhaftende Zellen zu entfernen. Verwenden Sie ein Mehrkanalpipette mit geringer Leistung, um vorsichtig und sanft Je 100 ul PBS in jede Vertiefung, und invertieren Platte wieder. Wiederholen Sie die PBS waschen einmal.
  4. Kehren Sie zum PBS entfernen und 100 ul 4% Paraformaldehyd in jede Vertiefung. Damit die Platte für 20 mi sitzenn der Zellen zu reparieren. Nach 20 Minuten, die Platte umdrehen und fügen Sie 100 ul PBS.
  5. Man beachte, dass die Gesamtfluoreszenz Wells können gemeldet werden, oder die Anzahl von Zellen quantifiziert werden kann. Zur Quantifizierung erste Platte eine Standardkurve in Doppelbestimmung unter Verwendung HeyA8 Zellen bei einer Konzentration von 1 Million Zellen / ml.
    1. Stellen Sie die Standardkurve indem sie zum Stillstand 1 Million Zellen, Entfernen von Medien, und es ihnen ermöglicht, in 1 ml 4% Paraformaldehyd für 20 Minuten sitzen.
    2. Spin-Zellen wieder und bringen Sie in 1 ml PBS (Nachzählung Zellen 1 Million / ml-Konzentration, um zu bestätigen). Platte 50000, 40000, 30000, 20000, 10000, 5000, 1000 und 0 Zellen pro Vertiefung in doppelten und fügen PBS zur endgültigen Gesamtvolumen von 50 ul in jede Vertiefung.
  6. Unten lesen Sie die Kulturplatte auf einem Fluoreszenzplattenlesegerät (Anregung = 488 nm, Emission = 528 nm), Skalierung hohen Brunnen (50000 auf Standardkurve). Verwenden Sie die Standardkurve zu berechnen, wie viele Eierstockkrebszellen auf die organotyp haltenic Kultur in jeder Vertiefung (4A-C).

4. Proliferationstest 10

  1. Nachdem die Eierstockkrebszellen zu erholen (siehe Schritte 2.5 und 2.6 oben), pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugieren für 3 min bei 0,5 × g und dann zu verdünnen, die Zellen in das entsprechende Volumen von 1% FBS Medien (DMEM mit 1% FBS, 1% MEM Vitamine [93 mg / L], 1% MEM nichtessentiellen Aminosäuren [81,4 mg / L], 1% Penicillin-Streptomycin [Pen-Strep, 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin]), um eine Konzentration von 4000 Zellen zu erreichen / 150 ul.
  2. Kehren Sie die 96-Loch-Platte mit den HPMC / NOF organotypischen Kulturen, um verbrauchte Medium in jede Vertiefung zu entfernen, und fügen Sie 150 ul der Krebszelle Suspension 1% FBS Medien. Inkubieren der Platte bei 37 ° C in 5% CO 2 in einer feuchten Umgebung für 72 Stunden.
  3. Unten lesen Sie die Kulturplatte auf einem Fluoreszenzplattenlesegerät einmal täglich (Anregung = 488 nm, Emission = 528 nm), um die relative Verbreitung bewertender Zellen. Weiterhin den Test 96 Stunden, wenn der Medien bei 48 h (5A-C). Achten Sie darauf, die Kultur zu stören beim Medienwechsel (Umdrehen der Platte ist bevorzugt).

5. Invasion Assay 8

  1. Vor der Beschichtung der 3D-Kultur, fügen 7,5 & mgr; g Rattenschwanz Kollagen I in 200 ul PBS auf eine 24-Well-Kulturplatte Einsatz (8 & mgr; m Porengröße). Lassen Sie die Platte Inkubat O / N, dann vorsichtig die PBS mit einer Pipette unmittelbar vor dem Beschichten des HPMC / NOF organotypische Kultur auf die Kollagen-beschichteten Einsätze (Schritt 2, oben).
  2. Bereiten Sie die Eierstockkrebszellen, wie in Schritt 3.1. Um die Eierstockkrebszellen auf die organotypischen Kulturen an den Einsätzen Platte vorsichtig mit einer Pipette, um überschüssiges Medium aus dem oberen der Einsätze zu entfernen. Zugabe von 100 ul der Ovarialkarzinom-Zellsuspension in serumfreien Medien in jede Kammer.
  3. Fügen Sie 750 ul Vollwachstumsmedium in das Bohrloch unterhalb des Einsatzes, um Krebszellen in induzierenvasion in den organotypischen Kulturen. Inkubieren der Platte bei 37 ° C in 5% CO 2 in einer feuchten Umgebung für 24 Stunden.
    Hinweis: Eierstockkrebszellen, die die organotypische Kultur wird der Einsatz zu überqueren und bleiben auf der unteren Seite des Einsatzes einzudringen.
  4. Nach 24 Stunden, fassen Sie den Einsatz mit einer Zange und kurz abspülen in einen Becher mit PBS, bewegen Sie dann den Einsatz in eine leere gut. Gestrüpp der Oberseite jeder Einsatz mit beidseitig einer Wattestäbchen für insgesamt 1 min. Stellen Sie schnell den Einsatz in eine Platte mit 750 & mgr; l 4% Paraformaldehyd in jede Vertiefung. Lassen Sie jeder Einsatz in Paraformaldehyd für 10 Minuten, bevor die Übertragung der Einlagen in Vertiefungen mit 750 & mgr; l PBS gefüllt sitzen.
  5. Sehen Sie sich die Invasion Zellen (geklebt und an der Unterseite des Inserts fixiert) mit einem Mikroskop bei 2,5-facher Vergrößerung. Wenn der gesamte Brunnen ist im Blickfeld, passen Sie die Vergrößerung auf 10-fach und nehmen Sie 5 Bildern, einer nahe dem Zentrum und 1 in jedem Quadranten des Brunnens, die VermeidungAufnehmen von Bildern, die zu nahe an den Kanten. Folgen dem gleichen Muster für jede Vertiefung.
  6. Verwenden der Herstellerprogramm, um die Anzahl der Zellen in jeder Bild zählen, eine durchschnittliche Anzahl an Zellen in jeder Vertiefung (6A-C) eingedrungen pro Feld entsprechend ihrem Protokoll zu erhalten.

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Representative Results

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Die organotypische Kultur wurde hergestellt durch zunächst Mischen primären humanen Fibroblasten, die mit Collagen Typ I und dann Überlagerung dieser Kultur mit der 5-fachen Anzahl von Mesothelzellen montiert. Die Kultur wurde für mindestens 18 Stunden inkubiert, bevor Eierstockkrebszellen wurden zugegeben, um die Adhäsion, Invasion oder Proliferation zu untersuchen. Jeder Test wurde mit mehrfachen wiederholten (n = 3-5) von verschiedenen Patienten und zahlreiche Vertiefungen erhaltenen 3D-Kulturen wurden in jeden Zustand für die Haftung getestet (n = 5), Proliferation (n = 5) und Invasionsassays (n = 3) . Eierstockkrebszellen in die 3D organotypische Kultur nach 4 h (Figur 4) geklebt, vermehrt auf die Kultur nach 72 h (6-fachen HeyA8 Zellverdopplungszeit) (Figur 5) und nach 24 Stunden (Figur 6) eingedrungen. Die Adhäsion, Proliferation und Invasion von HeyA8 Eierstockkrebszellen war Integrin-abhängige (Abbildung 4-6). Insbesondere wird das RGD-Peptid und Blockier ANTIBodies zu & agr; 5-Integrin, β 1 -Integrin und α v β 3 -Integrin das Ovarialkarzinom Zelladhäsion an organotypischen Kultur inhibiert wird, während die RAD Peptid Kontroll-Antikörper und & bgr; 4-Integrin-Antikörper nicht (Figur 4) 10. Im Proliferationsassay die RGD-Peptid und blockierende Antikörper zu & agr; 5 - und & bgr; 1-Integrin inhibiert Ovarialkarzinom-Zellproliferation auf die organotypische Kultur, während die RAD Peptid, Kontrollantikörper, V & bgr; 3 -Integrin α Antikörper und & beta; 4-Integrin Antikörper nicht (5). In der Invasion Assay wird die RGD-Peptid und blockierende Antikörper gegen 5 & alpha; - und & bgr; 1 -Integrin gehemmt, während die α v β 3 -Integrin-Antikörper verstärkt Eierstockkrebszellinvasion durch die 3D organotypische Kultur. Die RAD-Peptid, Kontroll-Antikörper und β4-Integrin-Antikörper hatte keinen Einfluss Invasion (Abbildung 6). Selten sind diese Assays un interpretierbare (dh α 5 -Integrin-blockierenden Antikörper nicht Adhäsion, Proliferation oder Invasion zu inhibieren, verglichen mit dem Kontrollantikörper). Früher haben wir gefunden, dass bestimmte organotypischen Kulturen wird entfernt beim Wechsel der Medien oder PBS Wasch während den Tests zu waschen. Darüber hinaus, wenn die Eierstockkrebszellen tot sind oder noch nicht lange genug aus dem Trypsin gewonnen verdauen neu express Integrine, werden die Tests nicht. Daher ist es immer wichtig, um eine positive und negative Kontrolle in jedem Test haben, so dass die Qualität des organotypische Kultur und Eierstockkrebs-Zellassay beurteilt werden kann. Wie hier gezeigt, die RGD-Peptid, a 5 -Integrin und & bgr; 1 -Integrin blockierende Antikörper alle gehemmten Eierstock-Krebs Zelladhäsion, Invasion und Proliferation auf die organotypische Kultur und könnte als positive con verwendet werdenKontrollen in zukünftigen Tests. Ebenso β 4 -Integrin-blockierenden Antikörper nicht beeinflusst Ovarialkarzinom Zelladhäsion, Invasion und Proliferation auf die organotypische Kultur und könnte als eine negative Kontrolle in zukünftige Assays verwendet werden.

Abbildung 1
Abbildung 1. Histologie des Menschen omentalis Metastasierung. Hämatoxylin und Eosin-Färbung von (A) normale menschliche Netz (MC, Mesothelzellen, Fib, Fibroblasten, Adi, Adipozyten) und (B), Eierstockkrebs omentalis Metastasen (Met, Eierstockkrebs Metastasierung). Bar in Tafeln = 100 & mgr; m in der Länge. (C) Schematische Darstellung des 3D organotypischen Modell von Eierstockkrebs Metastasen imitiert frühen Eierstockkrebszell Metastasen in der Oberfläche des menschlichen Netzes. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehension von dieser Figur.

Figur 2
Figur 2. Isolierung von primären humanen omental Zellen. (A) ein Stück Netz an der Operation in PBS gesammelt und in das Labor transportiert. Das Gewebe wird bei 0,5 × g × 3 min pelletiert und auf frisches PBS überführt. (B) das Stück des Netzes ist mit einem 10 cm-Petrischale mit PBS gewaschen wurde, und Skalpelle werden verwendet, um das Netz in kleine Stücke (0,5 cm geschnitten 3 ). (CD) Die Gewebestücke werden unter Verwendung eines 25 ml serologischer Pipette gesammelt und in ein 50 ml konisches Röhrchen zur Isolierung von HPMC übertragen. PBS aus dem Röhrchen entfernt und HPMC werden vom PBS pelle eine 0,5 × g bei 37 ° C. (MC, Mesothelzellen, RBC, rote Blutkörperchen, Fib, Fibroblasten) (E) werden von der NOF remaini isoliert ng omentalis Gewebe nach Inkubation mit Hyaluronidase und Collagenase Typ III. Das Bild zeigt das Gewebe nach einer 6- bis 12-Stunden-Verdauung. NOF werden durch Spinnen bei 0,5 × g bei RT pelletiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Figur 3. Charakterisierung der HPMC und NOF isoliert aus menschlichem Gewebe Omentum. Die Phasenkontrast-Aufnahmen (A) Mesothelzellen (HPMC) und (B) Fibroblasten (NOF) nach dem Trennen vom Netz Gewebe. Menschliche HPMC für (C) und Cytokeratin-8 (E) Vimentin gefärbt. Menschen NOF für (F) Vimentin gefärbt, aber nicht für (D) Cytokeratin 8 Bar = 100 & mgr; m zu färben, gilt für alle Panels.ftp_upload / 53.541 / 53541fig3large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 4
Abbildung 4. Ovarialkarzinom Zelladhäsion an organotypischen Kultur Integrin abhängig. (A) Der Adhäsionstest wurde mit 50.000 fluoreszenzmarkierten Eierstockkrebszellen, HeyA8 Zellen durchgeführt, die in dem Protokoll beschrieben. Die gesamte Fluoreszenz in jeder Vertiefung wird berichtet. Das Steuer Antikörper Maus-IgG. Jeder Balken stellt den Mittelwert +/- Standardfehler Mittelwert. Vertreter (B) Phasenkontrast und (C) Fluoreszenzbilder von Ovarialkrebs Zelladhäsion an die organotypische Kultur. Bar = 100 & mgr; m, gilt für beide Panels. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 5
Figur 5. Eierstockkrebszellproliferation auf die organotypische Kultur Integrin abhängig. (A) Der Proliferationsassay wurde mit 4.000 fluoreszenzmarkierten Eierstockkrebszellen, HeyA8 Zellen durchgeführt, die in dem Protokoll beschrieben. Die Gesamtzahl von Zellen berichtet. Das Steuer Antikörper Maus-IgG. Jeder Balken stellt den Mittelwert +/- Standardfehler Mittelwert. Fusionierte Phasenkontrast und Fluoreszenzbilder von Eierstockkrebs-Zellproliferation in der organotypischen Kultur auf (B) 24 und (C) 96 Std. Bar = 100 & mgr; m, gilt für beide Panels. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Figur 6. Eierstockkrebsinvasion durch die organotypische Kultur Integrin abhängig. (A) Die Invasionsassay wurde mit 40.000 fluoreszenzmarkierten Eierstockkrebszellen, HeyA8 Zellen durchgeführt, die in dem Protokoll beschrieben. Die Anzahl der eindringenden Zellen (durch das 3D-Kultur mit dem Boden des Einsatzes bewegt wird) wird berichtet. Das Steuer Antikörper Maus-IgG. Jeder Balken stellt den Mittelwert +/- Standardfehler Mittelwert. (B) Phasenkontrast und (C) Fluoreszenzbilder von Eierstockkrebszellen, die durch die organotypische Kultur eingedrungen. Bar = 100 & mgr; m, gilt für alle Panels. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

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Ein organModell der Bauchmikroumgebung wurde gegründet, um die individuellen und kollektiven Funktion (en) der beiden zellulären und angeborene Komponenten der Mikroumgebung bei Eierstockkrebs Verbreitung zu bewerten. Die spezielle Protokolle für die Beschichtung und das Anpassen der 3D organotypische Kultur zu Eierstockkrebs Zell-Adhäsion, Proliferation und Invasion zu untersuchen sind. Primäre humane omentalis Mesothelzellen und Fibroblasten wurden von Patienten isoliert und in einem frühen Durchgang verwendet, um normale Morphologie und Patienten Variation zu erhalten. In diesem Modell wurden normale omentalis Fibroblasten und ECM (typischerweise Kollagen Typ I) mit einem primären humanen Mesothelzellen Monoschicht geschichtet. Dieses Modell histologisch ahmt die Bauchfellfutter, und ermöglicht es uns, neu erstellen und zu prüfen wichtigsten Ereignisse bei Eierstockkrebs Metastasen einschließlich Eierstockkrebs Zell-Adhäsion, Proliferation und Invasion 8,27.

Zuvor haben begrenzte 3D-Modellewurde gegründet, um Eierstockkrebs Wechselwirkungen mit der Mikroumgebung 13,14,21-25 zu untersuchen, während diese 3D organotypische Modell ist der Erste, der den Bau der Mesothelzellen-Auskleidung der Bauchhöhle neu zu erstellen. Das menschliche Netz wird von Patienten in unterschiedlichem Alter und Gesundheit gesammelt. Die Gesundheit des Gewebes wirkt sich unmittelbar auf die Mesothelzellen und Fibroblasten-Isolationstechniken. Je gesünder Gewebe erscheint heller in der Farbe mit sehr kleinen Läppchen (1-3 mm) im Vergleich zu Gewebe, das mehr in der Farbe orange mit großen Läppchen vorhanden (> 5 mm) ist. Die Mehrheit der HPMC abzustreifen in der Anfangs PBS, wie das Gewebe von der Operation an das Labor durchgeführt. Desto gesünder das Gewebe jedoch umso stabiler ist die HPMC sind, um die Entfernung und zusätzliche Waschungen mit PBS und die 1: 1 PBS: Trypsin-Verdau in einer Mischkultur aus HPMC und NOF Zellen führen. In den gesünderen Gewebe können einige HPMC überleben den 6-Stunden-Kollagenase zu verdauen, und eine Digest-O / N in 1x Kollagenaselösung in vollerWachstumsmedien wird empfohlen, eine reine NOF Kultur zu erhalten. Beachten Sie, das Netz muss unverzüglich in PBS bei Entfernung platziert werden oder keine HPMCs wird aus Gewebe gewonnen werden. Außerdem, wenn das Gewebe in PBS für einen längeren Zeitraum (> 2 h) bei RT oder in einem Kühlschrank aufbewahrt, die Zahl der lebenden HPMCs isoliert wird deutlich reduziert.

Eine 1: 5-Verhältnis von Fibroblasten zu Zellen Mesothelzellen plattiert ist, um das Verhältnis von Fibroblasten zu imitieren Zellen in vivo 8 Mesothelzellen. Es ist wichtig zu beachten, dass die Größe der isolierten Mesothelzellen variiert von Patient zu Patient unterschiedlich und kann dies Anpassung des Beschichtungsverhältnisses erforderlich. Mesothelzellen einiger Patienten viel kleiner sind; in diesen Fällen wird man die Platte die doppelte Anzahl von Mesothelzellen (20000). Zusätzlich werden die primären Zellen immer in einem frühen (1-2) Durchgang verwendet, um die Morphologie zu erhalten. Mesothelzellen kann quaderförmigen oder spindeldürren und quaderförmige Mesothelzellen mehr spindeldürren gewordenwie sie sind, oder mit einer größeren Belastung durch konditioniertes Medium von Eierstockkrebszellen oder die Behandlung mit TGF- & bgr; 10 passagiert.

Eierstockkrebszellen zu haften und dringen durch die mesenchymalen Mesothelzellen effizienter als der epithelialen Mesothelzellen aus den gleichen oder verschiedenen Patienten. In der Regel haben wir das organotypische Kultur 18 Stunden vor dem Beginn der funktionelle Assays mit Eierstockkrebszellen. Je länger die Mesothelzellen und Fibroblasten kultiviert werden, zusammen, um so mehr Zeit, sie zu verschiedenen Proteinen, einschließlich ECM-Proteine, die das Verhalten der Eierstockkrebszellen beeinflussen können, sekretieren können. Ein weiterer wichtiger Faktor zur Berücksichtigung in jedem Krebszelllinie oder primären humanen nehmen bei der Durchführung dieser Tests ist die differentielle Proliferationsrate und Expressionsniveau von Proteinen mit erhöhter Adhäsion, Invasion und / oder die Proliferation, einschließlich Integrine, Proteasen und Wachstumsfaktoren verbunden sind, Krebszelltypen.Die Zeit und die Anzahl der Krebszellen in jedem der funktionellen Assays mit der organotypischen Kultur verwendet wird, muss für jeden Krebszelllinie oder der Art des primären Krebszelle optimiert werden kann. Zum Beispiel in der beschriebenen Adhäsionstest, Eierstockkrebszellen könnte Invasion der Kultur während dieser Zeit.

Offensichtlich bedeutet dies organotypischen Modell enthält alle Komponenten der normalen Peritonealdialyse Mikro wie Immunpräzipitation, Endothelzellen und Zellen Adipozyten. Darüber hinaus das Modell hängt von der Zugänglichkeit und Verfügbarkeit von primären menschlichen Gewebes, da die Primärzellen sind nur innerhalb der ersten drei Durchgänge verwendet. Jedoch hat das Modell viele Vorteile in der Verwendung von primären humanen Zellen und Einbau mehrerer Zelltypen, die nachweislich eine wichtige Rolle bei der Bildung von Metastasen. Dieses Modell wurde genutzt, um Gen- und Proteinregulierung in den einzelnen Zelltypen (dh Krebszellen, normalen Mesothelzellen oder Fibroblasten-Zellen) nach der UntersuchungCo-Kultur. Insbesondere sind die Rollen von c-Met 28, MMP-2 9,29, E-Cadherin-30, β 1 -Integrin-10 & bgr; 3 -Integrin 16, & agr; 5-Integrin 10,31 und Fibronectin 10 in frühen Metastasierung erforscht. Zusätzlich hat das Modell die Möglichkeit, zu erweitern, um mehrere Zelltypen, wie den Einbau von Adipozyten 6 enthalten. Das Modell wurde modifiziert und für den Einsatz in Hochdurchsatz-Screening, um kleine Moleküle als Inhibitoren von Eierstockkrebs Zell-Adhäsion / Invasion in die Bauchmikroumgebung 27 zu identifizieren miniaturisiert. Zukünftige Anwendungen dieses Modells umfassen die Einarbeitung von Immunzellen in dem Assay, einschließlich Makrophagen für mechanistische Studien und Hochdurchsatz-Screening. Zusammenfassend stellt die organotypische Zellkultur ein nützliches Modell, um die Wechselwirkungen zwischen dem menschlichen Bauchmikroumgebung und Eierstockkrebszellen zu bewerten, mit dem goal Aufklärung wichtig molekularen Mechanismen der Verbreitung und Fortschreiten der Krankheit, und potenzielle therapeutische Ziele.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Isolation and culture of primary cells
PBS Fisher Scientific SH3001304
Single-edged razor blades Fisher Scientific 12-640
15 cm culture dishes BD Biosciences 353025
Glass flask ? ?
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 16000044_3616914956
DMEM with L-Glutamine Corning 10-013-CV
MEM Vitamins Corning 25-020-Cl
MEM Nonessential amino acids Corning 25-025-CI
Penicillin-Streptomycin Corning 30-002-CI
Shaker  Thermo-Fisher MaxQ 4450
Centrifuge Eppendorf 5702
Incubator Thermo-Fisher Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator Model 3100
Trypsin EDTA, 1x (0.25%) Corning 25-053-CI
Hyaluronidase Worthington Biochemical LS002592
T-75 Flasks BD Biosciences 353136
T-175 Flasks BD Biosciences 353112
Pipet tips Rainin P2, P10, P20, P200 and P1000
Pipet tips Corning Filtered tips P2, P10, P20, P200 and P1000
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
2. Plating 3D culture
Cell Counter Invitrogen Countess
Countess Cell Counting Chamber Slides Invitrogen C10313
Trypan Blue Stain (0.4%) Gibco 15250-061
Collagen Type I (Rat Tail) BD Biosciences 354236
96 well plate, clear bottom, black BD Biosciences 353219
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
3. Adhesion assay
Multichannel pipet Eppendorf Xplorer 300
Paraformaldehyde solution 4% in PBS Santa Cruz Biotechnology sc-281692
Plate reader Molecular Devices Minimax
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
5. Invasion assay
Cell Culture Inserts (8um, 24-well) BD Biosciences 353097
Cotton swabs Q-tips cotton swabs
Microscope Zeiss Axiovert 200m
Cell Profiler public domain
24 well plate BD Biosciences 353047
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
6. Antibodies
Anti-Integrin αVβ3 Antibody, clone LM609 EMD Millipore MAB1976
Beta 1  Oncosynergy OS2966
Alpha 5 [CD49e] ID Pharmingen 555615
Beta 4 [CD104] EMD Millipore MAB 2058

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References

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Modellierung der frühen Schritte der Eierstockkrebs Verbreitung in einer organotypischen Kultur der Menschen Peritonealhöhle
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Peters, P. N., Schryver, E. M., Lengyel, E., Kenny, H. Modeling the Early Steps of Ovarian Cancer Dissemination in an Organotypic Culture of the Human Peritoneal Cavity. J. Vis. Exp. (106), e53541, doi:10.3791/53541 (2015).More

Peters, P. N., Schryver, E. M., Lengyel, E., Kenny, H. Modeling the Early Steps of Ovarian Cancer Dissemination in an Organotypic Culture of the Human Peritoneal Cavity. J. Vis. Exp. (106), e53541, doi:10.3791/53541 (2015).

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