ADN électroporation, isolement et d'imagerie de myofibres

Introduction

Myofibres individuels sont de grandes cellules syncytial, très organisée. Il ya quelques modèles de culture de cellules pour les muscles; Cependant, ces modèles ont comme limitation majeure qu'ils ne différencient pas complètement dans les fibres musculaires matures. Par exemple, les lignées de cellules C2C12 et L6 sont dérivées de souris et les rats, respectivement ^4.1. Dans des conditions de famine de sérum, les cellules mononucléaires "de myoblastes comme« cesser la prolifération, subissent le retrait du cycle cellulaire, et entrent dans le programme myogénique former des cellules multinucléées avec sarcomères, appelées myotubes. Avec des conditions de culture prolongées, myotubes peuvent présenter des propriétés contractiles et "contraction" dans la culture. Lignées cellulaires humaines ont désormais été mis en place ^5. En plus de ces lignées cellulaires immortalisées, myoblastes mononucléées peuvent être isolées de muscle et dans les conditions d'inanition de sérum semblables formera myotubes. Ces lignées cellulaires et des cultures primaires de myoblastes sont hautement utiliserful car elles peuvent être transfectées avec des plasmides ou des virus et transduites utilisés pour étudier des processus biologiques cellulaires de base. Cependant, ces cellules, même lorsque induite pour former des myotubes, manquent beaucoup des traits saillants de l'organisation musculaire mature. Plus précisément, les myotubes sont beaucoup plus petits que les fibres musculaires matures individuelles et manquent de la forme normale de fibres musculaires. Critique, myotubes manquent transversales (T-) tubules, le réseau membraneuse requis pour ^la libération de Ca efficace tout au long du myoplasme.

Une autre méthode pour myoblastes primaires ou lignées de cellules myogéniques consiste à utiliser myofibres matures. La transgénèse peut être utilisé pour établir l'expression de protéines marquées, mais cette méthode est coûteuse et prend du temps. In vivo électroporation de muscle de souris a émergé comme une méthode préférée pour sa vitesse et la fiabilité ^6-10.

Méthodes pour électroporation in vivo et l'isolement efficace des myofibres haavez été optimisé pour le fléchisseur de la souris des orteils (FDB) ⁶ musculaire. Les procédés peuvent être effectués facilement et sont minimalement invasive pour induire l'expression in vivo à partir de plasmides. Cette approche est maintenant combinée à des méthodes d'imagerie à haute résolution, y compris l'imagerie après rupture de laser de la ^6,7 sarcolemme. La combinaison de colorants fluorescents et de l'expression des protéines marquées par fluorescence de peut être utilisé pour surveiller des processus biologiques cellulaires en myofibres matures.

Protocol

Les méthodes de cette étude ont été effectuées en conformité avec l'éthique Feinberg School of Medicine de la Northwestern University Institutional Animal Care et l'utilisation Comité (IACUC) des lignes directrices approuvées. Tous les efforts ont été faits pour minimiser la souffrance.

1. Procédure expérimentale dans électroporation in vivo de la court fléchisseur des orteils (FDB) Muscle Bundle souris

1. Plasmides de conception pour l'expression in vivo en utilisant un promoteur connu pour exprimer dans des cellules de mammifères (par exemple, le cytomégalovirus, CMV) ou dans le muscle (par exemple, Muscle Créatine kinase, MCK) ^6,7. Grandes plasmides peuvent exprimer à des niveaux inférieurs. Le promoteur de CMV a été largement utilisé ^6,7.
2. Purifier plasmides de E. coli en utilisant endotoxines conditions gratuits par les instructions du fabricant. Dissoudre le plasmide dans un tampon stérile, d'endotoxine TE à 2 - 5 ug de plasmide / ul.
3. Diluer et aliquoter le plasmide à une Concentration de 20 ug d'ADN dans 10 ul de TE endotoxine libre stérile (2 ug / ul) dans du tampon par injection d'un tube de microcentrifugation stérile. Préparer une aliquote par injection.
4. Diluer le stock de hyaluronidase à 1x au phosphate solution saline stérile tamponnée sans calcium et le magnésium (PBS - / -) donnant une concentration finale de 8 unités. Aliquote de 10 pi de hyaluronidase dilué par injection dans un tube à centrifuger stérile.
5. Anesthésier la souris en utilisant 2,5% d'isoflurane jusqu'au sous sédation et ne répond pas à la queue ou de l'orteil pincement. Placer l'animal dans une position couchée sur le dos sur un coussin chauffant ou une table de chauffage pour maintenir la température normale du corps.
6. Nettoyer le coussinet plantaire de la souris avec une application alternée d'un gommage povidone iode et de l'alcool trois fois en utilisant une technique de préparation en provenance de l'emplacement d'aiguille et rayonnant vers l'extérieur. Cette technique maintient le site de l'aiguille à l'état aseptique, minimisant introduction d'agents pathogènes.
7. Injecter le coussinet plantaire de ee souris avec 10 ul de la solution de hyaluronidase 1x (2 mg / ml = 8 unités) entre la peau et le muscle en utilisant une seringue stérile de 1 ml. Hyaluronidase digère les composants de la matrice extracellulaire pour permettre l'entrée plus efficace des myofibres dans le plasmide. Entrée à la base du talon et de faire avancer l'aiguille vers les orteils. Relâchez lentement le liquide que l'aiguille est rétracté. Le site d'injection sous la peau va étendre et commencer à virer au rose.
8. Répétez les étapes 1.6 et 1.7 sur le pied controlatéral.
9. Débranchez l'anesthésie et placez la souris de retour dans la cage. Laisser la souris pour se remettre complètement de l'anesthésie.
10. Attendre 2 heures.
11. Répétez les procédures de stérilisation anesthésier et de pied, les étapes 1.5 et 1.6.
12. Injecter l'ADN de plasmide dilué dans le coussinet plantaire de la même façon que la hyaluronidase. Assurez-vous que le volume maximum est de 20 pi ou moins. Pour l'expression plasmidique double injecter 20 pg de chaque plasmide avec un volume maximum de 20 &# 181; l ou moins.
13. Répéter l'injection de plasmide sur la patte controlatérale ou utiliser le pied controlatéral pour les injections de contrôle.
14. Sur le pied qui a été initialement injecté, soulever la peau loin du muscle soulignant avec des pinces fines et placez une aiguille 27 G à travers les boules de peau près les orteils dans une position perpendiculaire à la ligne de guérir-orteil du pied. Prenez une seconde aiguille stérile 27 G et le placer horizontalement à travers la peau au niveau du talon. La place aiguilles parallèles entre elles ~ 1 cm.
15. En utilisant des pinces crocodiles, des électrodes de serrage aux aiguilles parallèles assurant que les aiguilles ne sont pas en contact les uns des autres. L'utilisation de la pâte à modeler peut fixer les pinces en place.
16. Connectez électrodes à un stimulateur électrique.
17. Électroporer le muscle en appliquant 20 impulsions, 20 ms dans la durée / chacune, à 1 Hz, à 100 V / cm. Les orteils peuvent se contracter avec une stimulation.
18. Répétez la procédure de stimulation sur le pied controlatéral si nécessaire.
19. Retirer aiguilles. Essuyez le coussinet plantaire avec gommage povidone iodée.
20. Éteignez l'anesthésie. Retour de la souris à la cage de récupération et de l'activité de moniteur. Si la procédure a été menée comme prévu, l'animal devrait reprendre la marche normale dans les 30 minutes et présentent pas de différence dans le niveau de la marche ou de l'activité d'un comportement pré-injection. Par conséquent, aucune analgésiques post-procédure sont nécessaires. Lors de la récupération, le réexpédier vers le vivarium.
    Note: L'expression des protéines peut être testée dès l'âge de 48 heures après l'électroporation. Toutefois, pour permettre la récupération plus complète après l'électroporation, nous préférons l'isolement et l'étude des myofibres 7 - 14 jours après l'électroporation ^10. L'expression peut être dosée aussi longtemps que 4 semaines après l'électroporation.

2. Procédure expérimentale pour l'isolement du court fléchisseur des orteils (FDB) des fibres

1. Collagénase dégel. Pour chaque faisceau FDB préparer deux puits dans une plaque de culture de tissu à 12 puits. Dans une bien ajouter 1 ml de préchauffé Eagles modifié milieu de Dulbecco, plus sérum-albumine bovine (DMEM + BSA) et dans l'autre et ajouter 1 ml de solution de Ringer préchauffé. En outre, ajouter des frais 10 ml de solution de Ringer 1x à 35 mm plat Sylgard.
2. Sacrifier l'animal par CO ₂ ou un anesthésique par inhalation de gaz, suivie par dislocation cervicale ou une autre méthode pour garantir la mort.
3. Retirez les pieds postérieurs au-dessus de la cheville en utilisant une lame de rasoir propre et plonger dans une solution de Ringer 1x dans les 35 mm plat Sylgard.
4. Pin un pied serré, seule vers le haut, sur le plat Sylgard avec 30 g d'aiguilles à travers chacune des 5 conseils d'orteil et à la cheville.
5. À partir de la cheville, couper la peau vers le haut le côté du pied le long de la racine des cheveux vers les orteils, attention à ne pas entailler le muscle sous la peau. Répétez de l'autre côté du pied.
6. Tenue de la peau à la base de la cheville avec une pince fine, couper la peau à travers le talon.
7. Lifting de la peaubattre avec des pinces, des ciseaux pointer vos vers la peau pour ne pas entailler le muscle. Snip le tissu conjonctif sous-jacent, éliminant efficacement la peau.
8. Pour retirer le faisceau musculaire FDB a coupé le gros tendon au talon pour libérer le tendon de l'os. En tenant le tendon avec une pince, disséquer le faisceau FDB du gros tendon blanc enlevant soigneusement toute tissu conjonctif attaché à la FDB avec des ciseaux. Si fait correctement le faisceau facilement soulever des tendons sous-jacents révélant tendons blancs lumineux menant aux chiffres individuels. Couper le FDB les tendons près des orteils libérer le faisceau du pied.
9. Placer l'ensemble du faisceau de muscle dans le puits contenant du milieu DMEM + BSA.
10. Répétez sur le pied controlatéral.
11. Une fois tous les muscles FDB sont isolés, ajouter 100 pi de la collagénase à chaque puits contenant DMEM + BSA et les muscles.
12. Vérifier le succès de l'électroporation sur un microscope à fluorescence inversée avant la digestion. Si properl faity, vers le haut de 90% l'efficacité de transfection peuvent être atteints.
13. Incuber la plaque à une humidifié, 37 ° C incubateur à 10% _de CO 2 pendant environ 1 heure. Le temps d'incubation peut varier selon le modèle de la maladie et le fond et le sort de la collagénase.
14. Après 1 h, transférer soigneusement le faisceau FDB à la solution ainsi contenant uniquement Ringers.
15. Triturer le faisceau FDB dans le puits avec la solution de Ringer en utilisant une pipette de 1 ml. Coupez l'extrémité de la pointe de la pipette avec une lame de rasoir propre tels que le faisceau peut facilement passer à travers la pointe de la pipette. Triturer délicatement le muscle (~ 15 fois) permettant le faisceau de passer haut et en bas parallèlement à la pointe. Fibres intactes vont tomber dans la solution de Ringer. Lorsque les fibres ne tombent pas facilement le faisceau, placez le muscle du dos dans une solution de collagénase.
16. Plaque fibres isolées sur le plat ~ 500 pi par plaque.
17. Laisser le muscle à digérer dans le puits pendant 15 min.
18. Répétez les étapes 2.15de 2,17 jusqu'à ce que le faisceau diminue en taille et la majorité des fibres sont dissociées à partir du faisceau (généralement un total de 2 à 3 fois). Une fois dissocié le muscle passe facilement à travers une pipette de 1 ml.
19. Laissez fibres fixer à la boîte pour un minimum de 15 min. Solution de Ringer frais peut être ajouté à la plaque pour diluer la collagénase résiduel ou modifiée en fonction de contraintes de temps.
    Remarque: Les fibres sont maintenant prêts pour l'imagerie.

3. Procédure expérimentale pour la visualisation de la membrane induite par laser Dommages utilisant la microscopie confocale

1. Fibres de charge immédiatement avant l'imagerie avec 300 pi de 2,5 um FM 1-43 de FM 4-64 colorant dans une solution de Ringer. En général, les fibres d'image 15 min à 2 h après l'isolement. Cependant, les fibres peuvent être visualisés à l'isolement après 24 h.
2. Placer le plat de fond de verre sur un microscope confocal équipé d'un laser UV et un objectif 60X / 63X.
3. Localiser une fibre. Assurez-vous la fibre est fermement attachéau plat en tapant sur la base du microscope. Exclure les fibres qui ont été endommagés dans le processus de dissociation. Fibres endommagées peuvent contenir des vésicules membranaires, des niveaux élevés assimilation de colorant FM, boucle ou plier intensément.
4. Pour induire des lésions de la membrane sur la fibre, positionner le sarcolemme dans le centre de la fenêtre d'imagerie avec un champ libre de noyaux. Focus sur le sarcolemme en utilisant le canal de colorant FM tels que le sarcolemme est extrêmement forte.
5. Placez les cheveux ROI de croix sur le sarcolemme utilisant le canal FM 4-64.
6. Irradier un point à 80% de puissance de 1 pixel pour 3 sec (~ 350 nm x 350 nm zone). Colorant FM sera entrer dans la cellule à l'endroit de la blessure. Puissance et le temps peuvent être ajustés pour augmenter ou diminuer la zone de l'insulte.
7. Capturez des images de la fibre avant que des dommages, au moment de dommages, tous les après-dommages 2 secondes, puis toutes les 10 secondes pour un maximum de 5 min. Timing peut être ajustée en fonction des besoins. Les images individuelles peuvent être convertis en films time-lapse dans J. Image
8. Répétez les étapes3.3 à 3.7 sur un maximum de 3 fibres par boîte.

Representative Results

L'électroporation est une technique peu invasive qui introduit efficacement ADN plasmidique purifié dans le court fléchisseur des orteils (FDB) faisceau musculaire (figure 1A). Sept jours après la transfection par fluorescence protéine marquée est visualisé dans les fibres musculaires isolées (figure 1B). Fibres isolées sont ensuite étalées et préparés pour l'imagerie sur un microscope confocal. Les fibres peuvent être soumises à une lésion induite par laser. Colorant FM peut être utilisée pour identifier le site de la lésion de la membrane (Figure 1C)

Pendant le processus de digestion, un petit nombre de fibres musculaires peut être blessé (flèche blanche) (figure 2A). Myofibres endommagés peuvent être identifiés par bourgeonnement de la membrane présente au niveau du sarcolemme (flèche noire). La fibre endommagée ne convient pas pour une expérimentation plus poussée et ne doit pas être utilisé. Images confocales représentatives montrant l'expression ofa protéine fluorescente de fusion dans les fibres musculaires isolées Figure 2B. L'utilisation du promoteur du CMV dirige l'expression de la protéine optimale en myofibres. DIC imagerie montre une fibre optimale. FM 4-64 est présent à la membrane à de faibles niveaux avant de dommages (figure 2C).

Représentant l'image d'un myofibre chargé avec FM 4-64 imagé sur un microscope confocal Leica SP 5. Le sarcolemme est centré dans le champ de vue (des boîtes blanches) et le ROI réticule (blanc x) est aligné sur le, bord fluorescente nette du sarcolemme dans une zone dépourvue de myonuclei (Figure 3, milieu). Noyaux sont évités car ils peuvent influencer colorant FM analyse post imagerie. Sur les dommages de la membrane, colorant FM entre minimalement myofibres normales (figure 3, droite). Les fibres musculaires défectueux en réparation de la membrane permet d'afficher les niveaux de FM colorant absorption accrue à un dommage induit par laser.

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Figure 1. Schéma de protocole in vivo de dommages électroporation et laser. (A) Hyaluronidase est injecté dans le coussinet plantaire d'une souris anesthésiée. L'ADN plasmidique est ensuite injecté et la tension est appliquée. Après l'injection (b) sept jours, le court fléchisseur des orteils (FDB) faisceau (flèche blanche panneau du milieu) est isolé du coussinet plantaire laissant derrière tendons exposés (flèche noire). (C) Les fibres sont étalées et les dommages induits par laser est effectuée sur myofibres vivants. Le panneau de gauche, échelle de 50 um. Panneau de droite, échelle de 5 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 2. myofibres isolés Exprimer par fluorescence protéines marquées. Sept jours après l'électroporation, expression de la protéine est détectée à travers le myofibre. (A) Les résultats de la procédure d'isolement dans un petit nombre de fibres musculaires inutilisables avec blebbing distincte de la membrane (flèche noire) et les perturbations de la membrane (flèche blanche). Échelle de 5 um. (B) de l'image représentant d'un myofibre saine. Sarcomères régulièrement espacés sont visualisés en imagerie DIC (à gauche). Un myofibre exprimant annexine A6 marqué avec la GFP (panneau central). Il est minime signal de colorant FM avant de dommages (panneau de droite). Échelle de 5 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3. Alignement du laserRéticule sur le Sarcolemme de FM-positif. La région d'intérêt sur ​​le sarcolemme est centré dans le champ de vision. Le sarcolemme est amplifié (boîte blanche pointillée) et réticule ROI aligné sur le bord de FM positive forte du sarcolemme dans une zone dépourvue de noyaux (panneau central). Sur dommages, colorant FM entre au site de la lésion (panneau de droite, flèche blanche). Échelle de 5 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

L'utilisation d'électroporation pour étudier les protéines marquées par fluorescence in vivo est idéalement adapté pour l'étude du muscle étant donné l'absence de modèles de lignée cellulaire appropriée qui reproduisent fidèlement la structure de la cellule musculaire entière. Ce protocole décrit l'utilisation de l'électroporation et la microscopie confocale à haute résolution pour fournir une image détaillée de la localisation de la protéine et la translocation après blessure au laser. Cette méthode peut être adapté à l'étude d'autres processus cellulaires, y compris la réorganisation du cytosquelette, la traite, et la fusion.

En utilisant ce protocole, jusqu'à 90% des myofibres au sein du plasmide express FDB de faisceau de muscle, et cela peut être vu aisément par microscopie de fluorescence avant et après dissociation myofibres. Il y a typiquement un gradient d'expression observés avec une expression plus élevée plus près de la site d'injection. En raison du gradient d'expression, l'effet de la variation expression de la protéine peut être contrôlée en arrièrema seule expérience. Comme avec toutes les méthodes de transfection, cette approche est limitée par les questions liées à la surexpression. En particulier, avec une expression de haut niveau, l'agrégation des protéines peut se produire. Dans notre expérience, le marqueur fluorescent mCherry démontre plus agrégation que la balise protéine fluorescente verte améliorée (eGFP) réduisant la résolution et la netteté des domaines protéiques (par exemple voir Figure 4 à ^7). En outre, mTurquise2 et Vénus fluorescentes balises deux démontrent l'expression de fluorescence suffisante. Toutefois, les deux protéines sont moins brillant que eGFP.

Cette méthode peut être utilisée pour l'image myofibres de vie sous une variété de conditions, y compris les agents des tests pharmaceutiques et blessant cellulaire. Nous avons utilisé des blessures laser de perturber le sarcolemme, mais d'autres processus en blessant pourraient être adaptés à cette méthode. A cet effet, la formation de bulles membrane créée par choc osmotique ainsi que des lésions de la membrane induite par roulement des billes de verre peut également êtreévalué en utilisant myofibres électroporation ^11,12. Pour blessure laser, le type et la puissance du laser, ainsi que l'objectif vont influencer le temps nécessaire pour créer une lésion de la membrane ^13,14. En outre, des tampons externes, en particulier la concentration de calcium et de colorant FM dans la zone tampon vont influencer le processus de réparation ^13,15. Cette méthodologie a été testée sur les deux systèmes d'imagerie confocale Nikon et Leica et les deux sont capables d'exécuter la technique. FM 4-64 est bien adapté pour l'expérimentation de la protéine fluorescente verte ^7. D'autres ont utilisé FM 1-43, un autre colorant lipophile qui lie les phospholipides chargés négativement avec un pic d'excitation à 470 nm et une émission pic à 610 nm, ce qui limite l'application de ce colorant ^13,15,16. Photoblanchiment et la phototoxicité sont les deux résultats possibles en raison de plus-imagerie. Déterminer le bon équilibre entre le temps de l'exposition, la fréquence d'image et le nombre de canaux imagésont des paramètres facilement manipulées pour réduire ces effets.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Life Technologies	11995-073	Dissection Media Dilution: 50 ml +100 g BSA
Collagenase, Type II	Life Technologies	17101-015	Fiber Digestion Dilution: 160 mg / 4 ml DMEM (stock 40 mg/ml aliquot)
Falcon 12-well dishes	Fisher Scientific	877229	Fiber Digestion
Ringers Solution			Fiber Digestion and Imaging Dilution: 146 mM NaCl 5 mM   KCl 2 mM   CaCl2 1 mM   MCl2 10 mM HEPES pH7.4 in H2O
1 ml Pipettes	Axygen	T-1000-C-R	Digestion
Razor Blades	Personna	94-120-71	Digestion
Precision Glide 30 G needle	BD Biosciences	305128	Dissection
1x PBS (-/-)	Life Technologies	14190-250	Dissection
Sylgard 184	Fisher Scientific	50-366-794	Dissection
Forceps	FST by Dumont	#5/45	Dissection
Forceps	Roboz	RS-4913	Dissection
Scissors	World Precision Instruments	500260	Dissection
BSA	Sigma	A7906	Dissection media Dilution: 100 mg/50 ml DMEM
Falcon 60 mm dishes	Fisher Scientific	08772B	Dissection- used to hold sylgard
Clay			Electroporation
Stimulator	Grass	s88x	Electroporation
Clamps	Radio Shack	270-356	Electroporation
Triadine	Aplicare	82-220	Electroporation
Precision Glide 27 G needle	BD Biosciences	305136	Electroporation
Simulator	Grass	SIU-V	Electroporation
Gauze	Covidien	2146	Electroporation
Hyaluronidase	Sigma	H4272	Injection Dilution: Add 160 ul PBS (1x) to 40 µl 5x stock
1 cc U-100 Insulin Syringe (28G1/2)	BD Biosciences	329420	Injection
Eppendorf Tubes	Fisher Scientific	02-682-550	Injection
35 mm glass bottom Microwell dish	MaTek	P35G-1.5-14-C	Microscopy
FM 4-64	Life Technologies	T-13320	Microscopy Dilution: Final 2.5 ug/ml
FM 1-43	Life Technologies	T-35356	Microscopy Dilution: Final 2.5 ug/ml
Endotoxinfree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362	Plasmid Purification