Kvantitativ Fundus autofluorescence for Evaluering av retinal sykdommer

Introduction

Den retinal pigment epitel (RPE) støtter funksjonen av sensoriske netthinnen gjennom en rekke prosesser ^1. Aldersrelatert macula degenerasjon (AMD) er den viktigste årsaken til botemiddel blindhet i industrialiserte land og er preget av endringer i RPE, inkludert tap av pigment, tap av funksjon og atrofi. I AMD og i normal aldring, akkumulerer RPE fluorescerende, lysosom-avledede organeller som inneholder fagocytterte fotoreseptoren fragmenter, referert til som Lipofuscin granuler. Oppbyggingen av RPE lipofuscin har vært antatt å indikere oksidativt dysfunksjon ^en, men nyere studier har vist at RPE morfologi forblir normalt i alderen øynene med høy Lipofuscin nivå ^2. Men unormale mønstre av lipofuscin distribusjon, spesielt tap av lipofuscin, er dokumentert markører for AMD og AMD progresjon, både histologisk og klinisk ^3,4

defekte processing av RPE lipofuscin har også vist seg å forekomme i visse arve retinal degenerasjon. Pasienter som lider av Stargardt sykdom (STGD) akkumuleres lipofuscin i RPE i ung alder, til slutt utvikle synstap lik som hos AMD ^5. Disse funnene antydet at lipofuscin akkumulering kan i seg selv være giftig og kjøre RPE dysfunksjon ^6,7. Men gjorde en detaljert avbildning studie av pasienter med STGD over tid ikke bekrefte at fokus lipofuscin akkumulering førte til påfølgende RPE tap ^8. Derfor, selv om Lipofuscin abnormiteter er markører for retinal degeneration, en rolle for direkte toksisitet av lipofuscin fortsatt uprøvd.

RPE er den mest bakre celle laget av retina, men genererer de fleste fluorescerende signal fra den okulær fundus. Generering og deteksjon av autofluorescens (AF) avledet fra RPE kan utføres ved hjelp av konfokal laser-skanning ophthalmoscopy (cSLO), som gjør det mulig for visualization av den romlige fordelingen av fundus AF. Visse retinal degeneration demonstrere karakteristiske mønstre av fundus AF og AF imaging hjelpemidler i diagnostisering og overvåking av disse forholdene. Selv om standard AF bildebehandling er klinisk viktig, har kvantitative AF (QAF) blitt et viktig virkemiddel for å vurdere RPE helse. Vi og andre har utviklet en standardisert tilnærming som sikkert kan avgjøre QAF nivåene på bestemte retinal steder ^9. QAF har potensielle bruksområder i diagnostisering og overvåking av retinal forhold, og kan også ha nytte i prognose og risiko lagdeling. I tillegg har de diagnostiske mulighetene QAF også blitt beskrevet for visse retinasykdom ^10-12. Her gir vi trinnvise detaljer for å utføre vår teknikk ledsages av en visuell demonstrasjon av sin søknad i evalueringen av friske og syke øyne.

Protocol

Etikk Uttalelse: Alle pasienter som deltok i disse studiene ble gjort det i samsvar med godkjente Institutional Review Board tilsyn ved New York University School of Medicine.

1. Pasient Utvalg og innledende forberedelse til Imaging

Merk: Følgende materialer kreves: 0,5% tropikamid øyedråper, 2,5% fenylefrin øyedråper, cSLO utstyrt med spektral domene optisk koherens tomografi (SD-oktober), og intern fluorescens referanse.

1. Før bildebehandling, riktig satt opp cSLO for datainnsamling i henhold til produsentens instruksjoner.
2. Monter en intern fluorescerende referanse i cSLO. Merk: Den interne fluorescerende referanse, som er kjøpt fra produsenten, ligger i en metallring og er plassert rett bak kameralinsen. Hvis en cSLO fra en annen produsent blir brukt, kan det være en annen konfigurasjon enn det som er beskrevet idenne protokollen.
   1. For å sette inn referansen inn i cSLO, vri linsen for å fjerne det, skru av maskinens metallringen, og erstatte den med den nye metallring som inneholder referanse.
      Merk: de indre fluorescerende referanse er vesentlig for QAF teknikk, som gjør det mulig korreksjon for variasjoner i lasereffekten og detektorens følsomhet / gevinst.
3. Har pasienter rekruttert for bildebehandling gjennomgå en rutinemessig utvidet øyeundersøkelse og få bakgrunnsinformasjon om fortid okulær historie og underliggende medisinske tilstander som kan manifestere med okulær funn.
4. Utvid elever med 0,5% tropikamid og 2,5% fenylefrin. KRITISK STEP: Utvid elever til minst 6 mm. Merk: Det er en forutsetning for uavbrutt passasje av lys, og således for optimal visualisering og måling av fundus.
5. Før bildebehandling, plassere pasienten riktig på cSLO, med haken hvilende på chinrest, pannen plassert mot forehead hvile, og lateral Hjørnene riktig justert med indikatorene.

2. Baseline Imaging av Ocular Fundus

1. For det første bilde i fundus med nær infrarød refleksjon (IR) lys (bølgelengde 820 nm) for å sentrere kameraets over makula og få ujevn fokus.
   1. Med pasienten riktig plassert, slår hardware innstillingen på kontrollpanelet til IR avbildningsmodus, posisjon kameraet manuelt til fundus er i full fokus, og ta et bilde
   2. Juster innstillingen på kontrollpanelet til "IR-oktober", som bruker spektral-domene optisk koherens tomografi (SD-oktober) i forbindelse med IR bildebehandling for å evaluere makula for underliggende sykdom.
   3. Bruk guider til stede i bildevinduet til riktig orientere oktober til IR-bilde av fundus. For å oppnå optimal SD-oktober kvalitet, plassere kameraet slik at OCT bildet er i den øverste tredjedel av sin bildevinduet. Tilegne seg minst en horisontal linje scen gjennom fovea og spenner over hele bildefeltet.

3. Sette opp QAF Imaging

1. Bruk "High speed" image oppkjøpet. Merk: Denne innstillingen gjør for raskere bildeopptak, noe som reduserer risikoen for signaltap på grunn av pasientbevegelse og resulterer blokkering av lys av iris eller øyelokk.
2. Bruk "Mean av 9" frames. Merk: Denne innstillingen gjør det mulig for den raske, sekvensiell fangst av 9 bilderammer, som kan være senere "gjennomsnitt" for å redusere støy og artefakter (se nedenfor).
3. Bruk "30 x 30 graders" -feltet. Merk: Dette refererer til de grader av retinal område fanget under bildet oppkjøpet.
4. Før bildebehandling, advare pasienten om det blå lyset, da dette kan være skremmende i begynnelsen.
5. Slå på AF-modus og justere kameraaksen slik at skjermen er maksimalt "fylt" med fundus AF (minimal mørkere sidene og hjørnene av bildet).
   1. Hvis pasienter have vanskeligheter tolerer lyse blå lys, starter bildebehandling med kameraet lenger vekk fra øyet og deretter bringe kameraet sakte mot pasienten til fundus er i full størrelse.
      KRITISK TRINN: Hvis lyset går inn i eller ut fra øyet er blokkert, redusert signal vil medføre. Lokalisert Nedgangen er synlig som asymmetrisk mørkere et bilde side eller hjørne. Generalisert tap av signal er sett når øyebevegelser alene hindrer lysgjennomgang.
6. Rett kameraet slik at AF-signalet er på sitt høyeste nivå gjennom hele feltet. Målet for maksimal signal snarere enn skarpeste bildet, men de omtrent korrelerer. Juster kameraets fokus ved å flytte cSLO å flytte kameraet enten manuelt eller med oftalmoskop joystick.
7. Juster følsomheten / gevinst slik at fundus AF er lett synlig, men unngå overmetning. Under bildet oppkjøpet, fargede piksler synlige i enten intern referanse (plassert på toppen avbilde) eller fundus indikere overmetning og således tap av signal.

4. Image Acquisition

Merk: KRITISK STEP: Målet i bildet oppkjøpet bør være å få 2 høye kvalitet 9-ramme bildestakker per økt for å kontrollere for variasjon mellom bilder i en økt. Etter reposisjonering pasienten og kamera, få en andre økt av to bilder for å vurdere og kontrollere for variasjon. Alle bildene til slutt vil bli kalibrert til den interne referanse (beskrevet nedenfor).

1. Hente bilder først etter minst 20 sek på "bleking" (full eksponering av netthinnen til AF lys) for å minimere absorpsjon av lys ved rhodopsin i sensoriske netthinnen ^9.
   1. Bruk denne perioden for å optimalisere kamera justering, fokus og følsomhet.
2. Har fagene blink før hvert bilde oppkjøpet som et friskt tear film forbedrer signalkvalitet.
3. Unngå øyelokkene i planet av oppkjøpet.
   Merk: Det kan være nyttig å manuelt åpne øyet for mer utfordrende pasientene. Forfatterne anbefaler at en assistent utfører denne oppgaven.
4. Optimalisere justering før hvert bilde oppkjøpet for å sikre at lyset ikke er hindret av iris som resulterer i redusert signal.
   Merk: Som ved alle fall mindre bevegelse er svært vanlig, forfatterne anbefaler fint omstilling som er nødvendig før hvert bilde oppkjøpet. Guiding og oppmuntre pasienten mens bilde bidrar til å redusere bevegelse. Forfatterne anbefaler også å bruke maskinens fot-pedal som "erverv knappen" for å minimere operatør distraksjon.
5. Utføre post-bildebehandlingen ved å beregne den "midlere" av 9-ramme stabel for å øke signal-til-støy-forhold. Beregne gjennomsnittet av en stabel med cSLO programvaren ved å velge alternativet for å beregne gjennomsnittet.
   Merk: Det kan være stabler der noen rammer ikke er av optimal kvalitet (dvs. har lokalisert eller generalisert nedsatt signal forhold til de optimale rammer), derfor skal hvert stabelen, og fjern merket suboptimale rammer før beregning av gjennomsnittet.
   Merk: Mean bilder med aksepterbare signal-til-støy-forhold kan behandles fra minst 3 rammer. Det er vanlig for sidene og hjørnene av hvert bilde for å ha svakere signal enn de sentrale 20 grader på grunn av begrensninger i den cSLO selv.
   1. Hvis programvaren spør om operatøren ønsker å normalisere gråtonene (dvs. strekke histogrammet) mellom 0 og 255, velg "Nei". Dette opprettholder uendret grånivåer for analyse.

5. Bildeanalyse

1. Analyser AF bilder som tidligere beskrevet ved hjelp av bildeanalyse programvare utviklet for QAF teknikk (IGOR, ^9). En kort beskrivelse av en typisk bildeanalyse ved hjelp av denne programvaren er inkludert nedenfor.
   1. Last inn QAF programmet i IGOR og importere bilder (i bmp format) eksporteres fracSLO programvare med pikselstørrelsesforholdet 768 x 768 (standard utgang parameter).
   2. Velg bildet i rullegardinmenyen og starte analysen.
   3. Flytt kalibrerings indikatorer på bildet slik at den "trådkorset" ligge over fovea og "bracket" ligger an papillen (disse indikatorene brukes til å skalere og posisjonere Rois). Når den er riktig plassert, ber bruke programvare deretter fylle bildet med omkrets ROIs omgir fovea (se figurene 1, 2).
   4. Velg alternativet i IGOR å kalibrere den generelle grå nivåer av hvert bilde til de nivåene som finnes i den interne fluorescerende referanse. Merk: Dette trinnet kan for kalibrering av maskinmessige faktorer, inklusive den elektroniske nullnivået av hvert bilde og den interne referansekalibreringsfaktoren for hver maskin, så vel som pasientrelaterte faktorer som alder, brytning og corneal kurvatur.
      Merk: Analysen Programvaren viser deretter den faste regions på det resulterende bilde og en QAF verdi er demonstrert i hver region. QAF verdier blir også automatisk med i et regneark format i et eget vindu. "
   5. Generer Qaf "varme kart" ved å velge alternativet innenfor ledetekster. Alle bilder og data kan eksporteres fra IGOR programvare i et Excel-regneark ved å velge de riktige alternativene.

Representative Results

Denne teknikken ble brukt til å studere QAF både hos friske ¹³ og sykdomstilstander ^10-12. Hos friske øyne (figur 1), blir AF avgis fra RPE fordeles forholdsvis jevnt over hele fundus (figur 1A). Redusert intensitet er sett i den sentrale macula regionen på grunn av blokkering av lyset ved macular pigment, og på sidene og hjørnene av bildet på grunn av optikk i øyet og kamera. Fartøy er mørke og bør være i klart fokus på godt ervervet bilder. Figur 1B viser en tilsvarende varmekart representasjon av QAF nivåene fra figur 1A. Kjøligere farger tilsvarer områder med lavere intensitet, mens varmere farger tilsvarer områder med høyere intensitet. Maksimal intensitet er generelt sett i den andre konsentriske 8-segment ring (vist i figur 1 B). Denne regionen er også mindre utsatt for bildebehandling relatert variabilligheten enn regionene nærmere bilde grenser, og er utenfor den sentrale regionen hvor makula pigment har en stor innvirkning på QAF nivåer. Således er de gjennomsnittlige intensitetene av denne ringen brukes til de fleste dataanalyser ¹³ Fig. 2 viser en representativ analyse i et øye med AMD demonstrere geografisk atrofi (GA), en avansert form for AMD. Denne formen for AMD resultater i lokaliserte områder av RPE tap, dokumentert av kraftig redusert eller fraværende AF, og fører til progressiv synstap.

Figur 1. autofluorescens i friske øyet. (A) autofluorescens (AF) bilde av den høyre øyet til en normal pasient. OD: optisk disk, Fo: fovea, Ma: makula, Ref: intern referanse. (B) Etterbehandle QAF kartet AF bilde fra (A). Varmere farger relateres til høyere AF intensitet. fast regioner er vist, og QAF verdiene for hver region er indikert. 8-segmentet perifoveal ring brukes i dataanalysen er angitt med stiplet linje. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. autofluorescens i øyet vise geografisk vinn på grunn av AMD. (A) autofluorescens (AF) bilde av det venstre øyet av en pasient med avansert AMD viser geografisk atrofi (GA) av RPE (representative område avgrenset av stiplet linje). OD: optisk disk, Fo: fovea, Ma: makula, Ref: intern referanse. Merk kraftig redusert og mangler AF i regioner som tilsvarer GA i makula. (B) Etterbehandle QAF kartet AF bilde fra (A). Faste regionene vises, og QAF verdier for hver region enre indikert. 8-segmentet perifoveal ring brukes i dataanalysen er angitt med stiplet linje. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Unormal RPE lipofuscin fordeling, enten økes eller reduseres, er et følsomt markør for retinal sykdom og er vanligvis forbundet med tap av sensoriske retina funksjon. Her beskriver vi bruk av QAF for evaluering av RPE lipofuscin. Innlemmelse av en intern fluorescerende referanse til rette for variabel laser makt og detektorfølsomhet ⁹ sammen med våre standardiserte avbildningsteknikk muliggjør pålitelig kvantifisering av AF nivåer. Det er vårt mål at denne metoden vil hjelpe i diagnostisering og overvåking av retinal sykdom, og til slutt i å vurdere effekten av terapeutiske intervensjoner, for eksempel narkotika eller genterapi. QAF kan også bistå i lagdeling av personer i risikosonen for forhold som AMD.

Vi har generert en stor retningsgivende database med QAF data som skal brukes som et referanseverktøy for tolkningen av retinal patologi ^13, og har også beskrevet QAF i flere sykdoms states, inkludert Stargardt sykdom ^10, blinken maculopathy ¹² og Best sykdom ^11. Hos friske netthinnen, er det ulike QAF nivåer mellom etniske grupper, med betydelig høyere Qaf i hvite enn svarte og asiater, og viste at kvinner har høyere QAF nivåer enn menn. Kanskje mest påfallende, øker QAF som pasienter alder, som tilsvarer RPE Lipofuscin nivåer, som tidligere målt ved spectrofluorometry ^14. Selv om dagens normative data kun strekker seg opp til 60 år, viser det seg at pasientene har en målt reduksjon i RPE lipofuscin etter fylte 70 ^14. Interessant nok ser det ikke ut til at endringer i RPE celle nummer oppstå som pasienter ⁱ alderen ² og så de observerte reduksjoner i AF kan skyldes en omfordeling eller reduksjon i RPE lipofuscin ^tre. Det vil være interessant å finne ut om disse reduksjonene i AF i alderdommen korrelerer med nedsatt RPE funksjon og økt risiko for AMD.

15. En annen begrensning er at teknikken er vanskelig å utføre og er sterkt avhengig av operatøren. Det er viktig å konsekvent få bilder av høy kvalitet for å sikre nøyaktige målinger av AF nivåer. For å oppnå dette, forfatterne anbefaler streng overholdelse av bildeprotokollen samt tilstrekkelig praksis. Selv om noen pasienter dårlig tåler de sterke lysglimt som kreves for AF bildebehandling, som sikrer pasientene at eksponeringen er godt innenfor trygge grenser er nyttig ^en. For å muliggjøre optimal bildebehandling, er det avgjørende å utvide elevene til minst 6 mm, og for å få flere bilder med uhindret lysgjennomgang (se ovenfor). Oppnå optimal fokus og unngå oversaturation piksler er også avgjørende. Nyttige praksis omfatter kommunikasjon med pasienten mens avbildning, bruk av hjelpe dersom øyelokk må løftes og bruke fotpedal for utløsning av kameraet, som beskrevet ovenfor.

I sammendraget, understanding patofysiologien av RPE i netthinnens degeneration er fortsatt et område med aktiv forskning, og potensielt viktig terapeutisk effekt. Som QAF gir mulighet for direkte sammenligning av AF nivåer i bildene innhentet lengderetningen, mellom pasienter og mellom sentrene, er det et verdifullt verktøy som kan bidra til dette forståelse samt gi nyttig klinisk informasjon. Den detaljerte protokollen skissert her vil hjelpe andre i oppkjøpet av pålitelige QAF data, og at de viktige kliniske anvendelser av QAF vil oppmuntre forskningssentre og kliniske netthinnen spesialister til å gjøre bruk av QAF teknikk.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spectralis HRA + OCT	Heidelberg Engineering
0.5% tropicamide ophthalmic solution			Any brand can be used
2.5% phenylephrine ophthalmic solution			Any brand can be used
Internal fluorescent reference	Heidelberg Engineering
IGOR Pro software	WaveMetrics