Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

Modellazione Piazza precoci di cancro ovarico Diffusione in una cultura Organotipica della Cavità peritoneale umano

doi: 10.3791/53541 Published: December 31, 2015

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tutti i protocolli di ricerca descritti sono stati esaminati dalla University of Chicago Institutional Review Board (IRB). Il consenso informato è stato ottenuto da ogni paziente prima dell'intervento chirurgico e lo studio è stato approvato dalla University of Chicago IRB. Un tipo cappa di sicurezza biologica 2 e guanti devono essere utilizzate per la manipolazione dei tessuti umani per la protezione e per ridurre il rischio di contaminazione delle cellule.

1. Isolamento e la coltura di cellule stromali primarie non trasformati

  1. Collezione tessuti umani e di preparazione.
    1. Ottenere esemplari di omento umana, 2 cm 3, rimossi durante un intervento chirurgico addominale, e immergere subito tessuto RT tampone fosfato salino (PBS) (Figura 2A). Un pezzo di omento 3 cm x 2 cm produce tipicamente 1 milione di cellule primarie umane mesoteliali (HPMC) e 200.000 fibroblasti umani primari o fibroblasti omentali normali (NOF).
    2. Centrifugare il PBS il tessuto è stato immerso in a 0,5 xg per 3min più presto possibile dopo la raccolta (<2 ore in PBS) e trasferire il tessuto fresco 20 ml PBS in una provetta conica da 50 ml. Tagliare il tessuto in 5mm 3 pezzi da tritare con bisturi in un diametro di 15 centimetri, piatto di coltura sterile (Figura 2B).
  2. Primaria mesothelial umano isolamento delle cellule 8
    1. Per isolare HPMC, trasferire il tessuto tritato in 50 ml provette coniche e attendere 1 minuto per i pezzi solidi di galleggiare verso l'alto (Figura 2C & S). HPMC e globuli rossi (RBC) saranno presenti nel liquido sul fondo. Utilizzare una pipetta per rimuovere il liquido dal fondo della provetta e in un nuovo tubo conico. Spin il liquido verso il basso a 0,5 xg per 3 min e aspirare il surnatante dal pellet HPMC / RBC.
      1. Ripetere il processo per tre volte: aggiungere 20 ml di PBS al tessuto tritato, permettono il tessuto a salire, rimuovere il liquido dal basso con una pipetta e nella provetta HPMC / RBC, spin down, e rimuovere ilsurnatante. Dopo che tutti i giri sono stati completati e il surnatante viene aspirato, il pellet conterrà HPMC e RBC.
    2. Piatto tutte le cellule del pellet in un pallone 75 cm 2 in 15 ml di terreni di crescita completo (DMEM con 10% di siero fetale bovino [FBS], 1% vitamine MEM [93 mg / L], 1% di acidi MEM amminoacidi non essenziali [81.4 mg / L], 1% di penicillina streptomicina [Pen-Strep, 100 U / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina]).
    3. Eseguire un lavaggio secondario PBS per isolare HPMCs supplementari.
      1. Per la PBS secondario lavare, scuotere il tessuto solido residuo a 200 rpm, 37 ° C per 10 minuti in 20 ml di PBS, quindi attendere 1 minuto per il tessuto di galleggiare verso l'alto. Rimuovere il liquido dal fondo della provetta in un nuovo tubo, centrifugare a 0,5 xg per 3 min, e aspirare il surnatante.
      2. Piatto tutto il HPMC / RBC dal PBS secondario lavare in un pallone di 75 cm separata 2 in 15 ml di terreni di crescita completa.
    4. Per isolare ogni rNumero residua HPMC, agitare il tessuto macinata a 200 rpm, 37 ° C ° per 10 min a 20 ml di una miscela 1: 1 0,25% tripsina mM EDTA 25: soluzione PBS in volume. Lasciare il tessuto a salire, raccogliere il liquido sul fondo della provetta in un nuovo tubo 50 ml, e spin giù a 0.5 gx 3 min.
      1. Aspirare il surnatante e piastra tutto il HPMC / RBC in un pallone di 75 cm 2 separata in 15 ml di terreni di crescita completa.
    5. Cultura le cellule piastrate a 37 ° C e 5% CO 2 in un ambiente umidificato. Mangimi cellule placcato con l'aggiunta di 15 ml di media piena crescita nei giorni 3 e 5 senza rimuovere i media spesi. HPMC può essere coltivato per 5-7 giorni prima della scissione.
      1. Utilizzare a basso passaggio HPMC (fino a passaggio 2) in tutti gli esperimenti per ridurre al minimo dedifferenziazione e la modifica di fenotipo originale. Utilizzare un microscopio a grande campo, preferibilmente con un obiettivo 20x con funzionalità di contrasto interferenza differenziali plastica o obiettivo 4-20x con capabilitie contrasto di fases (filtri di contrasto di fase sul microscopio) per l'adozione di tutte le immagini delle cellule, e un obiettivo 10x () in campo chiaro per analizzare immunoistochimica 3,3'-diaminobenzidina (DAB) colorazione.
    6. Verificare che il HPMC sono cubica ed esprimere citocheratina 8 e vimentina eseguendo immunoistochimica 8 (figura 3A, C, E).
  3. NOF isolamento 8
    1. Preparare 10 ml di uno stock di soluzione di tipo collagenasi III (10x) mediante la combinazione di un 1: 1: 1 miscela di 100x Pen-Strep: 1.500 unità di attività / ml di collagenasi di tipo III: attività 714 unità / ml di ialuronidasi in PBS.
    2. Agitare il tessuto omento macinata, che rimane dopo l'isolamento HPMC a 200 rpm, 37 ° C per 6 ore in 10 ml di soluzione di 10x collagenasi tipo III diluito nei media senza siero (DMEM con 1% vitamine MEM [93 mg / L], 1% MEM aminoacidi non essenziali [81,4 mg / L], 1% di penicillina streptomicina [Pen-Strep, 100 U / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina]). Tessuto digerito sarà opaco e potrebbe avere alcuni detriti fibroso (Figura 2E).
    3. Centrifugare le cellule NOF soluzione contenente in sospensione a 0,5 xg per 3 min a RT, aspirare il supernatante e piastra il pellet in un pallone 75 cm 2 in 13 ml di terreni di crescita completa.
    4. Rimuovere vecchi media e sostituirlo con 15 ml di fresco terreni di crescita completo dopo 24 ore. NOF può essere coltivato per 1-3 giorni prima della scissione. Nota proliferazione del NOF cesserà quando le cellule raggiungono confluenza.
    5. Confermare che i fibroblasti umani primari sono, cellule allungate piatte ed esprimono vimentina, ma non citocheratina 8 eseguendo immunoistochimica 8 (figura 3B, D, F). Utilizzare a basso passaggio NOF per esperimenti (idealmente prima del passaggio 3) per ridurre al minimo dedifferentiation e modifica di fenotipo originale. Utilizzare un microscopio a grande campo con un obiettivo 20x con funzionalità di plastica DIC dell'adozione di tutte le immagini in fase di cellule,e un obiettivo 10x in campo chiaro per analizzare immunoistochimica DAB colorazione.

2. Placcatura Cultura organotipica 8

  1. NOF uscita dal pallone di coltura 75 cm da risciacquo con 10 ml di PBS seguita da 3 ml di 0,25% / 25 mM EDTA tripsina per non più di 5 min. Neutralizzare tripsina con almeno 3 volte il volume del terreno di coltura completo.
  2. Trasferire le cellule trypsinized in una provetta da 50 ml e spin down a 0.5 gx 3 min. Rimuovere il surnatante e portare le cellule back up in 5 ml di media piena crescita. Utilizzare un contatore di cellule per contare le cellule recuperate dal pallone di coltura.
  3. Diluire le cellule nel volume appropriato di supporto piena crescita al piatto 2.000-4.000 NOF per 100 microlitri su un piatto nero, chiaro a fondo, 96 pozzetti. Aggiungere 0,5 mg / 100 ml di coda di topo collagene I alla miscela cella prima placcatura. Let cellule siedono a 37 ° C in 5% CO 2 in un ambiente umidificato per almeno 4 ore, o fino a quando le cellulead aderire alla superficie della piastra.
  4. Rilasciare HPMC dal pallone di coltura usando gli stessi metodi descritti in fasi 2.1 e 2.2. Diluire le cellule nella quantità appropriata di terreni di crescita completo alla tavola 10.000-20.000 HPMC per 50 microlitri in cima al NOF già placcato con collagene I in piastre da 96 pozzetti. Lasciare le cellule siedono a 37 ° C in 5% CO 2 in un ambiente umidificato per almeno 18 ore prima di iniziare esperimenti.
  5. La proteina fluorescente verde Cultura (GFP) esprimente le cellule tumorali dell'ovaio HeyA8 nei media piena crescita. Le cellule tumorali dell'ovaio HeyA8 sono fluorescente da espressione di un vettore lentivirale che esprime copepodi cGFP (pCDH-CMV-MCS-EF1). Le cellule tumorali dell'ovaio HeyA8 dovrebbe essere 80-90% confluenti il ​​giorno di utilizzo (fase di crescita logaritmica). Rilasciate le cellule dalla piastra di coltura e contare con le stesse modalità descritte nei passaggi 2.1-2.2 per le cellule primarie.
  6. Consentire cellule di cancro ovarico di recuperare nei media piena crescita per 15-20 minuti a 37 ° C in untubo conico con coperchio sigillato liberamente.

3. Adesione saggio 8

  1. Dopo il recupero, agglomerare le cellule di cancro ovarico, facendo girare per 3 min a 0,5 xg e poi rimuovere il surnatante e diluire le cellule nel volume adeguato di mezzi privi di siero per ottenere una concentrazione di 50.000 cellule / 100 microlitri.
  2. Capovolgere le piastre a 96 pozzetti con / NOF colture organotipiche HPMC per rimuovere il supporto spesi, e aggiungere 100 ml di sospensione cellulare di cancro nei media senza siero in ciascun pozzetto. Incubare la piastra a 37 ° C in 5% CO 2 in un ambiente umidificato per 30 minuti a 4 ore.
  3. Capovolgere la piastra a 96 pozzetti per rimuovere i media e le cellule non aderenti. Utilizzare una pipetta multicanale a bassa potenza da Dispensare attenzione e delicatezza 100 ml di soluzione in ciascuno bene, e invertire di nuovo piatto. Ripetere la PBS lavare una volta di più.
  4. Inverti per rimuovere PBS e aggiungere 100 microlitri paraformaldeide 4% in ogni pozzetto. Lasciare la piastra a sedere per 20 min per fissare le cellule. Dopo 20 minuti, capovolgere la piastra e aggiungere 100 microlitri di PBS.
  5. Si noti che la fluorescenza totale di pozzetti possono essere segnalati o il numero di cellule può essere quantificata. Per la quantificazione, prima piastra una curva standard in duplicato utilizzando cellule HeyA8 ad una concentrazione di 1 milione di cellule / ml.
    1. Rendere la curva standard riducendo la velocità 1 milione di cellule, rimuovendo i media, e consentendo loro di sedersi in 1 ml di paraformaldeide 4% per 20 min.
    2. Spin cellule di nuovo e portare fino in 1 ml di PBS (cellule raccontano per confermare 1.000.000 / concentrazione ml). Piatto 50.000, 40.000, 30.000, 20.000, 10.000, 5000, 1000, e 0 cellule in ciascun pozzetto in duplicato, e aggiungere PBS per un volume totale finale di 50 microlitri in ciascun pozzetto.
  6. Fondo leggere la piastra di coltura su un lettore di fluorescenza piatto (eccitazione = 488 nm, emissione = 528 nm), il ridimensionamento alti pozzi (50.000 in curva standard). Utilizzare la curva standard per calcolare il numero di cellule di cancro ovarico aderito alla organotypcultura ic in ciascun pozzetto (Figura 4A-C).

4. Proliferazione Assay 10

  1. Dopo che le cellule tumorali dell'ovaio recuperare (vedere i passi 2.5 e sopra 2.6), agglomerare le cellule facendo girare per 3 min a 0,5 xg e quindi diluire le cellule nel volume appropriato di 1% FBS supporti (DMEM con 1% FBS, 1% MEM vitamine [93 mg / L], 1% MEM aminoacidi essenziali [81,4 mg / L], 1% di penicillina streptomicina [Pen-Strep, 100 U / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina]) per ottenere una concentrazione di 4.000 cellule / 150 ml.
  2. Capovolgere la piastra a 96 pozzetti con i HPMC / NOF colture organotipiche di estrarre il supporto spesi, e aggiungere 150 ml di sospensione cellulare cancro nel 1% dei media FBS in ciascun pozzetto. Incubare la piastra a 37 ° C in 5% CO 2 in un ambiente umidificato per 72 hr.
  3. Fondo leggere la piastra di coltura su un lettore di piastre a fluorescenza una volta al giorno (di eccitazione = 488 nm, emissione = 528 nm) per valutare la relativa proliferazionedi cellule. Continuare il test per 96 ore, cambiando i media a 48 ore (Figura 5A-C). Fare attenzione a non disturbare la cultura quando si cambia supporto (invertendo il piatto è preferibile).

5. Invasione Assay 8

  1. Prima di placcatura la cultura 3D, aggiungere 7,5 mg coda di topo collagene I in 200 l di PBS a 24 pozzetti inserto piastra di coltura (8 micron dimensione dei pori). Lasciate che la piastra di incubare O / N, quindi rimuovere con cautela la PBS con una pipetta immediatamente prima placcatura cultura organotipica HPMC / NOF sugli inserti collagene rivestite (step 2, sopra).
  2. Preparare le cellule tumorali ovariche come al punto 3.1. Al piatto le cellule tumorali ovariche sulle colture organotipiche sugli inserti, utilizzare con cautela una pipetta per rimuovere l'eccesso supporto dalla parte superiore degli inserti. Aggiungere 100 ml di sospensione cellulare tumore ovarico in mezzi privi di siero in ciascun pozzetto.
  3. Aggiungere 750 ml di media piena crescita nel pozzo sotto l'inserto di indurre cellule del cancro invasion nelle culture organotipiche. Incubare la piastra a 37 ° C in 5% CO 2 in un ambiente umidificato per 24 ore.
    Nota: le cellule tumorali ovariche che invadono la cultura organotipica attraverserà l'inserto e rimanere sul lato inferiore dell'inserto.
  4. Dopo 24 ore, cogliere l'inserto con le pinze e brevemente sciacquarlo in un bicchiere di PBS, quindi spostare l'inserto in un pozzo vuoto. Scrub parte superiore di ogni inserto con entrambi i lati di un batuffolo di cotone per un totale di 1 min. Introdurre rapidamente l'inserto in un piatto contenente 750 ml 4% paraformaldeide in ogni pozzetto. Consentire ad ogni inserto di sedersi in paraformaldeide per 10 minuti prima di trasferire gli inserti nei pozzetti riempiti con 750 l di PBS.
  5. Vedi le cellule invase (aderito e fissati al fondo di inserti) con un microscopio a 2,5x. Quando l'intero pozzo è all'interno del campo di vista, regolare l'ingrandimento di 10x e prendere 5 immagini, uno vicino al centro e 1 in ciascun quadrante del pozzo, evitandoprendendo immagini troppo vicino ai bordi. Seguire lo stesso schema per ogni bene.
  6. Utilizzare il programma del produttore per contare il numero di cellule in ogni immagine per ottenere un numero medio di cellule invase per campo in ogni pozzetto (Figura 6A-C) in base al loro protocollo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

La coltura organotipica stato assemblato mescolando dapprima fibroblasti umani primari con collagene di tipo I e quindi sovrapponendo questa cultura con 5 volte il numero di cellule mesoteliali. La cultura è stata incubata per almeno 18 ore prima di cellule di cancro ovarico sono stati aggiunti per studiare l'adesione, invasione o la proliferazione. Ciascun test è stato ripetuto con multiplo (n = 3-5) culture 3D ottenuti da pazienti diversi e numerosi pozzi sono stati testati in ciascuna condizione per l'adesione (n = 5), la proliferazione saggi (n = 5) e l'invasione (n = 3) . Cellule tumorali ovariche aderito alla coltura organotipica 3D dopo 4 ore (Figura 4), ​​proliferavano sulla coltura dopo 72 ore (6 volte la cella raddoppio tempo HeyA8) (Figura 5), e invaso dopo 24 ore (Figura 6). L'adesione, la proliferazione e l'invasione delle cellule di cancro ovarico HeyA8 era integrina-dipendente (Figura 4-6). In particolare, il peptide RGD e bloccando ANTIBodies di alfa 5 -integrin, β 1 -integrin e α v β 3 -integrin inibito l'adesione delle cellule del cancro ovarico alla cultura organotipica, mentre il peptide, anticorpo di controllo RAD e beta 4 -integrin anticorpo non ha (Figura 4) 10. Nel saggio di proliferazione, il peptide RGD e bloccando gli anticorpi ad a 5 - e ß 1 -integrin inibito la proliferazione delle cellule di cancro ovarico sulla cultura organotipica, mentre il peptide RAD, il controllo degli anticorpi, α v ß 3 -integrin anticorpo e ß 4 -integrin anticorpo non ha (Figura 5). Nel saggio di invasione, il peptide RGD e anticorpi bloccanti alfa a 5 - e beta 1 -integrin inibita, mentre il α v β 3 -integrin anticorpo potenziato ovarico invasione delle cellule di cancro attraverso la cultura organotipica 3D. Il RAD peptide, anticorpo di controllo, e β4 -integrin anticorpo non ha influenzato l'invasione (Figura 6). Raramente, questi test saranno un-interpretabile (ossia α 5 -integrin anticorpo bloccante non inibire l'adesione, la proliferazione o l'invasione rispetto al anticorpo di controllo). In precedenza, abbiamo trovato che certe colture organotipiche laveranno via al variare dei media o PBS lavaggio durante i test. Inoltre, se le cellule tumorali ovariche sono morti o non hanno recuperato abbastanza a lungo dalla tripsina digest integrine di ri-Express, il test non funzioneranno. Pertanto, è sempre importante avere un controllo positivo e negativo in ciascun saggio così la qualità della coltura organotipica e ovarico dosaggio cellula tumorale può essere valutata. Come mostrato qui, il peptide RGD, alfa 5 -integrin e ß 1 -integrin anticorpi bloccanti tutto inibita ovarico adesione delle cellule del cancro, l'invasione e la proliferazione della cultura organotipica e potrebbe essere utilizzata come con positivocontrolli in test futuri. Analogamente, β 4 -integrin anticorpo bloccante non ha influenzato ovarico adesione delle cellule del cancro, invasione e la proliferazione alla cultura organotipica e potrebbe essere usato come controllo negativo nei test futuri.

Figura 1
Figura 1. Istologia di metastasi omental umana. Ematossilina e eosina di (A) normale omento umano (MC, cellule mesoteliali, Fib, i fibroblasti, Adi, adipociti) e (B), il cancro ovarico metastasi omental (Met, metastasi del cancro ovarico). Bar in pannelli = 100 micron di lunghezza. (C) Schema del modello organotipica 3D di metastasi del cancro ovarico precoce ovarico imitando le metastasi delle cellule tumorali alla superficie del omento umana. Cliccate qui per vedere una grande versione di questa figura.

Figura 2
Figura 2. Isolamento di cellule umane primarie omentali. (A) Un pezzo di omento versata alla chirurgia in PBS e trasportato al laboratorio. Il tessuto viene pellettizzato a 0.5 xgx 3 min e trasferita PBS fresco. (B) Il pezzo di omento viene trasferita una capsula di Petri 10 cm, lavate con PBS, e bisturi sono usati per tagliare il omento in piccoli pezzi (0,5 cm 3 ). (CD) I pezzi di tessuto sono prelevati con 25 ml pipetta sierologica e trasferiti in una provetta conica da 50 ml per l'isolamento di HPMC. PBS viene rimosso dal tubo e HPMC viene pellettizzato dal PBS 0,5 xga 37 ° C. (MC, cellule mesoteliali, RBC, globuli rossi, Fib, fibroblasti) (E) NOF sono isolati dal remaini tessuto omentale ng dopo incubazione con ialuronidasi e collagenasi tipo III. L'immagine mostra il tessuto dopo una digestione da 6 a 12 ore. NOF sono pellettato facendo girare a 0.5 xg a temperatura ambiente. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Caratterizzazione di HPMC e NOF isolato dal tessuto omento umano. Immagini a contrasto di fase (A) di cellule mesoteliali (HPMC) e fibroblasti (B) (NOF) dopo l'isolamento omento dal tessuto. HPMC umana macchiato per (C) citocheratina 8 e (E) vimentina. NOF umana macchiato per (F) vimentina, ma non macchia per (D) citocheratina 8. Bar = 100 micron, si applica a tutti i pannelli.ftp_upload / 53541 / 53541fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. adesione delle cellule di cancro ovarico per la cultura organotipica è integrina-dipendente. Assay (A) L'adesione è stata eseguita con 50.000 fluorescenza marcata cellule di cancro ovarico, cellule HeyA8, come descritto nella sezione relativa al protocollo. È stato riferito La fluorescenza totale di ogni bene. L'anticorpo di controllo è IgG di topo. Ogni barra rappresenta l'errore medio +/- standard di media. Rappresentante (B) a contrasto di fase e (C) immagini fluorescenti di adesione delle cellule del cancro ovarico alla cultura organotipica. Bar = 100 micron, vale per entrambi i pannelli. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5. proliferazione delle cellule del cancro ovarico sulla coltura organotipica è integrina-dipendente. Assay (A) La proliferazione è stata eseguita con 4.000 fluorescenza marcata cellule di cancro ovarico, cellule HeyA8, come descritto nella sezione Protocollo. È riportato il numero totale di cellule. L'anticorpo di controllo è IgG di topo. Ogni barra rappresenta l'errore medio +/- standard di media. Dalla fusione a contrasto di fase e le immagini fluorescenti di ovarico proliferazione delle cellule tumorali sulla cultura organotipica a (B) 24 e (C) 96 ore. Bar = 100 micron, vale per entrambi i pannelli. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

tp_upload / 53541 / 53541fig6.jpg "/>
Figura 6. invasione cancro ovarico attraverso la cultura organotipica è integrina-dipendente. Assay (A) L'invasione è stata eseguita con 40.000 fluorescenza marcata cellule di cancro ovarico, cellule HeyA8, come descritto nella sezione relativa al protocollo. È riportato il numero di cellule invasori (spostato attraverso la cultura 3D al fondo dell'inserto). L'anticorpo di controllo è IgG di topo. Ogni barra rappresenta l'errore medio +/- standard di media. (B) contrasto di fase e (C) immagini fluorescenti di cellule di cancro ovarico che hanno invaso attraverso la cultura organotipica. Bar = 100 micron, si applica a tutti i pannelli. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Un modello organotipica del microambiente peritoneale è stato istituito per valutare la funzione individuale e collettiva (s) di entrambi i componenti cellulari e innate del microambiente in ovarico diffusione del cancro. Sono disponibili i protocolli specifici per la placcatura e personalizzare la cultura organotipica 3D per indagare ovarico adesione delle cellule tumorali, la proliferazione e l'invasione. Cellule primarie umane omentali mesothelial e fibroblasti sono stati isolati da pazienti e utilizzati in un passaggio precoce per preservare la morfologia normale e la variazione del paziente. In questo modello, normali fibroblasti omentali e ECM (tipicamente collagene di tipo I) sono stati stratificati con un monostrato di cellule mesoteliali primario dell'uomo. Questo modello istologicamente simula il rivestimento peritoneale, e ci permette di ricreare ed esaminare eventi chiave nella metastasi del cancro ovarico tra cui l'adesione delle cellule di cancro ovarico, la proliferazione e l'invasione 8,27.

In precedenza, i modelli 3D hanno limitatestato stabilito per studiare le interazioni tumore ovarico con il microambiente 13,14,21-25, mentre questo modello organotipica 3D è il primo a ricreare la costruzione del mesotelio rivestimento della cavità peritoneale. L'omento umana viene raccolto da pazienti di varia età e la salute. La salute del tessuto influenza direttamente le tecniche di isolamento delle cellule e fibroblasti mesothelial. Il tessuto sano appare di colore più chiaro con molto piccoli lobuli (1-3 mm) rispetto al tessuto che è più colore arancio con grandi lobuli presenti (> 5 mm). La maggior parte di HPMC slough off in iniziale PBS come il tessuto viene trasportato da un intervento chirurgico al laboratorio. Il sano il tessuto, tuttavia, il più resistente il HPMC sono di rimozione, e ulteriori lavaggi PBS e 1: 1 di PBS: tripsina digest può tradursi in una coltura mista di cellule HPMC e NOF. Nei tessuti sani, alcuni HPMC può sopravvivere la collagenasi 6 ore digerire, e un digest O / N in soluzione collagenasi 1x in pienamezzi di crescita è raccomandato per ottenere una coltura pura NOF. Nota l'omento deve essere posto immediatamente in PBS dopo la rimozione o nessun HPMCs saranno recuperati dal tessuto. Inoltre, se il tessuto è memorizzato in PBS per un periodo di tempo (> 2 ore) estesa a RT o in frigorifero, il numero di HPMCs vitali isolato è significativamente ridotta.

Un rapporto 1: 5 di fibroblasti di cellule mesoteliali è placcato per imitare il rapporto di fibroblasti di cellule mesoteliali in vivo 8. È importante notare che le dimensioni delle cellule mesoteliali isolate varia da paziente a paziente e questo può richiedere una regolazione del rapporto di placcatura. Le cellule mesoteliali di alcuni pazienti sono molto più piccoli; in questi casi, piastra doppio del numero di cellule mesoteliali (20.000). Inoltre, le cellule primarie sono sempre utilizzati in una fase iniziale (1-2) passaggio per preservare la morfologia. Cellule mesoteliali possono essere cellule mesoteliali cubiche o esili, e cuboidali diventano più esilecome sono diversi passaggi, o con una maggiore esposizione ai mezzi condizionati dalle cellule tumorali ovariche o trattamento con TGFβ 10.

Cellule tumorali ovariche possono aderire ed invadere attraverso le cellule mesoteliali mesenchimali più efficiente rispetto alle cellule mesoteliali epiteliali dallo stesso o da diversi pazienti. In genere, abbiamo istituito la cultura organotipica per 18 ore prima di iniziare i test funzionali con cellule di cancro ovarico. Più a lungo le cellule mesoteliali e fibroblasti sono coltivati ​​insieme, più il tempo che devono secernere diverse proteine, tra cui proteine ​​ECM, che possono influenzare il comportamento delle cellule di cancro ovarico. Un altro fattore importante da tenere in considerazione durante l'esecuzione di questi test è il livello di tasso di proliferazione differenziale e l'espressione di proteine ​​associate con una maggiore aderenza, l'invasione, e / o la proliferazione, inclusi integrine, proteasi, e fattori di crescita, in ogni linea di cellule di cancro o primario dell'uomo tipi di cellule del cancro.Il tempo e numero di cellule tumorali utilizzato in ciascuno dei saggi funzionali con la coltura organotipica deve essere ottimizzato per ciascuna linea cellulare di cancro o tipo di cellula di cancro primario. Ad esempio, nel saggio aderenza descritto, le cellule tumorali ovariche potrebbero invadere la coltura durante questo tempo.

Chiaramente, questo modello organotipica non contiene tutti i componenti del normale microambiente peritoneale come immunitario, endoteliali e cellule adipociti. Inoltre, il modello dipende l'accessibilità e la disponibilità di tessuti umani primari, come le cellule primarie sono utilizzati solo entro i primi tre passaggi. Tuttavia, il modello ha molti vantaggi nell'utilizzo di cellule umane primarie e integrazione di molteplici tipi di cellule che hanno dimostrato di svolgere ruoli importanti in metastasi. Questo modello è stato utilizzato per indagare geni e proteine ​​regolazione nei tipi cellulari individuali (cioè, le cellule tumorali, mesoteliali normali o fibroblasti) dopoco-coltura. In particolare, i ruoli di c-Met 28, MMP-2 9,29, E-caderina 30, β 1 -integrin 10, ß 3 -integrin 16, alfa 5 -integrin 10,31, e fibronectina 10 ai primi di metastasi hanno stata esplorata. Inoltre, il modello ha il potenziale per espandersi per includere più tipi di cellule, come l'incorporazione degli adipociti 6. Il modello è stato modificato e miniaturizzato per l'impiego in high-throughput screening per identificare i piccoli inibitori molecolari di cancro ovarico cellule adesione / invasione al microambiente peritoneale 27. Le future applicazioni di questo modello comprendono l'inserimento di cellule immunitarie nel test, tra cui i macrofagi per studi meccanicistici e high-throughput screening. In sintesi, la coltura cellulare organotipica fornisce un modello utile per valutare le interazioni tra il microambiente peritoneale umano e cellule tumorali ovariche, con la goal di chiarire importanti meccanismi molecolari della diffusione e la progressione della malattia, e di individuare potenziali bersagli terapeutici.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Isolation and culture of primary cells
PBS Fisher Scientific SH3001304
Single-edged razor blades Fisher Scientific 12-640
15 cm culture dishes BD Biosciences 353025
Glass flask ? ?
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 16000044_3616914956
DMEM with L-Glutamine Corning 10-013-CV
MEM Vitamins Corning 25-020-Cl
MEM Nonessential amino acids Corning 25-025-CI
Penicillin-Streptomycin Corning 30-002-CI
Shaker  Thermo-Fisher MaxQ 4450
Centrifuge Eppendorf 5702
Incubator Thermo-Fisher Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator Model 3100
Trypsin EDTA, 1x (0.25%) Corning 25-053-CI
Hyaluronidase Worthington Biochemical LS002592
T-75 Flasks BD Biosciences 353136
T-175 Flasks BD Biosciences 353112
Pipet tips Rainin P2, P10, P20, P200 and P1000
Pipet tips Corning Filtered tips P2, P10, P20, P200 and P1000
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
2. Plating 3D culture
Cell Counter Invitrogen Countess
Countess Cell Counting Chamber Slides Invitrogen C10313
Trypan Blue Stain (0.4%) Gibco 15250-061
Collagen Type I (Rat Tail) BD Biosciences 354236
96 well plate, clear bottom, black BD Biosciences 353219
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
3. Adhesion assay
Multichannel pipet Eppendorf Xplorer 300
Paraformaldehyde solution 4% in PBS Santa Cruz Biotechnology sc-281692
Plate reader Molecular Devices Minimax
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
5. Invasion assay
Cell Culture Inserts (8um, 24-well) BD Biosciences 353097
Cotton swabs Q-tips cotton swabs
Microscope Zeiss Axiovert 200m
Cell Profiler public domain
24 well plate BD Biosciences 353047
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
6. Antibodies
Anti-Integrin αVβ3 Antibody, clone LM609 EMD Millipore MAB1976
Beta 1  Oncosynergy OS2966
Alpha 5 [CD49e] ID Pharmingen 555615
Beta 4 [CD104] EMD Millipore MAB 2058

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R., Ma, J., Zou, Z., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J. Clin. 65, (1), 5-29 (2015).
  2. Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. Am. J. Pathol. 177, 1053-1064 (2010).
  3. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat. Med. 19, 1423-1437 (2013).
  4. Correia, A. L., Bissell, M. J. The tumor microenvironment is a dominant force in multidrug resistance. Drug Resist Updat. 15, 39-49 (2012).
  5. Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: Functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21, 309-322 (2012).
  6. Nieman, K. M., et al. Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth. Nat. Med. 17, 1498-1503 (2011).
  7. Daya, D., McCaughy, W. T. Pathology of the peritoneum: A review of selected topics. Semin. Diagn. Pathol. 8, 277-289 (1991).
  8. Kenny, H. A., Krausz, T., Yamada, S. D., Lengyel, E. Use of a novel 3D culture model to elucidate the role of mesothelial cells, fibroblasts and extra-cellular matrices on adhesion and invasion of ovarian cancer cells. Int. J. Cancer. 121, 1463-1472 (2007).
  9. Kenny, H. A., Kaur, S., Coussens, L. M., Lengyel, E. The initial steps of ovarian cancer cell metastasis are mediated by MMP-2 cleavage of vitronectin and fibronectin. J. Clin. Invest. 118, 1367-1379 (2008).
  10. Kenny, H. A., et al. Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion. J. Clin. Invest. 124, 4614-4628 (2014).
  11. Strobel, T., Cannistra, S. A. β1-integrins partly mediate binding of ovarian cancer cells to peritoneal mesothelium in vitro. Gynecol. Oncol. 73, 362-367 (1999).
  12. Strobel, T., Swanson, L., Cannistra, S. A. In vivo inhibition of CD44 limits intra-abdominal spread of a human ovarian cancer xenograft in nude mice: A novel role for CD 44 in the process of peritoneal implantation. Cancer Res. 57, 1228-1232 (1997).
  13. Iwanicki, M., et al. Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium. Cancer Discov. 1, 144-157 (2011).
  14. Lessan, K., Aguiar, D., Oegema, T. R., Siebenson, L., Skubitz, A. P. CD44 and β1 integrin mediate ovarian carcinoma cell adhesion to peritoneal mesothelial cells. Am. J. Pathol. 154, 1525-1537 (1999).
  15. Ahmed, N., Riley, C., Rice, G., Quinn, M. Role of integrin receptors for fibronectin, collagen and laminin in the regulation of ovarian carcinoma functions in response to a matrix microenvironment. Clin. Exp. Metastasis. 22, 391-402 (2005).
  16. Kaur, S., et al. β3-integrin expression on tumor cells inhibits tumor progression, reduces metastasis, and is associated with a favorable prognosis in patients with ovarian cancer. Am. J. Pathol. 175, 2184-2196 (2009).
  17. Niedbala, M. J., Crickard, K., Bernacki, R. In vitro degradation of extracellular matrix by human ovarian carcinoma cells. Clin. Exp. Metastasis. 5, 181-197 (1987).
  18. Kanemoto, T., Martin, G. R., Hamilton, T. C., Fridman, R. Effects of synthetic peptides and protease inhibitors on the interaction of a human ovarian cancer cell line (NIH:OVCAR-3) with a reconstituted basement membrane (matrigel). Invasion Metastasis. 11, 84-92 (1991).
  19. Rieppi, M., et al. Mesothelial cells induce the motility of human ovarian carcinoma cells. Int. J. Cancer. 80, 303-307 (1999).
  20. Barbolina, M. V., Adley, B. P., Ariztia, E. V., Liu, Y., Stack, M. S. Microenvironmental regulation of membrane type 1 matrix metalloproteinase activity in ovarian carcinoma cells via collagen-induced EGR1 expression. J. Biol. Chem. 282, 4924-4931 (2007).
  21. Burleson, K. M., et al. Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers. Gynecol. Oncol. 93, 170-181 (2004).
  22. Suzuki, N., et al. HMOCC-1, a human monoclonal antibody that inhibits adhesion of ovarian cancer cells to human mesothelial cells. Gynecol. Oncol. 95, 290-298 (2004).
  23. Kishikawa, T., et al. Two distinct pattern of peritoneal involvement shown by in vitro and in vivo ovarian cancer dissemination models. Invas. Metast. 15, 11-21 (1995).
  24. Casey, R. C., et al. Establishment of an in vitro assay to measure the invasion of ovarian carcinoma cells through mesothelial cell monolayers. Clin. Exp. Metastasis. 20, 343-356 (2003).
  25. Niedbala, M. J., Crickard, K., Bernacki, R. Interactions of human ovarian tumor cells with human mesothelial cells grown on extracellular matrix. Exp. Cell Res. 160, 499-513 (1985).
  26. White, E. A., Kenny, H. A., Lengyel, E. Three-Dimensional modeling of ovarian cancer. Adv. Drug Deliv. Rev. 79-80, 184-192 (2014).
  27. Kenny, H. A., et al. Quantitative high throughput screening using a primary human three-dimensional organotypic culture predicts in vivo efficacy. Nature Comm. (2015).
  28. Sawada, K., et al. c-Met overexpression is a prognostic factor in ovarian cancer and an effective target for inhibition of peritoneal dissemination and invasion. Cancer Res. 67, 1670-1680 (2007).
  29. Kenny, H. A., Lengyel, E. MMP-2 functions as an early response protein in ovarian cancer metastasis. Cell cycle. 8, 683-688 (2009).
  30. Sawada, K., et al. Loss of E-cadherin promotes ovarian cancer metastasis via alpha 5-integrin, which is a therapeutic target. Cancer Res. 68, 2329-2339 (2008).
  31. Mitra, A. K., et al. Ligand-independent activation of c-Met by fibronectin and α(5)β(1)-integrin regulates ovarian cancer invasion and metastasis. Oncogene. 30, 1566-1576 (2011).
Modellazione Piazza precoci di cancro ovarico Diffusione in una cultura Organotipica della Cavità peritoneale umano
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Peters, P. N., Schryver, E. M., Lengyel, E., Kenny, H. Modeling the Early Steps of Ovarian Cancer Dissemination in an Organotypic Culture of the Human Peritoneal Cavity. J. Vis. Exp. (106), e53541, doi:10.3791/53541 (2015).More

Peters, P. N., Schryver, E. M., Lengyel, E., Kenny, H. Modeling the Early Steps of Ovarian Cancer Dissemination in an Organotypic Culture of the Human Peritoneal Cavity. J. Vis. Exp. (106), e53541, doi:10.3791/53541 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter