Abstract
الملوحة هي من أهم خصائص البيئة المائية. للكائنات المائية أنها تحدد موائل المياه العذبة والمياه المالحة، ومياه البحر. في كثير من الأحيان يتم إجراء اختبارات السمية للمواد الكيميائية وتقييم المخاطر البيئية على الأحياء المائية في المياه العذبة، ولكن سمية المواد الكيميائية للكائنات المائية يعتمد على درجة الحموضة، ودرجة الحرارة، والملوحة. لا توجد طريقة، ومع ذلك، لاختبار الاعتماد ملوحة السمية بالنسبة للكائنات المائية. هنا، كنا الميداكا (Oryzias latipes) لأنها يمكن أن تتكيف مع المياه العذبة والمياه المالحة، ومياه البحر. تركيزات مختلفة من متوسطة تربية جنين (ERM) (1X، 5X، 10X، 15X، 20X، و30X) كانوا يعملون لاختبار سمية الجسيمات nanocolloidal الفضة (الرسائل الوطنية الثانية) لالميداكا البيض (1X ERM و30X ERM ديك الضغوط الأسموزية أي ما يعادل على المياه العذبة ومياه البحر، على التوالي). في لوحات ستة جيدا البلاستيكية، تعرضت 15 بيضة الميداكا في ثلاث نسخ إلى الرسائل الوطنية الثانية في 10 ملغم / لتر و# 8722؛ (1) في تركيزات مختلفة من إدارة مخاطر المؤسسات في الرقم الهيدروجيني 7 و 25 درجة مئوية في الظلام.
كنا المجهر تشريح وميكرومتر لقياس معدل ضربات القلب في 15 ثانية والعين قطر يوم 6 و طول الجسم الكامل للاليرقات على الفقس اليوم (القسم 4). وقد لوحظت الأجنة حتى الفقس أو 14 يوما. نحن ثم عد معدل الفقس كل يوم لمدة 14 يوما (المادة 4). لنرى تراكم الفضة في الأجنة، استخدمنا إضافة بالحث البلازما الطيفي لقياس تركيز الفضة من الحلول اختبار (القسم 5) والأجنة dechorionated (المادة 6). وسمية الرسائل الوطنية الثانية لأجنة الميداكا زيادة الواضح مع زيادة الملوحة. هذا الأسلوب الجديد يسمح لنا لاختبار سمية المواد الكيميائية في درجات الملوحة المختلفة.
Introduction
منذ إنشاء منظمة التعاون الاقتصادي والمبادئ التوجيهية للاختبار التنمية (OECD) للمواد الكيميائية الاختبار في عام 1979، تم نشر 38 المبادئ التوجيهية للاختبار في القسم 2 من المبادئ التوجيهية، تأثيرات على الأنظمة الحيوية 1. جميع الكائنات الحية المائية اختبارها كانت من موائل المياه العذبة، وهي محطات المياه العذبة؛ الطحالب. اللافقاريات مثل الغار والهاموش. والأسماك مثل الميداكا، الزرد، وتراوت قوس قزح. بالمقارنة مع بيئات المياه المالحة، وبيئات المياه العذبة أكثر المتضررين مباشرة من الأنشطة الاقتصادية والصناعية الإنسان. ولذلك، فقد تم ترتيب أولوية بيئات المياه العذبة لاختبار لأنهم أكثر عرضة من التلوث.
في المناطق الساحلية، بما في ذلك مصبات الأنهار، الملوحة تختلف بين أوضاع المياه ومياه البحر المالحة، وغالبا ما لوثت هذه المناطق حسب النشاط الصناعي 2. تتميز المناطق الساحلية والأراضي الرطبة المرتبطة بها التي كتبها hالتنوع البيولوجي البيئي IGH والإنتاجية. ولذلك يجب أن النظم الإيكولوجية الساحلية تكون محمية من التلوث الكيميائي. ومع ذلك، هناك كان محدودا البحوث السمية البيئية في موائل المياه ومياه البحر المالحة.
Sakaizumi 3 درس التفاعلات السامة بين ميثيل الزئبق والملوحة في البيض الميداكا اليابانية، ووجدت أن زيادة الضغط الاسموزي لمحلول الاختبار تعزيز سمية ميثيل الزئبق. . Sumitani آخرون 4 يستخدم البيض الميداكا للتحقيق سمية العصارة المكب. وجدوا أن معادلة الاسموزية للالعصارة إلى البيض هو المفتاح لإحداث تشوهات خلال مرحلة التطور الجنيني. وبالإضافة إلى ذلك، ذكرت Kashiwada 5 أن الجسيمات النانوية البلاستيك (39.4 نانومتر في القطر) تغلغلت بسهولة من خلال المشيمه الميداكا البيض في ظل ظروف شديدة الملوحة (15X الجنين تربية المتوسطة (ERM)).
نموذج سمكة صغيرة نموذجية، والميداكا اليابانية (Oryzias latipes 6. يمكن الميداكا اليابانية يعيشون في ظروف تتراوح من المياه العذبة إلى مياه البحر بسبب كلوريد الخلايا المتقدمة جدا على 7. وهم بالتالي من المحتمل أن تكون مفيدة لاختبار في ظروف مع مجموعة واسعة من الملوحة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم علاج الميداكا اليابانية المستخدمة في هذه الدراسة إنسانية وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية للجامعة تويو، مع إيلاء الاعتبار الواجب للتخفيف من القلق والانزعاج.
1. الفضة Nanocolloids (الرسائل الوطنية الثانية)
- شراء الرسائل الوطنية الثانية النقاء (20 ملغ / لتر -1، 99.99٪ النقاء، الجسيمات يعني قطرها حوالي 28.4 ± 8.5 نانومتر العالقة في الماء المقطر).
- التحقق من نقاء وتركيز على الميدالية الفضية عن طريق إضافة بالحث البلازما الطيفي (ICP-MS) يحلل وفقا لدليل التشغيل 8. التحليلات وصفت طريقة المعالجة لICP-MS في قسم 7.
2. إعداد SNC حلول (خليط من الفضة الغروية وحج +) مع الملوحة المختلفة
- إعداد 60 ERM × تتألف من 60 ز كلوريد الصوديوم، 1.8 ز بوكل، 2.4 غ CaCl 2 · 2H 2 O، و9.78 ز MgSO 4 · 7H 2 O في 1 لتر من الموجrapure المياه؛ ضبط درجة الحموضة إلى 7.0 مع 1.25٪ NaHCO 3 في الماء عالى النقاء.
- تحريك حل ERM عند 25 درجة مئوية خلال الليل.
- مزيج الرسائل الوطنية الثانية مع ERM المخفف. إعداد 40 مل من كل حل SNC-ERM مختلطة. التركيز النهائي هو 10 ملغ / لتر -1 من الرسائل الوطنية الثانية في تركيزات مختلفة من ERM (1X، 5X، 10X، 15X، 20X، أو 30X).
- ضبط درجة الحموضة في حل مختلط SNC-ERM إلى 7.0 مع 0.625٪ NaHCO 3 في الماء عالى النقاء. ضبط الأس الهيدروجيني مهم جدا في إعداد الحل SNC، ليتم تسهيل الإفراج حج + من الظروف الحمضية 9.
- استخدام AGNO 3 كمركب مرجعية للالرسائل الوطنية الثانية.
- مزيج AGNO 3 مع ERM المخفف. إعداد 40 مل من AGNO 3 -ERM حل مختلط في تركيز AGNO 3 من 15.7 ملغم / لتر -1 (10 ملغ / لتر -1 الفضة) في تركيزات مختلفة من ERM (1X، 5X، 10X، 15X، 20X، أو 30X) .
ملاحظة: لدراسة سمية الغروانية الفضة، AGNO 3الحل، الذي هو مصدر من الفضة القابلة للذوبان، ويستخدم كمركب مرجعية للالرسائل الوطنية الثانية، والتي هي خليط من المواد الغروية الفضة والفضة القابلة للذوبان.
- مزيج AGNO 3 مع ERM المخفف. إعداد 40 مل من AGNO 3 -ERM حل مختلط في تركيز AGNO 3 من 15.7 ملغم / لتر -1 (10 ملغ / لتر -1 الفضة) في تركيزات مختلفة من ERM (1X، 5X، 10X، 15X، 20X، أو 30X) .
3. الميداكا الثقافة وحصاد البيض
- الحصول على الميداكا (latipes O.) (سلالة البرتقالي والأحمر) (60 ذكور و 60 إناث).
- ثقافة الميداكا كمجموعات (20 ذكور و 20 إناث كمجموعة واحدة) في 1X ERM في 3 دبابات L باستخدام نظام زراعة التدفق من خلال الميداكا.
- الثقافة في الحالات التالية:
مجموعة الرقم الهيدروجيني للمستنبت: 6،2-6،5
ضوء: دورة الظلام: 16: 8 ساعة
درجة حرارة متوسطة الثقافة: 24 ± 0.5 درجة مئوية
الضغط الاسموزي من مستنبت: 257 الميلي أسمول
- الثقافة في الحالات التالية:
- تغذية الميداكا على يرقات الأرتيميا سالينا الساعة 10:00 (مرة واحدة يوميا) وإطعام الجاف النظام الغذائي الاصطناعي الأسماك في الساعة 09:00، 11:00، 13:00، 15:00، 17:00 و (خمس مرات في اليوم).
- الحصول A. سالينا يرقات. <لى> إعداد 5 لترات من محلول ملحي 3.0٪ في كوب من البلاستيك.
- إضافة 30 غرام من البيض الأرتيميا إلى محلول الملح في كوب.
- احتضان البيض عند 25 درجة مئوية لمدة 48 ساعة مع السطح (4 لتر / دقيقة -1) باستخدام مضخة التهوية.
- بعد 48 ساعة، ووقف محتدما.
- يسمح الحل للوقوف لمدة 5 إلى 10 دقيقة لفصل A. تحاك سالينا يرقات (الجزء السفلي من الحل) من البيض لم يفقس البيض و(الجزء العلوي من الحل).
- إزالة الطبقة العليا من الحل عن طريق الترقيد.
- ابحث في الجزء السفلي من الحل من خلال غربال بفتحات من 283 ميكرون، وجمع يرقات التي تمر عن طريق شبكة مع فتحات من 198 ميكرون.
- تغذية يرقات إلى الميداكا في غضون 6 ساعة.
4. سمية اختبار الرسائل الوطنية الثانية أو AGNO 3
- شطف البيض الميداكا (المرحلة 21) ثلاث مرات مع حل اختبار [الرسائل الوطنية الثانية (10 ملغ / لتر -1) أو AGNO 3 (15.7 ملغم / لتر -1 إلى 10 ملغم / لتر -1 الفضة) في كل تركيز إدارة مخاطر المؤسسات (1X، 5X ، 10X، 15X، 20X، أو 30X) في الرقم الهيدروجيني 7]. والضوابط، واستخدام البيض في 1 × 30 × ERM في الرقم الهيدروجيني 7.
- إضافة 15 بيضة تشطف إلى 5 مل من كل حل الاختبار في ستة جيدا لوحات بلاستيكية. (تنفيذ التجارب تعرض ثلاث مرات لSNC أو AGNO 3 سمية اختبار باستخدام كل حل الاختبار.)
- التفاف على لوحات في رقائق الألومنيوم.
- احتضان لوحات ملفوفة عند 25 درجة مئوية في الظلام حتى الفقس أو لمدة 14 يوما.
- مراقبة البيض يتعرض كل 24 ساعة لإجراء تغييرات بيولوجية والبيض الميتة (الشكلان 1 و 2).
- تبادل الحلول اختبار كل 24 ساعة.
- أداء الملاحظات على النحو التالي.
- في يوم 6 من التعرض، والاعتماد على معدل ضربات القلب (في 15 ثانية) سالأجنة و الميداكا تحت المجهر تشريح باستخدام ساعة توقيت (الشكل 3A).
- في يوم 6 من التعرض، وقياس حجم العين (قطر) من الأجنة الميداكا تشريح تحت المجهر باستخدام ميكرومتر (الشكل 3B).
- على الفقس اليوم، وقياس أطوال الجسم الكاملة من اليرقات تحت المجهر تشريح باستخدام ميكرومتر (الشكل 3C).
- عد عدد من البيض يتعرضون أن يفقس خلال 14 يوما (الشكل 3D).
5. عزل الفضة القابلة للذوبان من SNC الحل، وتحليل الفضة
- عزل الفضة القابلة للذوبان من كل حل SNC (خليط من المواد الغروية الفضة والفضة القابلة للذوبان) من خلال تصفية من خلال مرشح 3 كيلو دالتون غشاء على 14000 س ز و 4 درجات مئوية لمدة 10 دقيقة. استخدام 3 كيلو دالتون غشاء عزل الفضة القابلة للذوبان من الرسائل الوطنية الثانية، لأن ذكرت قطر متوسط من الرسائل الوطنية الثانية المجمعة في 1X ERM هو 67.8 نانومتر 11 لالثانية أن من حج + هو 0.162 نانومتر 12؛ وكيلو دالتون غشاء 3 يستبعد جزيئات بأقطار من 2 نانومتر أو أكثر (13).
- قياس تركيز الفضة في 50 ميكرولتر من حل تصفيتها (= تركيز الفضة القابلة للذوبان) من خلال تحليل ICP-MS (الشكل 3E) وفقا لدليل التشغيل ICP-MS 8. التحليلات وصفت طريقة المعالجة لICP-MS في قسم 7.
6. قياس الفضة التراكم في الميداكا الأجنة
- كشف البيض الميداكا (المرحلة 21) إلى الرسائل الوطنية الثانية أو AGNO 3 كما هو موضح في قسم 4.
- في يوم 6 من التعرض، وإزالة المشيماء من البيضة (أي dechorion) باستخدام الميداكا الفقس انزيم وفقا للبروتوكول وصفها في كتاب الميداكا 14.
- قياس تركيز الفضة من البيض dechorioned عن طريق تحليل ICP-MS وفقا لICP-MS العاملة دليل 8 (الشكل 3F). والمعالجةالتحليلات وصفت طريقة لICP-MS في قسم 7.
7. قياس تركيز الفضة التي كتبها ICP-MS تحليل
- إضافة عينات [50 ميكرولتر من محلول الفضة (للتأكد من صحة تركيز الفضة، القسم 1)؛ ثلاثة أجنة dechorionated (القسم 5). أو 50 ميكرولتر من حل تصفيتها (القسم 5)] إلى تفلون دورق 50 مل.
- إضافة 2.0 مل من حمض النيتريك عالى النقاء إلى الدورق 50 مل.
- تسخين الخليط على طبق ساخن على 110 درجة مئوية حتى قبل أن يجف (حوالي 3 ساعات).
- حل مسألة العضوية بشكل كامل، إضافة 2.0 مل من حمض النيتريك عالى النقاء و 0.5 مل من بيروكسيد الهيدروجين إلى الدورق.
- تسخين الخليط مرة أخرى على صفيحة ساخنة حتى قبل أن يجف (حوالي 3 ساعات).
- حل هذه البقايا في 4 مل من 1.0٪ محلول عالى النقاء حمض النيتريك.
- نقل 4 مل من محلول لأنبوب الطرد المركزي.
- كرر 7،6-7،7 مرتين (أي ما مجموعه ثلاث مرات). الحجم النهائي هو 12.0مل.
- قياس تركيز الفضة من العينة (المنحلة في 1.0٪ عالى النقاء حمض النيتريك) باستخدام تحليل ICP-MS وفقا لدليل التشغيل 8.
- استخدام الداخلي وحل معيار خارجي (انظر قائمة المواد) لقياس تركيز الفضة. وقد تم اعتماد الحل المعيار الداخلي والخارجي من قبل الجمعية الأمريكية لاعتماد المختبرات (A2LA). وكانت حدود الكشف من الفضة 0.0018 نانوغرام / مل -1 (الحل) و0.016 نانوغرام ملغ الوزن -1 (هيئة الجنين).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وكان تأثير الملوحة على سمية SNC اضح جدا: كان تحريض تشوه أو موت الملوحة تعتمد (الشكلان 1 و 2). قمنا بقياس المؤشرات الحيوية المظهرية (معدل ضربات القلب، وحجم العين، طول كامل الجسم، ومعدل الفقس) في SNC (10 ملغ / لتر -1) الأجنة -exposed. وكشفت هذه المؤشرات الحيوية المظهرية التي تعتمد على ملوحة SNC سمية.
وتراوحت معدلات القلب 29،6-32،2 نبضة / 15 ثانية في جميع أنحاء 1x إلى 30X ERM في الضوابط. ومع ذلك، فإنها انخفضت بشكل ملحوظ (P <0.01) مع SNC أو AGNO تعرض 3 في 30X ERM (الشكل 3A). انخفاض معدل ضربات القلب يشير إلى تدهور حالته الصحية. لم تكن هناك اختلافات كبيرة في طول الجسم الكامل لليرقات تحت السيطرة أو AGNO 3 التعرض في الملوحة تتراوح بين 5X إلى 30X ERM مقارنة مع فيما يخصه 1X ERM الصورةolutions. كان طول الجسم باستمرار 4،55-4،69 ملم. ومع ذلك، انخفض طول الجسم معنويا (P <0.01) إلى 4.33 و 3.77 ملم، نتيجة التعرض SNC في 15X 20X وERM مقارنة مع الحلول 1X إدارة مخاطر المؤسسات المعنية؛ علاوة على ذلك، فقد انخفضت إلى 3.75 مم في 30X ERM (كان التحليل الإحصائي غير متوفر في 30X ERM لفقس واحد فقط) (الشكل 3C). تناقص طول كامل الجسم يشير إلى تثبيط النمو. لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية في قطر العين في التحكم في الملوحة تتراوح من 1x إلى 30X ERM مقارنة مع 1X إدارة مخاطر المؤسسات. كان قطرها العين باستمرار 0،357-0،366 مم. ومع ذلك، انخفضت بشكل ملحوظ على SNC أو AGNO تعرض 3 في 20x وأو 30X ERM مقارنة مع في الحلول 1X إدارة مخاطر المؤسسات المعنية (الشكل 3B). تناقص قطر العين يدل على تثبيط التنموي للجهاز العصبي. كل البيض السيطرة تحاك في غضون 14 يوما. ومع ذلك، عند التعرض SNC في 20x وو30X ERM انخفض معدل الفقس بشكل كبير إلى 71٪ و 2٪ على التوالي من المعدل في 1X ERM (P <0.01) (الشكل 3D). أيضا، على AGNO 3 التعرض أنها انخفضت بشكل ملحوظ في 30X ERM (P <0.01). انخفاض معدل الفقس يدل على التأثير السام وجود الرسائل الوطنية الثانية أو AGNO 3. وبالتالي تظهر هذه الأربعة المؤشرات الحيوية المظهرية الملوحة تعتمد سمية SNC.
الملوحة يزيد تشكيل مجمع المعادن القابلة للذوبان في الماء، وهذه المجمعات قد يكون لها آثار سامة 3،8. في دراستنا، ICP-MS تحليل الفضة كشفت أن تركيزات الفضة القابلة للذوبان في حلول اختبار زادت مع زيادة الملوحة. تركيز الفضة في الأجنة أيضا زيادة (أرقام 3E، 3F).
"/>
الشكل 1: زيادة الملوحة يزيد SNC سمية. ارتفع عدد الوفيات وعدد الأجنة وضعت بشكل غير طبيعي مع زيادة الملوحة تحت التعرض SNC. (أ) مجموعة صورة البيض الميداكا تعرضت ل 10 ملغم / لتر -1 حل SNC بتركيزات إدارة مخاطر المؤسسات المختلفة. الصور هي نموذجية من البيض الميداكا تتعرض لالرسائل الوطنية الثانية، ولاحظ تحت المجهر تشريح. البيض الميداكا السيطرة وضعت بشكل جيد، وجميع من لهم تحاك في 1x إلى 30X إدارة مخاطر المؤسسات. في 10 ملغم / لتر -1 التعرض SNC، على الرغم من كل البيض الميداكا تحاك في 1x إلى 15X إدارة مخاطر المؤسسات، وتشوهات تنموية (أوجز الأحمر المستطيلات، لم يفقس) وأجنة لم يفقس في غضون 14 يوما (الأخضر أوجز المستطيلات، لم يفقس) لوحظت في 20x وو 30X إدارة مخاطر المؤسسات. (ب) تضخمت الصور من أسفل اليمين من (أ). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الحمار = "jove_content" FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> 
تعرضت المؤشرات الحيوية المظهرية النموذجية من البيض الميداكا تتعرض لالرسائل الوطنية الثانية البيض الميداكا في مرحلة التطوير 21 إلى الرسائل الوطنية الثانية (10 ملغ / لتر -1) في تركيزات مختلفة من ERM لمدة 6 أيام (أ) الجنين الميداكا تحكم مع التطور الطبيعي: الرقم 2.. (ب) التشوه التنموي (درجة خفيفة من الضرر). هذا الجنين عرض ذمة pericardiovascular. قلب أنبوبي. جلطات الدم؛ تطوير كافية من الأوعية الدموية (وبالتالي نقص التروية)، النخاع الشوكي، والذيل، عيون، والدماغ. وذيل قصير. (ج) تشوه التنموي (درجة كبيرة من الضرر). وأظهر هذا الجنين تدمير الكيس المحي. تطوير كافية من الأوعية الدموية (وبالتالي نقص التروية)، النخاع الشوكي، والذيل، عيون، والدماغ. وذيل قصير. وقد لوحظت علامات في (ب) و (ج) عند التعرض SNC في 20x وو30X إدارة مخاطر المؤسسات. <وأ href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53550/53550fig2large.jpg" الهدف = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3: آثار التعرض للالرسائل الوطنية الثانية أو نترات الفضة على المؤشرات الحيوية السمية خلال تطوير الميداكا البيض التنموية مرحلة 21 البيض الميداكا تتعرض لالرسائل الوطنية الثانية (10 ملغ / لتر -1) أو نترات الفضة (10 ملغ / لتر -1 والفضة) في. وقد لوحظت سلسلة من ERMS لمدة 6 أيام. [الأزرق] تحكم (ERM)؛ [الأحمر] الرسائل الوطنية الثانية في 10 ملغم / لتر -1 في إدارة مخاطر المؤسسات. [الأخضر] AGNO 3 في 10 ملغم / لتر -1 والفضة في إدارة مخاطر المؤسسات. (أ) معدل ضربات القلب في 15 ثانية. انخفاض معدل ضربات القلب يشير إلى تدهور حالته الصحية. قطرها (ب) عين. تناقص قطر العين يدل على تثبيط التنموي للجهاز العصبي. (ج) طول الجسم كامل. ديالتجعيد طول كامل الجسم يدل على تثبيط نمو. (د) معدل الفقس. انخفاض معدل الفقس يشير إلى التأثير السام وجود الرسائل الوطنية الثانية. (ه) تركيزات المجمعات الفضة القابلة للذوبان من الرسائل الوطنية الثانية أو نترات الفضة في حلول اختبار (ملغم / لتر -1). (و) تركيزات الفضة في الأجنة تتعرض لالرسائل الوطنية الثانية أو نترات الفضة في سلسلة من ERMS. * فرق كبير (تحليل التباين، P <0.05) مقارنة مع حل 1X إدارة مخاطر المؤسسات المعنية. NA: غير متوفر بسبب تحاك واحد فقط. أشرطة الخطأ تشير إلى الانحراف المعياري. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الميداكا هو أسماك المياه العذبة التي هي متسامح للغاية لمياه البحر. ليس من المعروف جيدا أن الموائل الطبيعية الأصلية لهذه الأسماك والمياه المالحة قبالة الساحل الياباني 6. وبالتالي، الأسماك الميداكا وضعت بشكل جيد خلايا كلوريد 7. هذه الخاصية الفريدة توفر العلماء طريقة جديدة لاختبار سمية المواد الكيميائية في البيئة بوصفها وظيفة من الملوحة (المياه العذبة إلى مياه البحر) باستخدام سوى نوع واحد من الأسماك.
للحصول على البيض الميداكا في المرحلة 21، يجب أن تحصد البيض كل صباح واختار في المرحلة 20. عادة، الميداكا أزواج يبدأ التزاوج في الصباح الباكر (قبل شروق الشمس) وإنتاج البيض بنسبة شروق الشمس. البيض حصادها في الصباح يجب أن تكون على نحو مرحلة 10 أو 11. إذا كان هناك حاجة للسيطرة على نمو البويضات قبل بدء التجربة، والتنمية البيض يمكن إبطاء باستخدام درجات حرارة بين 15 و 20 درجة مئوية قبل الوصول إلى مرحلة 21. قياس تركيز الفضة (الفضه للذوبانإيه) كانت في اختبار الحلول وفي الأجنة dechorionated المهم أن تحقيقنا للاعتماد ملوحة سمية SNC. الفقس الانزيم هو أفضل انزيم مناسب من الناحية البيولوجية لإزالة المشيماء، لأن خصوصية العالية تعني أنه لا يوجد لديه بروتين ضار. لا ينصح proteinases أخرى. وحتى الآن، الانزيم فقط الفقس المتاح هو أن لالميداكا. هذا هو واحد الحد من هذا الأسلوب.
أظهرت تأثير واضح الملوحة على نتائج اختبارات السمية الكيميائية التي تحاكي تلك الخصائص المائية الطبيعية واقعية قدر الإمكان، كما هو الحال في تجاربنا، كان مفيدا للتحقيق سمية المواد الكيميائية في البيئة. اكتشاف أن تم زيادة SNC سمية المقرر أن تركيزات الفضة عالية من الملوحة ينطبق إلى حد كبير على السمية الإيكولوجية للمواد الكيميائية الملوثة في جميع المجالات المائية. في حالة العام اختبار السمية الكيميائية في مياه البحر، لا يوجد حتى الآن أي nominat نموذج الأسماكإد من قبل المنظمات الدولية أذن (على سبيل المثال، ومنظمة التعاون والتنمية المنظمة الدولية للتوحيد القياسي). بين أسماك المياه العذبة (على سبيل المثال، الميداكا، الزرد، الكارب، التراوت، والمنوة) التي تم استخدامها لاختبار السمية الكيميائية، إلا أن الميداكا لديه كل من مزايا التكيف الملوحة، الفقس توافر انزيم، الخصوبة العالية، و حجم صغير بما فيه الكفاية لسهولة استخدامها في التجارب المعملية. وعلاوة على ذلك، الميداكا يمكن أن تتكيف مع مجموعة واسعة درجة الحرارة (2-38 درجة مئوية) 6. في البيئات المائية، والملوحة ودرجة الحرارة هي التأثيرات البيئية الأكثر أهمية على مصير المواد الكيميائية؛ لذا يجب أن يكون لدينا وسيلة للتعديل لمجموعة من البحوث البيئية المائية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silver nanocolloids | Utopia Silver Supplements | ||
| NaCl | Nacalai Tesque, Inc. | 31319-45 | For making ERM |
| KCl | Nacalai Tesque, Inc. | 28513-85 | For making ERM |
| CaCl2·2H2O | Nacalai Tesque, Inc. | 06730-15 | For making ERM |
| MgSO4·7H2O | Nacalai Tesque, Inc. | 21002-85 | For making ERM |
| NaHCO3 | Nacalai Tesque, Inc. | 31212-25 | For making ERM |
| AgNO3 | Nacalai Tesque, Inc. | 31018-72 | |
| pH meter | HORIBA, Ltd. | F-51S | |
| Balance | Mettler-Toledo International Inc. | MS204S | |
| medaka (Oryzias latipes) orange-red strain | National Institute for Environmental Studies | ||
| medaka flow-through culturing system | Meito Suien Co. | MEITOsystem | |
| Artemia salina nauplii eggs | Japan pet design Co. Ltd | 4975677033759 | |
| aeration pump | Japan pet design Co. Ltd | non-noise w300 | |
| Otohime larval β-1 | Marubeni Nissin Feed Co. Ltd | Otohime larval β-1 | Artificial dry fish diet |
| dissecting microscope | Leica microsystems | M165FC | |
| micrometer | Fujikogaku, Ltd. | 10450023 | |
| incubator | Nksystem | TG-180-5LB | |
| shaker | ELMI Ltd. | Aizkraukles 21-136 | |
| 6-well plastic plates | Greiner CELLSTAR | M8562-100EA | |
| aluminum foil | AS ONE Co. | 6-713-02 | |
| stopwatch | DRETEC Co. Ltd. | SW-111YE | |
| 3 kDa membrane filter | EMD Millipore Corporation | 0.5 ml centrifugal-type filter | |
| 50 ml Teflon beaker | AS ONE Co. | 33431097 | |
| Custom claritas standard | SPEXertificate | ZSTC-538 | For internal standard |
| Custom claritas standard | SPEXertificate | ZSTC-622 | For external standard |
| ultrapure nitric acid | Kanto Chemical Co. | 28163-5B | |
| hydrogen peroxide | Kanto Chemical Co. | 18084-1B | for atomic absorption spectrometry |
| ICP-MS | Thermo Scientific | Thermo Scientific X Series 2 | |
| hot plate | Tiger Co. | CRC-A300 |
References
- OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2 Effects on Biotic Systems. , OECD. Available from: http://www.oecd-ilibrary.org/environment/oecd-guidelines-for-the-testing-of-chemicals-section-2-effects-on-biotic-systems_20745761 (2015).
- National Coastal Condition Report. , Environmental Protection Agency, Office of Water and Office of Research and Development. Washington, DC. (2001).
- Sakaizumi, M. Effect of inorganic salts on mercury-compound toxicity to the embryos of the Medaka, Oryzias latipes. J. Fac. Sci. Univ. Tokyo. 14 (4), 369-384 (1980).
- Sumitani, K., Kashiwada, S., Osaki, K., Yamada, M., Mohri, S., Yasumasu, S., et al. Medaka (Oryzias latipes) Embryo toxicity of treated leachate from waste-landfill sites. J. Jpn. Soc. Waste Manage. Exp. 15 (6), 472-479 (2004).
- Kashiwada, S. Distribution of Nanoparticles in the See-through Medaka (Oryzias latipes). EHP. 114 (11), 1697-1702 (2006).
- Iwamatsu, T. The Integrated Book for the Biology of the Medaka. , University Education Press. Japan. (2006).
- Miyamoto, T., Machida, T., Kawashima, S. Influence of environmental salinity on the development of chloride cells of freshwater and brackish-water medaka, Oryzias latipes. Zoo. Sci. 3 (5), 859-865 (1986).
- XSERIES 2 ICP-MS Getting Started Guide Revision B - 121 9590. , Thermo Fisher Scientific Inc.. Available from: http://202.127.146.37/eWebEditor/uploadfile/20130314161434190.pdf (2007).
- Kashiwada, S., Ariza, M. E., Kawaguchi, T., Nakagame, Y., Jayasinghe, B. S., Gartner, K., et al. Silver nanocolloids disrupt medaka embryogenesis through vital gene expressions. ES & T. 46 (11), 6278-6287 (2012).
- Iwamatsu, T. Stages of normal development in the medaka Oryzias latipes. Mech. Dev. 121, 605-618 (2004).
- Kataoka, C., Ariyoshi, T., Kawaguchi, H., Nagasaka, S., Kashiwada, S. Salinity increases the toxicity of silver nanocolloids to Japanese medaka embryos. Environ. Sci.: Nano. 2, 94-103 (2014).
- Shannon, R. D. Revised effective ionic radii and systematic studies of interatomic distances in halides and chalcogenides. Acta Cryst. 32, 751-767 (1976).
- Pore size chart. , Spectrum Laboratories, Inc.. Available from: http://jp.spectrumlabs.com/dialysis/PoreSize.html (2015).
- Wakamatsu, Y. Medaka Book, 6.1: Preparation of hatching enzyme. , National BioResource Project (NBRP) Medaka. Available from: [cited 2015] https://shigen.nig.ac.jp/medaka/medakabook/index.php?6.1%20preparation%20of%20hatching%20enzyme (2015).
