Kvantitativ Fundus autofluorescens för utvärdering av retinala sjukdomar

Introduction

Näthinnans pigmentepitel (RPE) stödjer funktionen av den sensoriska näthinnan genom många processer ^1. Åldersrelaterad makuladegeneration (AMD) är den viktigaste orsaken till behandlingsbar blindhet i industriländerna och kännetecknas av förändringar i RPE, inklusive förlust av pigment, förlust av funktion och atrofi. I AMD och i normalt åldrande, RPE ackumulerar fluorescerande, lysosom härledda organeller som innehåller fagocyterade fotoreceptor-fragment, benämnda lipofuscin granuler. Ansamlingen av RPE lipofuscin har ansetts indikera oxidativ dysfunktion ^1, men nyare studier har visat att RPE morfologi är normal i åldern ögon med hög lipofuscin nivå ^2. Men onormala mönster av lipofuscin distribution, särskilt förlust av lipofuscin, dokumenteras markörer för AMD och AMD progression, både histologiskt och kliniskt ^3,4

defekta processjunga om RPE lipofuscin har också visat sig förekomma i vissa ärvda retinala degeneration. Patienter som lider av Stargardts sjukdom (STGD) samlas lipofuscin i RPE vid en ung ålder, så småningom utveckla synförlust liknar den som ses i AMD ^5. Dessa fynd tyder på att lipofuscin ackumulering kan själv vara giftiga och köra RPE dysfunktion ^6,7. Men en detaljerad bildanalysstudie av patienter med STGD tiden inte bekräfta att fokus lipofuscin ackumulering ledde till efterföljande förlust RPE ^8. Därför, även om lipofuscin abnormiteter är markörer för retinal degeneration, en roll direkt toxicitet lipofuscin fortfarande oprövad.

RPE är den mest bakre cellskiktet av näthinnan, men genererar huvuddelen av fluorescerande signal från den okulära fundus. kan utföras generering och detektering av autofluorescens (AF) härledd från RPE med användning av konfokal scanning laser oftalmoskopi (cSLO), vilket möjliggör VIsualization av den geografiska fördelningen av ögonbotten AF. Vissa retinala degeneration visar tydliga mönster av ögonbotten AF och AF imaging hjälpmedel i diagnos och övervakning av dessa villkor. Även standard AF avbildning är kliniskt viktig, har kvantitativ AF (QAF) blivit ett viktigt medel för att bedöma RPE hälsa. Vi och andra har utvecklat en standardiserad metod som på ett tillförlitligt sätt kan bestämma QAF nivåer vid specifika retinal platser ^9. QAF har potentiella tillämpningar vid diagnos och övervakning av retinala betingelser, och kan också ha användbarhet vid prognos och riskstratifiering. Dessutom har de diagnostiska funktionerna i QAF också beskrivits för vissa näthinnesjukdom ^10-12. Här ger vi stegvisa uppgifter för att utföra vår teknik tillsammans med en visuell demonstration av dess tillämpning i utvärderingen av friska och sjuka ögon.

Protocol

Etik uttalande: Alla patienter som ingick i dessa studier gjordes detta i enlighet med godkända Institutional Review Board tillsyn på New York University School of Medicine.

1. Patient urval av och inledande Förberedelse för Imaging

Obs: Följande material behövs: 0,5% tropikamid oftalmisk lösning, 2,5% fenylefrin ögondroppar, cSLO utrustad med spektral domän optisk koherens tomografi (SD-oktober), och intern fluorescens referens.

1. Före avbildning, lämpligt inrätta cSLO för datainsamling i enlighet med tillverkarens instruktioner.
2. Montera en intern fluorescerande referens i cSLO. Obs: Den interna fluorescerande referens, som köpts från tillverkaren, är inrymt i en metallring och placeras direkt bakom kameralinsen. Om en cSLO från en annan tillverkare användes, kan det finnas en annan konfiguration än den som beskrivs idetta protokoll.
   1. För att sätta in hänvisning i cSLO, vrid linsen för att ta bort den, skruva maskinens metallringen, och ersätta den med den nya metallringen innehåller referensen.
      Notera: den inre fluorescerande referens är väsentlig för QAF tekniken, eftersom den tillåter korrektion för variation i lasereffekt och detektorkänsligheten / förstärkningen.
3. Har patienter rekryteras för avbildning genomgå en rutin dilaterad synundersökning och få bakgrundsinformation om tidigare okulär historia och underliggande medicinska tillstånd som kan manifesteras med okulära fynd.
4. Vidga elever med 0,5% tropikamid och 2,5% fenylefrin. Kritiskt steg: Dilate eleverna att minst 6 mm. Obs: Detta är viktigt för oavbruten passage av ljus, och därmed för optimal visualisering och mätning av ögonbotten.
5. Före avbildning, placera patienten ordentligt på cSLO, med hakan vilande på chinrest, pannan placeras mot forehead vila, och i sidled canthi väl överens med indikatorerna.

2. Baseline Imaging av ögonbotten

1. Först bild fundus med nära infraröd reflektans (IR) ljus (våglängd 820 nm) för att centralisera kameran över gula fläcken och få grov fokus.
   1. Med patienten i rätt läge, växlar inställningen hårdvaran på kontrollpanelen IR imaging läge, manuellt tills fundus är läget kameran i full fokus och ta en bild
   2. Justera inställningen på kontrollpanelen för att "IR-oktober", som använder spektral-domän optisk koherens tomografi (SD-oktober) i samband med IR-avbildning för att utvärdera makula för bakomliggande sjukdom.
   3. Använd guiderna finns i bildfönstret för att korrekt orientera oktober till IR bild av ögonbotten. För att uppnå optimal SD-oktober kvalitet, placera kameran så att oktober bilden är i den övre tredjedelen av dess avbildning fönstret. Förvärva åtminstone en horisontell linje scen genom fovea och spänner över hela bildfältet.

3. Installera QAF Imaging

1. Använd "High speed" bildtagning. Obs: Denna inställning gör det möjligt att snabbare bildtagning, vilket minskar risken för signalförlust på grund av patientrörelse och resulterande blockering av ljus genom iris eller ögonlocken.
2. Använd "Mean 9" ramar. Obs: Denna inställning gör det möjligt att snabbt, sekventiell fånga 9 bildramar, som därefter kan "i genomsnitt" för att minska buller och artefakter (se nedan).
3. Använd "30 x 30 graders" fältet. Obs: Detta avser graden av retinal område Tillfångabildtagning.
4. Före avbildning, varna patienten om det blå ljuset, eftersom detta kan vara alarmerande i början.
5. Slå på AF-läget och anpassa kameraaxel så att skärmen är maximalt "fylld" med fundus AF (minimal mörkare sidor och hörn av bilden).
   1. Om patienter have svårighet att tolerera den ljusa blått ljus, börja avbildning med kameran längre bort från ögat och sedan ta med kameran långsamt mot patienten tills fundus är i full storlek.
      Kritiskt steg: Om ljus som kommer in i eller ut från ögat är blockerad, minskad signal kommer att resultera. Lokaliserad minskning syns som asymmetrisk mörkfärgning av en bildsida eller ett hörn. Generaliserade signalförlust ses när ögonrörelser ensam hindra ljus passage.
6. Rikta kameran så att AF-signalen är på sin högsta nivå i hela fältet. Sträva efter maximal signal snarare än skarpaste bilden, men de ungefär korrelerar. Justera kamerans fokus genom att flytta cSLO att flytta kameran manuellt eller med oftalmoskop joystick.
7. Justera känsligheten / vinst så att fundus AF är lätt att se, men undvika övermättnad. Under bildtagning, färgade pixlar synliga i antingen intern referens (längst upp påbild) eller fundus indikerar övermättnad och därmed signalförlust.

4. Image Acquisition

Obs: kritiskt steg: Målet i bildtagning bör vara att få 2 högkvalitativa 9-frame bildstaplar per session för att kontrollera för variabilitet mellan bilder i en session. Efter flytta patienten och kamera, få en andra session två bilder för att bedöma och kontroll för variabilitet. Alla bilder kommer slutligen kalibreras till den interna referens (beskrivs nedan).

1. Hämta bilder först efter åtminstone 20 sekunder av "blekning" (full exponering av näthinnan till AF ljus) för att minimera absorption av ljus genom rhodopsin i den sensoriska näthinnan ^9.
   1. Använd denna period för att optimera kamerans inriktning, fokus och känslighet.
2. Har ämnen blinkar innan varje bild förvärv som en ny tårfilm förbättrar signalkvaliteten.
3. Undvik ögonlocken i planet av förvärvet.
   Obs: Det kan vara bra att manuellt öppna ögonlock för mer utmanande patienter. Författarna rekommenderar att en assistent utför denna uppgift.
4. Optimera anpassningen före varje bildtagning för att säkerställa att ljuset inte hindras av iris resulterar i minskad signal.
   Obs: Som åtminstone mindre rörelse är mycket vanligt, författarna rekommenderar fina omläggning behov före varje bildtagning. Vägledande och uppmuntra patienten medan avbildning bidrar till att minska rörligheten. Författarna rekommenderar även att använda maskinens fotpedal som "förvärvs knappen" för att minimera operatörens distraktion.
5. Utföra post-bildbehandling genom att beräkna "medelvärde" av 9-frame stack för att öka signal-till-brus-förhållande. Beräkna medelvärdet av en stapel med hjälp av cSLO programvara genom att välja alternativet att beräkna medelvärdet.
   Obs: Det kan finnas stackar där vissa ramar inte är av högsta kvalitet (dvs har lokaliserat eller gener minskat signal i förhållande till de optimala ramar), därför noggrant inspektera varje stapel och avmarkera suboptimala ramar före beräkning av medelvärdet.
   Obs: Mean bilder med acceptabla signal-brusförhållanden kan bearbetas från minst 3 ramar. Det är normalt för sidorna och hörnen på varje bild för att ha lägre signal än den centrala 20 grader på grund av begränsningar inom cSLO själv.
   1. Om programmet frågar om operatören vill normalisera grånivåerna (dvs sträcka histogrammet) mellan 0 och 255, välj "Nej". Detta bibehåller oförändrade gråtoner för analys.

5. Bildanalys

1. Analysera AF bilderna som beskrivits tidigare med hjälp av bildanalys programvara utvecklad för QAF teknik (IGOR, ^9). En kort beskrivning av en typisk bildanalys med hjälp av detta program ingår nedan.
   1. Ladda QAF programmet i IGOR och importera bilder (i bmp-format) som exporteras fråncSLO programvara med pixelproportioner 768 x 768 (standard utparameter).
   2. Markera bilden i rullgardinsmenyn och starta analysen.
   3. Flytta kalibrerings indikatorer på bilden så att "hårkors" ligga fovea och "fäste" ligger an mot optisk skiva (dessa indikatorer används för att skala och placera ROI). När rätt läge uppmanas använda programvara sedan fylla bilden med periferi ROI omger fovea (se figur 1, 2).
   4. Välj alternativet i IGOR att kalibrera de totala gråskalenivåer av varje bild till dessa nivåer som förekommer i den interna fluorescerande referens. Notera: Detta steg möjliggör kalibrering av maskinrelaterade faktorer, innefattande det elektroniska nollnivån av varje bild och den interna referenskalibreringsfaktorn för varje maskin, såväl som patientrelaterade faktorer, innefattande ålder, refraktion och hornhinnans krökning.
      Obs! Analysprogram visar sedan den fasta regions på den resulterande bilden och QAF värde visas inom varje region. QAF värden också automatiskt in i en kalkylbladsformat i ett separat fönster. "
   5. Generera QAF "värmekartor" genom att välja alternativet inom kommandot anvisningarna. Alla bilder och data kan exporteras från IGOR programvara i ett Excel-ark genom att välja lämpliga alternativ.

Representative Results

Denna teknik användes för att studera QAF både hos friska ¹³ och sjukdomstillstånd ^10-12. Hos friska ögon (Figur 1), AF avges från RPE fördelas relativt jämnt över hela fundus (Figur 1A). Minskad intensitet ses i centrala makula regionen på grund av blockering av ljus genom macular pigment, och på sidorna och hörn av bilden på grund av ögats optik och kamera. Fartygen är mörka och bör vara i tydligt fokus på väl förvärvade bilder. Figur 1B visar en motsvarande värmeavbildningsrepresentationen av QAF nivåer från figur 1A. Svalare färger motsvarar områden med lägre intensitet medan varmare färger motsvarar områden med högre intensitet. Maximal intensitet är i allmänhet ses i andra koncentriskt åtta etapper ringen (visas i figur 1B). Denna region är också mindre utsatt för avbildning relaterad soligthet än regioner närmare bildgränserna, och ligger utanför det centrala området där macula pigment har en stor inverkan på QAF nivåer. Sålunda är de genomsnittliga intensiteter av denna ring som används för de flesta dataanalyser ^13. Figur 2 presenterar en representativ analys i ett öga med AMD demonstrerar geografisk atrofi (GA), en avancerad form av AMD. Denna form av AMD resulterar i lokala områden av RPE förlust, framgår av kraftigt minskad eller frånvarande AF, och orsakar progressiv centrala synförlust.

Figur 1. autofluorescens i friska ögat. (A) autofluorescens (AF) bild av det högra ögat hos en normal patient. OD: optisk skiva, Fo: fovea, Ma: macula, Ref: intern referens. (B) efter bearbetning QAF karta över AF bild från (A). Varmare färger korrelerar till högre AF intensitet. fast regjoner är visade, och QAF värdena för varje region är indikerade. 8-segmentet perifoveal ring som används i dataanalys indikeras av den streckade linjen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2. autofluorescens i ögat som visar geografisk atrofi på grund av AMD. (A) autofluorescens (AF) bilden av det vänstra ögat hos en patient med avancerad AMD visar geografisk atrofi (GA) i RPE (representant region omskriven av den streckade linjen). OD: optisk skiva, Fo: fovea, Ma: macula, Ref: intern referens. Obs minskas markant och frånvarande AF i regioner som motsvarar GA i gula fläcken. (B) efter bearbetning QAF karta över AF bild från (A). Fasta områden visas, och QAF värdena för varje region enre anges. 8-segmentet perifoveal ring som används i dataanalys indikeras av den streckade linjen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Onormal RPE lipofuscin distribution, vare sig ökas eller minskas, är en känslig markör för näthinnesjukdom och förknippas i allmänhet med förlust av sensorisk näthinnan funktion. Här beskriver vi tillämpa QAF för utvärdering av RPE lipofuscin. Inkorporering av en intern fluorescerande referens för att korrigera för variabel lasereffekt och detektorkänsligheten ⁹ tillsammans med våra standardiserade avbildningsteknik medger en tillförlitlig kvantifiering av AF nivåer. Det är vårt mål att denna metod kommer att underlätta diagnos och övervakning av näthinnesjukdom, och så småningom för att bedöma effekten av terapeutiska ingrepp, såsom läkemedel eller genterapi. QAF kan också hjälpa till att skiktning av individer i riskzonen för tillstånd såsom AMD.

Vi har skapat en stor normativ databas av QAF data som ska användas som ett referensverktyg för tolkningen av retinal patologi ^13, och har också beskrivit QAF i flera sjukdoms states, inklusive Stargardts sjukdom ^10, prick makulopati ¹² och Best sjukdom ^11. I friska näthinnan, det finns olika QAF nivåer mellan etniska grupper, med betydligt högre QAF i vita än svarta och asiater, och visade att kvinnor har högre QAF nivåer än män. Kanske mest påfallande, ökar QAF eftersom patienter ålder, vilket motsvarar med RPE lipofuscin nivåer, såsom tidigare mätt genom spektrofluorometri ^14. Även nuvarande normativa uppgifter endast sträcka sig upp till 60 års ålder, verkar det som om patienter har en uppmätt minskad RPE lipofuscin efter 70 års ålder ^14. Intressant, verkar inte det att förändringar i RPE cell nummer förekommer som patienter i åldern ² och så de observerade minskningarna i AF kan bero på en omfördelning eller minskning av RPE lipofuscin ^3. Det ska bli intressant att bestämma huruvida dessa minskningar i AF i ålderdomen korrelerar med nedsatt RPE funktion och ökad risk för AMD.

en5. En annan begränsning är att tekniken är svårt att utföra och är mycket operatörsberoende. Det är viktigt att alltid få högkvalitativa bilder för att säkerställa noggranna mätningar av AF nivåer. För att uppnå detta, författarna rekommenderar att strikt följa avbildningsprotokoll samt adekvat praxis. Även om vissa patienter dåligt tolererar de ljusa ljusblixtar som krävs för AF avbildning, försäkra patienter som exponeringsnivåer är väl inom säkra gränser är till hjälp ^1. För att möjliggöra optimal avbildning, är det viktigt att vidga eleverna att åtminstone 6 mm och för att få flera bilder med fri ljustransmission (se ovan). Att uppnå optimal fokus och undvika övermättnad av pixlar är också viktigt. Användbara metoder är kommunikation med patienten medan avbildning, om ögonlocket behöver använda en assistent som ska lyftas och använda fotpedalen för att utlösa kameran som beskrivits ovan.

I sammanfattning, unelse patofysiologi RPE i näthinnan degeneration fortfarande ett område med aktiv forskning och potentiellt viktig terapeutisk effekt. Som QAF möjliggör direkt jämförelse av AF-nivåer i bilder som erhållits i längdriktningen, mellan patienter och mellan centra, är det ett värdefullt verktyg som kan bidra till denna förståelse samt ge användbar klinisk information. Den detaljerade protokoll som beskrivs här kommer att hjälpa andra i förvärvet av tillförlitliga QAF data och att de viktiga kliniska tillämpningar av QAF kommer att uppmuntra forskningscentra och kliniska näthinnan specialister att utnyttja QAF tekniken.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spectralis HRA + OCT	Heidelberg Engineering
0.5% tropicamide ophthalmic solution			Any brand can be used
2.5% phenylephrine ophthalmic solution			Any brand can be used
Internal fluorescent reference	Heidelberg Engineering
IGOR Pro software	WaveMetrics