Protocol
כל פרוטוקולי המחקר המתוארים נבדקו על ידי אוניברסיטת שיקגו Institutional Review Board (IRB). הסכמה מדעת שהתקבלה מכל מטופל לפני הניתוח והמחקר אושר על ידי אוניברסיטת שיקגו IRB. יש להשתמש בסוג בטיחות ביולוגית קבינט 2 וכפפות בעת טיפול רקמות אנושיות להגנה וכדי להפחית את הסיכון של זיהום תאים.
1. בידוד והתרבות של תאי סטרומה לא הותמר הראשיים
- אוסף אדם רקמה והכנה.
- להשיג דגימות של omentum האנושי, 2 סנטימטר 3, הוסר במהלך ניתוח בבטן, ולטבול מייד רקמה מלוחים RT-פוספט (PBS) (איור 2 א). חתיכת omentum 3 סנטימטרים X 2 סנטימטר בדרך כלל מניבה 1 מיליון תאים ראשוניים אדם mesothelial (HPMC) ו200,000 fibroblasts אדם ראשוני או fibroblasts הנורמלי omental (נוף).
- ספין למטה PBS הרקמה הייתה שקועה ברמה של 0.5 XG במשך 3דקות בהקדם האפשרי לאחר איסוף (<2 שעות בPBS) ולהעביר את הרקמה עד 20 מיליליטר PBS הטרי בצינור חרוטי 50 מיליליטר. לחתוך את הרקמה לתוך 3 חתיכות 5 מ"מ על ידי מיותר עם אזמלים בקוטר 15 סנטימטר, צלחת תרבות סטרילי (איור 2).
- בידוד תא mesothelial האנושי ראשוני 8
- כדי לבודד HPMC, להעביר את הרקמות טחונות לתוך צינורות חרוטי 50 מיליליטר ולחכות 1 דקות לחתיכות מוצקות ללצוף למעלה (איור 2 ג & D). HPMC ותאי דם אדומים (RBC) יהיו נוכחים בנוזל שבתחתית. השתמש pipet כדי להסיר את הנוזל מהחלק התחתון של הצינור ולתוך צינור חרוטי חדש. ספין הנוזל מטה ברמה של 0.5 XG במשך 3 דקות ולשאוב supernatant מגלולת HPMC / RBC.
- חזור על התהליך שלוש פעמים: להוסיף 20 מיליליטר PBS לרקמות טחונות, לאפשר רקמה לעלות, להסיר נוזל מהתחתית עם טפטפת ולתוך צינור HPMC / RBC, ספין למטה, ולהסיר אתsupernatant. אחרי הכל הספינים הושלמו וsupernatant הוא aspirated, גלולה תכיל HPMC וRBC.
- צלחת כל התאים מהגלולה לבקבוק 2 75 סנטימטר ב 15 מיליליטר של תקשורת צמיחה מלאה (DMEM עם סרום 10% שור עוברי [FBS], ויטמיני ממ 1% [93 מ"ג / ליטר], חומצות אמינו החיוני ממ 1% [81.4 מ"ג / ליטר], 1% סטרפטומיצין פניצילין [פן-דלקת, 100 U / פניצילין מיליליטר ו -100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין]).
- בצע לשטוף PBS משניים לבודד HPMCs נוסף.
- לPBS המשני לשטוף, לנער את הרקמה המוצקה שנותרה על 200 סל"ד, 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ב 20 מיליליטר של PBS, ולאחר מכן לחכות 1 דקות לרקמות ללצוף למעלה. הסר את הנוזל מהחלק התחתון של הצינור לתוך צינור חדש, צנטריפוגות ב 0.5 XG במשך 3 דקות, ולשאוב supernatant.
- פלייט כל HPMC / RBC מPBS המשני לשטוף בבקבוק 2 75 סנטימטר נפרד ב 15 מיליליטר של תקשורת צמיחה מלאה.
- כדי לבודד כל remaining HPMC, לנער את הרקמות טחונות ב 200 סל"ד, 37 ° מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ב 20 מיליליטר של 1: 1 0.25% טריפסין EDTA 25 מ"מ: פתרון PBS לפי נפח. לאפשר לרקמות לעלות, לאסוף את הנוזל בחלק התחתון של הצינור לתוך צינור 50 מיליליטר חדש, וספין למטה ברמה של 0.5 GX 3 דקות.
- לשאוב supernatant וצלחת כל HPMC / RBC בבקבוק 2 75 סנטימטר נפרד ב 15 מיליליטר של תקשורת צמיחה מלאה.
- תרבות התאים המצופה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 בסביבה humidified. תאי הזנה מצופים על ידי הוספת 15 מיליליטר של תקשורת צמיחה מלאה בימים 3 ו -5 מבלי להסיר את התקשורת בילתה. HPMC יכול להיות מתורבת במשך 5-7 ימים לפני הפיצול.
- השתמש HPMC נמוך מעבר (עד למעבר 2) בכל הניסויים כדי למזער dedifferentiation ושינוי של פנוטיפ המקורי. השתמש במיקרוסקופ שדה רחב רצוי עם מטרת 20x עם יכולות ההפרש פלסטיק ניגוד להפרעה או אובייקטיבי 4-20x עם capabilitie ניגוד שלבs (מסנני שלב ניגוד למיקרוסקופ) לקחת את כל התמונות של תאים, ומטרת 10x () בשדה בהיר לנתח immunohistochemical 3,3' diaminobenzidine מכתים (DAB).
- ודא שHPMC הוא cuboidal ולהביע cytokeratin 8 וvimentin על ידי ביצוע אימונוהיסטוכימיה 8 (איור 3 א, ג, ה).
- כדי לבודד HPMC, להעביר את הרקמות טחונות לתוך צינורות חרוטי 50 מיליליטר ולחכות 1 דקות לחתיכות מוצקות ללצוף למעלה (איור 2 ג & D). HPMC ותאי דם אדומים (RBC) יהיו נוכחים בנוזל שבתחתית. השתמש pipet כדי להסיר את הנוזל מהחלק התחתון של הצינור ולתוך צינור חרוטי חדש. ספין הנוזל מטה ברמה של 0.5 XG במשך 3 דקות ולשאוב supernatant מגלולת HPMC / RBC.
- בידוד NOF 8
- הכן 10 מיליליטר של המניה של פתרון מסוג collagenase III (10x) על ידי שילוב של 1: 1 תערובת של 100x פן-דלקת: 1 פעילות יחידות 1500 / מיליליטר של סוג collagenase השלישי: פעילות 714 יחידות / מיליליטר של hyaluronidase ב PBS.
- לנער את הרקמות טחונות omentum שנותרו לאחר בידוד HPMC ב 200 סל"ד, 37 מעלות צלזיוס במשך 6 שעות ב 10 מיליליטר של הפתרון מסוג 10x collagenase III המדולל בסרום ללא מדיה (DMEM עם ויטמיני 1% ממ [93 מ"ג / ליטר], חומצות 1% ממ אמינו החיוני [81.4 מ"ג / L], 1% סטרפטומיצין פניצילין [פן-דלקת, 100 U / פניצילין והמ"ל 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין]). רקמה מתעכל תיראה אטומה ואולי קצת פסולת סיבית (איור 2E).
- צנטריפוגה תאי NOF התמיסה המכילה בהשעיה על 0.5 XG במשך 3 דקות ב RT, לשאוב supernatant וצלחת גלולה בבקבוק 2 75 סנטימטר ב -13 מיליליטר של תקשורת צמיחה מלאה.
- הסר המדיה ישנה ולהחליף עם 15 מיליליטר של תקשורת צמיחה מלאה הטרי לאחר 24 שעות. NOF יכול להיות מתורבת ל1-3 ימים לפני הפיצול. התפשטות הערה של NOF תחדל כאשר התאים מגיעים confluency.
- ודא שfibroblasts האדם העיקרי הם תאים שטוחים, מוארכים ולהביע vimentin אבל לא cytokeratin 8 על ידי ביצוע אימונוהיסטוכימיה 8 (איור 3, D, F). השתמש NOF נמוך מעבר לניסויים (באופן אידיאלי לפני המעבר 3) כדי למזער dedifferentiation ושינוי של פנוטיפ המקורי. השתמש במיקרוסקופ שדה רחב עם מטרת 20x עם יכולות דסק"ש פלסטיק ללוקח את כל תמונות השלב של תאים,ומטרת 10x בשדה בהיר לנתח צביעת DAB immunohistochemical.
2. ציפוי Organotypic תרבות 8
- NOF שחרור מהבקבוק תרבות 75 סנטימטרים על ידי שטיפה עם 10 מיליליטר של PBS ואחרי 3 מיליליטר של 0.25% טריפסין / 25 מ"מ EDTA ללא יותר מ 5 דקות. לנטרל טריפסין עם לפחות 3 פעמים את נפח תקשורת צמיחה מלאה.
- העבר את תאי trypsinized לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל ומסובב את ברמה של 0.5 GX 3 דקות. הסר supernatant ולהביא תאים לגבות ב 5 מיליליטר של תקשורת צמיחה מלאה. השתמש בדלפק תא לספור את התאים התאוששו מהבקבוק התרבות.
- לדלל תאים בנפח המתאים של תקשורת צמיחה מלאה לצלחת 2,000-4,000 NOF לכל 100 μl על צלחת שחורה, עם תחתית ברורה, 96-היטב. להוסיף 0.5 מיקרוגרם / μl 100 של קולגן אני עכברוש זנב לתערובת התא לפני ציפוי. בואו תאים לשבת על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 בסביבה humidified לפחות 4 שעות, או עד שהתאיםלדבוק במשטח הצלחת.
- שחרר HPMC מהבקבוק התרבות משתמש באותן שיטות שתוארו בשלבי 2.1 ו -2.2. לדלל תאים בכמות המתאימה של תקשורת צמיחה מלאה לצלחת 10,000-20,000 HPMC לכל 50 μl על גבי NOF כבר מצופה קולגן אני ב96-גם צלחות. בואו התאים לשבת על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 בסביבה humidified לפחות 18 שעות לפני תחילת ניסויים.
- חלבון תרבות ירוק ניאון (GFP) -expressing תאי סרטן השחלות HeyA8 בתקשורת צמיחה מלאה. תאי סרטן השחלות HeyA8 שכותרתו fluorescently ידי ביטוי של וקטור lentiviral להביע טרגליים cGFP (pCDH-CMV-MCS-EF1). תאי סרטן השחלות HeyA8 צריכים להיות מחוברות 80-90% ביום שימוש (שלב צמיחת לוגריתמים). לשחרר תאים מצלחת התרבות ולספור באמצעות אותן השיטות שתוארו בצעדים 2.1-2.2 לתאים ראשוניים.
- לאפשר לתאי סרטן השחלות להתאושש בתקשורת צמיחה מלאה במשך 15-20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בצינור חרוטי עם המכסה אטום באופן רופף.
3. הדבקה Assay 8
- לאחר התאוששות, גלולה תאי סרטן השחלות על ידי ספינינג במשך 3 דקות ברמה של 0.5 XG ולאחר מכן להסיר את supernatant ולדלל את התאים בנפח המתאים של סרום ללא מדיה כדי להשיג ריכוז של 50,000 תאים / μl 100.
- הפוך את 96-גם הצלחות עם תרבויות organotypic / NOF HPMC להסיר תקשורת בילתה, ולהוסיף את ההשעיה תא הסרטן 100 μl בסרום ללא מדיה לכל אחד. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 בסביבת humidified למשך 30 דקות עד 4 שעות.
- הפוך את צלחת 96-היטב כדי להסיר תקשורת ותאים שאינם חסיד. השתמש pipet רבי ערוצים בהספק נמוך לpipet בזהירות ובעדינות של PBS 100 μl לכל טוב, ולהפוך את צלחת שוב. חזור על PBS לשטוף פעם נוספת.
- הפוך להסרת PBS ולהוסיף paraformaldehyde 100 μl 4% לכל אחד. לאפשר את הצלחת לשבת במשך 20 מילn כדי לתקן את התאים. לאחר 20 דקות, להפוך את הצלחת ולהוסיף 100 μl PBS.
- שימו לב שהקרינה הכוללת של בארות ניתן לדווח או את מספר התאים ניתן לכמת. לכימות, צלחת ראשונה עקומה סטנדרטית בשני עותקים באמצעות תאי HeyA8 בריכוז של 1 מיליון תאים / מיליליטר.
- הפוך את העקומה סטנדרטית על ידי ספינינג למטה 1 מיליון תאים, הסרת תקשורת, ומאפשר להם לשבת בparaformaldehyde 1 מיליליטר 4% במשך 20 דקות.
- תאי ספין שוב ולהעלות ב 1 מ"ל PBS (תאי ספירה חוזרת כדי לאשר 1 מ'/ מיליליטר ריכוז). צלחת 50,000, 40,000, 30,000, 20,000, 10,000, 5000, 1000, ו -0 תאים לכל טוב בשני עותקים, ולהוסיף PBS להיקף כולל סופי של 50 μl בכל טוב.
- תחתון לקרוא את צלחת התרבות על קורא ניאון צלחת (עירור = 488 ננומטר, פליטה = 528 ננומטר), דרוג בארות גבוהות (50,000 על עקומה סטנדרטית). השתמש בעקומה סטנדרטית לחישוב תאי סרטן השחלות כמה דבקו organotypתרבות IC בכל טוב (4A-C איור).
4. הפצת נשק Assay 10
- לאחר שתאי סרטן השחלות להתאושש (ראה שלבים 2.5 ו -2.6 לעיל), גלולה התאים על ידי ספינינג במשך 3 דקות ברמה של 0.5 XG ואז לדלל את התאים בנפח המתאים של 1% FBS תקשורת (DMEM עם FBS 1%, ממ 1% ויטמינים [93 מ"ג / ליטר], חומצות 1% ממ שאינם חיוניות אמינו [81.4 מ"ג / L], 1% סטרפטומיצין פניצילין [פן-דלקת, 100 U / פניצילין מיליליטר ו -100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין]) כדי להשיג ריכוז של 4,000 תאים / 150 μl.
- הפוך את הצלחת 96-היטב עם / תרבויות organotypic NOF HPMC להסיר תקשורת בילתה, ולהוסיף 150 μl של ההשעיה תא הסרטן ב 1% FBS תקשורת היטב כל אחד. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 בסביבת humidified במשך 72 שעות.
- תחתון לקרוא את צלחת התרבות על קורא ניאון צלחת פעם אחת ביום (עירור = 488 ננומטר, פליטה = 528 ננומטר) כדי להעריך את ההתפשטות היחסיתשל תאים. המשך assay עבור 96 שעות, לשנות את התקשורת בשעה 48 (איור 5 א-ג). היזהר שלא להפריע לתרבות כאשר תקשורת משתנות (היפוך לצלחת עדיפה).
5. פלישת Assay 8
- לפני ציפוי תרבות 3D, להוסיף קולגן עכברוש זנב 7.5 מיקרוגרם אני ב200 μl PBS להוספת 24 גם צלחת התרבות (גודל נקבובית 8 מיקרומטר). בואו O דגירה צלחת / N, ולאחר מכן להסיר בזהירות את PBS עם pipet מייד לפני ציפוי תרבות organotypic HPMC / נוף על מוסיף מצופה קולגן (שלב 2, לעיל).
- הכן את תאי סרטן השחלות כמו בשלב 3.1. לצלחת תאי סרטן השחלות על תרבויות organotypic במוסיף, להשתמש בזהירות pipet כדי להסיר תקשורת עודפת מהחלק העליון של מוסיף. להוסיף את ההשעיה תא סרטן השחלות 100 μl בסרום ללא מדיה לכל אחד.
- להוסיף 750 μl של תקשורת צמיחה מלאה להרבה מתחת להוספה לגרום לתאי סרטן בvasion לתרבויות organotypic. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 בסביבת humidified למשך 24 שעות.
הערה: תאי סרטן השחלות שלפלוש תרבות organotypic תחצה את הכנס ותישאר בצד התחתון של הכנס. - לאחר 24 שעות, לתפוס את התוסף עם קרציות ובקצרה לשטוף אותו בכוס של PBS, ולאחר מכן להעביר את הכנס ולריק. לשפשף את החלק העליון של כל הכנס עם שני הצדדים של מקלון צמר גפן בסך של 1 דקות. במהירות להכניס את התוסף לצלחת המכילה 750 paraformaldehyde μl 4% בכל טוב. לאפשר לכל הוספה לשבת בparaformaldehyde למשך 10 דקות לפני העברה מוסיף לתוך בארות מלאות 750 μl PBS.
- צפה תאים פלשו (דבקה וקבוע לתחתית מוסיף) עם מיקרוסקופ בהגדלה 2.5x. כאשר כל גם הוא בתוך שדה הראייה, להתאים את ההגדלה ל10x ולקחת 5 תמונות, אחד בסמוך למרכז ו1 בכל רבע של הבאר, הימנעותלוקח תמונות כי הם קרובים מדי לשוליים. בצע את אותו דפוס לכל אחד.
- השתמש בתכנית של היצרן כדי לספור את מספר התאים בכל תמונה כדי לקבל מספר ממוצע של תאים פלשו לשדה בכל טוב (6 א-ג איור) על פי הפרוטוקול שלהם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תרבות organotypic הורכבה על ידי הערבוב הראשון fibroblasts האנושי ראשוני עם אני סוג קולגן ולאחר מכן כיסה את התרבות הזאת עם 5 פעמים את מספר תאי mesothelial. התרבות הייתה טופחה במשך לפחות 18 שעות לפני תאי סרטן השחלות נוספו ללמוד הידבקות, פלישה או הפצה. כל assay חזר על עצמו עם מספר (n = 3-5) תרבויות 3D המתקבלות ממטופלים שונים ובארות רבות נבדקו בכל תנאים להידבקות (n = 5), ריבוי מבחני (n = 5) ופלישה (n = 3) . תאי סרטן השחלות דבקו בתרבות organotypic 3D לאחר 4 שעות (איור 4), התרבו בתרבות לאחר 72 שעות (6 פעמים בפעם תא הכפלת HeyA8) (איור 5), ופלשו לאחר 24 שעות (איור 6). ההידבקות, השגשוג והפלישה של תאי סרטן השחלות HeyA8 היה integrin תלוי (איור 4-6). באופן ספציפי, פפטיד RGD וחסימת antibodies לα 5 -integrin, β -integrin 1 וα β v 3 -integrin עכבות הידבקות תא סרטן השחלות לתרבות organotypic, בעוד פפטיד, נוגדן השליטה וRAD β 4 -integrin נוגדן לא עשה (איור 4) 10. בassay ההתפשטות, פפטיד RGD וחסימת נוגדנים לα 5 - וβ 1 -integrin התפשטות תאי סרטן השחלות עכבות על תרבות organotypic, בעוד פפטיד רד, לשלוט נוגדן, α β v 3 -integrin הנוגדן וβ 4 -integrin נוגדן לא עשה (איור 5). בassay הפלישה, פפטיד RGD ונוגדני חסימה לα 5 - וβ 1 -integrin עכבות, תוך β α v 3 -integrin נוגדן משופר פלישת תאים סרטניים בשחלות דרך תרבות organotypic 3D. פפטיד רד, נוגדן שליטה, וβ4 -integrin נוגדן לא השפיע פלישה (איור 6). לעיתים נדירות, מבחני אלה יהיו בלתי לפרש (כלומר, α 5 -integrin חסימת נוגדן לא לעכב הידבקות, הפצה או פלישה בהשוואה לנוגדן השליטה). בעבר, מצאנו כי תרבויות organotypic מסוימות לשטוף על השינוי של התקשורת או שטיפת PBS במהלך מבחני. בנוסף, אם תאי סרטן השחלות הם מתים או לא התאוששו מספיק זמן מטריפסין לעכל integrins מחדש מפורש, מבחני לא יעבדו. לכן, זה תמיד חשוב שתהיה שליטה חיובית ושלילית בכל assay כך האיכות של תרבות organotypic וassay תא סרטן השחלות ניתן להעריך. כפי שניתן לראות כאן, פפטיד RGD, α 5 -integrin וβ 1 -integrin חסימת נוגדני הידבקות תא סרטן השחלות כל עכבות, פלישה והתפשטות לתרבות organotypic ויכול לשמש כקון החיוביקבוצת ביקורת במבחני עתיד. כמו כן, β 4 -integrin חסימת נוגדן לא השפיעה הידבקות השחלות תא סרטני, פלישה והתפשטות לתרבות organotypic ויכולה לשמש כביקורת שלילית במבחני עתיד.
איור 1. היסטולוגיה של גרורות omental אנושיות. Hematoxylin וכתם eosin של () omentum הנורמלי האנושי (MC, תאי mesothelial, פיבונצ'י, fibroblasts, עדי, adipocytes) ו- (ב) גרורות omental סרטן השחלות (Met, גרורות סרטן השחלות). בר בלוחות = באורך 100 מיקרומטר. (ג) סכמטי של מודל organotypic 3D של גרורות סרטן השחלות מחקה גרורות תא סרטן השחלות מוקדמות אל פני השטח של omentum האנושי. אנא לחץ כאן לצפייה גדולה יותר Verשיאון של נתון זה.
בידוד איור 2. תאי omental אנושיים ראשוניים. () חתיכת omentum נאסף בניתוח בPBS ומועבר למעבדה. רקמת pelleted ברמה של 0.5 xgx 3 דקות והועברה לPBS הטרי. (ב) חתיכת omentum מועברת לצלחת פטרי 10 סנטימטרים, שטפה עם PBS, ואזמלים משמשים לחתוך omentum לחתיכות קטנות (0.5 סנטימטרים 3 ). (CD) פיסות הרקמה נאספות בעזרת פיפטה 25 מיליליטר סרולוגית והועברו לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר לבידוד של HPMC. PBS הוא להסיר את הצינור וHPMC הם pelleted מPBS XG 0.5 על 37 מעלות צלזיוס. (MC, תאי mesothelial, RBC, תאי דם אדומים, פיבונצ'י, fibroblasts) (E) NOF מבודדים מremaini רקמת omental ng לאחר דגירה עם hyaluronidase וcollagenase סוג III. התמונה מראה את הרקמה לאחר עיכול 6- 12-שעות. NOF הם pelleted על ידי ספינינג ברמה של 0.5 XG ב RT. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. אפיון של HPMC ונוף מבודד מהרקמה אנושית omentum. תמונות שלב בניגוד ל() תאי mesothelial (HPMC) ופיברובלסטים (ב) (נוף) לאחר בידוד מרקמת omentum. HPMC האדם מוכתם עבור cytokeratin (ג) 8 וvimentin (E). NOF האדם מוכתם עבור vimentin (F), אבל לא להכתים לcytokeratin (ד) 8. בר = 100 מיקרומטר, חל על כל הלוחות.ftp_upload / 53,541 53541fig3large.jpg "target =" / _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. הדבקת תאי סרטן השחלות לתרבות organotypic היא integrin תלוי. Assay () ההידבקות בוצע עם 50,000 תאי fluorescently שכותרתו סרטן השחלות, תאי HeyA8, כפי שתואר בסעיף הפרוטוקול. הקרינה הכוללת בכל טוב מדווחת. נוגדן השליטה הוא העכבר IgG. כל עמודה מייצגת ממוצעת שגיאה הממוצעת +/- סטנדרטי. (ב) שלב בניגוד נציג ותמונות ניאון (C) של הידבקות תא סרטן השחלות לתרבות organotypic. בר = 100 מיקרומטר, חל על שני הלוחות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. התפשטות תאי סרטן השחלות על תרבות organotypic היא integrin תלוי. Assay () ההתפשטות בוצע עם 4,000 תאי fluorescently שכותרתו סרטן השחלות, תאי HeyA8, כפי שתואר בסעיף הפרוטוקול. המספר הכולל של תאים מדווח. נוגדן השליטה הוא העכבר IgG. כל עמודה מייצגת ממוצעת שגיאה הממוצעת +/- סטנדרטי. שלב בניגוד ממוזג ותמונות ניאון של התפשטות תאי סרטן השחלות על תרבות organotypic ב( ב ') 24 ו- (ג) שעות 96. בר = 100 מיקרומטר, חל על שני הלוחות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
tp_upload / 53,541 / 53541fig6.jpg "/>
6. פלישת סרטן השחלות איור דרך תרבות organotypic היא integrin תלוי. Assay () הפלישה בוצע עם 40,000 תאי fluorescently שכותרתו סרטן השחלות, תאי HeyA8, כפי שתואר בסעיף הפרוטוקול. מספר התאים הפולשים (עבר דרך תרבות 3D לתחתית להוסיף) מדווח. נוגדן השליטה הוא העכבר IgG. כל עמודה מייצגת ממוצעת שגיאה הממוצעת +/- סטנדרטי. (ב) שלב בניגוד ו- (ג) תמונות ניאון של תאי סרטן השחלות שפלשו דרך תרבות organotypic. בר = 100 מיקרומטר, חל על כל הפנלים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מודל organotypic של מייקרו-סביבת הצפק הוקם על מנת להעריך את התפקוד האישי וקולקטיבי (ים) של שני המרכיבים התאיים ומולדים של מייקרו-הסביבה בהפצת סרטן השחלות. הפרוטוקולים הספציפיים עבור ציפוי והתאמה אישי של תרבות organotypic 3D לחקור הידבקות תא סרטני, ופלישת השחלות מסופקים. תאים ראשוניים אדם omental mesothelial ופיברובלסטים בודדו מחולים ומשמשים במעבר מוקדם כדי לשמור על מורפולוגיה נורמלית ווריאצית מטופל. במודל זה, fibroblasts omental הנורמלי וECM (אני סוג קולגן בדרך כלל) היו שכבות עם monolayer תא ראשוני אדם mesothelial. היסטולוגית מודל זה מחקה את בטנת הצפק, ומאפשרת לנו ליצור מחדש ולבחון את אירועים מרכזיים בגרורות סרטן השחלות כוללים הידבקות תא סרטן השחלות, התפשטות, ופלישה 8,27.
בעבר, יש לי מודלים 3D מוגבליםהוקם כדי לחקור אינטראקציות סרטן השחלות עם מייקרו-הסביבה 13,14,21-25, ואילו מודל organotypic 3D זה הוא ראשון לשחזר את הבנייה של mesothelial-הציפוי הפנימי של חלל הצפק. Omentum האדם נאסף מהחולים השונים בגיל ומצב בריאותי. הבריאות של הרקמה משפיעה ישירות על טכניקות תא ובידוד פיברובלסטים mesothelial. הרקמה בריאה מופיעה קלה בצבע עם אוניות קטנות מאוד (1-3 מ"מ) בהשוואה לרקמות שהיא יותר בצבע כתום עם אוניות גדולות הנוכחיות (> 5 מ"מ). רוב HPMC להשיל את בPBS הראשוני כרקמה מתבצעת מניתוח למעבדה. הרקמה בריאה, לעומת זאת, מתאושש מהר יותר HPMC הוא להסרת, ושוטף PBS נוסף ו1: PBS 1: לעכל טריפסין עלול לגרום לתרבות מעורבת של תאי HPMC ונוף. ברקמות בריאה, כמה HPMC יכול לשרוד collagenase 6 שעות לעכל, ולעכל O / N בפתרון collagenase 1x במלואתקשורת צמיחה מומלצת לקבל תרבות NOF טהורה. הערה omentum חייב להיות ממוקם באופן מיידי בPBS עם ההסרה או לא HPMCs יהיה התאושש מהרקמה. יתר על כן, אם הרקמה מאוחסנת בPBS לתקופה ארוכה של זמן (> 2 שעות) ב RT או במקרר, מספר HPMCs קיימא מבודד מצטמצם משמעותי.
יחס של 1: 5 של fibroblasts לmesothelial תאים מצופה לחקות את היחס של fibroblasts לmesothelial תאי in vivo 8. חשוב לציין כי בגודל של תאי mesothelial מבודדים משתנה ממטופל למטופל וזה עשוי לדרוש התאמה ליחס הציפוי. תאי mesothelial של חלק מהחולים הם הרבה יותר קטנים; במקרים אלה, אנו צלחת כפולה מספר תאי mesothelial (20,000). בנוסף, התאים הראשוניים משמשים תמיד במעבר מוקדם (1-2) כדי לשמור על מורפולוגיה. תאי mesothelial יכולים להיות תאי mesothelial cuboidal או דקים, וcuboidal להיות יותר דקכפי שהם passaged, או עם חשיפה גדולה יותר לתקשורת מותנית מתאי סרטן השחלות או טיפול בTGFβ 10.
תאי סרטן השחלות עלולים לדבוק ולפלוש דרך תאי mesothelial mesenchymal יעילות רבה יותר מאשר תאי mesothelial אפיתל מהחולים זהים או שונים. בדרך כלל, אנו מקימים תרבות organotypic במשך 18 שעות לפני תחילת מבחני הפונקציונליים עם תאי סרטן השחלות. תאי mesothelial יותר ופיברובלסטים בתרבית ביחד, יותר זמן הם צריכים להפריש חלבונים שונים, כולל חלבוני ECM, אשר יכול להשפיע על ההתנהגות של תאי סרטן השחלות. גורם חשוב נוסף לקחת בחשבון בעת ביצוע מבחני אלה היא רמת שיעור התפשטות ההפרש וביטוי של חלבונים הקשורים להידבקות מוגברת, פלישה, ו / או הפצה, כוללים integrins, פרוטאזות, וגורמי צמיחה, בכל שורת תאי סרטן או אדם עיקרי תא סרטן סוגים.הזמן ומספר התאים סרטניים בשימוש בכל אחד מהמבחנים הפונקציונליים עם תרבות organotypic צריך להיות מותאם לכל שורת תאים סרטניים או סוג של תא סרטן ראשוני. לדוגמא, בassay ההידבקות תאר, תאי סרטן השחלות יכולים להיות פולשים התרבות בתקופה זו.
ברור, מודל organotypic זה אינו מכיל את כל המרכיבים של מייקרו-סביבת הצפק הרגיל כגון חיסון, אנדותל, תאים וadipocyte. בנוסף, המודל תלוי בנגישות והזמינות של רקמה אנושית ראשונית, כתאים הראשוניים המשמשים רק בתוך שלושה הקטעים הראשונים. עם זאת, יש לו את המודל יתרונות רבים בשימוש בתאים אנושיים ראשוניים ושילוב של סוגי תאים רבים שכבר הוכיחו לתפקיד חשוב בגרורות. מודל זה נעשה שימוש כדי לחקור ויסות הגנים וחלבונים בסוגי התאים הבודדים (תאי סרטן כלומר,, mesothelial הנורמלי או תאי פיברובלסטים) לאחרהתרבות משותפת. בפרט, את התפקידים של 28 c-Met, MMP-2 9,29, E-cadherin 30, β 1 -integrin 10, β 3 -integrin 16, α 5 -integrin 10,31, ופיברונקטין 10 בגרורות מוקדמות יש לי נחקר. בנוסף, יש לו את המודל הפוטנציאל להרחיב לכלול יותר סוגי תאים, כגון שילוב של adipocytes 6. המודל השתנה וממוזער לשימוש בהקרנת תפוקה גבוהה לזהות מעכבי מולקולה קטנים של הידבקות / פלישת תאים סרטניים בשחלות למייקרו-סביבת הצפק 27. יישומים עתידיים של מודל זה יכללו שילוב של תאי מערכת חיסון לתוך assay, כוללים מקרופאגים למחקרים מכניסטית והקרנת תפוקה גבוהה. לסיכום, תרבות תא organotypic מספקת מודל שימושי כדי להעריך את יחסי הגומלין בין מייקרו-סביבת הצפק האנושי ותאי סרטן השחלות, עם גואהl של הבהרת מנגנונים מולקולריים חשובים להתקדמות בהפצה ובמחלה, וזיהוי מטרות טיפוליות פוטנציאליות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Isolation and culture of primary cells | |||
| PBS | Fisher Scientific | SH3001304 | |
| Single-edged razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | |
| 15 cm culture dishes | BD Biosciences | 353025 | |
| Glass flask | ? | ? | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000044_3616914956 | |
| DMEM with L-Glutamine | Corning | 10-013-CV | |
| MEM Vitamins | Corning | 25-020-Cl | |
| MEM Nonessential amino acids | Corning | 25-025-CI | |
| Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Shaker | Thermo-Fisher | MaxQ 4450 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Incubator | Thermo-Fisher | Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator Model 3100 | |
| Trypsin EDTA, 1x (0.25%) | Corning | 25-053-CI | |
| Hyaluronidase | Worthington Biochemical | LS002592 | |
| T-75 Flasks | BD Biosciences | 353136 | |
| T-175 Flasks | BD Biosciences | 353112 | |
| Pipet tips | Rainin | P2, P10, P20, P200 and P1000 | |
| Pipet tips | Corning | Filtered tips P2, P10, P20, P200 and P1000 | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 2. Plating 3D culture | |||
| Cell Counter | Invitrogen | Countess | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10313 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Collagen Type I (Rat Tail) | BD Biosciences | 354236 | |
| 96 well plate, clear bottom, black | BD Biosciences | 353219 | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 3. Adhesion assay | |||
| Multichannel pipet | Eppendorf | Xplorer 300 | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
| Plate reader | Molecular Devices | Minimax | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 5. Invasion assay | |||
| Cell Culture Inserts (8um, 24-well) | BD Biosciences | 353097 | |
| Cotton swabs | Q-tips | cotton swabs | |
| Microscope | Zeiss | Axiovert 200m | |
| Cell Profiler | public domain | ||
| 24 well plate | BD Biosciences | 353047 | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 6. Antibodies | |||
| Anti-Integrin αVβ3 Antibody, clone LM609 | EMD Millipore | MAB1976 | |
| Beta 1 | Oncosynergy | OS2966 | |
| Alpha 5 [CD49e] | ID Pharmingen | 555615 | |
| Beta 4 [CD104] | EMD Millipore | MAB 2058 |
References
- Siegel, R., Ma, J., Zou, Z., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J. Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
- Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. Am. J. Pathol. 177, 1053-1064 (2010).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat. Med. 19, 1423-1437 (2013).
- Correia, A. L., Bissell, M. J. The tumor microenvironment is a dominant force in multidrug resistance. Drug Resist Updat. 15, 39-49 (2012).
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: Functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21, 309-322 (2012).
- Nieman, K. M., et al. Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth. Nat. Med. 17, 1498-1503 (2011).
- Daya, D., McCaughy, W. T. Pathology of the peritoneum: A review of selected topics. Semin. Diagn. Pathol. 8, 277-289 (1991).
- Kenny, H. A., Krausz, T., Yamada, S. D., Lengyel, E. Use of a novel 3D culture model to elucidate the role of mesothelial cells, fibroblasts and extra-cellular matrices on adhesion and invasion of ovarian cancer cells. Int. J. Cancer. 121, 1463-1472 (2007).
- Kenny, H. A., Kaur, S., Coussens, L. M., Lengyel, E. The initial steps of ovarian cancer cell metastasis are mediated by MMP-2 cleavage of vitronectin and fibronectin. J. Clin. Invest. 118, 1367-1379 (2008).
- Kenny, H. A., et al. Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion. J. Clin. Invest. 124, 4614-4628 (2014).
- Strobel, T., Cannistra, S. A. β1-integrins partly mediate binding of ovarian cancer cells to peritoneal mesothelium in vitro. Gynecol. Oncol. 73, 362-367 (1999).
- Strobel, T., Swanson, L., Cannistra, S. A. In vivo inhibition of CD44 limits intra-abdominal spread of a human ovarian cancer xenograft in nude mice: A novel role for CD 44 in the process of peritoneal implantation. Cancer Res. 57, 1228-1232 (1997).
- Iwanicki, M., et al. Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium. Cancer Discov. 1, 144-157 (2011).
- Lessan, K., Aguiar, D., Oegema, T. R., Siebenson, L., Skubitz, A. P. CD44 and β1 integrin mediate ovarian carcinoma cell adhesion to peritoneal mesothelial cells. Am. J. Pathol. 154, 1525-1537 (1999).
- Ahmed, N., Riley, C., Rice, G., Quinn, M. Role of integrin receptors for fibronectin, collagen and laminin in the regulation of ovarian carcinoma functions in response to a matrix microenvironment. Clin. Exp. Metastasis. 22, 391-402 (2005).
- Kaur, S., et al. β3-integrin expression on tumor cells inhibits tumor progression, reduces metastasis, and is associated with a favorable prognosis in patients with ovarian cancer. Am. J. Pathol. 175, 2184-2196 (2009).
- Niedbala, M. J., Crickard, K., Bernacki, R. In vitro degradation of extracellular matrix by human ovarian carcinoma cells. Clin. Exp. Metastasis. 5, 181-197 (1987).
- Kanemoto, T., Martin, G. R., Hamilton, T. C., Fridman, R. Effects of synthetic peptides and protease inhibitors on the interaction of a human ovarian cancer cell line (NIH:OVCAR-3) with a reconstituted basement membrane (matrigel). Invasion Metastasis. 11, 84-92 (1991).
- Rieppi, M., et al. Mesothelial cells induce the motility of human ovarian carcinoma cells. Int. J. Cancer. 80, 303-307 (1999).
- Barbolina, M. V., Adley, B. P., Ariztia, E. V., Liu, Y., Stack, M. S. Microenvironmental regulation of membrane type 1 matrix metalloproteinase activity in ovarian carcinoma cells via collagen-induced EGR1 expression. J. Biol. Chem. 282, 4924-4931 (2007).
- Burleson, K. M., et al. Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers. Gynecol. Oncol. 93, 170-181 (2004).
- Suzuki, N., et al. HMOCC-1, a human monoclonal antibody that inhibits adhesion of ovarian cancer cells to human mesothelial cells. Gynecol. Oncol. 95, 290-298 (2004).
- Kishikawa, T., et al. Two distinct pattern of peritoneal involvement shown by in vitro and in vivo ovarian cancer dissemination models. Invas. Metast. 15, 11-21 (1995).
- Casey, R. C., et al. Establishment of an in vitro assay to measure the invasion of ovarian carcinoma cells through mesothelial cell monolayers. Clin. Exp. Metastasis. 20, 343-356 (2003).
- Niedbala, M. J., Crickard, K., Bernacki, R. Interactions of human ovarian tumor cells with human mesothelial cells grown on extracellular matrix. Exp. Cell Res. 160, 499-513 (1985).
- White, E. A., Kenny, H. A., Lengyel, E. Three-Dimensional modeling of ovarian cancer. Adv. Drug Deliv. Rev. 79-80, 184-192 (2014).
- Kenny, H. A., et al. Quantitative high throughput screening using a primary human three-dimensional organotypic culture predicts in vivo efficacy. Nature Comm. , (2015).
- Sawada, K., et al. c-Met overexpression is a prognostic factor in ovarian cancer and an effective target for inhibition of peritoneal dissemination and invasion. Cancer Res. 67, 1670-1680 (2007).
- Kenny, H. A., Lengyel, E. MMP-2 functions as an early response protein in ovarian cancer metastasis. Cell cycle. 8, 683-688 (2009).
- Sawada, K., et al. Loss of E-cadherin promotes ovarian cancer metastasis via alpha 5-integrin, which is a therapeutic target. Cancer Res. 68, 2329-2339 (2008).
- Mitra, A. K., et al. Ligand-independent activation of c-Met by fibronectin and α(5)β(1)-integrin regulates ovarian cancer invasion and metastasis. Oncogene. 30, 1566-1576 (2011).
