Introduction
Miofibras individuales son células sincitiales grandes, altamente organizados. Hay unos cuantos modelos de cultivo celular de los músculos; Sin embargo, estos modelos tienen como principal limitación que no diferencian plenamente en miofibras maduras. Por ejemplo, las líneas celulares C2C12 y L6 se derivan de ratones y ratas, respectivamente a 1-4. En condiciones de privación de suero, las células mononucleares "-mioblastos como" dejan la proliferación, se someten a la retirada del ciclo celular, y entran en el programa miogénica formando células multinucleadas con sarcómeros, conocidos como miotubos. Con las condiciones de cultivo prolongados, miotubos pueden exhibir propiedades contráctiles y "contracción" en la cultura. Líneas celulares humanas han también ahora han establecido 5. Además de estas líneas de células inmortalizadas, mioblastos mononucleares se pueden aislar a partir de músculo y en las condiciones similares de privación de suero formará miotubos. Estas líneas celulares y cultivos de mioblastos primarios son altamente utilizarful, ya que pueden ser transfectadas con plásmidos o transducidas con virus y se usaron para estudiar los procesos biológicos celulares básicas. Sin embargo, estas células, incluso cuando inducida para formar miotubos, carecen de muchas de las características sobresalientes de organización músculo maduro. Específicamente, miotubos son mucho menores que las miofibras maduras individuales y carecen de la forma normal de miofibras. Críticamente, miotubos carecen transversales (T-) túbulos, la red membranosa necesaria para una eficiente Ca 2 + en libertad en todo el sarcoplasma.
Un método alternativo para mioblastos primarios o líneas de células miogénicas implica el uso de miofibras maduras. La transgénesis se puede emplear para establecer la expresión de proteínas etiquetadas, pero este método es costoso y consume tiempo. In vivo electroporación de músculo de ratón se ha convertido en un método preferido por su velocidad y fiabilidad 6-10.
Los métodos para la electroporación in vivo y el aislamiento eficiente de miofibras hahe sido optimizado para el músculo flexor corto de los dedos 6 ratón (FDB). Los métodos se pueden completar fácilmente y son mínimamente invasivo para inducir la expresión in vivo a partir de plásmidos. Este enfoque está ahora combinada con métodos de imagen de alta resolución de imagen, incluyendo después de la interrupción del laser del 6,7 sarcolema. La combinación de colorantes y expresión de proteínas marcadas con fluorescencia fluorescentes puede ser usado para monitorear los procesos biológicos celulares en miofibras maduras.
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Protocol
Los métodos de este estudio se realizaron en ética de acuerdo con la Escuela Feinberg de la Universidad Northwestern de Medicina Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC) directrices aprobadas. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento.
1. Procedimiento experimental in vivo electroporación del Flexor digitorum brevis (FDB) Muscle Bundle de Ratón
- Plásmidos de diseño para la expresión in vivo usando un promotor conocido para expresar en células de mamífero (por ejemplo, citomegalovirus, CMV) o en el músculo (por ejemplo, Músculo creatina quinasa, MCK) 6,7. Plásmidos más grandes pueden expresar en los niveles inferiores. El promotor CMV se ha utilizado ampliamente 6,7.
- Purificar plásmidos de E. coli utilizando endotoxinas condiciones libres por las instrucciones del fabricante. Disolver el plásmido en, tampón TE libre de endotoxina estéril a 2-5 mg de plásmido / l.
- Diluir y alícuota del plásmido a un concentration de 20 g de ADN en 10 l de endotoxina estéril libre de TE (2 g / l) tampón por inyección en un tubo de microcentrífuga estéril. Preparar una alícuota por inyección.
- Diluir el stock de hialuronidasa a 1x estéril con salina tamponada con fosfato sin calcio y magnesio (PBS - / -) dando una concentración final de 8 unidades. Alícuota de 10 l de hialuronidasa diluida por inyección en un tubo de microcentrífuga estéril.
- Anestesiar el ratón usando 2,5% isoflurano hasta sedado y no responde a la cola o pellizco del dedo del pie. Colocar el animal en posición supina sobre una almohadilla térmica o una mesa de calentamiento para mantener la temperatura corporal normal.
- Limpiar la almohadilla de la pata del ratón con una aplicación alternada de un lavado de povidona yodada y alcohol tres veces usando una técnica de preparación se origina en el sitio de la aguja y se irradia hacia el exterior. Esta técnica mantiene el sitio de la aguja en una condición aséptica, minimizando introducción patógeno.
- Inyectar la almohadilla plantar del XXe ratón con 10 l de la solución de hialuronidasa 1x (2 mg / ml = 8 unidades) entre la piel y el músculo usando una jeringa de 1 ml estéril. La hialuronidasa digiere componentes de la matriz extracelular para permitir la entrada más eficiente de plásmido en miofibras. Introduzca en la base del talón y hacer avanzar la aguja hacia los dedos de los pies. Suelte lentamente el líquido que se retrae la aguja. El sitio de la inyección bajo la piel se expandirá y comenzar a girar rosa.
- Repita los pasos 1,6 y 1,7 en el pie contralateral.
- Desconecte la anestesia y colocar el ratón de nuevo en la jaula. Deje que el ratón para recuperarse totalmente de la anestesia.
- Espere 2 horas.
- Repita los procedimientos de esterilización anestesiar y pies, pasos 1.5 y 1.6.
- Inyectar el ADN de plásmido se diluyó en la almohadilla de la pata de la misma manera como la hialuronidasa. Asegúrese de que el volumen máximo es de 20 l o menos. Para expresión dual plásmido inyectar 20 g de cada plásmido con un volumen máximo de 20 y# 181; l o menos.
- Repetir la inyección de plásmido en la almohadilla de la pata contralateral o usar el pie contralateral para inyecciones de control.
- Al pie que fue inyectado inicialmente, levantar la piel lejos del músculo subrayando con unas pinzas finas y colocar una aguja de 27 G a través de las bolas de la piel cerca de los dedos de los pies en una posición perpendicular a la línea de sanar-dedo del pie. Tome un segundo G aguja estéril 27 y colocarla horizontalmente a través de la piel en el talón. Coloque agujas paralelas entre sí ~ 1 cm de separación.
- El uso de pinzas de cocodrilo, electrodos de fijación a las agujas paralelas asegurándose de que las agujas no entren en contacto entre sí. El uso de la plastilina puede asegurar las abrazaderas en su lugar.
- Conectar los electrodos a un estimulador eléctrico.
- Electroporar el músculo mediante la aplicación de 20 pulsos, 20 ms de duración / cada uno, a 1 Hz, a 100 V / cm. Los dedos de los pies pueden contraerse con la estimulación.
- Repita el procedimiento de estimulación en el pie contralateral si es necesario.
- Retire las agujas. Limpie la almohadilla plantar con matorrales povidona yodada.
- Apague la anestesia. Devuelva el ratón a la jaula de la recuperación y la actividad monitor. Si se llevó a cabo el procedimiento como se esperaba, el animal debe recuperar la deambulación normal dentro de 30 minutos y muestran ninguna diferencia en la deambulación o la actividad a nivel de comportamiento pre-inyección. Por lo tanto, no se necesitan analgésicos después del procedimiento. Después de la recuperación, devuelva el animal para el vivero.
Nota: Expresión de proteínas se puede ensayar ya a los 48 horas después de la electroporación. Sin embargo, para permitir la recuperación más completa después de la electroporación, se prefiere el aislamiento y estudio de las miofibras 7 - 14 días después de la electroporación 10. La expresión puede ensayarse tanto tiempo como 4 semanas después de la electroporación.
2. Procedimiento Experimental para el aislamiento de los (FDB) Fibras Flexor Brevis
- Colagenasa deshielo. Para cada paquete FDB preparar dos pozos en una placa de cultivo tisular de 12 pocillos. En un pozo añadir 1 ml de pre-calentado Eagles Modificado de Dulbecco los medios de comunicación más albúmina de suero bovino (DMEM + BSA) y en el otro bien añadir 1 ml de solución de Ringer pre-calentado. Además, añadir frescas 10 ml de solución Ringers 1x a los 35 mm plato Sylgard.
- Sacrificio del animal a través de CO 2 o la inhalación de gases anestésicos, seguido por dislocación cervical u otro método para asegurar la muerte.
- Retire las patas traseras por encima de la articulación del tobillo usando una hoja de afeitar limpia y sumergir en solución 1x timbres en los 35 mm plato Sylgard.
- Pin un pie apretado, único hacia arriba, hacia el plato Sylgard con 30 agujas G a través de cada una de las puntas de los pies y 5 en el tobillo.
- Comenzando en el tobillo, cortar la piel hacia arriba el lado del pie a lo largo de la línea del cabello hacia los dedos, con cuidado de no cortar el músculo debajo de la piel. Repetir en el otro lado del pie.
- Sosteniendo la piel en la base del tobillo con unas pinzas finas, cortar la piel a través del talón.
- El levantamiento de la pielbatir con unas pinzas, señalar sus tijeras hacia la piel para no nick del músculo. Cortar el tejido conectivo subyacente, eliminando de forma eficaz la piel.
- Para quitar el haz muscular FDB cortó el tendón grande en el talón para liberar el tendón del hueso. Sosteniendo el tendón con una pinza, diseccionar el paquete FDB del tendón grande blanco retirando cuidadosamente cualquier tejido conectivo unido a la FDB con unas tijeras. Si se realiza correctamente el paquete levantará fácilmente fuera de los tendones subyacentes revelan tendones blancas brillantes que llevan a los dígitos individuales. Cortar la FDB en los tendones cercanos a los dedos de los pies liberar el paquete desde el pie.
- Coloque todo el paquete muscular en el pozo que contiene DMEM + BSA.
- Repita con el pie contralateral.
- Una vez que todos los músculos de FDB son aisladas, añadir 100 l de colagenasa a cada pocillo que contiene DMEM + BSA y el músculo.
- Compruebe el éxito de la electroporación en un microscopio fluorescente invertido antes de la digestión. Si properl hechoy, arriba de 90% de eficiencia de transfección se puede lograr.
- Incubar la placa en una humidificado, 37 ° C incubadora a 10% de CO 2 durante aproximadamente 1 hr. El tiempo de incubación puede variar dependiendo del modelo de la enfermedad y el fondo y el lote de colagenasa.
- Después de 1 hora, transferir cuidadosamente el paquete FDB a la solución de Ringer único pozo que contiene.
- Se tritura el paquete FDB en el pozo con la solución de Ringers utilizando una pipeta de 1 ml. Cortar el extremo de la punta de pipeta con una hoja de afeitar limpia de tal manera que el haz puede pasar fácilmente a través de la punta de pipeta. Se tritura suavemente el músculo (~ 15 veces) permitiendo que el haz pase a arriba y hacia abajo en paralelo a la punta. Fibras intactas se caerán en la solución de Ringer. Cuando las fibras no caen fácilmente el paquete, colocar el músculo de nuevo en solución de colagenasa.
- Placa las fibras aisladas en el plato ~ 500 l por placa.
- Permitir que el músculo para digerir en el pozo durante 15 min.
- Repita los pasos 2.15a 2.17 hasta que el paquete disminuye de tamaño y la mayoría de las fibras se disocia del haz (por lo general un total de 2.3 veces). Una vez disociado el músculo pasa fácilmente a través de una punta de pipeta de 1 ml.
- Deje que las fibras se adhieren al plato durante un mínimo de 15 min. Solución de Ringer fresco puede ser añadido a la placa para diluir la colagenasa residual o cambiado en función de las limitaciones de tiempo.
Nota: Las fibras están ahora listos para la imagen.
3. Procedimiento experimental para la visualización de daño de la membrana inducida por láser utilizando microscopía confocal
- Fibras de carga inmediatamente antes de la obtención de imágenes con 300 l de 2,5 M FM 1-43 del FM 4-64 colorante en solución de Ringer. Generalmente, las fibras de la imagen 15 min a 2 hr después del aislamiento. Sin embargo, las fibras se pueden visualizar hasta después de aislamiento 24 horas.
- Colocar el plato de fondo de cristal en un microscopio confocal equipado con un láser UV y un objetivo 60X / 63X.
- Localiza una fibra. Asegúrese de que la fibra se une firmementeal plato tocando la base del microscopio. Excluir fibras que fueron dañados en el proceso de disociación. Fibras dañadas pueden contener vesículas de membrana, los altos niveles de captación de tinte FM, rizo o doblar intensamente.
- Para inducir daño de la membrana sobre la fibra, posicionar el sarcolema en el centro de la ventana de imagen con un claro campo de núcleos. Concéntrese en el sarcolema utilizando el canal de colorante FM tal que el sarcolema es extremadamente agudo.
- Coloque la cruz ROI en el sarcolema utilizando el canal de FM 4-64.
- Irradiar un punto de 1 píxel en una potencia del 80% durante 3 s (~ 350 nm x 350 nm área). Colorante FM entrará en la celda en el sitio de la lesión. Potencia y el tiempo se pueden ajustar para aumentar o disminuir el área de insulto.
- Capturar imágenes de la fibra antes del daño, en el momento del daño, cada 2 seg post-daño, entonces cada 10 seg durante un máximo de 5 min. Timing se puede ajustar dependiendo de la necesidad. Las imágenes individuales se pueden convertir en películas a intervalos en Imagen J.
- Repita los pasos3.3 a 3.7 en un máximo de 3 fibras por plato.
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Representative Results
La electroporación es una técnica mínimamente invasiva que introduce de manera eficiente plásmido de ADN purificado en el flexor digitorum brevis (FDB) haz muscular (Figura 1A). Siete días después de la transfección con fluorescencia de proteínas marcadas se visualizaron en miofibras aisladas (Figura 1B). Fibras aisladas se sembraron a continuación, y se prepararon para formación de imágenes en un microscopio confocal. Las fibras pueden ser sometidos a la lesión inducida por láser. Colorante FM se puede utilizar para identificar el sitio de daño de la membrana (Figura 1C)
Durante el proceso de digestión, un pequeño número de miofibras puede resultar lesionado (flecha blanca) (Figura 2A). Miofibras dañados pueden ser identificados por formación de ampollas en la membrana presente en el sarcolema (flecha negro). La fibra dañada no es adecuado para la experimentación adicional y no debe ser utilizado. Confocal de imágenes representativas que muestran la expresión ofa proteína de fusión fluorescente dentro de las fibras musculares aisladas Figura 2B. Utilización del promotor CMV conduce la expresión de proteína óptima en miofibras. Formación de imágenes DIC muestra una fibra óptima. FM 4-64 está presente en la membrana a niveles bajos antes de daños (Figura 2C).
Imagen representativa de una miofibra cargado con FM 4-64 fotografiado en un microscopio confocal Leica SP 5. El sarcolema se centra en el campo de visión (cajas blancas) y el punto de mira ROI (blanco x) está alineado en el borde nítido, fluorescente del sarcolema en una zona desprovista de mionúcleos (Figura 3, centro). Los núcleos se evitan, ya que pueden influir en la imagen posterior análisis colorante FM. Al daño de la membrana, tinte FM entra mínimamente miofibras normales (Figura 3, derecha). Las fibras musculares defectuosas en la reparación de la membrana mostrará niveles de FM absorción de colorante aumento en el daño inducido por láser.
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Figura 1. Esquema de in vivo Protocolo de daños electroporación y láser. (A) hialuronidasa se inyecta en la almohadilla de la pata de un ratón anestesiado. El ADN plásmido se inyecta a continuación, y se aplica voltaje. (B) Siete días después de la inyección, el corto de los dedos flexor (FDB) paquete (flecha blanca panel central) está aislado de la almohadilla plantar dejando detrás tendones expuestos (flecha negro). (C) Las fibras se colocan y el daño inducido por láser se realiza en miofibras en vivo. El panel izquierdo, escala de 50 micras. Panel derecho, escala de 5 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 2. miofibras aisladas que expresan marcado con fluorescencia proteínas. Siete días después de la electroporación, expresión de la proteína se detecta en todo el miofibra. (A) Los resultados del procedimiento de aislamiento en un pequeño número de miofibras inutilizables con blebbing distinta membrana (flecha negro) y las interrupciones de membrana (flecha blanca). Escala de 5 micras. (B) Imagen Representante de un miofibra saludable. Sarcómeros espaciados uniformemente se visualizan en la DIC de imagen (izquierda). Un miofibra expresando anexina A6 etiquetado con GFP (panel central). No es mínima señal de colorante FM antes de daños (panel derecho). Escala de 5 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Alineación de LaserPunto de mira en la FM-positivo Sarcolema. La región de interés en el sarcolema se centra en el campo de visión. El sarcolema se magnifica (cuadro punteado blanco) y punto de mira de ROI alineado en el borde FM-positivo fuerte del sarcolema en una zona desprovista de núcleos (panel central). Al daños, tinte FM entra en el sitio de la lesión (panel de la derecha, flecha blanca). Escala de 5 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El uso de electroporación para estudiar las proteínas etiquetadas con fluorescencia in vivo es ideal para el estudio de los músculos debido a la ausencia de modelos de líneas celulares adecuadas que reproducen fielmente toda la estructura celular del músculo. Este protocolo describe la utilización de la electroporación y la microscopía confocal de alta resolución para proporcionar imágenes detalladas de la localización de proteínas y la translocación después de la herida láser. Este método puede adaptarse para estudiar otros procesos celulares incluyendo la reorganización del citoesqueleto, el tráfico, y la fusión.
Usando este protocolo, hasta el 90% de las miofibras en el plásmido expresa haz muscular FDB, y esto puede ser visto fácilmente por microscopía de fluorescencia antes y después de la disociación de miofibras. Normalmente hay un gradiente de expresión con una mayor expresión observada más cerca de la zona de inyección. Debido a la pendiente de expresión, el efecto de variar la expresión de proteínas se puede monitorizar froma experimento único. Como con todos los métodos de transfección, este enfoque está limitado por cuestiones relacionadas con la sobreexpresión. En particular, con alto nivel de expresión, se puede producir la agregación de proteínas. En nuestra experiencia, la etiqueta fluorescente mCherry demuestra más la agregación de la etiqueta de la proteína verde fluorescente (EGFP) la reducción de la resolución y la nitidez de los dominios de proteínas (por ejemplo, véase la Figura 4 en 7). Además, mTurquise2 y Venus etiquetas fluorescentes ambos demuestran suficiente expresión de fluorescencia. Sin embargo, ambas proteínas son menos brillante que eGFP.
Este método se puede utilizar para miofibras imagen viva bajo una variedad de condiciones incluyendo agentes de pruebas farmacéuticas y heridas celular. Utilizamos la lesión con láser para interrumpir el sarcolema, pero otros procesos hiriendo podría adaptarse a este método. Con este fin, la formación de vesículas de membrana creado por choque osmótico, así como lesión de la membrana inducida por laminación perlas de vidrio también puede serevaluado utilizando electroporación miofibras 11,12. Para heridas láser, el tipo y la potencia del láser, así como el objetivo influirán en la duración del tiempo necesario para crear una lesión de membrana 13,14. Además, los tampones externos, específicamente la concentración de calcio y el colorante FM dentro de la memoria intermedia de influirán en el proceso de reparación 13,15. Esta metodología ha sido probado en ambos sistemas de imagen confocal Nikon y Leica y ambos son capaces de realizar la técnica. FM 4-64 es muy adecuado para la experimentación con la proteína verde fluorescente 7. Otros han utilizado FM desde 1 hasta 43, otro colorante lipófilo que se une fosfolípidos de carga negativa con un pico de excitación a 470 nm y emisión pico a 610 nm, lo que limita la aplicación de este colorante 13,15,16. Photobleaching y fototoxicidad son los dos posibles resultados debido a la sobre-imagen. Determinar el equilibrio adecuado entre el tiempo de exposición, frecuencia de imagen y el número de canales de fotografiadoson parámetros fácilmente manipulados para reducir estos efectos.
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Disclosures
No hay conflictos de interés.
Acknowledgments
Esta obra fue financiada por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones NS047726, NS072027 y AR052646.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life Technologies | 11995-073 | Dissection Media Dilution: 50 ml +100 g BSA |
| Collagenase, Type II | Life Technologies | 17101-015 | Fiber Digestion Dilution: 160 mg / 4 ml DMEM (stock 40 mg/ml aliquot) |
| Falcon 12-well dishes | Fisher Scientific | 877229 | Fiber Digestion |
| Ringers Solution | Fiber Digestion and Imaging Dilution: 146 mM NaCl 5 mM KCl 2 mM CaCl2 1 mM MCl2 10 mM HEPES pH7.4 in H2O |
||
| 1 ml Pipettes | Axygen | T-1000-C-R | Digestion |
| Razor Blades | Personna | 94-120-71 | Digestion |
| Precision Glide 30 G needle | BD Biosciences | 305128 | Dissection |
| 1x PBS (-/-) | Life Technologies | 14190-250 | Dissection |
| Sylgard 184 | Fisher Scientific | 50-366-794 | Dissection |
| Forceps | FST by Dumont | #5/45 | Dissection |
| Forceps | Roboz | RS-4913 | Dissection |
| Scissors | World Precision Instruments | 500260 | Dissection |
| BSA | Sigma | A7906 | Dissection media Dilution: 100 mg/50 ml DMEM |
| Falcon 60 mm dishes | Fisher Scientific | 08772B | Dissection- used to hold sylgard |
| Clay | Electroporation | ||
| Stimulator | Grass | s88x | Electroporation |
| Clamps | Radio Shack | 270-356 | Electroporation |
| Triadine | Aplicare | 82-220 | Electroporation |
| Precision Glide 27 G needle | BD Biosciences | 305136 | Electroporation |
| Simulator | Grass | SIU-V | Electroporation |
| Gauze | Covidien | 2146 | Electroporation |
| Hyaluronidase | Sigma | H4272 | Injection Dilution: Add 160 ul PBS (1x) to 40 µl 5x stock |
| 1 cc U-100 Insulin Syringe (28G1/2) | BD Biosciences | 329420 | Injection |
| Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | 02-682-550 | Injection |
| 35 mm glass bottom Microwell dish | MaTek | P35G-1.5-14-C | Microscopy |
| FM 4-64 | Life Technologies | T-13320 | Microscopy Dilution: Final 2.5 ug/ml |
| FM 1-43 | Life Technologies | T-35356 | Microscopy Dilution: Final 2.5 ug/ml |
| Endotoxinfree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Plasmid Purification |
References
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