Kvantitativ Fundus Autofluorescens for Vurdering af retinale sygdomme

Introduction

Det retinale pigment epitel (RPE) støtter funktionen af den sensoriske nethinde gennem talrige processer ^1. Aldersrelateret maculadegeneration (AMD) er den vigtigste årsag til blindhed uhelbredelige i industrialiserede lande og er kendetegnet ved ændringer i RPE, herunder tab af pigment, tab af funktion og atrofi. I AMD og normal aldring, RPE ophobes fluorescerende, lysosomer-afledte organeller der indeholder fagocyterede fotoreceptor fragmenter, benævnt lipofuscin granulat. Ophobningen af RPE lipofuscin er blevet anset for at indikere oxidativ dysfunktion ^1, men nylige undersøgelser har vist, at RPE morfologi forbliver normalt i alderen øjne med høj lipofuscin niveau ^2. Men unormale mønstre af lipofuscin distribution, navnlig tab af lipofuscin, er dokumenteret markører for AMD og AMD progression, både histologisk og klinisk ^3,4

Defekte processing af RPE lipofuscin har også vist sig at forekomme i visse arvelige retinale degenereringer. Patienter, der lider Stargardt sygdom (STGD) akkumulerer lipofuscin i RPE i en ung alder, i sidste ende udvikle synstab svarende til den, set i AMD ^fem. Disse resultater antydede, at lipofuscin ophobning selv kan være giftige og køre RPE dysfunktion ^6,7. Men en detaljeret imaging undersøgelse af emner med STGD over tid ikke bekræfte, at omdrejningspunktet lipofuscin ophobning førte til efterfølgende RPE tab ^8. Så selv lipofuscin abnormiteter er markører for retinale degenereringer, en rolle for direkte toksicitet lipofuscin forbliver udokumenterede.

RPE er den mest posteriore cellelag af nethinden, men genererer størstedelen af ​​fluorescerende signal fra den okulære fundus. Generering og detektion af autofluorescens (AF) afledt af RPE kan udføres under anvendelse af konfokal scanning laser oftalmoskopi (cSLO), som giver mulighed for VIsualization af den rumlige fordeling af fundus AF. Visse retinale degenereringer demonstrere karakteristiske mønstre af fundus AF og AF-billeddiagnostiske hjælpemidler i diagnose og overvågning af disse betingelser. Selvom standard AF-billedbehandling er klinisk vigtig, har kvantitativ AF (QAF) blive et vigtigt middel til at vurdere RPE sundhed. Vi og andre har udviklet en standardiseret tilgang, der pålideligt kan bestemme QAF niveauer på bestemte retinale steder ^9. QAF har potentielle anvendelser i diagnose og overvågning af retinale forhold, og kan også have nytte i prognosen og risiko lagdeling. Desuden har de diagnostiske evner QAF også blevet beskrevet for visse sygdomme i retina ^10-12. Her giver vi trinvise oplysninger om udførelse af vores teknik ledsaget af en visuel demonstration af dens anvendelse i evalueringen af ​​raske og syge øjne.

Protocol

Etik Statement: Alle patienter indskrevet i disse undersøgelser blev gjort i overensstemmelse med godkendte institutionelle Review Board tilsyn ved New York University School of Medicine.

1. Patient Valg og Initial Forberedelse til Imaging

Bemærk: Følgende materialer er påkrævet: 0,5% tropicamid oftalmisk opløsning, 2,5% phenylephrin øjendråber, cSLO udstyret med spektral domæne optisk kohærens tomografi (SD-OLT) og intern fluorescens reference.

1. Forud for billedbehandling, passende oprettet cSLO til dataopsamling i henhold til producentens anvisninger.
2. Monter en intern fluorescerende reference i cSLO. Bemærk: Den interne fluorescerende reference, som er købt fra producenten, har til huse i en metalring og er placeret direkte bag kameralinsen. Hvis der anvendes en cSLO fra en anden producent, kan der være en anden konfiguration end den, der er beskrevet idenne protokol.
   1. For at indsætte henvisning i cSLO, drej linsen for at fjerne den, skru maskinens metal ring, og erstatte den med den nye metal ring, der indeholder referencen.
      Bemærk: det indre fluorescerende reference er afgørende for QAF teknik, da den tillader korrektion for variation i lasereffekt og detektor følsomhed / gevinst.
3. Har patienter rekrutteret til billedbehandling gennemgå en rutinemæssig dilateret øjenundersøgelse og få baggrundsoplysninger om fortid okulær historie og underliggende medicinske tilstande, der kan manifestere med okulære fund.
4. Spile elever med 0,5% tropicamid og 2,5% phenylephrin. KRITISK STEP: Dilate elever til mindst 6 mm. Bemærk: Dette er afgørende for uafbrudt passage af lys, og dermed for optimal visualisering og måling af fundus.
5. Forud for billedbehandling, placere patienten korrekt på cSLO, med hagen hvilende på chinrest, pande placeret mod forehead hvile, og lateral canthi korrekt justeret med indikatorerne.

2. Baseline Imaging af Ocular Fundus

1. Først billede fundus med nær infrarød reflektans (IR) lys (bølgelængde på 820 nm) for at centralisere kameraet over macula og opnå en grov fokus.
   1. Med patienten korrekt placeret, skal du skifte indstillingen hardware på kontrolpanelet til IR billedtilstand, position kamera manuelt, indtil fundus er i fuld fokus, og tage et billede
   2. Juster indstillingen på kontrolpanelet til "IR OLT", som bruger spektral-domæne optisk kohærens tomografi (SD-OLT), sammen med IR imaging at evaluere macula for underliggende sygdom.
   3. Brug styrene til stede i billedbehandling vinduet til korrekt orientere OLT til IR billede af fundus. For at opnå optimal SD-OLT-kvalitet, placere kameraet, således at OLT billede er i den øverste tredjedel af dens imaging vindue. Erhverve mindst én vandret linie scen gennem fovea og spænder over hele imaging feltet.

3. Opsætning QAF Imaging

1. Brug "Høj hastighed" image erhvervelse. Bemærk: Denne indstilling giver mulighed for hurtigere erhvervelse billede, hvilket nedsætter risikoen for tab af signal på grund af patientens bevægelser og deraf blokering af lys ved iris eller øjenlåg.
2. Brug "Mean af 9" rammer. Bemærk: Denne indstilling giver mulighed for hurtig, sekventiel erobringen af ​​9 billedrammer, som kan være efterfølgende "gennemsnit" for at reducere støj og artefakter (se nedenfor).
3. Brug "30 x 30 graders" feltet. Bemærk: Dette refererer til de grader af retinal område fange under erhvervelse billede.
4. Forud for billedbehandling, advare patienten om det blå lys, da dette kan være alarmerende i første omgang.
5. Tænd for AF-tilstand og tilpasse kameraet akse, således at skærmen er maksimalt "fyldt" med fundus AF (minimal mørkfarvning af siderne og hjørner af billedet).
   1. Hvis patienter have vanskelighed tolerere den klare blå lys, starte billeddannelse med kameraet længere væk fra øjet og derefter bringe kameraet langsomt mod patientens indtil fundus er i fuld visning.
      Afgørende skridt: Hvis lys ind i eller ud fra øjet er blokeret, nedsat signal vil medføre. Lokaliseret fald er synlig som asymmetrisk mørkfarvning af et billede side eller hjørne. Generaliseret tab af signal ses, når øjenbevægelser alene hindrer lys passage.
6. Juster kameraet således at AF-signalet er på sit højeste niveau i hele området. Målet for maksimal signal i stedet skarpeste billede, men de groft korrelerer. Juster kamera fokus ved at flytte cSLO at flytte kameraet enten manuelt eller med oftalmoskop joysticket.
7. Juster følsomheden / gevinst sådan at fundus AF er let synlige, men undgå over-mætning. Under billedoptagelsen, farvede pixel synlige i enten den interne reference (placeret på toppen af ​​denbillede) eller fundus indikerer overmætning og dermed tab af signal.

4. Image Acquisition

Bemærk: KRITISK STEP: Målet i købet billedet skal være at få 2 af høj kvalitet 9-frame billedstakke per session til at kontrollere for variation mellem billeder i en session. Efter genplacering patienten og kamera, få en anden samling af to billeder til at vurdere og kontrol for variabilitet. Alle billeder vil i sidste ende være kalibreret til den interne reference (beskrevet nedenfor).

1. Acquire kun billeder efter mindst 20 sek af "blegning" (fuld eksponering af nethinden til AF lys) for at minimere absorption af lys ved rhodopsin i den sensoriske nethinde ^9.
   1. Brug denne periode til at optimere kameraets justering, fokus og følsomhed.
2. Har de emner blinke før hvert billede erhvervelse som en frisk tårefilm forbedrer signalkvaliteten.
3. Undgå øjenlåg i planet af erhvervelsen.
   Bemærk: Det kan være nyttigt at manuelt åbne øjenlåg mere udfordrende patienter. Forfatterne anbefaler, at en assistent udfører denne opgave.
4. Optimer tilpasningen før hver erhvervelse billede for at sikre, at lyset ikke er blokeret af iris resulterer i nedsat signal.
   Bemærk: Som mindst mindre bevægelse er meget almindeligt, forfatterne anbefaler fine justering efter behov før hver billedoptagelse. Ledende og opmuntre patienten, mens billeddannelse hjælper faldet bevægelse. Forfatterne anbefaler også brug af maskinen fod-pedal som "-knappen erhvervelse" for at minimere operatørens distraktion.
5. Udførelse af post-billedbehandling ved at beregne "middelværdien" af 9-frame stack at øge signal-støj-forhold. Beregn middelværdien af ​​en stak ved hjælp af cSLO softwaren ved at vælge muligheden for at beregne middelværdien.
   Bemærk: Der kan være stakke hvor nogle rammer ikke er af optimal kvalitet (dvs. har lokaliseret eller generaliseret nedsat signal forhold til de optimale rammer), derfor omhyggeligt inspicere hver stak og fravælge suboptimale rammer før beregning af middelværdien.
   Bemærk: Mean billeder med acceptable signal-til-støj-forhold kan behandles fra mindst 3 rammer. Det er normalt, sider og hjørner af hvert billede for at få lavere signal end de centrale 20 grader på grund af begrænsninger i cSLO selv.
   1. Hvis softwaren spørger, om operatøren ønsker at normalisere de grå niveauer (dvs. strække histogram) mellem 0 og 255, skal du vælge "Nej". Dette fastholder uændrede gråtoner til analyse.

5. Image Analysis

1. Analysis of billeder som tidligere beskrevet anvendelse af billedanalyse software udviklet til QAF teknik (IGOR ^9). En kort beskrivelse af en typisk billedanalyse under anvendelse af denne software er inkluderet nedenfor.
   1. Læg QAF programmet i IGOR og importere billeder (i .bmp-format) eksporteres fracSLO software med pixelstørrelsesforholdet 768 x 768 (standard output parameter).
   2. Vælg billedet i drop-down menuen og starte analysen.
   3. Flyt kalibrering indikatorer på billedet, således at de "trådkors" ligge fovea og "beslag" støder den optiske disk (disse indikatorer anvendes til at skalere og placere ROIs). Ved korrekt positioneret, prompter bruge software derefter udfylde billedet med rundtgående ROIs omgiver fovea (se figur 1, 2).
   4. Vælg indstillingen i IGOR at kalibrere de overordnede grå niveauer af hvert billede til disse niveauer, der findes i den interne fluorescerende reference. Bemærk: Dette trin tillader kalibrering af maskinlæsbare faktorer, herunder den elektroniske nul niveau for hvert billede og den interne reference kalibreringsfaktor for hver maskine, samt patientrelaterede faktorer, herunder alder, brydning og hornhindens krumning.
      Bemærk: Analysen software viser derefter den faste regioner på det resulterende billede og en QAF værdi demonstreres inden for hver region. QAF værdier er også automatisk i et regneark format i et separat vindue. "
   5. Generer QAF "heat maps" ved at vælge indstillingen inden for de kommandoprompter. Alle billeder og data kan eksporteres fra IGOR software i et Excel-regneark ved at vælge de relevante indstillinger.

Representative Results

Denne teknik blev anvendt til at undersøge QAF hos både raske ¹³ og sygdomstilstande ^10-12. I sunde øjne (figur 1), er AF udsendes fra RPE fordelt relativt ensartet gennem fundus (figur 1A). Reduceret intensitet ses i den centrale makulært regionen på grund af blokering af lys ved makulært pigment, og ved siderne og hjørner af billedet på grund af optikken i øjet og kamera. Fartøjer mørke og bør være i klart fokus i godt erhvervede billeder. Figur 1B viser en tilsvarende varme kort repræsentation af QAF niveauer fra figur 1A. Køligere farver svarer til områder med lavere intensitet, mens varmere farver svarer til områder med højere intensitet. Maksimal intensitet ses generelt i andet koncentrisk 8-segment ring (angivet i figur 1 B). Denne region er også mindre udsat for billedbehandling relateret variabiltet end regioner tættere på billedet grænser, og er uden for den centrale region, hvor macula pigment har en stor indvirkning på QAF niveauer. Således er de gennemsnitlige intensiteter af denne ring anvendes til de fleste dataanalyser ^13. Figur 2 viser en repræsentativ analyse i et øje med AMD demonstrerer geografisk atrofi (GA), en avanceret form for AMD. Denne form for AMD resultater i lokaliserede områder af RPE tab, fremgår af markant reduceret eller fraværende AF, og forårsager progressiv central synstab.

Figur 1. Autofluorescens i sunde øjne. (A) Autofluorescens (AF) billede af det højre øje af en normal patient. OD: optisk disk, Fo: fovea, Ma: macula, Ref: interne reference. (B) Post-behandling QAF kort over AF-billede fra (A). Varmere farver korrelerer til højere AF-intensitet. Fast regioner er vist, og QAF værdier for hver region er angivet. 8-segment perifoveal ring bruges i dataanalyse er angivet med den stiplede linie. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. Autofluorescens i øjet vise geografisk atrofi grundet AMD. (A) Autofluorescens (AF) billede af det venstre øje af en patient med fremskreden AMD viser geografisk atrofi (GA) i RPE (repræsentativ region afgrænset ved stiplet linie). OD: optisk disk, Fo: fovea, Ma: macula, Ref: interne reference. Bemærk markant reduceret og fraværende AF i regioner svarende til GA i macula. (B) Post-behandling QAF kort over AF-billede fra (A). Faste regioner er vist, og QAF værdier for hver region enre angivet. 8-segment perifoveal ring bruges i dataanalyse er angivet med den stiplede linie. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Unormal RPE lipofuscin distribution, uanset om steget eller faldet, er en følsom markør for retinal sygdom og er generelt forbundet med tab af sensorisk nethinde funktion. Her beskriver vi anvendelse af QAF til evaluering af RPE lipofuscin. Inkorporering af en intern fluorescerende henvisning til at korrigere for variabel laser magt og detektor følsomhed ⁹ sammen vores standardiserede imaging teknik tillader pålidelig kvantificering af AF-niveauer. Det er vores mål, at denne metode vil hjælpe ved diagnose og overvågning af retinal sygdom, og til sidst i vurdering af effektiviteten af ​​terapeutiske interventioner, såsom lægemiddel- eller genterapi. QAF kan også hjælpe med lagdeling af personer i risikogruppen for lidelser som AMD.

Vi har genereret en stor normativ database over QAF data, der skal anvendes som reference værktøj for fortolkningen af retinal patologi ^13, og har også beskrevet QAF i flere sygdomme states, herunder Stargardt sygdom ^10, plet makulopati ¹² og Best sygdom ^11. Hos raske nethinden, er der forskellige QAF niveauer mellem etniske grupper, med betydeligt højere QAF i hvide end sorte og asiater, og viste, at kvinder har højere QAF niveauer end mænd. Måske mest slående, QAF stiger som patienter alder, som svarer til RPE lipofuscin niveauer, som tidligere målt ved spektrofluorometri ^14. Selvom nuværende normative data kun strække sig op til 60 år, fremgår det, at patienterne har en målt fald i RPE lipofuscin efter alder 70 ^14. Interessant, betyder det ikke ud til, at ændringer i RPE celle nummer forekomme som patienter alder ² og så de observerede fald i AF kan skyldes en omfordeling eller reduktion i RPE lipofuscin ^3. Det vil være interessant at fastslå, om disse fald i AF i alderdommen korrelerer med nedsat RPE funktion og øget risiko for AMD.

1Fem. En anden begrænsning er, at teknikken er udfordrende at udføre og er yderst operatør afhængig. Det er vigtigt at konsekvent få billeder af høj kvalitet for at sikre nøjagtige målinger af AF-niveauer. For at opnå dette, forfatterne anbefaler streng overholdelse af imaging-protokollen samt passende praksis. Selv om nogle patienter dårligt tåler de lyse lysglimt kræves for AF-billedbehandling, der sikrer patienterne at eksponeringsniveauet er godt inden for de sikre grænser er hjælpsom ^1. At muliggøre optimal billeddannelse, er det vigtigt at dilatere elever til mindst 6 mm og for at opnå flere billeder med uhindret lystransmission (se ovenfor). Opnåelse optimal fokus og undgå overmætning af pixels er også afgørende. Nyttige fremgangsmåder omfatter kommunikation med patienten, mens billeddannelse, brug af en assistent, hvis øjenlåget skal løftes og bruge fodpedalen til udløsning af kameraet, som beskrevet ovenfor.

Sammenfattende unståelse patofysiologi RPE i retinale degenereringer stadig et område af aktiv forskning, og af potentielt vigtig terapeutisk effekt. Som QAF giver mulighed for direkte sammenligning af AF-niveauer i billeder opnået på langs, mellem patienter og mellem centrene, er det et værdifuldt værktøj, der kan bidrage til denne forståelse samt give nyttige kliniske oplysninger. Den detaljerede proceduren skitseret her, vil hjælpe andre med købet af pålidelige QAF data, og at de vigtige kliniske anvendelser af QAF vil tilskynde forskningscentre og kliniske nethinden specialister til at gøre brug af QAF teknik.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spectralis HRA + OCT	Heidelberg Engineering
0.5% tropicamide ophthalmic solution			Any brand can be used
2.5% phenylephrine ophthalmic solution			Any brand can be used
Internal fluorescent reference	Heidelberg Engineering
IGOR Pro software	WaveMetrics