Introduction
Individuelle myofibre er store, meget organiseret syncytial celler. Der er et par celle-kultur modeller for muskel; Men disse modeller har deres største begrænsning, at de ikke fuldt ud differentiere til modne myofibre. For eksempel er C2C12 og L6 cellelinjer afledt fra mus og rotter, henholdsvis 1-4. Under betingelser af serum sult, de mononukleære "myoblast-lignende" celler ophøre proliferation, undergår celle tilbagetrækning cyklus, og indgå den myogene program danner flerkernede celler med sarkomerer, kaldet myotuber. Med langvarige dyrkningsbetingelser kan myorør udvise kontraktile egenskaber og "spjæt" i kultur. Humane cellelinier har nu også etableret 5. Ud over disse immortaliserede cellelinjer kan mononukleære myoblaster isoleres fra muskel og under de samme betingelser af serum sult vil danne myotuber. Disse cellelinier og primære kulturer myoblast er meget brugerful fordi de kan transficeres med plasmider eller transduceret med vira og anvendes til at undersøge grundlæggende cellebiologiske processer. Men disse celler, selv når induceret til dannelse af myorør, mangler mange af de vigtigste træk ved moden muskel organisation. Specifikt myorør er meget mindre end de enkelte modne myofibre og mangler den normale form af myofibre. Kritisk, myorør mangler tværgående (T-) tubuli, den membranøs netværk kræves til effektiv Ca 2+ frigivelse hele myoplasm.
En alternativ metode til primær myoblast eller myogene cellelinjer indebærer anvendelse modne myofibre. Transgenese kan anvendes til at etablere ekspression af mærkede proteiner, men denne metode er kostbar og tidskrævende. In vivo elektroporation af musemuskel er dukket op som en foretrukken fremgangsmåde til dets hastighed og pålidelighed 6-10.
Fremgangsmåder til in vivo elektroporation og effektiv isolering af myofibre have blevet optimeret til musen flexor digitorum brevis (FDB) muskel 6. Fremgangsmåderne kan gennemføres let og er minimalt invasiv at inducere in vivo-ekspression fra plasmider. Denne fremgangsmåde er nu kombineret med høj opløsning billeddannelse metoder, herunder billeddannelse efter laser afbrydelse af sarcolemma 6,7. Kombinationen af fluorescerende farvestoffer og ekspression af fluorescensmærkede proteiner kan anvendes til at overvåge cellebiologiske processer i modne myofibre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Metoderne i denne undersøgelse blev udført i etisk overensstemmelse med Northwestern University Feinberg School of Medicine Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) godkendte retningslinjer. Blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse.
1. Eksperimentel Procedure til in vivo Elektroporation af Flexor digitorum Brevis (FDB) Muscle Bundle i Mus
- Design plasmider til in vivo-ekspression under anvendelse af en promotor vides at udtrykke i pattedyrceller (f.eks, cytomegalovirus, CMV) eller muskel (f.eks Muscle Kreatinkinase, MCK) 6,7. Større plasmider kan udtrykke på lavere niveauer. CMV-promotoren er blevet anvendt i udstrakt 6,7.
- Oprense plasmider fra E. coli ved anvendelse endotoksinfrit betingelser producentens instruktioner. Opløs plasmidet i sterile, endotoksinfrit TE-puffer ved 2 - 5 ug plasmid / pl.
- Fortynd udportionerer plasmidet til en concentration af 20 ug DNA i 10 pi sterilt endotoksinfrit TE (2 pg / pl) buffer per injektion i en steril mikrocentrifugerør. Udarbejde én portion per injektion.
- Fortynd bestanden af hyaluronidase til 1x med sterilt phosphatbufret saltvand uden calcium og magnesium (PBS - / -), hvilket gav en slutkoncentration på 8 enheder. Portion 10 pi fortyndet hyaluronidase pr injektion i et sterilt mikrocentrifugerør.
- Bedøver musen hjælp 2,5% isofluran indtil bedøvet og ikke reagerer på hale eller tå klemme. Dyret i rygleje på en varmepude eller varmebord at opretholde en normal kropstemperatur.
- Rengør trædepuden af musen med en alternerende anvendelse af en povidon-iod krat og alkohol tre gange under anvendelse af en prep teknik stammer fra nålen stedet og udstråle udad. Denne teknik opretholder nålen sted i en aseptisk tilstand, hvilket minimerer patogen introduktion.
- Injicere trædepuden af the mus med 10 pi af 1 x hyaluronidase-opløsning (2 mg / ml = 8 enheder) mellem huden og musklen under anvendelse af en steril 1 ml sprøjte. Hyaluronidase fordøjer komponenter af den ekstracellulære matrix for at muliggøre en mere effektiv optagelse af plasmidet i myofibre. Indtast ved foden af hælen og føres nålen mod tæerne. Frigiver langsomt væsken, når nålen er trukket tilbage. Sitet injektion under huden vil udvide og begynder at slå pink.
- Gentag trin 1.6 og 1.7 på den kontralaterale fod.
- Afbryd anæstesi og placere musen tilbage i buret. Lad musen til at komme sig helt fra anæstesi.
- Vent 2 timer.
- Gentag bedøve og mund sterilisering procedurer, trin 1.5 og 1.6.
- Injicer den fortyndede plasmid-DNA i trædepuden på samme måde som hyaluronidase. Sørg for, at den maksimale lydstyrke er 20 pi eller mindre. Til dual plasmid udtryk injicere 20 ug af hvert plasmid med en maksimal volumen på 20 &# 181; l eller derunder.
- Gentag plasmidet indsprøjtning på den kontralaterale trædepude eller brug den kontralaterale fod til kontrol injektioner.
- På foden, der oprindeligt blev injiceret, løfte huden væk fra understreger musklen med fin pincet og placere en 27 G nål gennem kugler af huden i nærheden tæerne i stand vinkelret på helbrede-tå linje af foden. Tag en anden steril 27 G nål og placere den vandret gennem huden ved hælen. Placer nåle parallelt med hinanden ~ 1 cm fra hinanden.
- Brug alligator klemmer, clamp elektroder til de parallelle nåle og sørg nåle ikke kontakte hinanden. Brugen af modellervoks kan sikre klemmerne på plads.
- Tilslut elektroderne til en elektrisk stimulator.
- Elektroporere musklen ved at anvende 20 impulser, 20 ms varighed / hver, ved 1 Hz, ved 100 V / cm. Tæerne kan spjæt med stimulering.
- Gentag stimulationsproceduren på den kontralaterale fod, hvis det kræves.
- Fjern nåle. Tør trædepuden med povidon-iod krat.
- Sluk anæstesi. Retur musen til genopretning bur og monitor aktivitet. Hvis proceduren blev udført som forventet, bør dyret at genvinde normal ambulation inden for 30 min og udviser ingen forskel i mobilisering eller aktivitetsniveau fra præ-injektion adfærd. Derfor er der ikke behov post-procedure analgetika. Ved genopretning, sende dyret tilbage til terrariet.
Bemærk: Protein ekspression kan analyseres så tidligt som 48 timer efter elektroporering. Men for at gøre det muligt mere komplet helbredelse efter elektroporation, foretrækker vi isolation og undersøgelse af myofibre 7 - 14 dage efter, elektroporation 10. Ekspression kan analyseres, så længe 4 uger efter elektroporering.
2. Eksperimentel Procedure for isolering af Flexor digitorum Brevis (FDB) fibre
- Tø collagenase. For hver FDB bundt udarbejde to brønde på en 12-brønds vævskulturplade. I en brønd tilsættes 1 ml forvarmet Dulbeccos Modified Eagles Media plus bovint serumalbumin (DMEM + BSA) og i den anden og tilsættes 1 ml forvarmet Ringers Solution. Derudover tilsættes friske 10 ml 1X Ringers opløsning til 35 mm Sylgard skål.
- Sacrifice dyret gennem CO 2 eller bedøvende gas til inhalation, efterfulgt af cervikal dislokation eller anden metode til at sikre døden.
- Fjern bagtæerne over ankelleddet med en ren barberblad og nedsænkes i 1x Ringers opløsning i de 35 mm Sylgard fad.
- Pin ene fod stram, tunge opad, på Sylgard fad med 30 G nåle gennem hver af de 5 toe tip og på anklen.
- Startende ved anklen, snip huden lige op på siden af foden langs hårgrænsen mod tæerne, passe på ikke at nick musklen under huden. Gentag på den anden side af foden.
- Holder huden ved bunden af anklen med fine tænger, skære huden på tværs af hælen.
- Løft af hudenflap med pincet, pege din saks mod huden som for ikke at nick musklen. Snip det underliggende bindevæv, effektivt at fjerne huden.
- For at fjerne FDB muskel bundt skære store sene ved hælen at frigøre senen fra knoglen. Holding senen med en pincet, dissekere FDB bundt fra den store hvide sene forsigtigt fjerne enhver bindevæv knyttet til FDB med en saks. Hvis det gøres ordentligt pakken vil nemt løfte af de underliggende sener afslører lyse hvide sener, der fører til de enkelte cifre. Skær FDB på sener nær tæerne befri bundt fra foden.
- Anbring hele muskel bundt i brønden indeholdende DMEM + BSA.
- Gentag på den kontralaterale fod.
- Når alle FDB muskler er isolerede, tilsættes 100 ul collagenase til hver brønd indeholdende DMEM + BSA og muskler.
- Kontroller succes elektroporation på et inverteret fluorescensmikroskop før fordøjelse. Hvis det gøres properly, kan opnås op mod 90% transfektionseffektivitet.
- Inkubér pladen i en befugtet, 37 ° C inkubator ved 10% CO2 i ca. 1 time. Inkubationstiden kan variere sygdomsmodel og baggrunden og masser af collagenase.
- Efter 1 time, omhyggeligt overføre FDB bundtet til brønden, der kun indeholder Ringers opløsning.
- Udriv FDB bundt i brønden med Ringers opløsning ved anvendelse af en 1 ml pipette. Skær enden af pipettespidsen med en ren barberblad, således at bundtet let kan passere gennem pipettespidsen. Udriv forsigtigt musklen (~ 15 gange), hvilket tillader bundtet at passere op og ned parallelt med spidsen. Intakte fibre vil falde ud i Ringers Solution. Når fibrene ikke let falder af bundtet, placere musklen tilbage i collagenaseopløsning.
- Plate de isolerede fibre på skålen ~ 500 pi per plade.
- Tillad musklen at fordøje i brønden i 15 minutter.
- Gentag trin 2.15til 2,17 indtil bundtet formindskes i størrelse, og størstedelen af fibrene adskilles fra bundtet (sædvanligvis i alt 2-3 gange). Når dissocieret musklen let passerer gennem en 1 ml pipettespids.
- Lad fibre tillægger fadet i mindst 15 minutter. Frisk Ringers opløsning tilsættes til pladen for at fortynde resterende collagenase eller ændres afhængigt af tidsbegrænsninger.
Bemærk: Fibre er nu klar til billeddannelse.
3. Eksperimentel Procedure for Visualisering af Laser-induceret Membrane Skader hjælp konfokalmikroskopi
- Load fibre umiddelbart før billeddannelse med 300 pi 2,5 pM FM 1-43 af FM 4-64 farvestof i Ringers opløsning. Generelt billede fibre 15 min til 2 timer efter isolering. Dog kan fibre skal afbildes op til 24 timer efter isolering.
- Placer glasbund fad på en konfokal mikroskop udstyret med en UV-laser og en 60X / 63X mål.
- Find en fiber. Sørg for fiber er solidt fastgjorti skålen ved at trykke på mikroskopet base. Udeluk fibre, der blev beskadiget i dissociation processen. Beskadigede fibre kan indeholde bleb'er, optagelse høje niveauer af FM-farvestof, krøller eller bøje intenst.
- For at inducere skader membran på fiberen, placere sarcolemma i midten af scanningsvindue med et felt fri af kerner. Fokus på sarcolemma med FM farvestof-kanal, således at sarcolemma er ekstremt skarpt.
- Placér ROI trådkorset på sarcolemma udnytte FM 4-64-kanal.
- Bestråle en 1 pixel punkt ved 80% effekt i 3 sek (~ 350 nm x 350 nm-området). FM farvestof vil trænge ind i cellen ved skadestedet. Effekt og tid kan indstilles til at øge eller mindske området for skade.
- Tage billeder af fiberen før skaden, på tidspunktet for skaden, hver 2 sek efter skader, derefter hvert 10. sek i op til 5 min. Timing kan justeres alt efter behov. Individuelle billeder kan konverteres til time-lapse film på billede J.
- Gentag trin3.3 gennem 3.7 på op til 3 fibre pr fad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Elektroporation er en minimalt invasiv teknik, der effektivt introducerer oprenset plasmid DNA i flexor digitorum brevis (FDB) muskel bundt (figur 1A). Syv dage efter transfektion fluorescerende mærkede protein visualiseres i isolerede myofibre (figur 1B). Isolerede fibre udplades derefter og forberedt til billeddannelse på en konfokal mikroskop. Fibre kan udsættes for laser-induceret beskadigelse. FM farvestof kan anvendes til at identificere stedet for beskadigelse membran (fig 1C)
Under fordøjelsesprocessen, kan et lille antal myofibre komme til skade (hvid pil) (figur 2A). Beskadigede myofibre kan identificeres ved membranblæredannelse stede ved sarcolemma (sort pil). Den beskadigede fibre er ikke egnet til yderligere eksperimenter og bør ikke anvendes. Repræsentative konfokale billeder, der viser ekspressionen ofa fluorescerende fusionsprotein inden de isolerede myofibre Figur 2B. Udnyttelse af CMV-promotoren driver optimal proteinekspression i myofibre. DIC billeddannelse viser en optimal fiber. FM 4-64 er til stede ved membranen på et lavt niveau inden for beskadigelse (figur 2C).
Repræsentativt billede af en myofiber fyldt med FM 4-64 afbildet på en Leica SP 5 konfokalt mikroskop. Sarcolemma er centreret i synsfeltet (hvide kasser) og ROI kryds (hvid x) er rettet ind på den sprøde, fluorescerende kant af sarcolemma i et område blottet for myonuclei (figur 3, midten). Kerner undgås, da de kan påvirke FM farvestof analyse efter billeddannelse. Ved skader membran, FM farvestof træder minimalt normale myofibre (figur 3, højre). Muskelfibre defekte i membran reparation vil display øget niveauer af FM-dye optagelse på laser-induceret skade.
-together.within-side = "1"> 
Figur 1. Skematisk af in vivo Elektroporation og Laser Damage protokol. (A) Hyaluronidase injiceres i trædepuden af en bedøvet mus. Plasmid-DNA injiceres derefter og spænding påføres. (B) Syv dage efter injektion, flexor digitorum brevis (FDB) bundt (hvid pil midterste panel) isoleres fra trædepuden efterlader eksponerede sener (sort pil). (C) fibre udplades og laser-induceret skade udføres på levende myofibre. Venstre panel, skala 50 um. Højre panel, skala 5 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
3551fig2.jpg "/>
Figur 2. Isolerede myofibre udtrykker fluorescens mærkede proteiner. Syv dage efter elektroporation, er proteinekspression detekteres hele myofiber. (A) isoleringsproceduren resulterer i et mindre antal ubrugelige myofibre med særskilt membranblæredannelse (sort pil) og membran forstyrrelser (hvid pil). Scale 5 um. (B) Repræsentant billede af en sund myofiber. Jævnt fordelte sarkomerer visualiseres i DIC imaging (venstre). En myofiber udtrykker annexin A6 tagget med GFP (midten panel). Der er minimal FM farvesignal før skader (højre panel). Skala 5 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Justering af LaserSigtekorn på FM-positive sarcolemma. Regionen renter på sarcolemma er centreret i synsfeltet. Sarcolemma forstørres (hvid stiplet boks) og ROI sigtekornet rettet ind på den skarpe FM-positive kant af sarcolemma i et område blottet for kerner (center panel). Ved skader, FM farvestof kommer ind ved skadestedet (højre panel, hvid pil). Skala 5 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Anvendelsen af elektroporation til at studere fluorescens mærkede proteiner in vivo er velegnet til undersøgelse af muskel grund af manglen på passende cellelinje modeller, der trofast replikerer hele cellestruktur muskel. Denne protokol beskriver udnyttelsen af elektroporation og høj opløsning konfokal mikroskopi til at give detaljerede billeddannelse af protein lokalisering og translokation efter laser såret. Denne metode kan tilpasses til at studere andre cellulære processer, herunder cytoskelet reorganisering, menneskehandel, og fusion.
Ved anvendelse af denne protokol, op til 90% af myofibre i FDB muskel bundt Express plasmid, og dette kan ses let ved hjælp af fluorescensmikroskopi både før og efter myofiber dissociation. Der er typisk en gradient af udtryk med højere ekspression observeret tættere på injektionsstedet. På grund af gradienten af ekspression, kan virkningen af at variere proteinekspression overvåges froma enkelt eksperiment. Som med alle transfektionsfremgangsmåder, er denne fremgangsmåde begrænset af problemer i forbindelse med overekspression. Især med højniveau-ekspression, kan proteinaggregering forekomme. Det er vores erfaring, at mCherry fluorescerende tag demonstrerer mere sammenlægning end den forbedrede grønt fluorescerende protein (eGFP) tag reducerer opløsning og skarphed proteindomæner (f.eks se figur 4 i 7). Derudover mTurquise2 og Venus fluorescerende mærker både demonstrerer tilstrækkelig fluorescens udtryk. Men begge proteiner er mindre lyse end eGFP.
Denne metode kan anvendes til at afbilde levende myofibre under en række betingelser, herunder afprøvning farmaceutiske midler og celle sårdannelse. Vi brugte laser skade at forstyrre sarcolemma, men andre sårede processer kan tilpasses til denne metode. Med henblik herpå bleb'er dannelse af membranen skabt af osmotisk shock samt membran skade induceret af rullende glasperler kan også værevurderes udnytte elektroporerede myofibre 11,12. Til laser såret, vil typen og magt af laseren, samt målsætningen påvirke den tid er nødvendig for at skabe en membran læsion 13,14. Desuden vil eksterne buffere, især koncentrationen af calcium og FM farvestof i bufferen påvirke reparationsprocessen 13,15. Denne metode er blevet testet på både Nikon og Leica konfokal billeddannelse og begge er i stand til at udføre teknikken. FM 4-64 er velegnet til eksperimenter med grønt fluorescerende protein 7. Andre har anvendt FM 1-43, anden lipofile farvestof, som binder negativt ladede phospholipider med en excitation peak ved 470 nm og emission ved 610 peak nm, hvilket begrænser anvendelsen af denne farvestof 13,15,16. Fotoblegning og fototoksicitet er begge mulige udfald på grund af over-billeddannelse. Bestemmelse af rette balance mellem eksponeringstid, billede frekvens og antallet af kanaler afbildeter parametre let manipuleres for at reducere disse virkninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Der er ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health giver NS047726, NS072027 og AR052646.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life Technologies | 11995-073 | Dissection Media Dilution: 50 ml +100 g BSA |
| Collagenase, Type II | Life Technologies | 17101-015 | Fiber Digestion Dilution: 160 mg / 4 ml DMEM (stock 40 mg/ml aliquot) |
| Falcon 12-well dishes | Fisher Scientific | 877229 | Fiber Digestion |
| Ringers Solution | Fiber Digestion and Imaging Dilution: 146 mM NaCl 5 mM KCl 2 mM CaCl2 1 mM MCl2 10 mM HEPES pH7.4 in H2O |
||
| 1 ml Pipettes | Axygen | T-1000-C-R | Digestion |
| Razor Blades | Personna | 94-120-71 | Digestion |
| Precision Glide 30 G needle | BD Biosciences | 305128 | Dissection |
| 1x PBS (-/-) | Life Technologies | 14190-250 | Dissection |
| Sylgard 184 | Fisher Scientific | 50-366-794 | Dissection |
| Forceps | FST by Dumont | #5/45 | Dissection |
| Forceps | Roboz | RS-4913 | Dissection |
| Scissors | World Precision Instruments | 500260 | Dissection |
| BSA | Sigma | A7906 | Dissection media Dilution: 100 mg/50 ml DMEM |
| Falcon 60 mm dishes | Fisher Scientific | 08772B | Dissection- used to hold sylgard |
| Clay | Electroporation | ||
| Stimulator | Grass | s88x | Electroporation |
| Clamps | Radio Shack | 270-356 | Electroporation |
| Triadine | Aplicare | 82-220 | Electroporation |
| Precision Glide 27 G needle | BD Biosciences | 305136 | Electroporation |
| Simulator | Grass | SIU-V | Electroporation |
| Gauze | Covidien | 2146 | Electroporation |
| Hyaluronidase | Sigma | H4272 | Injection Dilution: Add 160 ul PBS (1x) to 40 µl 5x stock |
| 1 cc U-100 Insulin Syringe (28G1/2) | BD Biosciences | 329420 | Injection |
| Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | 02-682-550 | Injection |
| 35 mm glass bottom Microwell dish | MaTek | P35G-1.5-14-C | Microscopy |
| FM 4-64 | Life Technologies | T-13320 | Microscopy Dilution: Final 2.5 ug/ml |
| FM 1-43 | Life Technologies | T-35356 | Microscopy Dilution: Final 2.5 ug/ml |
| Endotoxinfree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Plasmid Purification |
References
- Blau, H. M., et al.
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270, 725-727 (1977).
- Richler, C., Yaffe, D. The in vitro cultivation and differentiation capacities of myogenic cell lines. Dev Biol. 23, 1-22 (1970).
- Yaffe, D. Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells. Proc Natl Acad Sci USA. 61, 477-483 (1968).
- Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skelet muscle. 1, 34 (2011).
- DiFranco, M., Quinonez, M., Capote, J., Vergara, J. DNA transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation. J Vis Exp: JoVE. , (2009).
- Swaggart, K. A., et al. Annexin A6 modifies muscular dystrophy by mediating sarcolemmal repair. Proc Natl Acad Sci USA. 111, 6004-6009 (2014).
- Kerr, J. P., et al. Dysferlin stabilizes stress-induced Ca2+ signaling in the transverse tubule membrane. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 20831-20836 (2013).
- Anderson, D. M., et al. A micropeptide encoded by a putative long noncoding RNA regulates muscle performance. Cell. 160, 595-606 (2015).
- Roche, J. A., et al. Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation. Am J Physiol Cell Physiol. 301, C1239-1250 (2011).
- Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106, 157-169 (2001).
- Wang, B., et al. Membrane blebbing as an assessment of functional rescue of dysferlin-deficient human myotubes via nonsense suppression. J Appl physiol. 109, 901-905 (2010).
- Cai, C., et al. MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery. Nat Cell Biol. 11, 56-64 (2009).
- Marg, A., et al. Sarcolemmal repair is a slow process and includes EHD2. Traffic. 13, 1286-1294 (2012).
- Bansal, D., et al. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423, 168-172 (2003).
- Defour, A., et al. Dysferlin regulates cell membrane repair by facilitating injury-triggered acid sphingomyelinase secretion. Cell Death Dis. 5, e1306 (2014).
