Summary
우리는 귀 및 쥐의 꼬리에서 일차 섬유 아세포를 생성하기위한 간단하고 신속한 실험 절차를 설명한다. 절차는 특별한 동물 훈련을 필요로하지 않고, 최대 10 일 동안 실온에서 저장 귀에서 배양 섬유 아세포의 생성을 위해 사용될 수있다.
Abstract
차 세포는 조직에서 직접 파생 된 설립 세포주에 비해 생체 내에서 세포의 생리 학적 상태를보다 잘 나타내는 것으로 생각된다. 그러나, 일차 세포 배양 물은 일반적으로 제한된 수명을 가지며 빈번하게 재 확립 될 필요가있다. 섬유 아세포는 일차 전지의 쉽게 접근 할 수있는 소스입니다. 여기, 우리가 귀 마우스의 꼬리에서 차 섬유 아세포 문화를 확립하기 간단하고 빠른 실험 절차에 대해 설명합니다. 프로토콜은 최대 10 일 동안 실온에서 저장 귀에서 일차 섬유 아세포 배양을 확립하는데 사용될 수있다. 프로토콜에 따라 신중하게되면 오염은 일부 경우에 장시간 저장된 비 멸균 조직의 사용에도 불구하고 발생하기 어렵다. 섬유 아세포 문화에 빠르게 증식과 복제 성 노화가 진행되기 전에 상당한 숫자로 확장 할 수 있습니다.
Introduction
차 세포는 시험관 조건에서 조직 배양 생활에서 파생됩니다. 그것은 일반적으로 일차 전지가 더 밀접하게 생리 학적 상태와 그들이 불멸 또는 종양 세포 라인 1보다 시작된 조직의 유전 적 배경을 닮은 것으로 가정한다. 그 때문에, 일차 세포는 생물학적 질문 2,3-을 연구하는데 유용한 모델을 나타낸다. 그러나 무한정 성장 설립 세포 라인과는 달리, 일차 전지는 결국 문화의 노화를 받아야 자주 다시 설정해야합니다.
일반적으로 사용되는 세포는 일차 섬유 아세포, 상피 세포, 내피 세포, T 세포, B 세포, 골수 유래 대 식세포 (BMDM) 골수 유래의 수상 세포 (BMDC)를 포함한다. 섬유 아세포는 종종 일차 세포 배양 모델로서 이용된다. 그들은 다른 일차 전지를 통해 주요 장점을 제공합니다. 세포 배양은 쉽게 쉽게 유지, 설립 및 더의 purifica을 필요로하지 않습니다문화 이전에 세포의 기. 그들은 빠른 초기 확산 및 전문 매체 또는 정품 인증 프로토콜에 대한 요구 사항이 있습니다. 섬유 아세포를 효율적으로 생물학적, 화학적, 물리적 프로토콜을 사용하여 형질 4,5- 수있다. 세포 배양을 확립하기 전에 실온에서 최대 10 일 동안 귀를 저장하는 가능성이있다. 섬유 아세포 문화는 세포질 프로세스의 시각화에 도움과 유도 만능 줄기 (IPS) 세포를 6으로 재 프로그래밍에 적합하다.
섬유 아세포는 콜라겐 단백질과 세포 외 기질 (7)을 분비 결합 조직의 중요한 세포이다. 그들은 여러 조직 8 구조적 틀을 제공하고 상처 치유 및 조직 수선에 9,10- 필수적인 역할을한다.
여기, 우리는 섬유 아세포 귀에서 문화와 마우스 (11)의 꼬리를 확립하기 간단하고 빠른 (<4 시간) 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 최소한의 마우스가 필요합니다경험 (12,13 다른 프로토콜과 대조적으로) 조직을 수확하는 최대 10 일 동안 실온에서 저장 매체에 귀에서 배양을 확립하는데 사용될 수있다.
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Protocol
마우스는 euthanization까지 제도적 지침 (기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 가이드 라인 싱가포르 국립 대학과 실험 동물 연구를위한 국가 자문위원회 (NACLAR) 지침)을 준수 무균 상태에서 보관 하였다.
1. 마우스
- 해당 유전 적 배경 중 하나 마우스를 주문하십시오. 이 프로토콜은 하나의 C57BL / 6 마우스 유래의 조직에 기초한다.
완전 배지 2. 준비
- 10 % 소 태아 혈청 (FCS), 50 μM 2- 머 캅토 에탄올, 100 μM 아스파라긴, 2 mM의 글루타민, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 용액 로즈웰 파크 메모리얼 연구소 (RPMI) 1640 배지에하기 성분을 첨가함으로써 완전 배지를 준비한다.
효소 솔루션 3. 준비
- 15 ML 원뿔 바닥 튜브 콜라게나 D 솔루션을 준비합니다.
- 콜라게나 디 디의 10 mg의 무게4 용액에 ssolve 콜라게나 D 완전한 매체.
- 1.7 ml의 microcentrifuge 관에서 프로 나아 솔루션을 준비합니다.
- 프로 나제 10 mg의 무게.
- 1 M 트리스 완충액 (pH 8.0)의 5 μl를 추가합니다. 의 0.5 M EDTA (pH 8.0) 1 μl를 추가합니다.
- 멸균 물 494 μL와 최고.
- 30 분 동안 수욕에서 37 ℃에서 프로 나제 용액을 부화.
콜라게나 D-프로 나제 믹스 (≤2 꼬리) 4. 준비
참고 : 무균 세포 배양 후드에서 다음 단계를 수행합니다.
- 콜라게나 D 솔루션의 4 ml의 프로 나제 솔루션의 250 μl를 추가합니다.
- 멸균 15ml의 원뿔형 바닥 튜브에 0.2 μm의 주사기 필터를 통해 콜라게나 D-프로 나제 혼합물을 전달한다.
귀와 꼬리 조직에서 섬유 아세포의 5 추출
- 해당 기관의 지침에 따라 쥐를 안락사.
- 세포 배양 후드에서 멸균 수술기구 (가위와 집게를) 놓습니다.
- 두 10cm 세포 배양 접시에 각각 10 ml의에게 완전한 매체를 추가합니다.
- 귀 (~ 1cm 반경)와 가위와 마우스 (꼬리의 끝에서) 꼬리 5cm를 잘라 멸균 50 ML 원뿔 바닥 튜브에 40 ml의 70 % 에탄올에 5 분 동안 품어.
- 5 분 동안 후드에서 개방 10cm 세포 배양 접시에 배치하여 공기 건조 귀와 꼬리. 일단 단계 5.3에 설명 된대로 전송 귀 두 개의 배양 접시에 꼬리 조각은 "귀"를 10 ml의에게 완전한 매체를 포함하는 "꼬리"를 표시, 건조.
- 귀와 꼬리 사용하여 가위로 머리를 제거합니다.
- 가위를 사용하여 크기가 3mm보다 작은 조각으로 귀와 꼬리를 잘라.
- "귀"와 "꼬리"라고 표시된 1.8 ml의 cryotube 튜브로 절단 된 조직을 전송하고 유리 병에 1.8 ml의 마크에 도달하기 위해 볼륨에 대한 충분한 콜라게나 D-프로 나제 솔루션을 추가 할 수 있습니다.
- 피쉐이커에 수평으로 cryotube 튜브를 레이스와 37 ℃에서 90 분 동안 200 rpm으로 샘플을 흔들.
- 90 분 부화 후, 진탕 기에서 cryotube 튜브를 제거하고 후드에 튜브를 배치합니다.
- 두 10cm 세포 배양 접시, 표시 "귀"와 "꼬리"각에 10 ml의에게 완전한 매체를 추가하고 각 접시에 70 μm의 셀 스트레이너를 넣어.
- > 5 분 10 ML의 주사기 플런저를 사용하여 조직을 분쇄 강제 단계 5.11에서 제조 된 따라 표시된 요리에 70 μm의 셀 스트레이너의 소화 귀와 꼬리 조직을 놓고. 셀 스트레이너에서 세포를 씻어 매체에 가끔 셀 스트레이너를 흔들어.
- "귀"와 "꼬리"라는 레이블이 붙은 두 개의 15 ML 원뿔 바닥 튜브에 각각의 접시에서 세포 현탁액을 피펫. 추가로 10 ml의 완전한 매체와 요리와 스트레이너를 세척하고 해당 15 ML 원뿔 바닥 튜브에 매체를 추가 할 수 있습니다.
- 세포를 스핀 다운~ 580 XG에 7 분 및 냉장 세포 원심 분리기를 사용하여 4 ° C의 서스펜션.
- 상등액을 제거 15ml의 원뿔형 바닥 튜브에 세포 펠렛을 10 ㎖를 완전 배지를 추가하고 세포를 재현 탁.
- 단계를 반복 5.14 및 5.15.
세포 혼합물 6. 배양
- 상층 액을 제거합니다. 세포 펠렛은 그대로 남아 있는지 확인합니다.
- 10ml에 세포 전체 매체를 다시 일시 중지하고 "귀"와 "꼬리"라는 레이블이 10cm 세포 배양 접시에 각각의 혼합물을 추가합니다.
- 문화 : 10 μL 암포 테리 신 B 용액 (250 μg의 / ㎖ 원액)를 추가합니다.
- 가습 5 % CO2 인큐베이터에서 37 ℃에서 세포를 배양한다.
- 셋째 날, 10 ml의 신선한 완전한 파편 제거 암포 테리 신 B의 10 μl를 포함하는 매체 (그림 1, 2)와 매체를 교체합니다.
섬유 아세포의 7 하위 문화
- 갔지N 문화는 약 70 % 컨 플루 (일 문화의 3 ~ 4) 매체를 제거하고 5 ml의 멸균 1X 인산 완충 식염수 (PBS)로 세포를 씻어 도달한다.
- PBS를 제거하고 세포에 2 ㎖의 멸균 1X 트립신 EDTA 솔루션을 추가 할 수 있습니다.
- 가습 5 % CO2 인큐베이터에서 37 ℃에서 5 분 동안 세포를 배양한다.
- 5 분 후, 부드럽게 배양 접시를 누르고 세포에 6 ml의에게 완전한 매체를 추가합니다.
- 15ml의 원뿔형 바닥 튜브에 세포 현탁액을 옮기고 냉장 세포 원심 분리기를 사용하여 450 ~ XG, 4 ° C에서 5 분 동안 튜브를 스핀.
- 상층 액을 제거하고 부드럽게 5 ml의 완전 배지에서 세포 펠렛을 다시 일시 중지합니다.
- 10cm 세포 배양 접시에 시드 2 × 105 세포 및 7.6 단계 7.1을 반복하기 전의 3-4일위한 가습 5 % CO2 인큐베이터에서 37 ℃에서 세포를 배양한다.
출하를위한 귀 8. 준비
참고 : T를 수행그는 무균 세포 배양 후드에서 다음 단계.
- 해당 기관의 지침에 따라 쥐를 안락사.
- 세포 배양 후드로 멸균 가위와 집게를 놓습니다.
- 50 ML 원뿔 바닥 튜브에 50 ㎖를 완전 배지를 추가합니다.
- 가위와 마우스의 귀 (~ 1 센티미터 반경)를 잘라.
- 사용 집게 (3 단계에서 제조 된) 50 ML 원뿔 바닥 튜브에 귀를 전송합니다.
- 해당 상자에 실온에서 출하하기 전에 파라 필름으로 50 ML 원뿔 바닥 튜브를 밀봉합니다.
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Representative Results
조직 파편의 상당한 양의 조직 결과에서 섬유 아세포의 추출 (도 1). 조직 파편과는 대조적으로, 섬유 아세포는 1 일, 문화의 3 사이의 조직 배양 플라스틱 표면에 부착. 섬유 아세포 배양 매체는 안전하게 크게 문화 (그림 2)에서 파편 현재의 수준을 감소해야 문화의 3 일에 변경 될 수 있습니다. 섬유 아세포는 가늘고 긴 형태와 명확하게 볼 세포질 (그림 1과 2)를 표시합니다. 유사 분열 세포는 이후 문화의 3 일에서 존재해야하고 세포 배양 3 ~ 4 일 이내에 세포 자랄 때 70 ~ 80 %에 도달해야한다. 10cm 배양 접시에 귀와 꼬리 조직에서 수율은 4 5 10 × 5 (귀), 문화의 3 일에서 5 5 10 × 6 전지 (꼬리) 범위. 섬유 아세포의 분리에 이어 세 번째 날, 세포를 계대 배양 할 수 있고, 10cm 배양 접시 당 2 × 105 세포로 시딩.
십일 동안 실온에서 저장 귀에서 섬유 아 세포의 추출 문화의 5~6일 내 70-80% 세포 포화 상태 (그림 3)가 발생한다. 5 일 후 10cm의 배양 접시 당 2 × 10 5 세포에서 세포를 심는 것은 또한 문화 3 ~ 4 일 이내에 약 1 × 10 6 세포를 야기한다. 장기 보관이 우리의 경험에서 노화 섬유 아세포를 입력하는데 걸리는 시간에 영향을 미치지 않는다 (데이터는 도시하지 않음).
멘틴 염색 (그림 4)로 표시된 바와 같이 배양 3 일 후 세포의 신원을 확인하기 위해, 세포가 위의 프로토콜을 사용하여 섬유 아 세포 마커 멘틴 (14)에 대해 표시 할 수 있습니다, 우리는 정기적으로 순수한 섬유 아세포 배양을 구하십시오.
앞서 3 일 후 추출 그림 1. 섬유 아세포 문화 매체의 변경합니다.세포 파편의 대표 시야 이미지 (흰색 화살표) 문화의 날 3에 존재. 이미지는 광학 현미경을 이용하여 100 × 배율로 촬영되었다. 스케일 바는 100 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
새로운 매체의 첨가 한 후 3 일 후 추출에 그림 2. 섬유 아세포 문화. 문화의 3 일에 섬유 아 세포의 대표 시야 이미지. 이미지는 광학 현미경을 이용하여 100 × 320 × 배율로 촬영되었다. 스케일 바는 100 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 십일 동안 실온에서 보관 귀 조직에서 3 일 후 추출에 섬유 아세포 문화. 문화의 3 일에서 섬유 아세포의 대표 시야 이미지. 이미지는 광학 현미경을 이용하여 100 × 320 × 배율로 촬영되었다. 스케일 바는 100 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
멘틴에 대한 섬유 아세포 배양의 그림 4. 라벨링. 문화의 3 일에 귀와 꼬리 섬유 아세포의 대표 공 촛점 이미지. 조직에서 추출한 섬유 아세포는 멘틴 (적색) 및 DAPI (파란색) 표지 하였다. 형광 이미지는 공 초점 마이크로 인수했다부. 스케일 바는 10 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에서 우리는 귀를 쥐의 꼬리에서 차 섬유 아세포 문화를 확립하기, 간단한 저렴하고 빠른 실험 절차를 제공합니다. 추출은 조직 3 일 후 격리 내에 부착하고 신속하게 분할하는 섬유 아 세포에서 발생한다. 일차 전지의 중요한 한계는 노화, 영구 성장 정지 15이다. 섬유 아세포는 노화되기 전에 프로토콜을 사용하여, 섬유 아세포 배양 크기 (2-3 배 증가) 및 확장 오류 증가, 세포의 평탄화에 의해 지시, 5 ~ 6 회 계대 될 수있다.
섬유 아 세포의 분리를 수행 할 때주의가 섬유 아세포의 낮은 복구가 발생합니다 불충분 절단 또는 소화로, 조직의 중단시 지불해야합니다. 이 섬유 아세포의 수를 증가 귀와 꼬리 섬유 아세포를 풀 수있다. 복막과 동일한 방식으로 처리 된 폐 조직을 포함하여 추가의 조직 (T)을 향상시키기 위하여 적당히 첨가 할 수있다섬유 아세포의 그는 수. 파편은 섬유 아 세포 추출 다음 문화에 존재하지만, 그것은 섬유 아세포는 세포 배양 접시에 부착하는 데 시간이 걸릴 만 사흘 후 매체를 변경하는 것이 좋습니다.
프로토콜의 전위 한계는 비 멸균 조직과 관련된 미생물 오염의 가능성을 사용하는 것이다. 오염의 위험을 줄이기 위해, 귀와 꼬리는 섬유 아세포를 수확하기 전에 70 % 에탄올에서 인큐베이션. 또한, 항진균제는 암포 테리 신 B 섬유 아세포 배양을 설정할 때 효모 및 곰팡이의 생장, 일반적인 문제를 방지하기 위해 주 배양에 첨가된다. 매체는 또한 페니실린과 세균 오염을 방지하기 위해 스트렙토 마이신이 포함되어 있습니다. 이주의 사항을 사용하여, 오염이 거의 몇 일 동안 실온에서 보관 한 귀와 꼬리에서 섬유 아세포를 설정하는 경우에도 관찰되지 않습니다.
이 프로토콜의 중요한 장점 중 하나 인 ABIL성만은 섬유 아세포를 분리하기 전에 10 일 동안 실온에서 매체에 저장된 귀에서 섬유 아 세포를 생성합니다. 우리는 저장 (70-80 %의 포화 상태 갓 격리 조직 3-4 일에 비해 5~6일 이내에 도달 할 때) 10 일 후 귀 섬유 아세포 문화를 확립 소폭 감소 효율을 관찰했다. 특급 배송을 권장하지만, 따라서, 마우스의 귀는, 표준 선박을 이용하여 연구자들에 의해 교환 할 수 있습니다. 경험상, 사용의 용이성 및 귀 조직 실험 절차는 거의 사용되지 않는다는 사실을 얻기 위해 종종 시간 소모 그렇지 수득 될 수도 유전자 변형 마우스의 조직에 접근 할 수있다. 꼬리를 들어 저장 후 복구하는 섬유 아 세포의 효율이 매우 다양 할 수 있고 귀는 선적을 사용할 수없는 경우 꼬리에만 사용되어야한다. 조직의 수확이 마우스의 처리에 최소한의 전문 지식과 훈련이 필요 마지막으로, 대부분의 사람들은, 프로토콜을 수행 할 수 있어야합니다.
프로토콜은 마우스의 조직을 사용하여 테스트되었습니다,하지만 이론 프로토콜이 추가 최적화를해야 할 수도 있지만, 다른 종의 조직을 사용하여 섬유 아세포 문화의 생성을 허용해야합니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 | HyClone | SH30027.01 | |
| Fetal Calf Serum | HyClone | SV30160.03 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Asparagine | Sigma-Aldrich | A4159 | |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G8540 | |
| Penicillin/Streptomycin | HyClone | SV30010 | |
| Ethanol | Merck Millipore | 107017 | Absolute for analysis |
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 11088866001 | From Clostridium histolyticum, lyophilized, non-sterile |
| Pronase protease | Merck Millipore | 53702 | From Streptomyces griseus |
| Tris buffer (pH 8) | 1st BASE | 1415 | Ultra pure grade |
| 0.5M EDTA (pH 8) | 1st BASE | BUF-1053 | Biotechnology grade |
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | 1st BASE | BUF-2040-10X4L | Ultra pure grade |
| Trypsin-EDTA solution 10X | Sigma-Aldrich | 59418C-100ML | 0.5% trypsin, 0.2% EDTA, trypsin gamma irradiated by SER-TAIN process, without phenol red, in saline |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2492-20ml | 250 μg/ml in deionized water, sterile-filtered |
| Scissors | Aesculap | ||
| Forcep | Aesculap | AE-BD312R | |
| 0.2 μM syringe filter | Sartorius Stedim | 16534 | |
| 70 μM cell strainer | SPL | 93070 | |
| Syringe plunger | Terumo | SS+10L | |
| Cryovial tube | NUNC | 368362 | |
| 1.7 ml microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10 cm cell culture dish | Greiner | 664160 | Cell culture treated dish |
| 15 ml conical bottom tube | Greiner | 188271 | |
| 50 ml conical bottom tube | Greiner | 227261 | |
| Water bath | GFL | 1002 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Incubation shaker | Sartorius Stedim | Certomat-BS1 | |
| Zeiss Axiovert 25 light microscope | Carl Zeiss AG |
References
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